(51) Int Cl.: C12N 5/07 ( )

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Il est rappelé que: Dans un délai de neuf mois à compter de la publication de la mention de la délivrance du brevet européen au Bulletin européen des brevets, toute personne peut faire opposition à ce brevet auprès de l'Office européen

1 176 190 B1

TEPZZ__76_9ZB_T

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EP 1 176 190 B1

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FASCICULE DE BREVET EUROPEEN

(45) Date de publication et mention de la délivrance du brevet:

05.12.2012 Bulletin 2012/49 (21) Numéro de dépôt: 01401958.2 (22) Date de dépôt: 20.07.2001

(51) Int Cl.:

C12N 5/07^(2010.01)

(54) Milieux de culture cellulaire, notamment pour la culture de follicules ou d’embryons.

Zellkulturmedium insbesondere für Kultur von Follikel oder Embryonen Cell culture medium, specially for culture of follicles or embryos (84) Etats contractants désignés:

AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

(30) Priorité: 24.07.2000 FR 0009694 (43) Date de publication de la demande:

30.01.2002 Bulletin 2002/05 (73) Titulaire: LABORATOIRE C.C.D.

75008 Paris (FR) (72) Inventeurs:

• Choay, Patrick F-75007 Paris (FR)

• Weinman, Serge F-75013 Paris (FR)

(74) Mandataire: Grosset-Fournier, Chantal Catherine Grosset-Fournier & Demachy

54, rue Saint-Lazare 75009 Paris (FR)

(56) Documents cités:

WO-A-96/12793

• LOO D T ET AL: "Differentiation of serum-free mouse embryo cells into astrocytes is accompanied by induction of glutamine synthetase activity." JOURNAL OF

NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 42, no. 2, 1995, pages 184-191, XP000993518 ISSN: 0360-4012

• ROY SHYAMAL K: "Epidermal growth factor and transforming growth factor-beta modulation of follicle-stimulating hormone-induced

deoxyribonucleic acid synthesis in hamster preantral and early antral follicles." BIOLOGY OF REPRODUCTION, vol. 48, no. 3, 1993, pages 553-557, XP000993507 ISSN: 0006-3363 Remarques:

Le dossier contient des informations techniques présentées postérieurement au dépôt de la demande et ne figurant pas dans le présent fascicule.

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Description

[0001] La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant que milieux de culture cellulaire, notamment pour follicules en cours de développement ou pour le développement d’embryons, et plus particu- lièrement d’embryons de mammifères, notamment d’embryons humains, éventuellement congelés.

[0002] Après maturation du follicule de De Graaf, l’ovu- lation permet à l’ovocyte de passer dans la trompe de Fallope pour y être éventuellement fécondé. L’embryon qui en résulte y demeure 3 à 5 jours pour se développer et atteindre les stades morula, puis blastocyste.

[0003] Dans la trompe, les gamètes, l’embryon, la morula, puis le blastocyste sont environnés par le fluide tu- baire. La composition de ce dernier est complexe : elle associe les composants fondamentaux du milieu inté- rieur de la mère à ceux du liquide folliculaire, et elle ne semble pas subir d’importants changements qualitatifs au cours des premiers jours de la phase post-ovulatoire.

Parvenu au stade blastocyste, l’embryon passe dans l’utérus dont la muqueuse a alors atteint un état de dé- veloppement favorable pour l’implantation et la nidation de l’oeuf.

[0004] Le passage de l’embryon dans l’utérus ne s’ef- fectue que lorsque l’un et l’autre sont parvenus au niveau de développement physiologique compatible avec l’implantation et la nidation : stade blastocyste pour l’embryon, endomètre proche de sa phase sécrétoire pour l’utérus.

[0005] Dans le cas de l’assistance médicale à la pro- création, ces conditions physiologiques suggèrent un milieu de culture unique et constant, et non pas séquentiel comme il en existe actuellement, associant tous les élé- ments nécessaires au développement, de la fécondation in vitro, éventuellement consécutive à l’ICSI (intra cyto- plasmic sperm injection, ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), jusqu’au transfert de l’embryon.

[0006] La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions constantes utilisables aussi bien pour la culture de follicules que pour le développement de l’embryon jusqu’au stade blastocyste, et ce avec des rendements comparables, voire supérieurs, à ceux obtenus avec les compositions actuellement sur le marché.

[0007] Le rôle des facteurs de croissance (encore désignés GF, growth factors) sur le développement in vitro des follicules est bien connu chez le mammifère.

Roy [Roy Shyamal K (1993), Biology of Reproduction, 48(3) : 553-557] décrit des compositions pour la culture in vitro de follicules comprenant au moins deux facteurs de croissance, lesquels ne sont jamais associés à un composé de la famille des corticoïdes.

[0008] La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules ou pour le développe- ment d’embryons, éventuellement après décongélation

des follicules ou des embryons, caractérisées en ce qu’elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme éner- gétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH, lesdits facteurs de croissance étant choisis parmi : - le facteur de croissance hépatique, encore désigné

HGF (hepatocyte growth factor),

- le facteur de croissance de transformation α, encore désigné TGFα (transforming growth factor), - le facteur de stimulation de colonies de granulocytes

et de macrophages, encore désigné GM-CSF (gra- nulocyte-macrophage colony stimulating factor), - le facteur épidermique de croissance, encore dési-

gné EGF (epidermal growth factor) et/ou HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor),

- les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF (growth differenciation factors), tels que le GDF-9,

- les facteurs de croissance semblables-à-l’insuline, encore désignés IGF (insuline-like growth factors), tels que l’IGF-1 et/ou l’IGF-2.

