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63
Notre travail a pour objectif d’étudier les plantes utilisées par les tradipraticiens Rwandais pour enlever les tâches hyperpigmentées et traiter des problèmes de la peau. L’idée d’étudier ces plantes nous vient du fait qu’au Rwanda, comme dans d’autres pays et tout particulièrement en Afrique sub-saharienne, mais aussi en Asie, la pratique de la dépigmentation à visée cosmétique est répandue. Cette pratique est réservée aux personnes désireuses d’obtenir un teint de peau aussi clair et homogène que possible. Dans la plupart des sociétés, ce teint constitue apparemment un avantage social.
Cette pratique consiste à appliquer sur la peau, de façon répétée et sur une durée prolongée, des topiques dépigmentants. Néanmoins, la dépigmentation ne se limite pas seulement aux populations noires et asiatiques. En effet, elle s’applique aussi à l’élimination des taches solaires (lentigo), des taches de vieillesse et des taches de rousseurs des personnes à peau blanche. Ces produits sont encore utilisés pour le traitement de troubles dermatologiques comme, les mélasmes, etc.
Dans le cas de la dépigmentation volontaire, les pratiquants utilisent des produits agressifs qui sont normalement utilisés pour un but médical et appliqués à des petites surfaces et à faible concentration. C’est le cas des dérivés de l’hydroquinone, des corticoïdes, ou encore des sels de mercure. D’autres produits plus agressifs sont encore occasionnellement utilisés pour traiter certaines zones difficiles à éclaircir, ou pour accéder à une dépigmentation plus rapide : l’eau oxygénée, l’eau de Javel et autres détergents n’en sont que des exemples (Brenner and Hearing, 2008).
L’utilisation des ces produits est associée à beaucoup d’effets secondaires comme l’acné, les dermatophyties, les mycoses, les vergetures, l’ochronose exogène, les dermites de contact, etc. Des effets adverses systémiques sont également rapportés tels un hypercorticisme ou bien une insuffisance surrénalienne lors de sevrage brutal des corticoïdes ainsi que le développement d’une hypertension artérielle.
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Ce travail se penche donc sur l’étude de la problématique de la dépigmentation volontaire de la peau au Rwanda et la recherche de molécules pouvant être proposées comme alternatives plus sûres.
Dans ce but, notre travail se propose de :
- Inventorier, avec l’aide des tradipraticiens, les plantes utilisées à cette fin sur toute l’étendue du territoire Rwandais ;
- Evaluer les pratiques de la dépigmentation volontaire dans la ville de Kigali ; - Choisir les plantes les plus citées pour une étude ultérieure au laboratoire ;
- Etudier la modulation de la tyrosinase par les extraits totaux de ces plantes sur différents modèles biologiques ;
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3.1. Choix des plantes à étudier : enquête auprès des tradipraticiens
3.1.1. Choix de la population d’étude.
Avant de commencer l’enquête, le choix de la population d’étude posait un problème. En effet, étant donné que la dépigmentation volontaire est considérée comme un phénomène de mode, qui débute à la fin de l’adolescence ou chez l’adulte jeune (Morand et al., 2007), nous pensions choisir les jeunes comme population d’étude ; mais finalement, nous nous sommes rendue compte que ces derniers n’étaient pas le bon choix. En effet, comme le montrent les résultats d’une enquête dans le sud du Rwanda (Mukazayire et al., 2011), la médecine traditionnelle, et par là la connaissance des vertus des plantes, est souvent le fait de personnes âgées.
Notre recherche bibliographique nous a montré que la dépigmentation volontaire est plutôt pratiquée par les femmes, habitant les villes et appartenant à un niveau social élevé (M'bemba-Ndoumba, 2004; Mahé et al., 2004; Petit, 2007). En essayant de diriger notre enquête vers ces femmes, nous nous sommes rendue compte que ces dernières utilisent soit des produits vendus sur le marché, soit des plantes mais ayant des propriétés bien connues et déjà décrites par la littérature (exemple Aloe
vera L. (Gupta and Masakapalli, 2013). En tant que chercheur sur les plantes médicinales avec une
visée d’isoler de nouvelles molécules à partir de ces plantes, ce choix de population d’enquête ne nous intéressait pas non plus, de par le risque de se concentrer sur des plantes déjà étudiées.
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Lors de notre enquête, il est apparu que, devant un véritable phénomène de mode comme la dépigmentation volontaire, les tradipraticiens tentent de l’assimiler à leur quotidien. Au Rwanda, la dépigmentation volontaire est nommée « Kwitukuza », littéralement traductible comme « se rendre rouge ». Donc, pour les tradipraticiens, tout ce qui peut rendre rouge (colorant) ou faire rougir est dépigmentant. Pour orienter nos résultats, nous avons demandé aux tradipraticiens, de nous présenter les plantes qui, une fois appliquées sur une zone hyperpigmentée de la peau, comme des cicatrices, peuvent ramener cette zone à la coloration normale {la description de la méthode d’enquête utilisée se trouve dans le premier article (article 1) de la section résultats et discussion}. Les plantes de notre étude ont été choisies en fonction du pourcentage de citation par les tradipraticiens.
