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Effet de l’apport d’azote minéral avant le débourrement sur la qualité de la jeune pousse foliaire chez le scion de peuplier (Populus tremula x alba) : estimation des flux d’azote issus de la remobilisation et de l’absorption par
un marquage 15N en conditions contrôlées
Sylvain Vrignon-Brenas
To cite this version:
Sylvain Vrignon-Brenas. Effet de l’apport d’azote minéral avant le débourrement sur la qualité de la jeune pousse foliaire chez le scion de peuplier (Populus tremula x alba) : estimation des flux d’azote issus de la remobilisation et de l’absorption par un marquage 15N en conditions contrôlées. 2012, 67 p. �hal-01267876�
MASTER II Biologie et Environnement
SPECIALITÉ : Génomique, Ecophysiologie et productions végétales RAPPORT DE STAGE PRESENTE PAR:
Sylvain Vrignon-Brenas
SUJET
Effet de l’apport d’azote minéral avant le débourrement sur la qualité de la jeune pousse foliaire chez le scion de peuplier (Populus tremula x alba) : estimation des flux d’azote issus de
la remobilisation et de l’absorption par un marquage
15N en conditions contrôlées
Responsables de stage :
Monsieur Philippe Malagoli, Maître de Conférences, UBP Monsieur François Beaujard, Chargé de recherches, INRA
Unité Mixte de Recherche 547 Physique et Physiologie Intégrative de l'Arbre Fruitier et Forestier
INRA Site de Crouël Rue de Beaulieu
63100 Clermont-Ferrand Tel : 04 73 62 43 73
Juin 2012
Résumé
La variation de la disponibilité en azote dans les sols au débourrement pourrait, dans le cas de l’arbre, avoir un impact plus important que prévu sur sa manière de gérer ses propres réserves carbonées et azotées et à terme, sur sa survie. L’objectif de cette expérimentation est de quantifier l’effet d’un apport précoce d’azote dans la solution nutritive avant le débourrement sur la qualité de la jeune pousse foliaire en lien avec les flux d’azote issus de l’absorption et de la remobilisation. Le protocole a consisté à cultiver des plants de peuplier en conditions contrôlées ayant reçu ou non de K15NO3 avant le débourrement dans une solution recyclée depuis la sortie de l’hiver jusqu’à l’étalement des limbes. Il ressort que l’apport d’azote précoce avant le débourrement n’a aucun effet sur le profil de débourrement et sur la croissance de l’arbre au cours de l’expérimentation. En revanche, l’apport d’azote augmente de façon importante la surface et la teneur en azote foliaires des jeunes pousses. De plus, l’utilisation du marqueur montre (i) que la moitié de l’azote absorbé avant le débourrement se retrouve dans la jeune pousse, (ii) l’écorce et les racines participent principalement au remplissage en azote de la jeune pousse.
Mots-clés : Populus tremula x alba, débourrement, 15N, fertilisation azotée
Abstract
Variations of soil nitrogen availability during bud burst may have a larger effect than expected on carbon and nitrogen management within tree, ultimately tree surviving. This experiment aims at investigating effect of early N application (before bud bursting) in nutrient solution on leaflet characteristics in line with flows of nitrogen derived from uptake and remobilization. Protocol is based upon 1 year-old poplar plants growing from dormancy to leaflet appearance under controlled conditions in a recycled nutrient solution receiving or not K15NO3 before bud bursting. Early nitrogen application has no effect on tree development and growth during the experiment. By contrast, applying N early leads to a steep increase of leaf area and N content in leaflets. Moreover, use of stable isotope 15N showed that (i) half of nitrogen taken up before bud burst was allocated toward leaflets and (ii) bark and roots massively participate to nitrogen filling in leaflets.
Keywords : Populus tremula x alba, bud bursting, 15N, nitrogen fertilization
REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, je souhaite remercier Monsieur le Professeur Jean-Louis Julien, responsable du M2R GEPV pour m’avoir permis de suivre cette formation et de m’avoir accueilli au sein du PIAF.
Je souhaite également exprimer mes remerciements les plus chaleureux à :
- Monsieur Philippe Malagoli et Monsieur François Beaujard, maîtres de mon stage de M2R, qui m’ont apporté avec beaucoup de gentillesse, de disponibilité et de patience.
Mais également pour leur aide, leurs connaissances et de leurs conseils avisés,
- toutes les personnes du laboratoire pour l’accueil chaleureux qu’elles m’ont réservé et l’aide matérielle qu’elles m’ont consentie. Un grand merci à Marc Vandame et Brigitte Saint-Joanis pour qui les montages et démontages de chromatographie ioniques n’ont plus de secrets.
-un autre grand merci à Suraphon Thitithanakul, toujours sympathique et de bonne humeur, pour qui la culture du peuplier en solution recyclée n’a plus aucun secret et qui a su me faire partager ces connaissances acquises pendant sa thèse.
-un dernier remerciement à Sandrine qui m’a soutenu et surtout est parvenu à me supporter pendant l’élaboration de ce rapport.
Abréviations
AMT AMmonium Transport ARG Arginine
ASN Asparagine
BSP Bark Storage Protein
CHATS Constitutive High Affinity Transport System DIN Dissolved Inorganic N
DON Dissolved Organic N GLN Glutamine
GOGAT Glutamate synthase GS Glutamine Synthétase
HATS High Affinity Transport System
IHATS Inductile High Affinity Transport System LATS Low Affinity Transport System
MS Matière Sèche NiR Nitrite Reductase NR Nitrate Reductase NRT Nitrate Transporter
NSC Non Structural Carbohydrate
NSNC Non Structural Nitrogenous Compounds SOM Soluble Organic Matter
VSP Vegetative Storage Protein SLA Specific Leaf Area (cm²/g)
SOMMAIRE
I. Introduction ... 1
II. bibliographie... 2
A. Absorption racinaire de l’azote chez l’arbre ... 2
B. Cycle de l’azote dans l’arbre ... 4
1. Flux d’azote in planta en lien avec le cycle de développement de l’arbre ... 4
2. Formes de stockage et de transport de l’azote... 7
C. Le débourrement : à l’interface entre absorption et recyclage ... 9
D. Problématique... 10
III. Matériel et méthodes ... 10
A. Caractérisation du système de culture ... 10
1. Préparation des arbres ... 10
2. Caractérisation initiale des arbres et sélection de lots homogènes... 11
3. Dispositif expérimental ... 12
B. Mesure de l’absorption minérale par disparition dans la solution nutritive ... 12
C. Profil de débourrement ... 13
D. Récoltes et mesure de la croissance... 14
1. Tige... 14
2. Racines ... 14
3. Feuilles ... 15
E. Statistiques ... 15
1. Architecture / azote ... 15
2. Profil de débourrement... 15
IV. Résultats ... 16
A. Profil de débourrement et croissance des scions de peuplier ... 16
1. Profil de débourrement... 16
2. Croissance, allocation de la matière sèche in planta et surface foliaire... 16
B. Humidité pondérale ... 17
C. Cinétique de l’absorption du nitrate par mesure de disparition dans la solution nutritive ... 18
D. Statut azoté ... 19
1. A la sortie d’hiver... 19
2. Evolution du statut azoté au cours de l’expérimentation ... 19
E. Allocation du 15N in planta... 21
V. Discussion et perspectives... 22
A. Effet de l’apport d’azote avant le débourrement sur le développement et la croissance 22 B. Effet de l’apport d’azote sur le recyclage de l’azote ... 23
C. Perspectives ... 25
1. Vers une amélioration méthodologique de l’estimation des flux N... 25
2. Au-delà de la quantification des flux… ... 25
Figure 1 : Principales étapes du cycle de l’azote dans un écosystème forestier ouvert (A) ou fermé (B) (Rennenberg et al., 2009).
