Tetrazólio para detectar virulência em Xanthomonas campestris pv. manihotis.

Junhoj1983 28] Vol.8

TETRAZÓLIO PARA DETECTAR

VlRUL~NCIA

EM

XANTHOMONAS CAMPESTRIS

PV.

MANIHOTIS*

JOSÉ TADEU ATHAYDE1 &REGINALDO DA SILVA ROMEIR02

1 Laboratório deFitopatologia, EMCAPA, C.P. 391, CEPo29.000 - Vitória - ES. 2 Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, CEPo 36.570 - Viçosa -MG.

(Aceito para publicação em 06/05/83)

RESUMO

Colônias de Xanthomonas campestris pv. manihotis obtidas em meio de Cloreto de 2, 3, 5 - Trifenil tetrazólio, CTT, variaram, tanto no tamanho como na proporção das cores branca e vermelha, a saber: Colônias do tipo "A" - grandes, com centro vermelho correspon-dente àmetade do diâmetro da colônia, e grande margem branca. Houve predominância desse tipo; colônias tipo "B" -pequenas, geralmente com diâmetro 3 vezes inferior ao do tipo "A", quase totalmente vermelhas e com uma pequena margem branca, de até 0,5 mm de largura; colônias tipo "C" - as de menor diâmetro, inteiramente brncas; colônias tipo "D" - de diâme-tro variável, entre os tipos extremos "A" e"C", apresentando variações, também, na proporção das cores branca e vermelha, desde um minúsculo ponto vermelho no centro da colônia até coloração próxima àdotipo "B".

Na avaliação da patogenicidade das colônias, feita por três métodos de inoculação, obser-vou-se que as colônias tipo "A", "C" e "D" foram virulentas, ao passo que as colônias tipo "B" foram de baixa virulência ou avirulentas. Por testes sorológicos, comprovou-se serem todas as colônias pertencentes à mesma espécie.

Parte da dissertação submetida pelo primeiro autor aoDepartamento deFitopatologia da Universidade Federal deViçosa, para obtenção do Ti tulodeMestre emFitpatologia.

284

ABSTRACT

FITOPATOLOGIA BRASILEIRA

Tetrazolium to detect virulence in Xanthomonas campestris pv. manihotis isolates Colonies of Xanthomonas

campestris

pv. manihots obtained on 2, 3, S-Triphenyl tetra-zoliurn Chloride TTC medium had different sizes and whíte/red color variations, such as follow: Type A colonies - large ones with reddish center and large colourles margins. The diameter of the center corresponds to the half of the diameter of the colony. This was the predominant type;

Type B colonies - samll ones almost entirely reddish. The diameter of type B colonies was usually one third of the diameter of type A colonies. The colonies margins were white about 0,5 mm wide;

Type C colonies - tiny white ones;

1!pe

!>

colonies - ~ith diameter between type A and type C. This colony type showed varia-bons fi the red/whíte colo r proportion from a tiny red point in the center of the colony to the

color of type B colony.

Evaluation of pathogenicity of the colonies showed that types A, C and D were virulent. Type B colonies were weakly virulent or avirulent. Serological tests confirmed that the four types of colonies belonged to the same especies.

INTRODUÇÃO

Em 1941, Kulmand e Jerchel, citados por Mattson et aI., 1944, sintetizaram alguns sais de tetrazólio e chamaram a atenção para o fato de que soluções diluídas desses sais coloriam leveduras, tecidos de planta e bactérias.

A aplicação de tetrazólio em bacterio-logia deu-se quando Lederberg (1948), pro-curava desenvolver métodos para detectar variantes fermentativas de

Escherichia

coli. Colônias de variantes não-fermentatívas eram coloridas de vermelho-escuro, ao passo que as de variantes fermentativas não sofriam alterações de cor.

Levine e Garber (1950) incorporando cloreto de 2,3, S-trifeníl tetrazólio ao meio ~e crescimento de Pasteurella pestis, possíbí-htaram a detecção de variantes morfológí-caso Huddleson

&

Balpzer, 1950, detectaram variantes morfológicas em Salmonella sp. e E. coli.