3.2. Enquête sur les pratiques de la dépigmentation volontaire dans la ville de
Kigali
Afin d’éclaircir la problématique liée à la dépigmentation volontaire, et devant un manque d’information quant à la prévalence de cette pratique au Rwanda, nous avons décidé de mener une enquête sur les lieux de travail des habitants de la ville de Kigali.
Notre enquête a cependant débuté chez les commerçants de cosmétiques afin d’inventorier les produits réputés dépigmentants ou ceux dont l’étiquetage mentionne des molécules à effets dépigmentants.
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révéler le but de l’enquête, a été utilisée {comme décrit dans le deuxième article (article 2) de la section résultats et discussion}.
Une fois les crèmes dépigmentantes inventoriées, nous avons élaboré notre questionnaire d’enquête pour étudier les cosmétiques utilisés et leurs critères de choix. Après, en comparant les informations, nous avons pu déduire le pourcentage des gens qui se dépigmentent en fonction des crèmes utilisées, ainsi que les raisons du choix de ces cosmétiques.
De cette partie découle un mémoire de fin d’étude en Sciences humaines et sociales que nous avons encadré et qui porte sur l’analyse sociologique des comportements des jeunes (15 à 20 ans) face à la dépigmentation volontaire.
Pour obtenir un point de vue des professionnels de santé, surtout en ce qui concerne les effets secondaires, nous avons interrogé dermatologues, médecins généralistes et infirmiers {la méthode est décrite dans le deuxième article (article 2) de la section résultats et discussion}.
3.3. Description du matériel végétal
Le matériel végétal est constitué de :
Feuilles Racines
Brillantaisia cicatricosa Lindau X
Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen X
Dolichopentas longiflora Oliv. X X
Protea madiensis Oliv. X (a)
Sesamum angolense Welw. X
(a)
69 3.3.1. Lieu de récolte des plantes et herbiers
Brillantaisia cicatricosa Lindau
Les feuilles ont été récoltées dans le jardin botanique de l’Institut de Recherche Scientifique et Technologique (IRST) : District Huye Province Sud Altitude 1650 m Coordonnées géographiques Longitude : 032°43’58.8’’ E Latitude : 02°37’12’’S
Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen
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Dolichopentas longiflora Oliv.
Les feuilles et les racines ont été récoltées dans une brousse non cultivée : District Nyaruguru Province Sud Altitude 1801 m Coordonnées géographiques Longitude : 029°39’55,8’’E Latitude : 02°39’50’’S
Protea madiensis Oliv.
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Sesamum angolense Welw.
Les feuilles ont été récoltées sur un champ en jachère. District Huye Province Sud Altitude 1757 m Coordonnées géographiques Latitude : 02°38’28’’S Longitude : 029°42’10’’E
Toutes les plantes ont été récoltées au mois de juillet 2007, et un complément en décembre 2009. Les feuilles ont été séchées dans un hangar à l’abri de la lumière et réduites en poudre mécaniquement. Les racines de Dolichopentas longiflora ont d’abord été lavées pour éliminer la terre, puis séchées de la même manière que les feuilles.
Les racines de Protea madiensis ont été lavées, épluchées avec un couteau pour enlever l’assise pilifère (couche superficielle de la peau), suivant la recette de tradipraticiens. Puis, l’écorce de la racine est détachée à l’aide du couteau et séchée de la même manière que les feuilles. Nous signalons que le bois de la racine n’est pas utilisé.
3.3.2. Identification des plantes étudiées
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N° d’herbier à NHRa N° d’herbier à NHBb
Brillantaisia cicatricosa Nkaka P. 9 BR 0000005299218
Chenopodium ugandae Kanya JP. 6 BR 0000006946173
Dolichopentas longiflora Kamagaju L. 10 BR 0000005343621
Protea madiensis Kamagaju L. 8 BR 0000005333271
Sesamum angolense Kamagaju L. 9 BR 0000005098545
aNHR : National Herbarium of Rwanda/ bNHB : National Herbarium of Belgium
3.4. Préparation des extraits pour tests biologiques et criblage phytochimique
Les poudres de feuilles (50 g) et des écorces de racines ont été épuisées par percolation successive des solvants suivants : n-hexane, chloroforme, méthanol et eau, cela pour Brillantaisia cicatricosa,
Chenopodium ugandae et Protea madiensis. Pour Dolichopentas longiflora (feuilles et racines) et Sesamum angolense, nous avons commencé l’extraction avec l’acétate d’éthyle puis méthanol et
l’eau, cela pour diminuer le nombre d’extraits. Après extraction au méthanol, nous avons constaté que les extraits de feuilles étaient trop lipidiques, et nous avons décidé de recommencer la percolation avec du n-hexane, acétate d’éthyle, méthanol et eau, uniquement pour les feuilles. Cela nous a permis d’obtenir, pour les feuilles de Dolichopentas longiflora et Sesamum angolense, deux types d’extraits acétate d’éthyle et méthanol (I, II). Le extrait obtenu a été séché dans un évaporateur rotatif sous pression réduite à 40°C, puis évaporé à sec sous Speed Vac. L’extraction nous a donné au total 27 extraits dont les rendements sont présentés dans le troisième article (article 3).
