Micropropagation des clones d'eucalyptus hybrides E. urophylla X E. grandis au Cirad-Forêt : compte rendu d'activités de novembre 1997 à janvier 2000

(1)

1 MICROPROPAGATION DES CLONES D'EUCALYPTUS

HYBRIDES

E. UROPHYLLA

X

E. GRANDIS

AU CIRAD-FORÊT:

Compte-Rendu d'Activités

De Novembre 1997

à

Janvier 2000

***

O. MONTEUUIS S. NOURISSIER-MOUNTOU Ci rad-Forêt

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1

1. Contexte

Durant la période considérée, les activités in vitro ont eu lieu au sein du laboratoire de Génétique du Cirad-Forêt de Baillarguet, axé prioritairement conformément à sa dénomination sur les études de Génétique. Les aspects in vitro sont marginaux et ont concerné pour une grand part la micropropagation de clones hybrides d'Acacia mangium X Acacia auricu/iformis.

2. Les "anciens" clones

Nous avons "hérité" en Novembre 1997, en même temps que les clones d'Acacia, des clones d'E. urophyl/a X E. grandis provenant du contrat passé avec Vitropic et micropropagés depuis l'arrêt du dit contrat par le BSFT. L'inventaire figure en annexe 1.

L'activité depuis s'est poursuivie au rythme de repiquages effectués tous les 2 mois, faute de pouvoir réduire la périodicité (voir annexe 2 pour plus de précisions).

L'inventaire actuel se résume comme suit:

1

Le suivi des cultures a montré:

* de grosses différences de comportement interclonales sur le milieu de base adopté à la suite de quelques tests (insuffisants!) de mise au point (voir annexe 2). Ainsi, des clones tels que les numéros 24, 25 et 26 se multiplient bien alors que d'autres, soumis aux mêmes conditions, dégénèrent voire disparaissent - cas des clones 37, 49, 52, 53, 65 ...

* une forte tendance à l'oxydation nocive au bon développement des cultures;

* la nécessité de raccourcir la périodicité des subcultures à 2 ou 3 semaines au lieu des durées de 2 mois actuellement en vigueur.

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1

2

Le matériel régénéré a permis d'initier quelques essais ·d'enracinement in vitro, notamment dans le cadre des stages de Coralie Dewasme (voir annexe 3), ou de Aubain Saya (voir annexe 4).

Signalons à ce propos que Au bain Saya est reparti au Congo le 10/7 /1999 avec 22 microboutures enracinées des clones 24, 25 et 26 (voir annexe 4), et environ 150 microboutures enracinées d'Acacia mangium X Acacia auriculiformis,

dans le but de tester ce matériel sous forme de pieds-mères hors-sol intensifs (Eucalyptus) - suite à sa visite à l'AFOCEL Sud - ou en plantation pour les acacias.

Nous n'avons à ce jour aucune nouvelle de ce matériel.

3. Les nouveaux clones

En 1999, des nouveaux clones ont été envoyés du Congo à 4 reprises en vue d'être micropropagés dans le laboratoire de Génétique du Cirad-Forêt à Baillarguet.

Ces opérations peuvent être résumées comme suit:

* Envoi du 22/3/99: Il s'agissait de 22 clones (la liste figure en annexe 5) envoyés sous la forme de portions médianes de rameaux, exemptes de bourgeons et de ce fait inaptes à une utilisation directe in vitro.

Le détail des manipulations effectuées sur ce matériel est récapitulé en annexe 5. La nature du matériel - rameaux de petit diamètre avec un stock limité de réserves endogènes - et les conditions de la serre du LSTM n'ont pas permis le production de nouvelles pousses, comme cela aurait pu être possible à partir de sections de branches de plus gros diamètre.

Les introductions in vitro de ce matériel quantitativement très limité - voir détail en annexe 5 - n'ont pas survécu.

Suite à ce premier envoi de matériel non adéquat, une note précisant le type de matériel requis a été rédigée (cf annexe 6).

* Envoi du 17/6/99: Non arrive .... : la glacière de conditionnement avec le matériel végétal accompagnant l'arrivée d'Aubain Saya s'est perdue entre Pointe Noire et Montpellier.