Introduction
1
I. INTRODUCTION
Beaucoup d’écosystèmes forestiers se sont développés sur des sols caractérisés par une disponibilité limitée en nutriments, notamment en macro-éléments (dont l’azote) (Rennenberg et al., 1998). Contrairement au carbone, l’azote est un élément limitant pour le développement, la croissance et, à terme, la survie de l’arbre. Or, à l’échelle de l’écosystème (Figure 1), il s’avère que la dynamique de cet élément est caractérisée par (i) des faibles niveaux d’intrants et (ii) un recyclage important reposant sur la dépolymérisation et la minéralisation de la litière (Schimel et Bennett, 2004). Dans le cas des arbres fruitiers, une offre trop réduite ou trop importante d’éléments fertilisants, dont l’azote, peut avoir des conséquences négatives durables (stimulation de l’alternance, mauvaise qualité des fruits, perte des éléments fertilisants par lessivage). A l’échelle de l’arbre, les quantités d’azote prélevées sont déterminées par (i) les quantités disponibles dans le sol (résultantes de la compétition de l’arbre avec les microorganismes du sol et les autres espèces de sous-bois), (ii) la nature des composés azotés (minérale et organique) (Schimel et Bennett, 2004) et (iii) les capacités intrinsèques de l’arbre à absorber l’azote (taille du système racinaire, système de transport et symbiose mycorrhyzienne) (Fotelli et al., 2002, 2005). Par ailleurs, les changements climatiques annoncés (hausse de la température, fréquence accrue des périodes de sécheresse et d’inondations) (IPCC, 2007) et les activités humaines (dépôts atmosphériques d’azote) vont impacter directement ou indirectement sur le prélèvement de l’azote du sol par l’arbre (Rennenberg et al., 2009).
Il apparaît donc qu’une compréhension accrue (i) de la coordination entre l’absorption racinaire et la dynamique in planta de l’azote, (ii) des interactions avec le métabolisme carboné et (iii) des potentialités de croissance des jeunes pousses issues du débourrement pendant la période critique du printemps (débourrement) permettrait une meilleure gestion de l’acte agronomique (notamment la fertilisation azotée) dans la conduite des couverts ligneux.
C’est pourquoi l’objectif de l’étude présentée vise à étudier l’effet d’un apport précoce (avant le débourrement) sur la qualité de la jeune pousse foliaire, et en particulier, sur les flux d’azote issus de l’absorption et de la remobilisation entre les différents compartiments chez le peuplier (Populus tremula x alba).
Bibliographie
2
II. BIBLIOGRAPHIE
A. Absorption racinaire de l’azote chez l’arbre
Le transport et l’allocation de l’azote dans l’arbre dépendent des conditions environnementales et physiologiques mais sont surtout liés aux flux existants. En effet, le flux généré par le continuum sol/plante/atmosphère va permettre le déplacement de l’eau dans les vaisseaux du xylème mais également des éléments minéraux présents dans le sol et nécessaires au développement végétal (Sperry et al., 2003). Cependant, il est souvent observé pour un certain nombre d’éléments minéraux, une absorption différente par rapport à la quantité d’eau mise en jeu. Il existe donc un système de régulation par l’intermédiaire de canaux ou de transporteurs spécifiques pour les ions qui peuvent être de plusieurs natures.
L’azote peut être absorbé par la plante sous forme minérale (ammonium, nitrate) et organique (peptides et acides aminés), ces dernières pouvant présenter chez certaines espèces un réel enjeu étant donné la difficulté à venir pour la production d’engrais azotés inorganiques et les perturbations anthropiques sur le cycle de l’azote. Pour que le transport soit possible -quelque soit la forme transportée- il faut considérer (1) que la forme transportable soit présente dans le sol (2), que des systèmes de régulation permettant l’absorption soient présents et fonctionnels et que (3) le métabolisme endogène soit capable d’utiliser l’azote et de l’incorporer dans des métabolites.
Systèmes de transport
Deux formes d’azotes inorganiques coexistent dans le sol : le nitrate (NO3-) et l’ammonium (NH4+). Ces ions sont plus ou moins discriminés en fonction des espèces végétales lors de l’absorption. Ainsi, il a été montré une nette préférence de l’ammonium en tant que source d’azote pour le sapin blanc tandis que le nitrate sera favorisé chez le peuplier tremble et le Douglas (Min et al., 1999). Cette préférence est expliquée par la présence de transporteurs à nitrate et à ammonium au niveau racinaire.
L’absorption de l’azote minéral dans les cellules racinaires est assurée par des transporteurs spécifiques regroupés en deux systèmes de transport: les systèmes de transport à forte (HATS) et à faible (LATS) affinité.
* Le système de transport à forte affinité HATS (High Affinity Transport System) suit une cinétique de type Michaelis-Menten et il est saturable à partir de concentrations en NO3- atteignant 200 à 500 µM selon les espèces étudiées (Doddema et
Bibliographie
3 Telkamp, 1979). La cinétique d’absorption du système HATS peut être caractérisée par deux paramètres, la constante apparente d’affinité (Km) et l’influx maximal (Im). Dans le cas du peuplier, le HATS sature pour une concentration de l’ordre de 500 µM dans la solution nutritive. Mäck et Tischner (1990) en utilisant un analogue structural, la p- fluorophénylalanine qui empêche la synthèse de protéines fonctionnelles en se substituant à la phénylalanine (acide aminé supposé intervenir fréquemment dans la constitution des sites actifs des transporteurs anioniques animaux ou végétaux), ont pu inhiber, chez l’orge, l’augmentation de la vitesse d’absorption lorsque les plantes sont réalimentées avec une solution nutritive contenant du nitrate. Comme pour l’ensemble des végétaux étudiés jusqu’à présent, le système de transport fonctionnant agissant pour de faibles concentrations en nitrate est constitué d’une composante exprimée de façon constitutive appelée « CHATS » (Constitutive High Affinity Transport System) et d’une composante inductible appelée
« IHATS » (Inducible High Affinity Transport System), nécessitant la synthèse de protéines fonctionnelles. En effet, il a été montré que ces transporteurs peuvent être synthétisés de façon différentielle en fonction de l’historique de la nutrition azotée de la plante : la vitesse maximale d’absorption pouvant être multipliée par 10 chez Populus (Min et al., 2000) montrant ainsi une autre catégorie de transporteurs de haute affinité induite par le nitrate (IHATS). Contrairement à ce qui est observé pour le nitrate, une composante inductible n’a pas pu être identifiée dans le cas de l’absorption de l’ammonium.
* Pour de fortes concentrations de nitrate (s’échelonnant de 500 µM à 1 mM), l’influx de NO3- est proportionnel à la concentration en nitrate dans le milieu extérieur (Siddiqi et al., 1990 ; Faure-Rabasse et al., 2002). En effet, le système de transport à faible affinité LATS n’est pas saturable par le nitrate. Il est généralement admis que ce système est exprimé de façon constitutive (Siddiqi et al., 1990 ; Glass et Siddiqi, 1995). Cependant, les études moléculaires effectuées chez diverses espèces confirment l’existence d’un système LATS inductible (Hordeum vulgare : Huang et al., 1999 ; Nicotiona plumbaginifolia : Fraisier et al., 2001 ; Arabidopsis thaliana : Okamoto et al., 2003). De plus, l’obtention de mutants déficients en systèmes de transport HATS chez Arabidopsis thaliana a permis de montrer que le système LATS interviendrait également pour de faibles concentrations en nitrate dans le milieu extérieur (Okamoto et al., 2003). D’un point de vue génétique, les transporteurs à ammonium sont en cours de caractérisation moléculaire : l’analyse des séquences nucléiques fait ressortir une famille de gènes AMT divisée en deux sous-familles AMT1 et AMT2.