74 Deuxième procédé d’extraction
Figure 23 : Schéma des deux procédés d’extraction pour Dolichopentas longiflora et Sesamum
75 Criblage phytochimique :
Le criblage phytochimique préliminaire a été réalisé en chromatographie sur couche mince, et par des réactions chimiques en solution. Les principaux réactifs utilisés pour mettre en évidence la présence des métabolites secondaires sont décrits dans le troisième article (article 3).
3.5. Tests biologiques
Les 27 extraits obtenus ont été soumis aux tests d’activité in vitro. En effet, l’un des objectifs
principaux de notre travail vise à étudier la modulation de la tyrosinase par les extraits totaux de nos 5 plantes et ce, sur différents modèles biologiques. Les différents tests effectués sont :
L’étude de la cytotoxicité des 27 extraits envers deux lignées de mélanome humain a été menée dans le but de connaître la concentration non toxique de nos extraits de plantes afin de pouvoir les appliquer sans risque sur les cellules.
Les extraits ont été testés aux concentrations n’ayant pas montré de cytotoxicité sur les cellules afin d’en mesurer l’effet sur la pigmentation.
Les différents extraits de plantes ont été testés sur des extraits totaux de mélanocytes humains afin d’en mesurer l’effet sur la tyrosinase humaine.
L’effet des 27 extraits de plantes a été mesuré sur la tyrosinase de champignon en solution et sur Chromato plaque
L’effet des 27 extraits sur l’activité de la tyrosine hydroxylase a été testé par la méthode de Pomerantz.
3.5.1. Culture cellulaire
Elle se fait dans des boîtes de culture de 75 et 175 cm2 ou dans des plaques 96 puits à fond plat (Nunc). Les cellules sont maintenues à 37 °C dans un incubateur (Hera cell 150) sous une atmosphère de 5 % en CO2 et 100 % d’humidité. Les manipulations en conditions stériles sont
76
Trypsine-EDTA, GIBCO). L’ajout de milieu frais neutralise les traces de trypsine ; les cellules peuvent être utilisées ou remises en culture.
Le renouvellement du milieu est essentiel pour les cellules afin d’assurer l’approvisionnement en éléments vitaux et l’élimination des déchets toxiques produits par les cellules.
3.5.2. Milieu de culture
Le milieu de culture utilisé est le HAM’S F10 (GIBCO, Life Technologie) auquel est ajouté du sérum de veau fœtal 5 %, du sérum de veau nouveau-né (5 %), un mélange d’antibiotiques (streptomycine, pénicilline G, sulfate de kanamycine) (1 %) et de la L-Glutamine.
Pour les mélanocytes normaux de la peau, le même milieu est utilisé mais il contient en plus : - HEPES 6 mM (SIGMA) ;
- Choléra-toxine 1 nM (SIGMA) ;
- BPE (Bovine Pituitary Extract 40 μg/mL (SIGMA); - Phorbol 12-myristate 13-acétate 30 nM (SIGMA) ; - Isobutyl-méthyl-xanthine 50 μM (SIGMA) ; - Phosphoéthanolamine 100 μM (SIGMA) ; - Hydrocortisone 0.5 μM (SIGMA) ;
- Ethanolamine 100 μM (SIGMA).
3.5.3. Lignées cellulaires
Les cellules utilisées pour obtenir les extraits cellulaires sont des mélanocytes humains normaux (LOCE-NM034) ; la concentration en tyrosinase est en effet plus élevée dans les mélanocytes normaux que dans les mélanocytes malins. Les autres lignées cellulaires utilisées sont des mélanocytes humains malins (MM001, MM018).
77 3.5.4. Comptage cellulaire
Comptage automatique : les cellules sont décollées et 10 µl de la suspension cellulaire sont mélangés à 10 µl de solution de Bleu Trypan. Puis, 10 µl sont prélevés du mélange et déposés sur une cellule de comptage. Le comptage se fait par un compteur automatique « TC10 TM automated cell counter » (Bio-Rad).