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3 * Envoi du 19/6/99: Suite à cette mésaventure, renvoi de 5 clones, à savoir

18-147, 18-149, 18-209, 18-220, 18-323, chacun représentés par 5 boutures enracinées et 5 rondins.

Les rondins ont été retaillés et mis à forcer également dans les conditions de serre LSTM, qui n'ont pas permis la production espérée de pousses ep1cormiques, vraisemblablement à cause de températures trop élevées et des rayons solaires incidents à cette période de l'année .. Les boutures enracinées ont été rempotées et placées en serre LSTM où elles se sont bien comportées. Nous disposons actuellement des effectifs suivants:

3 pieds-mères pour le clone 18-147,

5 pieds-mères pour le clone 18-220, 4 pieds-mères pour le clone 18-323

Les nouvelles pousses émises au bout de quelques semaines ont été utilisées avec succès pour initier des cultures les 26/10/99 et 16/11/99 (cf inventaire annexe 7).

Entre temps, 12 protocoles de désinfections ont été testés sur des jeunes pousses d'Eucalyptus gunnii provenant de la station AFOCEL Sud, à

raison de 24 microboutures par protocole, soit un total de 288 microboutures. Le détail de ces manipulations - qui ne font pas ressortir de résultats très probants si ce n'est l'importance des contaminations d'origne bactérienne - figure en annexe 8.

* Envoi du 30/7/99: Il s'agissait d'extrémités de pousses très herbacées correspondant à 10 clones dont l'identité est précisée en annexe 9. Ce matériel, acheminé par P.A. Cornillon avait été récolté 3 jours auparavant et est arrivé dans un état bien défraîchi - avait manifestement souffert de la chaleur.

Néanmoins, en dépit de sérieuses contraintes au niveau du personnel (matériel arrivé le vendredi à 1 Oh, Sophie en congés annuels,. .. ), un total de 406 microboutures correspondant aux 10 clones (voir annexe 9 pour plus de détails) a été introduit en culture primaire. Aucune microbouture n'a survécu, vraisemblablement du fait du stress lié aux conditions d'acheminement.

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1

4

4. Bilan et commentaires

En dépit des avatars évoqués précédemment, l'inventaire du matériel actuellement en culture est détaillé en Annexe 7. On notera la bonne représentativité (enfin!) des "nouveaux" clones.

La priorité, conformément aux consignes reçues, demeure "la montée en puissance" de ces clones 18-147, 18-149, 18-209, 18-220 et 18-323 dont les pieds-mères dans la serre LSTM peuvent être utilisés, le cas échéant, pour de nouvelles introductions primaires ..

L'optimisation des milieux de culture pour l'entretien des clones, leur multiplication, voire leur enracinement se fera par l'entremise de 1 ou 2 stagiaires qui travailleront sur ce sujet durant 2 à 3 mois. Les anciens clones,

largement représentés pourront servir de matériel de base pour ces essais d'enracinement, sans sous-estimer néanmoins les effets clonaux dans la perspective d'une éventuelle transposition à d'autres clones ... Le problème se pose toujours de savoir le devenir de ces plants enracinés des anciens clones,

hormis la poubelle! Ceci d'autant plus que nous sommes sans aucune nouvelle du matériel végétal ramené par Aubain Saya!

La nécessité de repiquer les clones toutes les 3 semaines est une réelle contrainte que nous n'arrivons pas (cf annexe 7) à maitriser dans les conditions actuelles du fait de moyens humains insuffisants (50% du temps de Sophie Nourissier-Mountou). A titre d'information, la périodicité des sub-cultures pour les autres espèces est de 2 à 2,5 mois. Ces faibles moyens humains dont nous disposons (2,5 jours de technicien pour l'ensemble des tâches in vitro) ne permettent pas d'envisager un élargissement de la gamme de clones actuellement en culture.

C'est une situation que nous ne pouvons que regretter.

Olivier MONTEUUIS

Sophie NOURISSIER-MOUNTOU,

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1

1 Annexe 1

COMPTE-RENDU DE VISITE AU BSFT DU 7 NOVEMBRE 1997.

A la demande d'Yves PRIN, je me suis rendu le 7 Novembre 1997 au BSFT

en vue d'inventorier le matériel végétal en serre et en cours de

micropropagation in vitro susceptible d'être transféré dès que possible dans

les conditions adéquates du Cirad-Forêt à Baillarguet. J'ai à cette occasion

rencontré Mme Jeannine CHAUMONT et Christine LEROUX.