O emprego de sais de tetrazólio em fitobacteriologia é relativamente recente. Em 1954, Kelman conseguiu distinguir três tipos

diferentes de colônias de Psuedomonas sola-nacearum pelo seu aspecto em meio de te-trazólio e correlacionou o aspecto da colônia com a sua virulência. Smale

&

Worley (1956), Friedman (1964), Goodman, citado por Romeiro (1980), também encontraram, respectivamente, para Pseudomonas phaseo-fico Ia, Xanthomonas phaseoli,

Erwinia

cara-tovora e

Erwinia

amylovora uma relação entre a coloração de colônias em meio de CTT e virulência, sendo que este unimo observou que as colônias pequenas e ver-melhas eram avirulentas, com células despro-vidas de cápsula.

O objetivo deste trabalho foi testar a possiblidade de uso do cloreto de 2 3 5 - trifenil tetrazólio na detecção de colônias virulentas de Xanthomonas campestris pv. manihotis.

MATERIAIS E MÉTODOS Quatro isolamentos de X campestris pv. manihotis advindos de diferentes regiões do País (Tabela 1) foram armazenados em óleo mineral durante mais de 10 meses.

Vol.8 Junho/1983 ₂₈₅

Tabela 1 - Isolamento de Xanthomonas campestris pv. manihotis empregado neste trabalho.

Número na coleção de

bactérias da UFV Procedência

Isolamento e Identificação UFV -05 UFV -06 UFV - 29 UFV -30 ENA - 2647 ENA - 2648 MINAS GERAIS ESPIRITO SANTO KIMURA,O. * KIMURA,O. ATHAYDE, J.T. ** ATHAYDE,J.T.

* Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Itaguaí-RJ ** EMCAPA, Vitória-ES

A bactéria foi cultivada em meio que continha 10 g de sacarose, 8 g de caseína áci-da hidrolisaáci-da, 4 g de extrato de levedura, 2 g de K2HP04, 0,3 g de MgS04.7H20,

15 g de agar-agar e 1.000 ml de água destila-da (Kado

&

Heskett, 1970).

Ao meio fundente foram adicionados 10 ml de cloreto de 2, 3, 5 - trifenil tetra-zólio a 0,5% que foi esterilizado em separado a 1210C durante 15 minutos. Em seguida, preparam-se as placas de Petri, que foram semeadas com suspensão bacteriana pelo

mé-.todo de estrias e incubadas a 280C.

A forma, a cor e o tamanho das colô-nias em crescimento foram observadas a partir de 24 horas após o semeio.

Colônias com diferentes características foram repicadas para tubos de ensaio com meio inclinado de Kado

&

Heskett (1970). Como os quatro isolamentos estudados apresentaram o mesmo tipo de variação, quanto ao aspecto das colônias em meio de cloreto de 2, 3, 5 - trifenil tetrazólio, o isolamento UFV-06 foi escolhido para a continuação do trabalho.

Todas as colônis do isolamento UFV-06 que apresentavam características cultu-rais diferentes foram utilizadas no teste de patogenicidade. Foram empregados três mé-todos de inoculação: por ferimento com pa-lito, na haste (Akiba et al., 1972 e Kimura,

1978); por ferimento, em folhas; e por ferimento, em corte do pecíolo (Robbs et al., 1972).

Para cada tipo diferente de colônia do isolamento UFV-06, estabeleceu-se uma subcultura, da qual se obteve o inóculo, a partir do cultivo no meio sólido descrito anteriormente, com 24 horas de incubação a 280C. Preparou-se uma suspensão bacte-riana em água destilada esterilizada, e a concentração desta suspensão foi ajustada para 10/\ células/ml, com o. auxílio do es-pectrofotômetro Colleman-l l l , ao com-primento de onda de 550 nm.