Comptage sur lame : 30 µl de la suspension cellulaire sont déposés sur une cellule de Neubauer surmontée d’une lamelle. Le nombre de cellules vivantes, c'est-à-dire de cellules excluant le colorant, est ensuite compté sur les quatre zones de seize carrés et la moyenne M des quatre valeurs exprime le nombre de cellules pour 0,1 μl de suspension. Le nombre de cellules par ml de la suspension cellulaire initiale de volume V est donc égal à M x 104 cellules/ml.
3.5.5. Solubilisation des extraits de plantes pour tests biologiques.
Pour que nos extraits de plantes soient utilisables sur les cellules, il a été nécessaire de trouver un solvant de dissolution compatible avec la survie cellulaire et la limite d’utilisation de ce solvant sur les cellules. Les solvants compatibles sont : DMSO max 1%; Isopropanol 0,5 % et l’éthanol 0,1 %.
a. Méthode :
Les essais de solubilisation ont été réalisés par approches successives :
Peser exactement/environ 2,5 mg de la poudre, ou de la pâte suivant la consistance de l’extrait, dans un tube en verre.
Ajouter 100 µl du solvant et noter le comportement du produit :
l’extrait est considéré comme soluble lorsque, en présence du solvant, l’extrait donne une solution limpide ;
la solubilisation est dite trouble, lorsque la solution obtenue n’est pas limpide ;
78
l’extrait est considéré comme insoluble quand, en présence du solvant, celui-ci reste incolore c’est à dire sans traces visibles d’extrait en solution ; l’extrait reste visiblement intact.
Une fois l’extrait solubilisé, l’étape suivante est de vérifier la concentration convenable pour qu’en ajoutant le milieu de culture, l’extrait ne précipite pas.
3.5.6. Mesure de la survie cellulaire et de la Cytotoxicité
3.5.6.1. Principe
L’essai MTT a été utilisé, il se base sur l’évaluation de l’activité enzymatique mitochondriale et donc la respiration cellulaire. Les cellules actives sur le plan métabolique réduisent un dérivé de tétrazolium, en l’occurence le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, en abbréviation MTT, en bleu de formazan insoluble dans l'eau et donc présent sous forme de cristaux (Figure 24). Ceux-ci sont ensuite dissous dans le DMSO, donnant une solution dont l’intensité de coloration bleu-violet est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes (Arnould et al., 1990).
MTT Formazan
-79 3.5.6.2. Protocole
Au jour J-1, les cellules sont décollées de leur boîte de culture avec une solution de trypsine (0,05% Trypsine-EDTA, GIBCO), reprises dans du milieu de culture et comptées. La densité cellulaire est ajustée à 15000 cellules par 100µl de milieu de culture et par puits d’une plaque de 96 puits). Les cellules sont ensuite incubées pendant 24 h à 37°C, pour que les cellules adhèrent. Au jour J, 100 μl de chaque effecteur (extrait de plante) sont ajoutés à différentes dilutions (n=12). La plaque est remise à incuber pendant 48h. Au jour J+2, la plaque est centrifugée 5 min à 500 g, le surnageant est enlevé et 100 μl de 3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) à 1 mg/ml dans du PBS sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est incubée pendant 3h à 37°C, puis centrifugée de nouveau 5 min à 500 g. Le surnageant est enlevé et remplacé par 100 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO). Enfin, l’absorbance de chaque puits est mesurée à 515 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (Multiskan Ex., USA). La figure 25 schématise la manipulation.
Figure 25 : Schéma suivi pour l’étude de la survie cellulaire/ cytotoxicité.
3.5.7. Inhibition de la tyrosinase humaine contenue dans des extraits mélanocytaires
3.5.7.1. Préparation des solutions et des extraits cellulaires
a. Solution L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine. Sigma D9628-5g) 10 mM
Dissoudre 100 mg de L-DOPA dans 50 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 6,8, conserver à -20°C.
b. Solution de lyse cellulaire
80
c. Solution de L-Tyrosine
Dissoudre 90,8 mg de L-Tyrosine dans 20 ml de NaOH 0,05 M. Soit 2,5x10-2 M à conserver à -20°C.
d. Préparation de la solution L-DOPA/L-Tyrosine
Pour une plaque, à raison d’un volume de 100 µl/puit, soit 12 ml au total, ajouter successivement : - 4,8 ml de L-DOPA 10 mM
- 1 ml de tampon Tris-HCl, pH 6,8, 25 mM - 5850 µl H2O
- 350 µl de L-Tyrosine 2,5x10-2 M
e. Préparation des extraits cellulaires
Les cellules sont décollées avec une solution de trypsine, puis lavées deux fois dans du PBS (Centrifuger à 500 g pendant 10 minutes). Entre chaque centrifugation, remettre les cellules en suspension dans un volume de 5 ml de PBS. Après comptage, la densité cellulaire est ajustée pour un volume de 50 ml répartis dans 5 tubes de 10 ml chacun. Après deux centrifugations successives à 2000 g afin de laver et isoler les culots cellulaires, la solution de lyse est ajoutée comme suit : ajouter 900 µl de solution de lyse, mélanger vigoureusement. Passer plusieurs fois au travers d’une aiguille de 0,6 mm. Centrifuger à 12000 g pendant 10 min, rassembler les surnageants prélever 3 x 100 µl pour le dosage des protéines, puis congeler.