Certains de ces gènes ont été étudiés en détail grâce à leur insertion dans un
Figure 2 : absorption et recyclage interne de l’azote chez le ligneux (d’après Millard et Grelet, 2010).
Figure 3 : Principales étapes du développement annuel de l'arbre en fonction des saisons
Bibliographie
4 système hétérologue. L’expression des différents AMT est variable selon les tissus et le stade de développement (Couturier et al., 2007).
Assimilation du nitrate et de l’ammonium
L’incorporation dans le métabolisme endogène de l’azote absorbé est rendue possible principalement grâce à la voie GS-GOGAT qui aboutit à la formation de glutamate à la suite de la réduction chimique du nitrate absorbé. Suite à son piégeage par les poils absorbants, le nitrate présent dans les cellules racinaires est capable, au bout de quelques minutes, d’induire de nombreuses fonctions (Wang et al., 2000) telles que la stimulation des enzymes :
- Du métabolisme azoté assurant sa réduction (NR, NiR), son transport (NRTs ; transporteurs du nitrate dans la plante) et son incorporation dans le cycle des acides aminés.
L’ammonium possède lui aussi une capacité de contrôle sur la GS et des transporteurs d’acides aminés (Wang et al., 2004). Lorsque la GS est surexprimée, il a été montré une plus forte allocation de l’azote en direction des feuilles ainsi qu’un meilleur taux de croissance des tiges, des feuilles et de la hauteur (Kirby et al., 2006), ce qui montre que dans certaines conditions, le taux de nitrate n’est pas limitant mais plutôt la capacité de la plante à l’intégrer dans son pool.
- Du métabolisme carboné (Scheible et al., 1997, 2000).
B. Cycle de l’azote dans l’arbre
1. Flux d’azote in planta en lien avec le cycle de développement de l’arbre
Le cycle de l’azote à l’échelle de l’arbre (Figure 2) peut être divisé en quatre phases principales tout au long de la période de végétation (Figure 3) :
- depuis la fin du débourrement (mars-avril) jusqu’à la floraison et la fin de la croissance foliaire (juin) : l’azote issu de l’absorption racinaire et issu de la remobilisation des organes de stockage (racines, tronc), accumulé au cours des années précédentes, est alloué aux nouveaux puits en croissance, en l’occurrence les jeunes pousses foliaires et les fleurs, - depuis la fin de la croissance foliaire (début de l’été) jusqu’à la maturité foliaire (fin de l’été) : l’azote est réalloué au sein de la feuille vers la chaîne métabolique photosynthétique afin d’optimiser la fixation de dioxyde de carbone et, in fine, la croissance de l’arbre. C’est à
Bibliographie
5 cette période de l’année que la croissance de l’arbre est maximale et que le stock de réserves carbonées est renouvelé. Durant cette phase estivale, la gestion de l’azote dépend essentiellement de la régulation des processus d’absorption et d’assimilation du nitrate et de l’ammonium. Ceci est en particulier vrai pour le nitrate, et ceci par différentes voies : GS- GOGAT (Fan et al., 2002), les acides organiques (Imsande et Tourraine, 1994) qui exerce un rétrocontrôle positif sur l’absorption racinaire ou encore les phytohormones (Collier et al., 2003).
Le nitrate absorbé va ensuite être distribué au sein de la plante entre les différents tissus par la sève xylémienne. En fonction des tissus et de leur état de nutrition, l’utilisation du nitrate sera différente : synthèse d’enzymes pour soutenir la croissance des organes végétatifs ou reproducteurs, stockage afin d’être réutilisé par la suite lors d’une période de carence ou encore séquestration en cas d’excès dans le sol ou de dysfonctionnement métabolique (Millard et Grelet, 2010). D’Avril à Septembre, l’azote total est majoritairement présent dans le phloème (10mg/gMS chez Prunus persica, Gomez et Faurobert, 2002). La concentration en protéines est divisée par deux, l’ensemble du pool azoté est alors sous forme d’acides aminés et d’azote minéral. (Gomez et Faurobert, 2002). On observe des résultats similaires chez Populus x canadensis Moench avec une teneur en protéines pouvant chuter à 2-3% sur la même période (Sauter et Van Cleve, 1994). L’azote des feuilles jeunes peut représenter environ 75% de l’azote total en raison d’un développement et d’une croissance optimale (une feuille par jour) à cette période et d’une teneur particulièrement élevée (de l’ordre de 6% de MS). En raison de cette vitesse de croissance élevée, le compartiment foliaire est le premier puits pour l’azote et le carbone de l’ensemble de l’axe,
- depuis le début de sénescence foliaire (début de l’automne) jusqu’à l’entrée en dormance (fin de l’automne-début hiver) : sous l’influence de signaux environnementaux (réduction de la longueur du jour, modification de la course du soleil (signal rouge clair/rouge sombre perçu par les phytochromes), les feuilles entrent en sénescence. Cette dernière se traduit par une protéolyse intense dans la feuille accompagnée, notamment, par la lyse des chloroplastes qui sont le siège de la photosynthèse (Hörtensteiner S. and Feller U., 2002) L’azote résultant est alors véhiculé depuis les feuilles (organes sources d’azote) vers les organes et tissus pérennes de stockage (principalement, racines et écorce). La fin de cette phase de résorption de l’azote est marquée par la chute totale des feuilles de l’arbre. Durant la phase de transition avant l’entrée en dormance, les flux d’azote à l’intérieur de l’arbre permettent de conserver 80% de l’azote in planta malgré la chute des feuilles et le retour subséquent d’une partie de l’azote vers la litière. La phase précédant cette chute est la
Bibliographie
6 dégradation des chloroplastes dont le pool protéique peut contenir jusqu’à 75% de l’azote de la feuille (Hörtensteiner et Feller, 2002). Lors de la remobilisation vers les organes de stockage, l’azote foliaire est redistribué vers les autres tissus, et notamment les grosses racines (diamètre supérieur à 1 mm) qui concentrent jusqu’à 50% de l’azote total de l’arbre dès le mois de novembre qui précède l’endodormance (Pregitzer et al., 1990). Chez de nombreuses espèces fruitières et forestières, la charge en azote peut être améliorée par l’application d’urée sur les feuilles à la fin de l’été voire au début automne. L’azote ainsi apporté au niveau des parties aériennes sera préférentiellement recyclé puis stocké afin de favoriser la reprise de végétation le printemps suivant (Khemira et al., 1998 ; Tagliavini et al., 1999) ; Dong et al., 2004). Parallèlement au stockage de l’azote dans les tissus pérennes (grosses racines et écorces), le carbone est lui aussi accumulé dans ces organes de stockage pendant la période estivale grâce à l’activité photosynthétique, en net excédent par rapport à la respiration foliaire, ce qui permet d’obtenir une teneur de NSC (carbone non structural) maximal en automne dans les tissus de stockage (Sauter et Van Cleve, 1994).