As inoculações foram realizadas em plantas de mandioca das cultivares 'Chagas' e 'Branquinha', susceptíveis a X campestris pv. manihotis (Athayde, 1979). As manivas foram plantadas, em vasos de barro, com capacidade para 5 kg de solo que continham uma mistura de solo argiloso e esterco de galinha esterilizado.

As inoculações foram realizadas em seis plantas de cada cultivar, com trinta centímetros de altura, por tratamento, em condições de casa de vegetação, e irrigadas duas vezes por dia, para manter o solo cons-tantemente úmido.

Na haste, a inoculação foi feita inserin-do a extremidade de um palito dentário es-terilizado, previamente imerso na suspensão

286

de inóculo, por 20 minutos, na axila da

terceira, quarta e quinta folhas abertas, a partir do ápice.

Para inoculação na folha, por feri-mento, foram feitas 6-8 perfurações no fo-líolo central da terceira, quarta e quinta folhas abertas, a partir do ápice, com agu-lha, inserida entre as cerdas de um pincel anteriormente imerso na suspensão do

inóculo,

Para a inoculação no pecíolo, por ferimento, fez-se o depósito de uma gota de 10 microlitros da suspensão bacteriana precisamente nos pontos do tecido exposto pelo corte dos pecíolos em biseI voltado para cima, a três centímetros da haste.

Foram seccionados os pecíolos da terceira, quarta e quinta folhas abertas, a partir do ápice. Eliminou-se o excesso do látex exu-dado da área seccionada, com gaze esterili-zada, antes da inoculação.

Plantas inoculadas com água estéril serviram como testemunhas.

Com 5, 8, 13 e 20 dias de inoculação foram feitas as leituras para avaliação da patogenicidade das subculturas.

Empregou-se o método de Hiss, citado por Romeiro (1976), para evidenciação de cápsula.

Estudou-se o relacionamento sorológi-co dos diferentes tipos de colônias obtidas no meio de tetrazólio. Na produção de antissoro contra X. campestris pv. mani-hotis, a bactéria foi cultivada no meio des-crito anteriormente. Após 48 horas de incubação a 280C, as células bacterianas foram suspensas em solução salina (NaCl 0,85%), e a concentração ajustada para 1010 cel/rnl ao espectrofotômetro. Partes iguais de suspensão bacteriana e adjuvante incompleto de Freund foram misturadas e emulsificadas. A imunização. de coelhos para a produção de antissoro foi feita apli-cando-se 0,5 rnl no menor dedo. da pata traseira de um coelho. Após 15 dias, apli-cou-se a segunda injeção (0,5 ml), na outra pata. Trinta dias após a primeira, fez-se

FITOPATOLOGIA BRASILEIRA a coleta do sangue do coelho, por secciona-mento da veia jugular. O sangue colhido foi deixado em repouso durante duas horas,

à temperatura ambiente. Em seguida, reco

-lheu-se o soro, que foi centrifugado a 3.500 rpm, durante 15 minutos. O sobrenadante foi titulado pelo método de aglutinação em lâminas, fracionado em alíquotas de 0,5 ml e mantido em congelador até o momento de sua utilização.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Quanto às características culturais, iso-lamentos de Xanthomonas campestris pv.

man iho tis , armazenados em óleo mineral por mais de 10 meses, comportaram-se dife-,rentemente de isolamentos obtidos direta-mente das plantas inoculadas com qualquer um dos quatro isolamentos (UFV'()5,

UFV'()6, UFV-29, UFV-30). Os isolamentos armazenados apresentaram grandes variações no crescimento em diâmetro das colônias.

Dentre várias tentativas feitas para correla-cionar tipos de colônias diferentes com vi-rulência, verificou-se que a separação das colônias por tamanho de diâmetro apresen-tou resultados contraditórios, pois colô-nias com tamanho semelhante comporta-vam-se diferentemente em relação à viru-lência enquanto que, os isolamentos feitos diretamente das plantas foram homogêneos em diâmetro e virulência. Verificou-se que a adição de cloreto de 2, 3, 5-trifenil tetra

-zólio ao meio-padrão de cultura possibilitou correlacionar o aspecto da colônia com a sua virulência, para os isolamentos armazenados.