3.5.7.2. Dosage colorimétrique des protéines des extraits cellulaires
Ce dosage est réalisé dans le but de normaliser la concentration en protéines pour l’évaluation de l’activité tyrosinase. Les extraits cellulaires sont dosés à 3 dilutions différentes (annexe 6: protocole).
Principe:
Le dosage se base sur la méthode de Bradford qui utilise le bleu de Coomassie pour ses propriétés de liaison aux protéines (liaisons van der Waals et électrostatiques) lequel provoque un changement de couleur du réactif (Bradford, 1976)
81
l’albumine sérique bovine (BSA) est utilisée comme standard et ainsi la concentration en protéines est exprimée en « équivalent BSA ». La méthode est validée par le fabriquant (Bio Rad) pour doser les protéines d’extraits cellulaires à condition de suivre le protocole fourni.
3.5.7.3. Mesure de l’activité tyrosinase
Comme décrit dans notre troisième article (article 3), une cinétique enzymatique est réalisée dans une plaque 96 puits. 100 μl de solution L-DOPA/L-tyrosine, 100 μl d’effecteurs (extraits à tester à différentes concentrations ou contrôle) et 70 μl d’extrait cellulaire (80 μg de protéines totales) sont ajoutés à chaque puit. La cinétique enzymatique est suivie après l’ajout du mélange-substrat L-DOPA/L-tyrosine et une première mesure est réalisée (t=0) à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (Multiskan Ex., USA). Ensuite les mesures sont effectuées toutes les 15 min sur une durée de 3 heures, période durant laquelle l'augmentation de l'absorbance suit une fonction linéaire en fonction du temps. Le % d'inhibition est la moyenne des rapports de différences entre l'actif et le contrôle (Kim et al., 2008).
3.6. Inhibition de l’activité de la tyrosinase de champignon sur chromatoplaque
couche mince.
82 3.6.1. Avant séparation chromatographique
- Déposer 5 µl de l’échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince (CCM gel de silice 60 F254) à l’aide d’un tube capillaire de 10 µl ;
- Laisser la goutte sécher pendant 5 min à température ambiante ;
- Pulvériser la solution enzymatique sur la surface entière de la plaque (0,5 ml/cm2) ; - Pulvériser la solution de L-DOPA/ L-tyrosine sur la même zone (0,5 ml/cm2) ;
- Laisser la plaque à l’abri de la lumière, prendre une photo toutes les 5 minutes, pendant 20 minutes.
3.6.2. Après séparation chromatographique
83
3.7. Inhibition de la tyrosinase de champignon en solution
Comme décrit dans le troisième article (article 3), nous avons testé l’inhibition de la tyrosinase de champignon, dans une plaque multipuits en utilisant la méthode décrite par Tomita et al., 1990 avec quelques modifications. Cette méthode nous a permis de visualiser l’effet des différents extraits de plantes sur l’activité de la tyrosinase de champignon à 9 concentrations différentes.
3.7.1. Protocole
Plaque de dilution
Dispenser dans une plaque multipuits :
84
Transvaser 100 µl de rangée en rangée à partir de la rangée 2, en passant les rangées 5 et 9 qui vont servir de contrôle et la rangée 1 sert de blanc. Rejeter les derniers 100 µl (< rangée 12).
Plaque de lecture
Transvaser 80 µl de chaque puits de la plaque de dilution vers la plaque de lecture. Ajouter rapidement à chaque puits des rangées 2 à 12 :90 µl de tyrosinase de champignon 45 U/ml. Complèter le volume (250 µl) de la rangée 1 avec du tampon. 80 µl du mélange L-dopa/L-tyrosine seront dispensés par l’automate du lecteur. La mesure est réalisée à 475 nm toutes les deux minutes pendant 30 minutes dans un lecteur de plaque à 37°.
3.8. Inhibition de l’activité tyrosine hydroxylase: Méthode de Pomerantz
La méthode a été décrite dans le troisième article (article 3).
3.8.1. Principe
85
Figure 26 : hydroxylation/oxydation de la tyrosine tritiée en dopaquinone et libération d’une molécule d’eau tritiée, témoin de la réaction, pour chaque molécule de substrat radioactif transformé.