L'inventaire à la date indiquée est le suivant:

1. EN SERRE:

Les Acacia auricu/iformis et hybrydes interspécifiques présumés

A.mangiumXA.auricu/iformis cultivés en pots sont de qualité très variable, avec

des signes particulièrement nets de déficiences minérales - couleur jaune.

Ils sont individuellment identifiés par les codes suivants:

AA.93/61, AA4.94/17, AA5.94/17, 2.28, 3.19, 3.26, 4.15, 4.21, 4.22, 4.23, 4.26,

5.13, 5.15, 5.25, 6.23, 6.24, 6.27, 6.5, 7.13, 7.16, 7.22, 7.23, 7.28, 8.15,

8.16, 8.19, 8.26, 9.19, 9.21, 9.25, 9.26, 9.27, 10.21, 10.23, 10.24, 11.28

+ 4 individus sans étiquette,

ce qui correspond à un total de 40 plants.

2. EN TUBES DE CUL TURE:

21. Hybrides interspécifigues présumés A.mangiumXA.auriculiformis.

Le matériel végétal in vitro se présente sous la forme de microboutures.

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1

No No No No No d'identification 1.1 1.24 2.28 3.26 4.15 4.21 4.23 4.26 5.13 Nombre 1 2 3 3 5 2 2 2 1 d'identification 5.15 6.15 6.23 6.27 6.5 7.13 7.22 7.23 8.16 Nombre 2 2 1 1 2 3 2 1 1 d'identification 8.19 9.19 9.26 93.61 10.24 11.28 Nombre 1 2 1 1 1 2 22. Acacia crassicaroa

Tout le matériel in vitro utilisé par Mme Ahée dans le cadre des expérimentations sur la transformation a été jeté.

23. Hybrides interspécifiques Eucalyptus urophv!laXEucalvptus grandis

Le matériel végétal in vitro se présente sous la forme de microboutures.

L'inventaire est le suivant:

d'identification 17 24 Nombre 10 10 d'identification 53 64 Nombre 10 10 Destinataires: Ph. VIGNERON Y.PRIN A.GALIANA 25 26 10 10 65 69 11 10 35 37 49 50 52 10 10 3 10 10 72 10

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/

Annexe 2

HISTORIQUE DES REPIQUAGES D'EUCALYPTUS

2 "lots" d'eucalyptus en fonction de la date du dernier repiquage à Nogent: -17 /10/97 -->lot a

-20/08/97 -->lot b

Dates de repiquages et milieux utilisés après leur transfert à Montpellier

#Repiquage

-27et 28 /11/97 --->lot a -12/12/97 -->lot b

##Milieu

Ces 2 lots sont repiqués sur du milieu A, sans hormone ,ni caséine: Pour 1 L de milieu A : Macro:50 ml FeEDTA: 25ml Micro: 1 ml Myolnositol: 5 ml Vitamines: 1 ml Saccharose: 30 g/l Phytagel: 2.5 g/l

pH mesuré à5,5/5,7 ,ajusté avec du KOH 0,1 N.

#Repiquage du 08 et du 13101198

Pour essayer de limiter les problèmes d'oxydation dans le milieu (coloration brune dûe à la

libération dans le milieu des inhibiteurs phénoliques qui peuvent conduire à la mort de

l'expiant), on met les explants pendant 2-3 jours à l'obscurité.

##Milieu A sans hormones et sans caséine

#Repiquage du 23 au 29/01 /98

##Milieu A sans hormones,ni caséine --->repiquage de la moitié des tubes sur ce milieu pour

chaque clone.

##Milieu A sans hormones,ni caséine avec 1 g/l de charbon actif Sigma C6289 --->repiquage

de l'autre moitié des clones.

(9)

1 /

#Repiquages du 23/03/98 au 16/04 ##Milieu A MS/2 BAP=0,25 mg/! ANA=0,01 mg/! Caséine=200 mg/l Saccharose=30 g/l Phytagel=2,5 g/l #Repiquages du 18 au 29/06/98

##Milieu A (Idem si dessus) MS/2 BAP=0,25 mg/l ANA=0,01 mg/l Caséine=200 mg/l Saccharose=30 g/l Phytagel=2,5 g/l #Repiquage du 27 au 31/07 /98 ##Milieu D BAP=O,lmg/l ANA=O.Olmg/l Caséine=200mg/l Saccharose= 3 Og/l Phytagel=2.5g #Repiquage du 1 au 8 octobre 1998

#Milieu D sans caséine BAP=O.lmg/l

ANA=O.O 1 mg/!