Lors de la période d’endodormance (automne-hiver), caractérisée par une chute des températures et une réduction de la photopériode, l’azote est stocké chez de nombreuses essences sous forme de protéines de réserve mais également d’acides aminés libres. Même si les acides aminés libres représentent une part importante de ce stockage, la quantité d’azote stockée par ces deux mécanismes est comparable du fait de la moindre quantité d’azote contenu par acide aminé (0.13gN/acide aminé contre 0.23gN/protéine chez le chêne, El Zein et al., 2011). C’est à cette période que la teneur en protéines est la plus élevée. Etant donné la caducité des essences fruitières et forestières, les différentes formes azotées sont stockées dans les parties pérennes de la plante : la tige et dans les racines (Pregitzer et al., 1990).
Parallèlement, le métabolisme carboné va lui aussi être bouleversé avec une forte concentration des tissus en amidon mais également en hexoses -en particulier glucose et fructose- qui seront capables de protéger les cellules des dégâts dus au froid par effets osmotiques (chêne ; El Zein et al., 2011),
- depuis la levée de la dormance (février) jusqu’à l’apparition des jeunes pousses foliaires (mars) : l’azote stocké lors de la phase de résorption sous forme de protéines de réserves et d’acides aminés dans les organes pérennes va se déplacer depuis les tissus de stockage (écorce et racines principalement) vers les nouveaux tissus (et donc puits pour l’azote et le carbone) en croissance tels que les bougeons puis les feuilles.
Bibliographie
7 La remobilisation de l’azote a lieu au cours du débourrement (Peuplier ; Cooke et Weih., 2005). A la fin de la période de dormance, l’azote doit être remobilisé afin d’être utilisé pour assurer la première phase de développement de l’arbre comportant notamment l’émission des feuilles préformées dans le bourgeon. Pendant cette période, une chute de la teneur en protéines dans les jeunes tiges est observée (Sauter et Van Cleve, 1994). Les études menées chez Betula pendula montrent que ces protéines sont transportées vers le xylème pendant la période de débourrement (Millard et al., 1998). Les phénomènes observés précédemment sont les mêmes pour tous les ligneux mais selon des proportions variables. Même si l’azote non structural (NSNC) ne semble pas présenter de cycle saisonnier, les variations de composition en acides aminés et protéines laissent suggérer des mouvements locaux de l’azote plutôt que de long mouvements le long de la tige (El Zein et al., 2011).
Lors des quatre phases décrites précédemment, les flux de matière entre les compartiments (sources et puits) seront très différents que ce soit du point de vue de l’intensité, mais également du sens. En effet, ces flux sont en prise directe avec la physiologie et plus généralement les relations sources-puits au sein de l’arbre. La physiologie observée chez l’arbre sera donc variable en fonction des saisons, ce qui a pour conséquence directe une variation en termes d’allocation des ressources et de formes présentes.
2. Formes de stockage et de transport de l’azote
Durant l’été, la fourniture suffisante par le sol de l’azote associée à une forte capacité de prélèvement de l’azote (reprise de la croissance racinaire et de l’activité des systèmes de transport racinaire) assure un niveau de nutrition azotée suffisant nécessaire pour une synthèse protéique efficace et un développement végétatif important. Cependant, les plantes, en particulier les espèces pérennes ligneuses, ont développé des stratégies de mise en réserve d’azote afin de pouvoir continuer ou reprendre leur croissance ou leur développement face à des situations de carence en azote, et ce à différentes échelles de temps (de la journée à plusieurs mois). Ainsi, le stockage azoté a pour particularité d’être programmé de façon saisonnière. Le stockage de l’azote se fait dans des tissus spécifiques tel que l’écorce mais qui dépendent souvent de l’espèce étudiée avec des formes de stockage spécifiques (Millard et Grelet, 2010). Cette mise en réserve se fait principalement durant l’automne, période durant laquelle des signaux comme la diminution de la photopériode sont perçus mais pendant laquelle les conditions ne sont pas encore défavorables. Suite au signal provoquant la sénescence foliaire, les protéines sont dégradées et transportées sous forme d’acides aminés vers des tissus de stockage et synthétisées en protéines de stockage (VSP). Le stockage au
Bibliographie
8 sens physiologique du terme ne doit pas être confondu avec l’accumulation qui se distingue par la non réutilisation de l’azote à la suite d’une consommation de luxe (Millard, 1988). A partir de cette définition, les VSP, qui sont des protéines sans activité métabolique durant la période de stockage (hiver), apparaissent comme étant des formes de stockage et non d’accumulation car elles sont, par définition, synthétisées à partir de l’azote issu de la résorption des sources puis, après leur remobilisation, sont allouées à des processus d’initiation de la croissance puis métabolisées afin d’activer cette croissance (Chapin et al., 1990). Chez le peuplier, la majorité des VSP sont stockées dans l’écorce sous forme de BSP, qui sont des protéines de l’ordre de 32 à 38KDa et classées d’un point de vue moléculaire en trois sub-familles (Cooke et Weih, 2005) : (1) les BSP, (2) WIN4 et (3) PNI288 qui ont été étudiées et ne semblent pas présenter de redondance fonctionnelle :
(1) la sous-famille des BSP est impliquée dans le stockage à court terme lors de la phase de dormance, des corrélations ont été démontrées entre son expression, la photopériode (probablement par l’intermédiaire des photochromes) et les faibles températures. Son expression est également liée à l’état de dormance des bourgeons et à la disponibilité en azote et permet une meilleure efficience de l’azote, (2) tout comme BSP la sous-famille WIN4 est exprimée suite à une disponibilité en azote ce qui en fait un acteur du stockage à court terme, mais à l’inverse l’expression a été montrée toute l’année avec un léger pic au début du printemps, et ceci dans des tissus en croissance. Il semblerait donc que cette sous-famille ait pour rôle le stockage temporaire de l’azote issu de la dégradation des BSP (Lawrence et al., 2001),
(3) PNI288 est la sous-famille la plus récemment découverte et donc étudiée, même si les études ne sont -à l’heure actuelle- que partielles, il semble que son expression soit très similaire à celle de WIN4 suggérant un rôle semblable à WIN4 (Cooke et Weih 2005).
En plus des VSP, l’azote peut être conservé sous forme d’acides aminés tels que l’arginine, la glutamine et l’asparagine qui sont des molécules contenant entre deux et quatre moles d’azote par mole d’acide aminé (Rennenberg et al., 2006).
En conclusion, la gestion optimale de l’azote dans la plante résulte de la coordination étroite entre l’absorption racinaire du nitrate (pour augmenter le pool azoté) et le recyclage de l’azote nécessaire à la mise en réserve dans les organes pérennes avant l’hiver. Ces deux processus assurent le nivèlement de la discontinuité d’apport d’azote par le sol et sont complémentaires.