3.8.2. Réactifs utilisés
Pour cette méthode, les réactifs suivants ont été utilisés : Tampon Phosphate 10 mM pH 6,8
Acide trichloracétique 1% L-tyrosine 1,5 mM
Tyrosine tritiée (activité spécifique 42,6 Ci/mmol) L-DOPA 0,3 mM
BSA 0,1 mg/ml dans du tampon phosphate pH 6,8
86 3.8.2. Protocole
A 30 µl d’extrait cellulaire ou de tyrosinase de champignon (15 U/ml : concentration finale), ajouter 10 µl de l’extrait de plantes (à la plus forte concentration puis à différentes concentrations pour les extraits qui se sont montrés actifs). Incuber le tout pendant une heure à 37°C. Après incubation, ajouter 10 µl du mélange de L-tyrosine 0,25 mM (concentration finale) et 1 µl de Tyrosine tritiée (activité spécifique 42,6 Ci/mmol). Puis, ajouter 10 µl de la solution contenant de l’albumine sérique bovine (0,1 mg/ml) et 0,05 mM L-dopa. Incuber encore une fois le mélange à 37°C.
Ajouter après incubation 450 µl du mélange de Norit A ®, Celite 545® et acide trichloracétique. Les tubes sont centrifugés pendant 30 minutes à 13000 x g. Les essais ont été effectués en triple dans des tubes eppendorf.
87
3.9. Fractionnement chromatographique bioguidé
3.9.1. Solvants et réactifs
Tableau 8 : solvants et réactifs utilisés pour la chromatographie
Produits Type Firme
Solvants (redistillés avant utilisation)
n-hexane, chloroforme, dichlorométhane, méthanol, acétate d’éthyle,
Merck
Chromatographie sur couche mince (plaques de silice)
CCM analytique (10 x 20 cm) : gel de silice 60F254
Merck
Chromatographie sur couche mince préparative
(plaques de 20 x 20 cm préparés au laboratoire)
un mélange 1/1 de gels de silice 60 F 254 et 60 PF 254 dans l’eau est coulé sur des plaques de verre ; l’épaisseur de la couche étant de 0,5 mm.
Merck
Chromatographie sur colonne ouverte
colonne en verre (diamètre : 10 cm), gel de silice 40-63 μm
Merck
Chromatographie Flash appareil Intelliflash 280;
88 1.1.1. 3.9.2. Méthodes chromatographiques
3.9.2.1. La Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
Cette méthode nous a permis de choisir, au fur et à mesure des fractionnements, les différents mélanges de solvants qui donnent une bonne séparation. Au cours des séparations en colonne ouverte flash-chromatographie, cette méthode nous a permis de réunir les conditions nécessaires (composition, effet sur la tyrosinase) pour mélanger les différentes fractions issues du fractionnement. Nous avons utilisé cette méthode au cours de la purification pour nous assurer de la pureté du produit isolé et au cours de l’identification pour comparer la molécule isolée à un produit commercial.
3.9.2.2. La flash-chromatographie
Il s’agit d’une technique rapide de séparation d’extraits naturels. La colonne est pré-remplie de gel de silice dans des cartouches en polyéthylène (SuperFlash 15 - 12 g, Interchim, Montluçon, France), injection solide et la pression maximale est de 13,8 bar.
La silice est d’une granulométrie plus petite et de distribution plus étroite par rapport à celle utilisée pour la chromatographie sur colonne ouverte (50 μm contre 63 à 200 μm). L’échantillon est au préalable adsorbé sur de la silice puis conditionné dans une cartouche d’injection. Dans notre cas, le gradient d’élution a été défini par l’appareil lui-même en entrant la valeur des rapports frontaux des spots actifs et des impuretés obtenus après migration de plaques CCM avec deux systèmes d’élutions différents.
89
3.9.2.3. La chromatographie sur couche mince préparative
La dernière étape de la purification a consisté en une CCM préparative. La sous-fraction active est déposée sur la plaque préparative à l’aide d’un déposeur semi-automatique (Linomat 5, CAMAG) contrôlé par ordinateur à l’aide du logiciel WinCats. Grâce à cet appareil, les dépôts sont effectués par vaporisation, un courant d’azote entraîne l’échantillon pour un dépôt propre et sans diffusion sur la plaque. Les plaques de CCM préparatives ont été au préalable lavées par élution dans du MeOH et réactivées dans une étuve à 110°C afin d’éviter toute contamination.
Ensuite, la plaque est placée dans la cuve préalablement saturée avec le mélange de solvants. Une fois l’élution réalisée, un côté de la plaque est coupé afin d’effectuer la révélation pour pouvoir visualiser la bande correspondant à la molécule d’intérêt. Celle-ci est alors grattée à l’aide d’une spatule afin de décoller la silice qui sera par la suite transférée dans une petite colonne de silice afin d’éluer le composé par un solvant polaire.