Saccharose=30g/l Phytagel=2.5g

## Manip rhizogenèse : on choisit les explants ayant une grande tige ---> 7 traitements

Témoin(mil.D); AJA 2,5 µm; AJA 5µm; AIB 2,5µm ; AIB 5µm; ANA 2,5µm; ANA 5µm.

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1

#Milieu D sans caséine BAP=O.lmg/l ANA=O.Olmg/I Saccharose=30g/l Phytagel=2.5g

#Repiquage du 17 au 19 décembre 1998 (dates à vérifier) #Milieu D sans caséine

BAP=O.lmg/l ANA=O.Olmg/l Saccharose=30g/l Phytagel=2.5g

Rm: seule environ la moitié des clones a été repiquée.

#Repiquage du 18 au 21 janvier 1999 #Milieu D sans caséine

BAP=O.lmg/I ANA=O.Olmg/l Saccharose=30g/l Phytagel=2.5g

Rm: l'autre moitié des clones a été repiquée.

#Repiquage du 2/2/99: #Milieu D sans caséine

BAP=O. l mg/! ANA=O.Olmg/l Saccharose= 3 Og/l Phytagel=2.5g

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1

1 Annexe 3

OBJECTIFS

Programme de sélection des eucalyptus: des hybrides artificiels interspécifiques d'eucalyptus

ont été obtenus au Congo, et le rôle de la culture in vitro est de maintenir en croissance les génotypes de ces hybrides.

II- Les eucalyptus

J -Généralités

Le genre Eucalyptus appartient à la famille des Myrtacées. Il est très diversifié et

regroupe environ 600 espèces. Le sous-genre Symphyomyrtus fournit le plus grand nombre

d'espèces (406) plantées à travers le monde. Deux sections de ce sous-genre contiennent

l'essentiel des espèces à fort développement utilisées en reboisement:

- section Transversaria (E. grandis, E.pellita, ... .)

- section Exertaria (E.urophylla, E.tereticornis, ... )

La presque totalité des espèces est originaire d' Australie et de Tasmanie. Seules deux

espèces sont étrangères au continent australien: E.deglupta (archipel de Sulawesi en Indonésie,

île de Mïndanao aux Phillipines) et E.urophylla (îles de la Sonde, Timor, îles de Florés) qui est

une espèce très représentée au Congo, un des pays d'introduction.

-En ce qui concerne leur biologie reproductive, la majorité des espèces d'eucalyptus

présente un nombre de chromosomes de 2n = 22 et la pollinisation est principalement

entomophile ce qui favorise l'hybridation interspécifique .

Au niveau morphologique, les eucalyptus sont des arbres à feuilles persistantes alternes.

Il peut exister un dimorphisme foliaire plus ou moins prononcé selon les espèces entre les semis

et les individus adultes. La taille de ces arbres adultes peut varier cons-idérablement, jusqu' à

plus de lOOm de haut

L'eucalyptus est, avec le pin, l'espèce forestière la plus largement utilisée pour les

reboisements dans la zone-intertropicale du fait de sa capacité d'adaptation et de sa croissance

rapide. Il peut être utilisé comme bois de feu ou de trituration (85%), perche et bois rond (10%) ou sciage (5%) dans les pays d'introduction, et est utilisé comme bois d'oeuvre principalement en Australie. L'amélioration génétique et la foresterie clonale sont appliquées dans certaines régions du monde (Brésil, Congo, Afiique du Sud) avec des retombées économiques importantes (Bouvet, 1995).

2- l,es hybrides interspécifiques

Dans certaines situations (comme au Congo), les hybrides interspécifiques constituent une alternative intéressante. Entre 1978 et 1982, les meilleures formules hybrides ont été recherchées. Ce sont principalement les espèces du sous-genre Symphyomyrtus qui ont été utilisées. Les combinaisons hybrides potentiellement les plus intéressantes proviennent de

croisements effectués entre les sections Exertaria (E. urophylla, ... ) et Transversaria

(E.grandis, ... ) (Vigneron,1991). Les aires d'origine de E.urophylla et E.grandis étant disjointes,

il ne pouvait pas y avoir d'hybrides interspécifiques naturels. Or le croisement de ces deux

espèces, dont il sera question dans ce rapport, ainsi que d'autres formules hybrides, sont

susceptibles de concurrencer les hybrides naturels.