Bibliographie
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C. Le débourrement : à l’interface entre absorption et recyclage
La coordination entre l’absorption racinaire printanière d’azote et la remobilisation associée dépendante de l’année n-1 est un processus complexe mais crucial pour assurer la fourniture en métabolites azotés des jeunes pousses en croissance après le débourrement. La quantité d’azote libérée pour la croissance dépend globalement de la taille des réserves carbonées et azotées (dimension des organes et teneur, forme de stockage) mais aussi de la capacité de l’arbre à les utiliser (Bollmark et al., 1999). Ce dernier point impose, la remobilisation des réserves et, d’autre part, la possibilité de mettre en mouvement les molécules libérées en les transportant sur des distances plus ou moins importantes (Sauter et Van Cleve, 1994). Par exemple, une carence en azote chez des jeunes plants de peuplier cultivés en solution nutritive entraîne, au niveau de l’individu, une réduction de la capacité photosynthétique (surface et durée de vie foliaire), une limitation du nombre de ramifications, une réduction de l’expression des gènes des protéines de réserves (VSP) et une stimulation des enzymes impliquées dans la synthèse de l’amidon (Cooke et Weih, 2005 ; Cooke et al, 2005). De façon plus large et d’un point de vue quantitatif, il ressort que (i) les réserves azotées participent massivement à la croissance des arbres, et ce d’autant plus que la taille de l’arbre augmente chaque année (Millard et Proe, 1991 ; Dyckmans et Flessa, 2001), (ii) un début de remobilisation peut être déclenché avant la reprise de l’absorption racinaire (Siebrecht et al., 2003 ; Millard et al., 2006), (iii) la concentration en azote dans la sève xylémienne augmente lors du débourrement et pendant la croissance des jeunes feuilles (Millard et al., 2006). D’un point de vue qualitatif, l’analyse de la composition de la sève xylémienne a montré une augmentation importante de la quantité d’acides aminés multi- azotées (glutamine, asparagine, arginine) provenant à la fois de l’absorption associée au métabolisme et de la remobilisation et, dans une moindre mesure, de nitrate issu de l’absorption (Siebrecht et al., 2003). Cependant, les concentrations en acides aminés et en nitrate ne dépendent pas uniquement des capacités de remobilisation mais aussi de la concentration en nitrate du milieu de culture et de la vitesse de flux de sève qui est modifiée lors la transition ‘phase non feuillée/phase feuillée’. Ces études concernent très généralement la période de croissance et non pas les périodes charnières de fin d’automne et de printemps qui sont au cœur de notre problématique.
Matériels et méthodes
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D. Problématique
L’azote est un élément indispensable au développement du végétal mais il reste trop souvent limitant car fluctuant à des moment-clés du développement et de la croissance. Il existe, chez les plantes pérennes, des mécanismes permettant le maintien de l’azote dans les tissus par l’intermédiaire du recyclage que ce soit sur de petites échelles ou lors d’une saison entière. La dynamique de l’azote est régulée de façon cyclique dans les plantes afin que son utilisation soit favorisée en sortie d’hiver lors de la phase de débourrement. Cette étape de remobilisation dépendra des flux de sève dans la plante tout d’abord localement puis dans l’ensemble de la plante. Il a été montré que l’apport d’azote avant cette phase pouvait avoir un effet positif sur la reprise de la végétation : le profil de débourrement restera le même mais la qualité de la pousse en termes de surface et de teneur en azote sera nettement améliorée.
La question posée ici est de mieux comprendre pourquoi cet azote a un impact positif et plus précisément comment il est utilisé par la plante lors de la transition de la dormance vers le débourrement. La principale hypothèse testée est que l’azote absorbé avant le débourrement est capable d’induire une stimulation de la remobilisation. Le marquage isotopique de chasse proposé permet de suivre le pool d’azote absorbé au cours du temps et dans les différents compartiments afin d’établir des bilans s’appuyant sur les flux d’azote issus de l’absorption et de la remobilisation.
III. MATERIEL ET METHODES
A. Caractérisation du système de culture
1. Préparation des arbres
Les arbres utilisés sont des scions (arbre âgé d’un an) de peupliers hybrides Populus tremula x alba clone INRA 717-1B4. Les scions ont été obtenus par enracinement de boutures issues micro-pieds-mères et faites l’année précédente sous serre. La croissance des plantes a été assurée dans des conditions équivalentes à celles de l’expérimentation. Les plantes ont été initialement cultivées toute une saison de végétation sous serre, dans le système de culture en solution recyclée et dans des pots cylindriques et en PVC de 10L qui ont été remplis de perlite (substrat chimiquement neutre, sans capacité d’échange cationique et à bonne capacité de rétention en eau). En fin de période de végétation et à partir du 15 octobre 2011, les jeunes arbres ont été transférés à l’extérieur de la serre avec une isolation faite au niveau des pots avec de la pouzzolane afin de limiter les échanges thermiques entre l’atmosphère et le
Matériels et méthodes
11 système racinaire pendant l’hiver et donc, en partie, pour limiter les effets du gel. Le stockage hivernal en extérieur a alors permis de lever naturellement la dormance des bourgeons. Après cette période de stockage les arbres ont été replacés sous serre, (7 Février 2012) pour engager les expérimentations. Elles ont été faites en système de culture en solution nutritive recyclée car ce système permet de maîtriser l’environnement ionique des racines. Il permet d’élaborer précisément des cinétiques d’absorption des éléments minéraux, et d’appliquer des techniques de marquage isotopique qui donne accès aux calculs de bilans de flux élémentaires (plus spécifiquement l’azote dans ces essais).
L’hiver 2011-2012 (annexe 1) a été particulièrement doux jusqu’en début février puis les températures ont chuté brutalement avec une phase de fort gel (mini-16°C). Pour limiter de possibles conséquences du gel, les plantes ont été rentrées sous serre et stockées hors gel en serre froid pendant 6 jours. Ensuite en conservant des températures froides (5°C nuit, 10°C jour), les plantes ont été placées sur les dispositifs de culture en solution recyclée et alimentées avec une solution nutritive (annexe 2) sans azote (6 arrosages par jour de 45 min, chacun). Cela afin d’homogénéiser les environnements ioniques racinaires au niveau de chaque plante. Après cette phase finissant l’acclimatation des plantes, la température de la serre a été augmentée pour démarrer les essais en nutrition minérale (10°C nuit et 15°C jour).
Les fréquences d’arrosage (6 par jour de 45 min) ont été conservées pendant toute la durée des expériences.
2. Caractérisation initiale des arbres et sélection de lots homogènes Les expériences ont été de courte durée (environ 2 mois) car elles ne concernent que la phase de transition entre la dormance et le départ de croissance des jeunes pousses au printemps. Afin d’augmenter la sensibilité pour l’analyse des résultats, les plantes ont été sélectionnées parmi une petite population de 36 scions hivernés pour constituer 5 lots de 5 plantes rendus le plus homogène possible. Pour cela toutes les plantes ont été caractérisées par leur hauteur et le volume de leur scion. L’élancement des scions a alors été restitué avec la détermination du volume qui fait appel à deux troncs de cône superposés et de hauteur égale pour chacun. Les diamètres des scions nécessaires aux calculs ont été mesurés deux fois à trois niveaux (bas, milieu et haut). Les arbres ont alors été sélectionnés de telle sorte que la variabilité biologique soit répartie de manière uniforme dans les séries (Test de Levene, pval=0.98) mais également à l’intérieur d’une même série (Test de Shapiro et Wilk, 0.45<pval<0.91). Les plantes mises en essais avaient ainsi une hauteur moyenne de 200 +- 10 cm et un volume moyen de 120 +- 20cm3.
Figure 4 : dispositif expérimental montrant les peupliers installés sur les dispositifs de culture en solution recyclée.