3.9.2.4. Fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle de Protea madiensis Oliv.
Dans le but d’isoler des molécules actives, un fractionnement chromatographique guidé par l’inhibition de la tyrosinase de champignon sur plaque CCM a été entrepris pour l’extrait à l’acétate d’éthyle des écorces de racines de Protea madiensis. En effet, les différentes méthodes utilisées pour étudier la modulation de la tyrosinase par 27 extraits de plantes ont montré que, parmi nos extraits, il y a des extraits inhibiteurs de la tyrosinase, activateurs de la tyrosinase et des extraits non actifs. Ces méthodes diffèrent par leurs procédures (en solution ou sur plaque CCM), par le type de tyrosinase utilisée (champignon ou humaine) ; les résultats obtenus peuvent varier en fonction de la méthode.
90
A partir de 4.110 kg de poudre d’écorces de racines, nous avons réalisé une percolation par 10 litres de n-hexane dont le rendement est de 0.2 %. Après séchage de la poudre, l’extraction par 13 litres d’acétate d’éthyle donne un rendement d’extraction de 1 %.
Sur les différents tests d’inhibition de la tyrosinase, l’extrait à l’acétate d’éthyle de Protea madiensis s’est montré actif et nous l’avons soumis au fractionnement guidé par l’inhibition de la tyrosinase de champignon sur CCM.
Comme décrit sur la Figure 30, le fractionnement a été mené sur des portions de 6.5 g de l’extrait total, sur une colonne ouverte de chromatographie d’adsorption sur silice (colonne en verre de 10 cm de diamètre, remplie avec 315 g de silice 40-63 μm Merck). L’extrait brut a été au préalable adsorbé sur 5 g de silice et transféré sur la colonne. Le tout a ensuite été recouvert d’une couche (5 mm) de sable de mer (E. Merck) pour amortir les chocs lors des ajouts de solvants.
Les conditions d’élution ont été déterminées en phase normale à partir de chromatographie sur couche mince (CCM). Le système d’élution consiste en un gradient à polarité croissante (Tableau 9). L’éluant est recueilli par volumes de 100 ml dans des erlenmeyers puis évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif (40°C). Les fractions de toutes les colonnes sont analysées par CCM (plaques réalisées en duplicat) en phase normale avec un système d’élution dichlorométhane/méthanol à gradient croissant. La première plaque de silice est observée sous lampe UV à des longueurs d’onde de 254 nm et 365 nm puis pulvérisée avec un mélange vanilline-acide sulfurique et chauffée pendant dix minutes dans une étuve à 110°C. La deuxième plaque est révélée par la tyrosinase de champignon puis un mélange tyrosine et L-dopa pour tester l’inhibition de la tyrosinase.
Ces deux plaques nous ont permis de rassembler nos différentes fractions suivant les ressemblances. La première colonne nous a permis de constater que les composants inhibiteurs de la tyrosinase de champignon, étaient recueillis jusqu’à la fraction 34. Cela a fait que les 5 colonnes suivantes ont été faites dans les mêmes conditions que la première en s’arrêtant à chaque fois à la fraction 34 avec un gradient dichlorométhane 40% et méthanol 60%.
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Toutes les fractions issues de six colonnes chromatographiques sont regroupées en 16 fractions (PM I, PM II, ……PM XVI) (Figure1 article 4) en fonction du profil chromatographique et de l’activité obtenue, puis évaporées à sec.
Après fractionnement sur colonne ouverte, la seconde étape d’isolement et de purification est menée grâce à la flash-chromatographie (CombiFlash RF). En effet comme décrit dans le quatrième article (Figure1 article 4), deux fractions PM II (175 mg) et PM IV (307 mg) ayant montré une forte inhibition de la tyrosinase de champignon (Figure 27, 28), seront fractionnées par flash-chromatographie jusqu’à l’isolement de composés purs.
Figure 27 : Profil chromatographique sur couche mince de la fraction PM II et de l’extrait brut acétate d’éthyle de Protea madiensis (EB) ; phase mobile CH2Cl2 : MeOH (99 : 1) ; dépôt 10 μg;
détection sous UV à 254 nm (A), à 365 nm (B), visualisation de l’inhibition de l’activité de la tyrosinase de champignon (C) et par le mélange vanilline – acide sulfurique (D). Remarquons l’absence d’extinction de fluorescence (pas de composés aromatiques), de trace d’activité inhibitrice de tyrosinase dans l’extrait brut au même rapport frontal que le dépôt PM II montrant ainsi la faible proportion de la molécule active dans l’extrait brut. Le cadre rouge montre la zone de migration de la molécule d’intérêt.