L'espèce E.grandis est caractérisée par des sujets de grande taille dont les plus hauts

peuvent dépasser 70 mètres. Elle est souvent plantée pour la production de bois de feu ou de pâte

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forme et un bon rendement. Par contre ils ne sont pas adaptés à une forte hygrométrie.

L'espèce E.urophyl/a, introduit au Congo en 1970, adaptée à une forte hygrométrie

présente donc un grand intérêt pour la zone tropicale humide. Elle confère aux descendances

interspécifiques son excellente adaptabilité. Le croisement avec E.urophylla permet aux

potentialités de E.grandis de s'exprimer dans la zone intertropicale.

On notera que 95% des plantations actuelles au Congo reposent majoritairement sur deux formules hybrides qui sont:

- E. "PF l ", hybride interspécifique naturel entre des mères alba et des pères pouvant être

E.grandis, E.robusta, E.urophylla. Le rendement de cet hybride est deux fois plus élevé (20-25

m3/ha/an)que celui des espèces pures (8-10 m3/ha/an).

- E. "12 AB" résultant d'un croisement entre E .tereticomis de rnadagascar et E.grandis.

II- Multiplication

Le repiquage des eucalyptus se fait par des coupes longitudinales du plant à multiplier.

Tout tissu vitreux est jeté, de même que les explants de taille trop faible (x<lcm).

Pour les hybrides E.urophylla xE.grandis, la concentration en BAP varie de 0 à 0.25 mg/Let

celle en ANA varie de 0 à 0.01 mg/L. En effet les eucalyptus réagissent mieux à la BAP que les

acacias car leur aptitude à la néoformation est meilleure.

ID- J,a rhizogenèse

Parmi les hybrides Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, les clones qui étaient le

plus développés après 3 mois sur un milieu MS/2 additionné de saccharose (30 g/L ), de caséine (200 mg/L), de phytorégulateurs ( BAP 0.25 g/L et ANA 0.01 g/L) et de phytagel (2.5 g/L) ont

été conservés. L'effectif total de ces clones est de 48 rnicroboutures réparties entre 12

microboutures du clone 18.26, 12 du clone 18.50 et 24 du clone 18.24.

Les clones 24, 26 et 50 sont transférés sur des milieux d'enracinement. Pour cela, des fragments suffisamment grands (x<lcm) sont prélevés sur les microboutures. Chaque clone est réparti équitablement entre les différents milieux.

Quatre milieux sont réalisés pour comparer l'aspect qualitatif des différentes auxines sur la rhizogenèse. L'ensemble des milieux contient les éléments de base du milieu MS/2 ainsi que du saccharose (30 g/L), de la caséine (200 mg/L), et du phytagel (2.5 g/L). Ils diffèrent uniquement par leur composition en régulateur de croissance. Le milieu témoin (T) est un milieu

"blanc" (c'est à dire qu'il ne contient aucun régulateur de croissance). Les 3 autres milieux

contiennent soit de l'acide indodylbutarique (AIB), soit l'acide naphtylacétique (ANA), soit l'acide indodylacétique (AIA) à raison d'une quantité de 5 µmol (Tableau 3).

Tableau 3: Teneurs en "auxine" pour les milieux de rhizogenèse.

Quantité pour Masse Molaire Masse pour IL Volume de

lL en g/mol en mg solution à lg/L pour0.5L ANA 5 µmol 186.2 0.931 465 µl AIB 5 µmol 203.2 1 500 µl AIA 5 µmol 175.2 0.876 435 µl • 1

(13)

IV- Résultats concernant la rhizogenèse

Sur l'ensemble de la culture, le taux d'enracinement atteint 51 %. Cependant il n'a pas été possible de mettre en évidence des différences suivant la nature de l'auxine présente dans le milieu (tableau 13). Le témoin où le milieu est exempt en auxine présente logiquement un taux d'enracinement nettement inférieur. On constate aussi, que sans "auxine", il n'y pas de formation de cal basal. Enfin, la formation de cal est supérieure dans le milieu contenant AIB par rapport aux deux autres régulateurs de croissance.

