I. 1. Les protéases de la famille caspase. ...4

(1)

RÉSUMÉ...1

ABRÉVIATIONS ...2

INTRODUCTION...3

I. L’ APOPTOSE ...3

I. 1. Les protéases de la famille caspase. ...4

I. 2. Les protéines de la famille Bcl-2. ...5

I. 3. Les étapes du processus de mort cellulaire par apoptose. ...6

I. 3. 1. L’induction...7

A. Les voies extrinsèques : l’exemple de membres de la superfamille des récepteurs au TNF. ...7

A.1. Les mécanismes de transduction du récepteur Fas...7

A.2. Les mécanismes de transduction du récepteur au TNF...9

A.3. Contrôle des voies de signalisation FASL/FAS et TNF/TNFRI au niveau du récepteur. ...9

B. Les voies intrinsèques : l’exemple des dommages à l’ADN. ...10

I. 3. 2. L’intégration. ...11

A. La perméabilisation mitochondriale membranaire...11

B. La libération des protéines de l’espace mitochondrial inter-membranaire...12

C. La formation de l’apoptosome...12

D. Régulation de la propagation du signal apoptotique. ...13

D. 1. La famille des IAP...13

D. 2. Smac/DIABLO...14

D. 3. HtrA2/Omi...14

I. 3. 3. L’exécution. ...15

A. L’activation des caspases effectrices...15

B. L’activation de nucléases...16

B. 1. Le système ICAD/CAD...16

B. 2. Le facteur AIF. ...16

B. 3. L’endonuclease G. ...17

C. Les modifications membranaires...18

II. L E TNF ET LA CELLULE ENDOTHÉLIALE ...19

II. 1. Effets physiologiques du TNF sur les cellules endothéliales...19

II. 2. Activité anti-tumorale du TNF et les cellules endothéliales...19

II. 3. Les voies de signalisation du TNF...20

A. La voie d’activation des kinases de stress p38 et JNK...21

B. La voie d’activation de NF-κB...21

C. La voie d’activation des ERK...22

II. 4. Présentation du modèle expérimental : la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) traitée au TNF. ...22

III. L ES PROTÉINES DE LA FAMILLE DES HN RNP. ...24

III. 1. La famille des hnRNP...24

III. 2. La protéine hnRNP K. ...24

III. 3. Implication potentielle de hnRNP K lors de l’apoptose...25

BUT DU TRAVAIL ...26

(2)

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ...28

S ECTION 1 : E TUDE DES VOIES DE SIGNALISATION IMPLIQUÉES LORS DES PHASES PRÉCOCES DE L ’ APOPTOSE PAR L ’ APPROCHE PHARMACOLOGIQUE . ...28

Résultats et discussion...28

I. Etude des voies activables par le TNF...28

1) La voie NF-κB. ...28

2) La voie des kinases de stress p38 et JNK. ...29

3) La voie des MAP kinases ERK...31

II. Etude d’autres voies kinases potentiellement impliquées lors du processus apoptotique. ...32

1) La voie de la PKA...32

2) La voie des PKC. ...32

3) La voie des PI3K...32

Conclusions de la S ECTION 1. ...33

S ECTION 2 : E TUDE DES MODIFICATIONS POST - TRADUCTIONELLES DE PROTEINES PAR PHOSPHORYLATION LORS DES PHASES PRECOCES DE L ’ APOPTOSE PAR UNE APPROCHE PROTEOMIQUE . ...34

Résultats. ...34

I. Comparaison des profils électrophorétiques bidimensionnels (profils 2D-PAGE) de phospho-protéines de BAEC stimulées au TNF+CHX et de CHO-K1 stimulées à la STS. ...35

1) Etude sur les BAEC. ...35

2) Etude sur les cellules CHO-K1. ...36

II. Caractérisation des modifications de phosphorylations observées dans les BAEC en réponse au traitement TNF+CHX. ...37

1) Relation avec l’induction d’apoptose...37

2) Spécificité cellulaire...38

III. Identification des protéines 5 à 7 et 11 à 15...38

1) Identification des protéines 5 à 7. ...40

2) Identification des protéines 11 à 15. ...40

IV. Caractérisation de la diminution de phosphorylation de RIIα dans les BAEC...41

1) Caractérisation de la modification subie par RIIα dans les BAEC...41

2) Etude de la distribution sub-cellulaire de RIIα dans les BAEC...41

3) Etude du rôle potentiel de RIIα dans le processus de mort cellulaire par apoptose des BAEC...42