Sessenta a setenta e duas horas depois do semeio da suspensão bacteriana em meio contendo cloreto de 2, 3, 5 - trifenil tetra-zólio, verificou-se a diferenciação de algumas características culturais das colônias. Foram observadas colônias de vários tamanhos e com diferentes proporções das cores branca e vermelha, a saber:

a) Tipo. "A" -colônias grandes, com centro vermelho, co.rrespo.ndente à metade do.

Vai. 8 Junhaj1983

diâmetro da colônia, e grande margem

branca. Houve predominância desse tipo.

b) Tipo "B" - colônias pequenas, gera

lmen-te com diâmetro 3 vezes inferior ao do tipo "A", quase totalmente vermelhas e com uma pequena margem branca, de até 0,5mm de largura.

c) Tipo "C" - colônias de menor diâmetro,

inteiramente brancas.

d) Tipo "D" - colônias de diâmetro variável,

entre os tipos extremos "A" e "C", apre-sentando variações também na proporção das cores branca e vermelha, desde um minúsculo ponto vermlho no centro da colônia até coloração próxima à do tipo

"B"

.

Não foram constatadas, a olho nu, al-terações na forma, no bordo e na elevação dos diversos tipos de colônias.

Segundo Kulmand e Jerchel, citados por Mattson et alo(1947), o mecanismo que ocasiona o aparecimento de colônias com variação na proporção das cores branca e vermelha está relacionado com a habilidade do sistema enzimático de determinadas bac-térias em reduzir o cloreto de 2, 3, 5 - trife-nil tetrazólio a vermelho de trifenil forma-zan. Esses resultados foram confirmados por Huddleson

&

Baltzer (1950).

Convencionou-se denominar os tipos de colônias pelo número do isolamento ori-ginal, seguido da letra que a descreve: i sola-mento UFV'()6-A (colônia tipo "A"); isola

-mento UFV-06-B (colônia tipo "B"); iso

-lamento UFV-06-C (colônia tipo "C") e isolamento UFV-06-D (colônia tipo "D").

No teste de patogenicidade, à exceção do isolamento UFV-06-B, os demais repro-duziram os sintomas típicos da doença.

Após o quinto dia da inoculação na haste, por ferimento com palito no.ponto de inserção, verificou-se início de colonízação,

expresso por anasarca no. tecido. Com oito dias, à exceção das plantas inoculadas com oisolamento. UFV-06-B, nas quais a infecção não progrediu, as demais apresentavam in

í-cio.de murcha nas folhas próximas do ponto

287

de inoculação. Com vinte dias, a infecção

ocasionada pelo isolamento UFV-06-B

per-maneceu estável, com aspecto necrótico, ao

passo que as plantas inoculadas com os demais isolamentos mostraram início de morte descendente, com murcha do

pontei-ro a exsudação de "pus bacteriano" nas has

-tes. Nos dias subseqüentes, as plantas

inocu-ladas com os isolamentos 06-A, UFV-06-C e UFV-06-D morreram, ao passo que as inoculadas com o isolamento UFV-06-B permaneceram aparentemente sadias, com cicatrização e formação de calo em torno do tecido lesionado da haste. As plantas

inoculadas com o isolamento UFV'()6-A apresentaram, durante o processo de

mur-cha, maior quantidade de exsudato bacteria-no na haste.

De acordo com o teste de patogenici-dade, empregando o método de inoculação com palito, não foram verifica das diferenças de virulência entre os isolamentos UFV-06-A, UFV.()6-C e UFV-06-D que permitissem

separ

ã

-los

,

mas estes diferiram do isolamento UFV-06-B já no quinto dia após a ino-culação.