Tableau 13:Enracinement selon la nature de l'auxine sur des hybrides E.urophyl/a x E.grandis. R = nombre de microboutures enracinées. NR = nombre de microboutures non enracinées.

ANA: acide naphtylacétique AJA: acide indodyl acétique AIB: acide indodylbutarique T: témoin sans auxine

Régulateur de croissance ~A Présence de cals + R 9 NR 3 % d'enracinement 66% V-Discussion AJA - + 1 9 2 4 53% AIB T - + - + -0 9 0 0 4 2 8 0 0 12 53% 25%

Il a été constaté lors de l'expérience de rhizogenèse sur les hybrides Eucalyptus urophylla

x Eucalyptus grandis, un enracinement des microboutures malgré l'absence d"'auxines" exogènes. Ces microboutures ne présentaient pas de cal basal contrairement à celles mises en culture en présence de ces régulateurs de croissance. Or le cal basal empêche la liaison correcte entre la tige et les racines. Il a aussi été observé une légère supériorité à l'enracinement ainsi qu'une réponse à la callogenèse plus faible pour le milieu contenant de !'ANA. Cependant il faudrait répéter cette expérience en faisant varier les concentrations en "auxine". Peut-être, que dans ce cas, la répartition des microboutures enracinées et celles possèdant des cals ne serait plus la même suivant ces différents composés (ANA, AJA, AIB).

Bibliographie:

BOUVET JM., 1995. Evolution de la variabilité avec l'âge et correlationjuvenile-adulte dans des populations d'eucalyptus, p6-25.

VIGNERON P., 1992. Création et amélioration de variétés hybrides d'Eucalytus au Congo.

(14)

1

1 Annexe 4

Résultats d'enracinement in vitro

des clones 24, 25, 26, 50 et 69.

Essai mis en place le 21/6/99 Lu le 19/7 /99

Milieu de base utilisé: D (voir composition en annexe 2)

N° Clone ANA (mg/I) 24 25 26 50 0,5 2/24* 14/24* 6/24* 1/23 1 4/24** 17/24 12/24 2 5/23** 20/24 16/24** 69 0/24

* Microboutures enracinées rapportées par A. Saya au Congo le 10/7/99

(15)

Annexe 5

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(18)

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1 Annexe 6

PRÉCISIONS CONCERNANT LE TYPE DE MATERIEL

VÉGÉTAL D'EUCALYPTUS A RAMENER DU CONGO

:

A. Nature:

Le matériel pourra être:

l) des boutures bien racinées en mottes :MELFER T - ou tout autre conteneur assurant un maintient du substrat d'élevage lors du transport.

La tige de ces boutures bien racinées pourra être rabattue à 5-1 Ocm au-dessus du collet juste avant le départ.

L'ensemble pourra être calé dans des récipients en évitant les risques de froid (soute de l'avion).

Bien s'assurer de l'identification de ces boutures: numérotation individuelle devant supporter les aléats du transport.

2) des extrémités de rameaux feuillés, avec des bourgeons axillaires non encore débourrés:

ce type de matériel herbacé est très fragile, et doit être conservé dans des sacs plastiques avec papier toilette ou sopalin imbibé d'eau ou d'une solution anti-fongique (type benlate). Il importe de réduire au maximum le délai entre la récolte - dans des bassines d'eau - et lutilisation de ces pousses. A cette fin, ces pousses seront prélevées juste avant le départ de Pointe Noire pour être traitées dés l'arrivée au CIRAD-Forêt àt Baillarguet (éviter les week-ends).

3) des portions de branches de 2 a 4 cm de diamètre et 30-50cm de long, enrobées dans du papier journal mouillé, puis mis en sac plastique.

(19)

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1

B) Quantité

Dans l'état actuel, il est préférable de ramener peu de clones bien représentés que beaucoup de clones representés par une quantité réduite de matériel végetal.

La quantité par clone sera bien entendu fonction des disponibilités en matériel végétal sur place et des moyens de transport.

A titre d'indication, 3 à 5 boutures racinées (1), plusieurs dizaines d'extrémités de rameaux (2) et 4 à 6 portions de branches (3) pour chaque clone constitueraient un bon compromis.