Figure 5: protocole expérimental reposant sur un marquage de chasse (15N) utilisé présentant les différents traitements appliqués. Le protocole utilisé repose sur l’étude de Suraphon Thitithanakul (thèse réalisée au PIAF, 2012)
Matériels et méthodes
12 3. Dispositif expérimental
L’objectif de cette expérimentation est de quantifier grâce à l’azote nitrique marqué au
15N, l’effet de l’apport de nitrate avant le débourrement, en particulier sur la qualité de la jeune pousse, et de préciser alors le devenir de cet azote absorbé. L’apport d’azote marqué est effectué suffisamment longtemps avant le débourrement pour qu’il soit nettement discriminé de l’azote non marqué et absorbé après le débourrement. Dans cette étude concernant la transition entre « dormance » et « reprise de croissance », la première phase a durée 16 jours et la deuxième, concernant l’étalement et la croissance des feuilles, a durée 10 jours. Pour comparer l’absorption d’azote à sa non absorption, le dispositif expérimental (figure 4) a consisté à traiter et récolter 5 lots de 5 plantes chacun conduit sur des systèmes de culture en solution nutritive recyclée (figure 5) : (I) un premier lot pour déterminer les caractéristiques biométriques (architecture et biomasse) et l’état des réserves azotées et carbonées des plantes au départ des expériences ( récolte du 22/02) , (II) deux lots pour traiter d’une nutrition sans azote (contrôle) et (III) deux lots pour traiter de l’apport d’azote. Les lots mis en culture, avec ou sans azote, ont été récoltés d’une part quelques jours (récolte du 8/03, 10 jours) avant le débourrement et d’autre part après une période de croissance limitée (récolte du 29/03, 10 jours) qui constitue aussi la fin de la partie expérimentale. Les dynamiques d’absorption cumulées du nitrate ont été élaborées par la mesure des volumes de liquide présent dans les réserves de solution nutritive et les prélèvements d’échantillon pour la détermination au laboratoire de la détermination des concentrations ioniques (Chromatographie ionique Metrohm avec colonnes de séparation : Metrosep C 3 (cations) et Metrosep A Supp 4 (anions)). Ces mesures ont été effectuées quotidiennement pendant toute la durée des essais.
B. Mesure de l’absorption minérale par disparition dans la solution nutritive
Pour déterminer l’absorption cumulée d’un élément minéral par échantillonnage sur les systèmes de culture en solution recyclée, le modèle d’interprétation des mesures (volume, concentration) et de restitution des résultats (données cumulées) prend pour hypothèse que tout élément quittant le dispositif de culture rentre dans les plantes mises en essai. Cette hypothèse implique que les variations de quantité d’un élément minéral dans le dispositif et entre deux prélèvements représentent une absorption ou un efflux physiologique par les racines. D’un autre point de vue, les plantes absorbent de l’eau et des ions, ce qui peut modifier profondément les caractéristiques du système cultural, et donc la réponse des
Figure 6 : principales étapes du débourrement chez le peuplier
Matériels et méthodes
13 plantes au niveau de l’absorption. Dans cette approche, le système de solution nutritive doit donc être régulièrement régénéré si l’on veut garder des contraintes de concentrations ioniques compatibles avec les gammes prévues pour les essais. Dans ce sens, les régénérations des solutions nutritives contenues dans les réserves (avec ou sans azote) ont été effectuées sous contrôle de la concentration en nitrate, aux mêmes dates pour toutes les lignes de culture et simultanément pour tous les dispositifs (21-02, 8-03, 9-03 et 22-03).
Dans le cas du marquage en azote, les systèmes de culture ont été régénérés trois fois de suite sur 24 heures pour éliminer toute trace d’azote marqué de l’environnement racinaire (8 et 9-03). Dans le cas de l’apport d’azote, marqué ou non marqué, la variation de la concentration en nitrate a été souhaitée dans une gamme de 2 à 0.5 mM avec une concentration initiale de 1.82 mM, ce qui correspond aussi à une concentration d’absorption favorable aux transporteurs de nitrate à faible affinité (LATS).
Les solutions nutritives appliquées aux essais (80L en cas classique) ont été fabriquées à partir de solution-mères préalablement fabriquées (utilisation à 0.5 pour mille) et d’eau déionisée produite sous serre par résines échangeuses d’ions (composition des solutions données en annexe 2). Les mesures issues de l’échantillonnage de dispositifs ont été traitées par le model proposé par Beaujard et Hunault (1997).
Le marquage de chasse a été effectué depuis du nitrate de potassium marqué à 98% pour l’isotope stable 15N et qui a été dilué à la confection des solutions d’utilisation pour la culture pour avoir en final un marquage de l’azote de la solution nutritive à 33% et une concentration en nitrate de 1.8 mM. Les deux lignes comportant de l’azote ont été traitées exactement de la même façon lors de la phase d’absorption avant débourrement.
C. Profil de débourrement
Afin d’associer des événements phénologiques (figure 6) à la courbe d’absorption, et cadrer les prélèvements, les profils de débourrement ont été réalisé quotidiennement sur l’ensemble des arbres. Pour chaque arbre, les bourgeons sont observés et leur stade est noté avec leur position sur l’axe. Le stade de référence, noté C sur une échelle de 5 stades, correspond à l’émergence des feuilles depuis les bourgeons et l’apparition claire de pointe verte. Ce stade est pris comme référence pour définir la date de débourrement. Les données informatisées sont ensuite analysées de façon statistique et donnent le délai moyen de débourrement pour chaque plante (50% des bourgeons passant ou ayant dépassés le stade C).
L’analyse phénologique menée a permis de repérer précisément les phases-clés de la croissance afin de positionner le prélèvement des plantes.
Matériels et méthodes
14
• Le premier prélèvement permet de caractériser l’état des tissus à la sortie de l’hiver,
• Le deuxième prélèvement a lieu au tout début de la phase de débourrement lorsque que les premiers bourgeons ayant atteints le stade C ont été observés.
• Le troisième prélèvement a lieu lorsque les limbes sont étalés et que le nombre de feuilles émises correspond au nombre théorique de feuilles présentes en phase de repos hivernal.
D. Récoltes et mesure de la croissance
A chaque récolte, les arbres sont séparés entre racines fines, grosses racines, tige et les jeunes axes portant les feuilles lorsqu’ils sont développés. Au cours de notre étude, deux compartiments ont été séparés au niveau de la tige et des grosses racines : le compartiment
« écorce » correspond au phelloderme, liber et cambium tandis que le compartiment
« xylème » correspond au xylème, cellules associées aux vaisseaux, parenchymes et moelle.
Pour chaque échantillon, la matière fraîche est mesurée puis les échantillons sont placés à l’étuve à 60°C pendant au moins 72h avant de déterminer la matière sèche. Dans le cas des tiges, les diamètres avec et sans écorce et les longueurs des échantillons ont été mesurés immédiatement après la récolte. Des analyses élémentaires des échantillons réduits en poudre ont permis de doser les teneurs en glucides (amidon et principaux sucres solubles) et en azote total dans chaque compartiment.
1. Tige
La tige est mesurée puis pesée. La tige est échantillonnée de la façon suivante : des échantillons sont réalisés à trois niveaux (20, 80 et 180cm).
Le diamètre total de la tige ainsi que celui du xylème sont mesurés deux fois du fait de la forme ellipsoïdale de la tige avant d’être séparé. L’écorce est séparée du xylème afin d’augmenter la précision de l’étude en prenant en compte deux compartiments. Les échantillons sont congelés dans l’azote liquide puis lyophilisés pendant 48h. Par la suite, ils seront pré-broyés puis broyés au broyeur à billes.
2. Racines
L’ensemble du système racinaire est séparé du substrat de culture et lavé. Il est séparé en deux : Les racines fines (diamètre inférieur à 2mm) et les grosses racines qui ont un rôle de stockage. Le système racinaire est passé à l’étuve cinq jours puis les compartiments pesés. Un échantillon de racines fines est prélevé sur la partie inférieure du système racinaire. Deux échantillons de grosses racines sont prélevés et le cortex est séparé du cylindre central.