O isolamento UFV'()6-A foi seleciona-do pelo crescimento em meio de CTT como o isolamento virulento típico de X. campestris pv. manihotis, em virtude da facilidade de caracterização em meio de cloreto 2, 3, 5 - trifenil tetrazólio, por apresentar maior quantidade em relação às demais colônias e maior reprodutividade do mesmo tipo de colônia em plaqueamen-tos sucessivos. Considerado de virulência semelhante aos isolamentos UFV.Q6-C e UFV'()6-D, foi comparado, por dois outros métodos de inoculação, com o isolamento UFV'()6-B, aparentemente de baixa viru-lência.

Cinco dias após a inoculação por

fe-rimento da folha ocorreu a formação de

anasarca em forma de halo circundando o

sítio de inoculação. O isolamento UFV-06-A originou halos com 2 mm de

288

formação de halos com 1 mm de diâmetro,

apenas visual na face inferior da folha.

Com oito dias, o isolamento UFV-06-A

originou anasarca de até quatro milímetros, visível nas duas páginas da folha, com des-coloração do tecido prxoímo, que tornou-se

amarelado. No caso do isolamento

UFV-06-B, ocorreu a formação de halos de

ana-sarca de três milímetros, somente na página

inerior, sem descoloração. Com o isolamento

UFV-06-A, aos treze dias, da região de

íno-culação do folíolo até a sua extremidade,

apresentava-se seca e com invasão sistêmica da folha, que atingia o pecíolo e a haste, in-clusive com exsudação de "pus bacteriano". Desse ponto em diante, as plantas exibiam os sintomas típicos da doença, até a morte.

Com o isolamento UFV-06-B, não houve

progresso da lesão, que se tornou necrótica,

de coloração marrom-escura, visível nas duas

páginas da folha, não havendo, portanto,

invasão sistêrnica. As plantas

permanece-ram sadias e, após a queda, das folhas

inoculadas, por senescência, desapareceram

os sinais de inoculação e as plantas

vegeta-ram normalmente e, mesmo em condições

favoráveis

à

bactéria, não foram verificados

sintomas da doença.

Somente treze dias após a inoculação

no peciolo, por ferimento, foram

observa-dos alguns observa-dos sintomas da doença, como

exsudação de "pus bacteriano" na haste

-das plantas inoculadas com o isolamento

UFV-06-A. Essa exsudação não ocorreu

com o UFV-06-B, mesmo após a morte

das plantas inoculadas com o isolamento

UFV-06-A.

°

isolamento UFV-D6-B, ao ser

ino-culado, por ferimento, na folha, produziu,

com 8 dias, sintomas iniciais semelhantes

aos ocasionados pelo isolamento

UFV-06-A. A partir desse momento, não se

ve-rificou progresso da infecção nem invasão

sistêmica; logo, não houve translocação da

bactéria, ao passo que, no caso do

isola-mento UFV-06-A, verificou-se invasão

sis-têmica e translocação para a haste,

con-FITOPATOLOGIA BRASILEIRA

seqüentemente morte da planta.

Esses resultados foram confirmados

pela inoculação no pecíolo da planta, onde

não se verificou a translocação da bactéria

do isolamento UFV-D6-B para a haste,

per-manecendo o pectolo semelhante ao da

testemunha, ao passo que, com o isolamento

UFV-06-A, foi verificada a translocação.

Os resultados obtidos com os

isola-mentos UFV-06-A e UFV-D6-B, nos quais a

coloração e o tamanho da colônia

correla-cinararn-se com a virulência, concordam com

os de Friedman (1964), Kelman (1954);

Goodman citado por Romeiro (1980); e

Smale & Worley (1956), em ensaios

seme-lhantes, com Erwinia carotovora,

Pseudo-monas solanacearum, Erwinia amy/ovora , e Pseudomonas phaseolico/a e

Xanthomo-nas phaseoli, respectivamente.

