Le Transcriptome
• Introduction
• Méthodes d’analyse du transcriptome
• Puces à ADN : principe et méthodologie
• PCR en temps réel
Vérification et validation des résultats microarrays
Apport de la PCR en temps réel
Intérêt de la PCR quantitative en temps réel :
Rappel de l ’équation de la
PCR N = N
0( 1 + E )
nAvec
• N
0: la quantité initiale de cible d’ADN
• E : efficacité de la PCR (E =1 dans le meilleur des mondes)
• n : le nombre de cycles d ’amplification
PCR quantitative: permet une mesure directe de la réaction au cours de l ’amplification
Nombres de cycles
expérimental théorie
L og A D N c ib le
Effet Plateau
• Dénaturation TAQ
• PPi inhibiteur
• Compétition/
réhybridation
N = N
0( 1 + E )
nN0 N
n
1+E
Domaine de quantification en PCR classique
Nombres de cycles
Lo g A D N c ib le
Echantillon A
Echantillon B
PCR temps réel
Nombres de cycles
Lo g A D N c ib le
Echantillon A
Echantillon B
Seuil de détection (Threshold)
Ligne de base Ct A Ct B
Cuting Threshold = Ct
Amplification du même échantillon distribué dans une microplaque de 96 puits
• Quantités finales de fluorescence sont très différentes
• Entrée simultanée en phase linéaire (Ct identiques)
• Ct est corrélé au nombre de copies initiales d ’ADN cible
• Si on a 2 fois plus d’ADN initial , le Ct est inférieur d’un cycle (si E=1)
• Il existe une relation linéaire entre le log du nombre de copies initiales et le cycle seuil sur au moins 6 logs
ΔCt=8 B9 B8
Il y avait 256 fois plus de cibles dans l’échantillon B9 que dans B8 (Si E=1)
Amplification du gène de la beta-actine
(dilutions en séries avec un facteur 2)
Le Ct permet de déterminer le
nombre de copies initiales
iCycler iQ
A Quoi ça ressemble ?
Les systèmes de détection les plus courants
• Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen.
• Les sondes Taqman
Les systèmes de détection les plus courants
• Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le SyberGreen.
• Les sondes Taqman
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
5’
Taq
Taq
3’
3’ 5’
Taq
Taq
5’
5’
SB
SB SB
SB SB SB
SB SB SB
SB SB
SB
SB
SB SB
SB
SB
SB
E lo ng at io n
Mesure: à la fin de l’étape d’élongation
UV
Vérification de la spécificité des amplifiats: utilisation des courbes de fusion
Identification des produits non spécifiques:
- primers-dimers
• Pourquoi? En SB, tous les fragments d’ADN doubles brins générés, spécifiques ou non, donneront un signal
• Programmer une courbe de fusion: 1 cycle avec une augmentation lente de la température pour permettre le passage de la totalité de l ’ADNds en ADNss
• Cette température, Tm, est caractéristique de l ’ADN et renseigne sur la séquence de l ’ADN sans directement le séquencer
• Pour cela on exploite le fait que le SYBR Green fluoresce environ 250 fois plus
quand il est lié au double brin d ’ADN. Quand la température augmente, les doubles brins disparaissent et la fluorescence diminue.
Exemple de courbe de fusion
Vous pouvez suivre en direct la
diminution de la fluorescence
quand la température
augmente (Real Time!)
Vous pouvez suivre en direct la
diminution de la fluorescence
quand la température
augmente (Real Time!)
Courbes de fusion: utilisation de la dérivée (-dF/dT)
Tm
Tm2 Tm1
Deux Tm indiquent la présence d’au
moins deux
fragments d’ADN ( le + souvent Tm1=
dimères de primers)
Les systèmes de détection les plus courants
• Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen.
• Les sondes Taqman
Sonde TaqMan
Reporter
Reporter QuencherQuencher
Fluorescéine ou FAM 5 ’ TAMRA
488 nm
520 nm
570 nm
Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sont ajoutés au milieu réactionnel
• Les deux amorces permettant l’amplification (amorce directe et amorce inverse complémentaire
• Une sonde qui peut s’hybrider sur une séquence correspondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!)
La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser, et un quencher dont la longueur d’onde d’excitation correspond à la longueur d’onde d’émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sont à proximité, le
quencher absorbe la fluorescence du reporter.
488 nm
FAM
570 nm
488 nm 520 nm
TAMRA
5’ 3’
5’
Hybridation
Elongation
Mesure à la fin de l’étape d’élongation
Pendant la PCR, la sonde s’hybride sur l’ADN simple brin lors de l’étape d’hybridation des amorces
488 nm 570 nm
5’ 3’
3’ 5’
Taq: ADN polymérase 5’- 3’ et Activité
Exonucléase 5’-3’