Matériels et méthodes
15 Dans les deux cas, les échantillons sont plongés dans l’azote liquide et lyophilisés (48h de traitement sous vide) avant d’être finement broyés.
3. Feuilles
Lors du dernier prélèvement, les feuilles sont prélevées aux mêmes niveaux que les trois échantillons de tiges :
* Architecture : des échantillons serviront pour les mesures de surface foliaire et de biomasse sèche afin de déterminer la SLA (rapport entre la surface foliaire en cm² et la biomasse sèche en g).
* Azote : les limbes sont séparés des pétioles puis plongés dans l’azote liquide et lyophilisés puis pesés séparément. Lors du broyage, les deux échantillons sont réunis afin de ne présenter qu’un seul compartiment.
* Reste des parties végétales après échantillonnage : il est séché à l’étuve à 60°C pendant plusieurs jours et pesé : la corrélation établie entre la masse et la surface sera utilisée afin de déterminer la surface totale des arbres.
Après avoir été finement broyés, les échantillons sont micropesés et encapsulés afin d’être dosés au spectromètre de masse (UMR INRA EVA de Caen). L’appareil (twenty-twenty, Europa Scientific) permet de mesurer l’azote total et le rapport 15N/14N. Pour ces mesures, le spectromètre est couplé à un appareil assurant la production de N2 (Roboprep CN). Ces mesures vont permettre de déterminer l’excès isotopique des différents compartiments prélevés aux différentes dates.
E. Statistiques
1. Architecture / azote
Les différents paramètres architecturaux et teneurs en azote mesurés sont comparés de manière statistique avec le logiciel xlstat (version 7.5.2, Addinsoft) à l’aide d’une ANOVA (P=0.05) à un facteur et du test de Tukey (TSD).
2. Profil de débourrement
Les bourgeons ont été suivis quotidiennement entre le 20 février et le 23 mars. Afin de tester l’effet de l’apport d’azote sur le profil de débourrement, les fréquences de chaque stade sont testées à l’aide de tests T (p=0,05). Il est également testé le délai moyen de débourrement à l’aide d’un test T (p=0,05).
Dates
Proportion des bourgeons au stade C
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
4/3 5/3 6/3 7/3 8/3 10/3 11/3 12/3 13/3 14/3 15/3 17/3 18/3 19/3 20/3 21/3 22/3
+N -N
Délai moyen de débourrement
Stade A
Stade C
Stade E
*
Figure 7 : cinétique de débourrement (exprimée en proportion de bourgeons ayant dépassés le stade C) depuis la sortie hiver jusqu’à 10 jours après le débourrement chez des scions de Peuplier (Populus tremula x alba) avec () ou sans (○) nitrate dans la solution nutritive. Les valeurs correspondent aux moyennes±écart-type avec n=5.
Résultats
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IV. RESULTATS
A. Profil de débourrement et croissance des scions de peuplier
1. Profil de débourrement
De manière globale, soixante bourgeons par arbre ont débourrés soit 87% du stock initial de bourgeons, quel que soit le niveau de traitement azoté (.test T, pval=0,72) soulignant ainsi l’absence d’effet de l’apport d’azote sur le nombre de bourgeons débourrés.
La cinétique de débourrement suit une loi logistique (figure 7). L’ensemble des bourgeons pour les traitements –N et +N débourrent entre le 12 mars (début de transition entre le stade A et le stade C) et le 16 mars (début de transition du stade C vers le stade E-F). La date moyenne de débourrement pour laquelle la moitié des bourgeons débourrés a atteint le stade C est graphiquement déterminée au 15 mars 2012. Si on considère les bourgeons ayant dépassés le stade C (figure 7), nous pouvons voir qu’il n’existe pas de différence entre traité (+N) et témoin (-N), sauf à la date du 14 mars (test T, p-val=0.03) pour laquelle la proportion de bourgeons au-delà du stade C est supérieure dans le lot ayant reçu de l’azote. Les résultats obtenus ici montrent donc que la date de débourrement correspondant au stade C (annexe 3) n’est pas soumise au traitement azoté appliqué en fin d’hiver. L’étude du profil de débourrement permet de mettre en évidence que ce phénomène physiologique primordial pour assurer la pérennité de l’arbre débute très tôt et conduit à un phénomène d’apparition des feuilles très rapide. En effet, même si le suivi a été effectué sur une période d’un mois, la phase de transition permettant la reprise de l’activité métabolique de l’arbre grâce à l’apparition des feuilles ne s’étale que sur une période de quatre à cinq jours. Si l’on s’intéresse aux étapes plus tardives, les stades E et F (étalement des limbes, annexe 4) semblent moins synchrones que ce qui est observé précédemment avec un léger retard du témoin. En conclusion, l’apport d’azote dans la solution nutritive avant le débourrement ne modifie pas le profil de débourrement défini par rapport au taux de débourrement, à la vitesse moyenne et à la date moyenne de débourrement.
2. Croissance, allocation de la matière sèche in planta et surface foliaire
Dans le traitement –N (témoin), la matière sèche totale des arbres (tableau I) varie peu au cours de l’expérimentation s’échelonnant de 80.17±11.07 g au stade A à la sortie hiver à 102.88±9.78 g 10 jours après le débourrement (Tableau I).
Tableau I : Matières sèches des feuilles, de la tige et des racines (g/plante), nombre de bourgeons débourrés (/plante), nombre de feuilles (/bourgeon), surface spécifique foliaire (specific leaf area, SLA ; cm2 /g de matière sèche) et humidité pondérale (g eau/g MS) depuis la sortie hiver jusqu’à 10 jours après le débourrement chez le scion de Peuplier (Populus tremula x alba) cultivé en conditions contrôlées. Les valeurs correspondent aux moyennes±écart-type avec n=5. Sortie hiverDébourrement Etalement des limbes Matière sèche (g) -N+N-N+N Feuilles - - - 14.62±0.8014.36±0.63 NS Ecorce 15.67±2.05 a18.08±1.82 a18.39±1.34 a14.79±1.58 a13.64±0.62 a Xylème 28.29±3.18 a31.34±3.02 a30.40±2.48 a29.45±2.61 a28.82±1.55 aTige Totale42.23±5.05 a48.75±4.44 a48.50±3.39 a45.74±3.74 a42.48±2.15 a Grosses25.61±4.28 a26.35±3.18 a30.84±2.68 a24.75±3.58 a19.89±1.84 a Fines12.33±1.92 a14.61±2.14 a15.00±1.15 a17.77±1.84 a13.56±0.45Racines Totales 37.14±6.04 a40.96±5.16 a45.83±3.78 a42.52±5.36 a33.45±1.88 a Plante entière 80.17±11.07 a 89.71±9.22 a94.33±6.64 a102.88±9.78 a 90.28±2.22 a Nombre de bourgeons débourrés- 59.1±2.061±2.6 NS- - Nombre de feuilles/pousse - - - 8.0±0.2 8.5±0.2 NS SLA (cm2 /g) - - - - 328.99±9.19 441.70±16.04 ** Ecorce 1.42±0.06 c 1.48±0.09 c 1.36±0.04 c 2.03±0.07 b 2.33±0.07 ab Xylème 1.13±0.04 c 1.22±0.02 c 2.47±0.06 a 1.25±0.03 c 1.96±0.18 b Humidité pondérale (g eau/g MS) Totale1.32±0.04 b 1.40±0.06 b 2.02±0.04 a 1.58±0.03 b 2.13±0.13 a
Résultats
17 Par ailleurs, les valeurs du rapport parties racinaires (PR)/aériennes (PA) sont constantes lors des deux premiers prélèvements (0.89±0.03) et diminuent lors de la dernière récolte en raison de l’apparition des feuilles (0.64±0.05), ces dernières représentant 15% de la biomasse sèche totale (soit 14.49g±0.13). Les valeurs du rapport PR/PA mettent en évidence une allocation équilibrée de la matière sèche entre les racines et la tige. De plus, au sein du compartiment racinaire, la matière sèche des grosses racines est globalement deux fois supérieure à celle des racines fines au cours de l’expérimentation (Tableau I). La conduction de la sève ainsi que la rigidité de l’axe sont assurées par le compartiment xylème qui va représenter environ deux fois plus de biomasse que l’écorce qui a pour rôles principaux d’assurer le stockage carboné et azoté ainsi qu’une activité cambiale forte. Une part importante de la biomasse est donc allouée dans les missions de soutien et de conduction.