Com a inoculação do isolamento

UFV-06-B, ocorreu, inicialmente, uma

co-lonização progressiva e lenta do tecido do

hospedeiro próximo do ponto de

inocula-ção. Em seguida, verifica-se a paralisação

no progresso da infecção. Um dos

meca-nismos poderia ser a imobilização da bacté-ria pela planta num processo ativo de

reco-nhecimento celular, como já descrito para

outras interações bactéria-planta (Corey &

Starr, 1957; Goodman et al., 1974; Huang

et al., 1958; Husain & Kelman, 1958;

Romeiro, 1980; Romeiro et al., 1981;

Sequeira & Graham, 1977; Stoffl, 1976).

Por meio do método de Hiss,

obser-vou-se a presença de cápsula no

isolamen-to UFV-06-A virulento. No entanto, sua

presença não foi verificada no isolamento

UFV-06-B, de baixa virulência ou

avirulen-to. Relações entre virulência e presença de

cápsula parecem existir em algumas

intera-ções planta-bactéria (Corey

&

Starr, 1957;

Goodman et al., 1974; Huang et al., 1958;

Husain & Kelman, 1958; Romeiro, 1980;

Romeiro et al., 1981; Sequeira & Graham,

1977; Stoffl, 1976.

Os antissoros produzidos a partir

dos imunógenos provenientes dos

isola-VoZ.8

ments UFV-06-A e UFV-06-B apresentaram

os títulos de 1:4096 e 1:8192,

respecti-vamente.

Os isolamentos UFV-D6-A, UFV-06-B,

UFV-06-C e UFV-06-D foram sorologica

-Junhoj1983 289

mente relacionados, pelo teste de dupla

difusão, com os antissoros contra os

isola-mentos UFV-06-A e UFV-D6-B,

verificando-se, pois, tratar-se de isolamentos da mesma

espécie.

LITERATURA CITADA

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Vol.8 Junhoj1983 291

REAÇÕES DE SEIS CULTIVARES DE AMENDOIM (ARACHIS HYPOGAEA) A

CERCOSPORA ARACHIDICOLA E

C.

PERSONATA EM FOLHAS DESTACADAS*

SÉRGIO A.MORAESi &CLÉLIO L.SALGAD02 1Seção de Microbiologia Fitotécnica, Instituto Agronômico,

13.100, Campinas, SP (Bolsista do CNPq) e 2E.S.A. "Luiz de Queiroz", 13 .400, Piracicaba, SP.

(Aceito para publicação em 16/5/83) RESUMO

As reações de seis cultivares de amendoim foram avaliadas utilizando a técnica de folhas destacadas. Os cultivares SO.909 e SO.911 destacaram-se como altamente resistentes a

C.

per-sonata

e moderadamente resistentes a

C.

arachidicola, e os cultivares SO.908 e SO.905, como

moderadamente resistentes apenas a

C. arachidicola.

Os cultivares SO.905 e SO.908 mostraram, respectivamente, moderada e alta suscetibilidade a C.

personata.

Os cultivares Tatu e Tatuf motraram-se altamente suscetíveis aos dois fungos.

Os quatro métodos utilizados para avaliar os sintomas causados pelas duas espécies de

Cercospora

(número de lesões por folíolo, diâmetro médio das lesões, área infectada por

fo-líolo, e índice de infecção) foram importantes para expressar as reações e .mecanismos de ~e-sistência de cada cultivar. Entretanto, o índice de infecção proposto, considerando a área

ID-fectada por folíolo e a área média do folíolo, e deste modo, estimando a porcentagem do tecido foliar necrosado, expressou melhor as reações dos cultivares a estes fungos.

Os resultados obtidos, semelhantes aos relatados em experimentos conduzidos em casa-de-vegetação ou em condições de campo, comprovaram a viabilidade e eficiência da téc~c~ de folhas destacadas para testar as reações de cultivares de amendoim aos fungos

C.

arachidi-cola

e

C. personata.

* Parte da tese de doutorado do primeiro autor. Trabalho apresentado no V Congresso Paulista de