Baillarguet, le 22/4/1999.

Olivier CIRAD-Forêt

(20)

1

1 Annexe 7

Inventaire des effectifs clonaux en culture le 17/1/2000:

"Anciens" clones

:

No Clone 17 24 25 26 35 50 64 69 72 N 7 151 649 35 1 207 53 60 5

"Nouveaux" clones:

N° Clone 18-147 18-149 18-209 18-220 18-323 N1 23 24 24 10 18 N2 17 9 24 3 9 N3 10 13 11 16 7 N4 9 11 7 23 7 N Total 59 57 66 52 41

N 1: Introduction du 26/10/99 à partir des "pieds-mères" en serre LSTM:

Protocole de désinfection: Solution aqueuse à 25% (v/v) d'eau de javel

du commerce, soit solution à 3°Chl.

Temps de trempage: 5 min.

24 microboutures pour chaque clone

1er repiquage le 29/11/99, 2ième repiquage le 4/1/2000

N2 idem N 1 excepté pour le temps de trempage de 10 min

N3: Introduction du 16/11/99 à partir des mêmes "pieds-mères" en serre LSTM.

Même protocole de désinfection que N 1, mais effectifs clonaux initiaux

suivants:

16 microboutures pour les clones 18-14 7 et 18-149, 12 microboutures

pour les clones 18-209 et 18-323, et 24 microboutures pour le clone

18-220.

(21)

Annexe 8

Résultats des essais relatifs aux protocoles de

désinfection pour l'introduction de pousses en cultures

primaires.

Essai mis en place le 25/6/99 Lu le 13/7 /99

Matériel végétal: jeunes pousses d'un clone AFOCEL d'Eucalyptus gunnii

Protocoles testés (chacun suivi de 3 rinçages abondants dans de l'eau ultra-pure stérilisée, manipulations en conditions stériles, sous hotte à flux laminaire):

1. Immersion 5 min dans eau de javel du commerce (12,5% de NaOCI) dilué

à 50%

2. Idem 1 mais immersion 10min dans eau de javel du commerce (12,5% de NaOCI) dilué à 50%

3. Idem 1 mais solution aqueuse eau de javel du commerce (12,5% de NaOCI) dilué à 25% 1

4. Idem 3 mais immersion 1 Omin dans solution aqueuse eau de javel du commerce (12,5% de NaOCI) dilué à 25% 1

5. Immersion 1 Omin dans solution aqueuse de Ca(OCl)₂ à 9% 6. Idem 5 mais pendant 20min

7. Idem 5 mais trempage préalable 1min dans solution d'ETOH à 70% + quelques gouttes de mouillant (Tween)

8. Idem 6 mais trempage préalable 1 min dans solution d'ETOH à 70% + quelques gouttes de mouillant (Tween)

9. a) Trempage 3min dans solution d'ETOH à 70% + quelques gouttes de mouillant (Tween)

(22)

10. Idem 9 mais Immersion 10 min dans solution aqueuse de HgCl₂ à 2%₀ (2g/I)

11. Idem 9, mais sans trempage prélable dans l'ETOH

12. Idem 10, mais sans trempage préalable dans ETOH

Tableau récapitulatif des résultats

Protocoles (N°) Explants morts Contaminations Contaminations Explants

par par bactéries apparemment

champignons sains et vivants 1 2/24=8% 1/24=4% 21/24=88% 0/24=0% 2 10/24=42% 2/24=8% 12/24=50% 0/24=0% 3 0/24=0% 3/24=13% 21/24=87% 0/24=0% 4 2/24=8% 1/24=4% 21/24=87% 0/24=0% 5 2/24=8% 0/24=0% 17/24=71% 5/24=22% 6 3/24=13% 4/24=17% 11/24=46% 6/24=25% 7 9/24=38% 1/24=4% 13/24=54% 1/24=4% 8 12/24=50% 3/24=13% 7/24=29% 2/24=8% 9 7/24=29% 1/24=4% 12/24=50% 4/24=17% 10 8/24=33% 0/24=0% 15/24=62% 1/24=4% 11 2/24=8% 1/24=4% 20/24=83% 1/24=4% 12 2/24=8% 1/24=4% 15/24=62% 6/24=25%