V. Caractérisation de la diminution de phosphorylation de HDGF dans les BAEC...43

1) Caractérisation de la modification subie par HDGF dans les BAEC ...43

2) Etude de la localisation cellulaire de HDGF...43

3) Etude du rôle potentiel de HDGF dans le processus de mort cellulaire par apoptose des BAEC stimulées au TNF+CHX...45

a) Etude de l’effet de la surexpression d’une protéine chimérique GFP-HDGF lors de l’apoptose des BAEC induite par TNF+CHX. ...45

b) Etude de l’effet de HDGF exogène lors de l’apoptose des BAEC induite par TNF+CHX...45

Discussion et perspectives...46

Conclusions de la S ECTION 2. ...53

(3)

S ECTION 3 : E TUDE DU RÔLE POTENTIEL DE LA PROTÉINE HN RNP K DANS LE CONTRÔLE DU

PROCESSUS APOPTOTIQUE . ...54

Résultats. ...54

I. Obtention de clones surexprimant chaque isoforme de la protéine hnRNP K. ...55

II. Etude de l’effet de la surexpression de la protéine hnRNP K sur l’induction de mort cellulaire des cellules CHO K1 induite par la staurosporine. ...55

III. Analyse de la modification de la protéine hnRNP K lors de l’apoptose des cellules CHO K1 induite par la staurosporine...56

Discussion. ...56

Conclusions et perspectives de la S ECTION 3...59

CONCLUSIONS GÉNÉRALES...60

MATÉRIEL ET MÉTHODES...61

I. Cultures cellulaires et traitement des cellules...61

1) Culture des cellules endothéliales bovine (BAEC)...61

2) Culture des cellules CHO-K1. ...61

3) Culture des cellules COS-7...61

4) Culture des cellules U937. ...62

5) Transfection de cellules eucaryotes. ...62

6) Sélection clonale. ...62

II. Mise en évidence de marqueurs associés à la mort cellulaire par apoptose. ...62

1) Inducteurs utilisés. ...62

2) Drogues utilisées...63

3) Quantification de la fragmentation de l’ADN. ...63

4) Mise en évidence de l’exposition des phosphatidyl-sérines au feuillet externe de la membrane plasmique...64

5) Mise en évidence de la libération du cytochrome c dans le cytosol. ...65

6) Dosage de l’activité Caspase-3. ...65

III. Techniques relatives à l’étude des protéines. ...66

1) Dosage protéique par méthode sur filtre en papier. ...66

2) Dosage selon Siekevitz de la radioactivité incorporée aux protéines. ...67

3) Expérience de retard sur gel (NF-κB)...67

4) Electrophorèse de protéines et technique de « western blotting ». ...68

5) Anticorps utilisés. ...69

6) Electrophorèse bi-dimensionnelle de protéines (2D-PAGE)...70

7) Mise en évidence du profil bidimensionnel électrophorétique (2D-PAGE) des phospho-protéines. ...71

8) Révélation des protéines par coloration à l’argent...72

9) Révélation des protéines par coloration au zinc. ...72

10) Purification des phospho-protéines 5 à 7 et 11 à 15. ...72

11) Digestion des échantillons et analyse au spectromètre de masse. ...73

12) Immunofluorescence indirecte...73

13) Dosage de l’AMP cyclique. ...74

14) Test d’activité kinase (PKA)...74

15) Purification de la protéine recombinante HDGF ...75

- par concentration de milieu conditionné...75

- sur colonne de nickel chélaté. ...75

16) Incorporation de [

³

H]thymidine dans les BAEC. ...76

(4)

IV. Techniques relatives à la manipulation de l’ADN. ...76

1) Minipréparation d’ADN plasmidique par la méthode de lyse alcaline...76

2) Construction des vecteurs pcDNA3, pcDNA3.1His et pEGFP contenant la séquence codante de HDGF bovin. ...77

3) Construction de vecteurs pcDNA3.1His contenant la séquence codante des 4 isoformes de hnRNP K humain...78

BIBLIOGRAPHIE ...79

ANNEXES...93

PUBLICATIONS ...99