A B C D
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Figure 28 : Profil chromatographique sur couche mince de la fraction PM IV et de l’extrait brut acétate d’éthyle de Protea madiensis (EB) ; phase mobile CH2Cl2 : MeOH (95 :5) ; dépôt 10 μg ;
détection sous UV à 254 nm (a), à 365 nm (b), visualisation de l’inhibition de l’activité de la tyrosinase de champignon (c) et par le mélange vanilline – acide sulfurique (d). Remarquons l’absence d’extinction de fluorescence (pas de composés aromatiques), de trace d’activité inhibitrice de tyrosinase dans l’extrait brut au même rapport frontal que le dépôt PM IV montrant ainsi la présence en proportion un peu plus élevé que dans le cas précédent (Figure 27) de la molécule active dans l’extrait. Le cadre rouge montre la zone de migration de la molécule d’intérêt.
a b c d
EB PM IV
PM IV EB
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Tableau 9 : Gradient de solvants utilisé lors du fractionnement bioguidé sur colonne ouverte de silice.
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3.9.2.5. Isolement et identification de molécule pigmentante à partir de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense Welw.
Ce fractionnement est mené dans le but d’isoler des molécules actives pigmentantes de l’extrait à l’acétate d’éthyle des feuilles de Sesamum angolense. Le fractionnement est guidé par un test d’inhibition/activation de la tyrosinase de champignon sur plaque CCM. En effet, cet extrait a montré, par la méthode de Pomerantz (mesure de la fonction tyrosine hydroxylase) une activation de l’activité de la tyrosinase de champignon (170 % par rapport au contrôle). Cette activité a été aussi retrouvée sur plaque CCM après élution. Curieusement, le profil chromatographique de cet extrait (acétate d’éthyle de Sesamum angolense) montre à la fois des zones d’inhibition et des zones d’activation de la tyrosinase. La méthode de Pomerantz montre que l’activité tyrosine hydroxylase est prépondérante dans cet extrait. A partir de cela, nous avons donc décidé de fractionner cet extrait afin d’isoler la ou les molécule(s) pigmentante(s).
La poudre des feuilles (1.5 kg) a été dégraissée dans un percolateur avec 3 litres de n-hexane. La poudre dégraissée a été extraite à l’acétate d’éthyle jusqu'à épuisement, le rendement d’extraction étant de 4 %.
Plusieurs analyses par chromatographie sur couche mince ont permis de dégager une phase mobile pour la flash-chromatographie (n-hexane/acétate d’éthyle). Une partie de l’extrait à l’acétate d’éthyle (1.5 g) de Sesamum angolense a été fractionnée par flash chromatographie sur une colonne pré-remplie de gel de silice (SuperFlash, 15-12 g) en deux fois dans du n-hexane avec un gradient de 0 à 100 % d’acétate d’éthyle. Les fractions obtenues ont été analysées par CCM en duplicat, avec à chaque fois une plaque pour la révélation par le mélange vanilline - acide sulfurique, ce qui permet de connaître la composition de la fraction, et une autre plaque pour la réaction enzymatique, cette plaque permettant de localiser les activateurs de la tyrosinase. Suite à ces deux informations, les fractions issues de deux flashs ont été mélangées et nous avons obtenu à la fin 13 fractions.
95 3.9.3. Méthodes analytiques
3.9.3.1. Analyses par spectrométrie de masse
Les molécules isolées ont été dissoutes soit dans du chloroforme (2-tridécanone, acide oléique, β-sitostérol) ou du méthanol (acide ursolique) pour une concentration de 1 mg/ml. Ces solutions ont ensuite été diluées 10 fois par un mélange méthanol/ acide formique (0.1 %) (50-50). Pour les produits dissous dans du chloroforme, la dilution s’est fait uniquement avec le méthanol car l’ajout de l’acide provoquerait une formation de deux phases.
Les spectres de masse ont été obtenus via le spectromètre à haute résolution / masse exacte de la plateforme Analytique (Faculté de Pharmacie : ULB). C’est un Quadrupole temps‐de‐vol, QTOF en anglais, QTOF 6520 series, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) couplé à une source d’ionisation de type électro‐spray (ESI) en mode positif pour la 2-tridécanone, l’acide oléique et l’acide ursolique ; puis de type APCI pour le β-sitostérol.
3.9.3.2. Analyses par Résonance Magnétique Nucléaire
Les échantillons ont été séchés et dissous dans un solvant deutéré, le CDCl3 (chloroforme deutéré)
pour la 2-tridécanone, l’acide oléique, et le β-sitostérol. La molécule isolée de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense (acide ursolique), a été dissoute dans CD3OD (méthanol deutéré). Les
spectres RMN 1H, 13C et DEPT135 ont été obtenus à l’aide d’un appareil RMN