L’apport d’azote dans la solution nutritive ne modifie pas la croissance ni l’allocation de la matière sèche entre les compartiments récoltés (ANOVA, P=0,05).
A la différence de la matière sèche, l’apport d’azote dans la solution nutritive entraîne une augmentation important de la surface foliaire. Cette augmentation ne s’explique pas par une augmentation du nombre de bourgeons ayant débourrés (59.1±2 et 61±2.6 pour les traitements –N et +N, respectivement) ou du nombre de feuilles par pousse foliaire (8±0.2 et 8.5±0.2 pour les traitements –N et +N, respectivement). L’accroissement de la surface foliaire résulte d’une amélioration de la valeur de surface foliaire spécifique (Specific Leaf Area, SLA). En effet, la valeur de cette dernière passe de 328.99±9.19 cm2.g-1 pour le traitement –N à 441.7±16.04 cm2.g-1 dans le traitement +N, ce qui correspond à un gain de 34% (Tableau).
En conclusion, il ressort que l’apport d’azote dans la solution nutritive avant le débourrement ne modifie pas la croissance et l’allocation de la matière sèche entre les compartiments. En revanche, l’apport d’azote se traduit par une augmentation très significative de la surface foliaire via un accroissement du SLA.
B. Humidité pondérale
A t0 (sortie de l’hiver), les valeurs d’humidité pondérale (exprimée en grammes d’eau par gramme de matière sèche) de la tige, de l’écorce et du xylème à la sortie de l’hiver sont respectivement 1.32, 1.42 et 1.13 g eau. g-1MS (tableau I).
Dans le traitement –N, ces valeurs varient peu tout au long de l’expérimentation, à l’exception d’une augmentation de l’humidité pondérale mesurée dans l’écorce (+37%) 10 jours après le débourrement (lors de l’étalement des limbes).
Étalement des limbes
Dates Quantitéd’azote nitrique absorbé (mmoles. Plante-1)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
21/2 24/2 27/2 1/3 4/3 7/3 10/3 13/3 16/3 19/3 22/3 25/3 28/3
Débourrement
« Marquage » 15N (AI = 33%) Apport 14N: « chasse» 15N
« sortie hiver »
Figure 8 : courbe d’absorption du nitrate mesurée par disparition du nitrate dans la solution nutritive depuis la sortie hiver jusqu’à 10 jours après le débourrement chez des scions de Peuplier (Populus tremula x alba) ayant reçu du nitrate dans la solution nutritive. Les valeurs correspondent aux moyennes±écart-type avec n=5.
Résultats
18 Dans le traitement +N, l’humidité pondérale de la tige est augmentée d’un facteur 1.5 au débourrement avant de se stabiliser à 2.13 g eau. g-1MS 10 jours après le débourrement. Cette augmentation résulte dans un premier temps d’un fort accroissement de l’humidité pondérale dans le xylème (x 2.2) tandis que l’humidité pondérale mesurée dans l’écorce est constante (Tableau I). A contrario, 10 jours après le débourrement, l’humidité pondérale diminue dans le xylème (-20%) et augmente dans l’écorce (x1.37) par rapport à celles mesurées au débourrement. L’apport d’azote améliore de façon très significative la réhydratation du xylème avant débourrement par rapport au témoin (test T, p-val<0.0001). Cette amélioration, même si elle tend à être moins accentuée par la suite en comparaison avec le témoin, se maintient dans le temps après que la reprise du flux ait eu lieu (test T, p-val=0.002).
En conclusion, l’apport d’azote avant le débourrement permet l’augmentation précoce et de manière très significative de la teneur en eau du xylème dans un premier temps étendue à l’ensemble des tissus au-delà du débourrement.
C. Cinétique de l’absorption du nitrate par mesure de disparition dans la solution nutritive
La courbe d’absorption cumulée du nitrate permet de mettre en évidence trois phases distinctes au niveau de l’absorption durant la période étudiée (figure 8) :
• Absorption de l’azote apporté avant le début du débourrement : 15 mmoles de nitrate par plante ont été absorbées dès l’apport de nitrate dans la solution nutritive avant d’atteindre un plateau le 04 mars 2012, soit 11 jours après l’apport du nitrate. L’absorption avant débourrement a été également associée à une augmentation de la pression du xylème correspondant à de la poussée racinaire qui a été mesurée (annexe 5),
• Arrêt de l’absorption du nitrate : le nitrate n’est plus absorbé entre le 04 mars jusqu’au débourrement (16 mars), montrant une résistance de la part de l’arbre à l’entrée de nitrate,
• Reprise de l’absorption à partir du débourrement : suite au plateau observé, l’absorption va recommencer progressivement après le débourrement et s’amplifier à partir du 22 mars 2012.
Ainsi, 25 mmoles de nitrate par plante seront absorbées jusqu’à la récolte « étalement des limbes ». L’amplification observée de l’absorption est parallèle au passage des flux d’eau dans la plante et de à la mise sous tension du xylème impliquant des valeurs négatives de pression.
Tableau II : Teneurs en azote (% de la matière sèche) dans la tige (écorce et xylème, haut et bas), dans les racines (fines et grosses), dans les feuilles et dans l’arbre entier depuis la sortie hiver jusqu’à 10 jours après le débourrement chez le scion de Peuplier (Populus tremula x alba) cultivé en conditions contrôlées. Les valeurs correspondent aux moyennes±écart-type avec n=5. Sortie hiverDébourrement Etalement des limbes Teneurs en azote (%MS) -N+N-N+N Ecorce 1,57±0,10a1,52±0,06a1,49±0,10a0,50±0,03c1,07±0,08b Xylème 0,45±0,04a0,50±0,03a0,48±0,01a0,19±0,01c0,35±0,02b Haut 1,77±0,27a1,93±0,18a1,82±0,19a0,50±0,07b1,22±0,24ab Bas 0,70±0,04a0,63±0,03a0,63±0,01a0,24±0,01c0,34±0,01b
Tige Totale0,97±0,09a1,04±0,07a1,01±0,07a0,30±0,02b0,59±0,07b Grosses0,67±0,04a0,66±0,06a0,78±0,05a0,32±0,02b0,69±0,08a Fines1,49±0,05bc 1,38±0,05c1,80±0,05a1,29±0,09c1,74±0,09ab Racines Totale0,92±0,02bc 0,90±0,06cd 1,12±0,04a0,73±0,03d1,10±0,06ab Feuilles - - - 2,46±0,03 4,91±0,23*** Arbre entier0,95±0,05b0,99±0,03b1,06±0,03b0,80±0,02c1,52±0,03a