[0009] Avantageusement, les facteurs de croissance contenus dans les compositions de l’invention appartien- nent à 5 familles de cytokines. Les hormones et les facteurs de croissance sont présents à des concentrations équilibrées, compatibles avec les conditions physiologiques. Les compositions de l’invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation les molécules régulatrices dont elles ont impérativement besoin. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes humains immatures cultivés en présence de cellules folliculaires. Elles peuvent aussi as- surer le développement de l’embryon humain jusqu’au stade blastocyste. Or, ce stade a un plus fort pourcentage d’implantation dans l’utérus que lorsque le transfert de l’embryon a lieu à un stade moins avancé, notamment aux stades de deux à environ huit cellules.

[0010] Avantageusement, les compositions de l’invention contiennent au moins trois facteurs de croissance choisis parmi ceux susmentionnés.

[0011] Avantageusement, les compositions de l’invention contiennent des facteurs de croissance humains recombinants.

[0012] Des compositions particulièrement préférées contiennent au moins de l’IGF-1 et/ou de l’IGF-2.

[0013] De préférence encore, les compositions sus- mentionnées de l’invention comprennent tous les facteurs de croissance susmentionnés.

[0014] De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l’invention sont nanomolaires, et avantageusement comprises entre environ 0,25 mg/L et environ 60 mg/L, notamment entre environ 0,5 mg/L et

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environ 50 mg/L.

[0015] Avantageusement les concentrations des facteurs de croissance et de différenciation contenus dans les compositions de l’invention sont telles que : - la concentration d’EGF est d’environ 40 mg/L à en-

viron 60 mg/L, notamment d’environ 50 mg/L, - la concentration de TGFα est d’environ 20 mg/L à

environ 30 mg/L, notamment d’environ 25 mg/L, - la concentration d’HGF est d’environ 40 mg/L à en-

viron 60 mg/L, notamment d’environ 50 mg/L, - la concentration de GM-CSF est d’environ 1,25 mg/L

à environ 1,75 mg/L, notamment d’environ 1,5 mg/L, - la concentration de GDF-9 est d’environ 4 mg/L à

environ 6 mg/L, notamment d’environ 5 mg/L, - la concentration de IGF-1 est d’environ 12,5 mg/L à

environ 17,5 mg/L, notamment d’environ 15 mg/L, - la concentration de IGF-2 est d’environ 12,5 mg/L à

environ 17,5 mg/L, notamment d’environ 15 mg/L.

[0016] L’invention a également pour objet les compositions susmentionnées comprenant un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et plus particulière- ment de la famille des glucocorticoïdes, tel que l’hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, de préférence sous une forme soluble en milieu aqueux.

[0017] Avantageusement, l’hydrocortisone susmen- tionnée se présente sous forme de sel hydrosoluble, notamment sous forme d’hémisuccinate d’hydrocortisone.

De préférence, la concentration du sel d’hydrocortisone dans les compositions susmentionnées, est comprise entre environ 5 x 10^-7 M et environ 10^-6 M, et est notamment d’environ 7 x 10^-7 M, soit environ 350 mg/L pour l’hémisuccinate d’hydrocortisone.

[0018] Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clé du métabolis- me énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que :

- la concentration de NAD/NADH soit d’environ 1 mg/L,

- la concentration de NADP/NADPH soit d’environ 1 mg/L.

[0019] L’invention concerne également les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisat, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l’état sec, et sont susceptibles d’être remis en solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques.

[0020] A ce titre, l’invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisats susmentionnés, contenant : - au moins deux facteurs de croissance tels que défi-

nis ci-dessus, ou la totalité de ces facteurs, - au moins un composé de la famille des corticoïdes

défini ci-dessus, tel que l’hémisuccinate d’hydrocor-

tisone,

- et, le cas échéant, au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.

[0021] L’invention a également pour objet l’application des compositions ou lyophilisats susmentionnés, en tant qu’adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules ou pour la culture d’embryons, éventuel- lement après décongélation des follicules ou des embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules ou des embryons, lesdits élé- ments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cho- lestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine B5 (pantothènate), la vitamine B8 (biotine), la vitamine B1 (thiamine) et/ou de la vitamine C.

[0022] L’invention concerne également un procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mé- lange d’une composition telle que définie ci-dessus, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d’une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules ou des embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus.

[0023] L’invention a plus particulièrement pour objet les milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules ou pour la culture d’embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des embryons, lesdits milieux étant tels qu’obtenus par mise en oeuvre d’un procédé susmentionné, et étant caractérisés en ce qu’ils comprennent une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les élé- ments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules ou des embryons.

[0024] L’invention a également pour objet un procédé in vitro de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus parti- culièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, ca- ractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de

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culture tel que défini ci-dessus selon l’invention, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours.

[0025] Avantageusement, les compositions de l’invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation des ovocytes et la maturation des embryons, notamment jusqu’au stade de blastocyste, éventuellement après dé- congélation des follicules ou des embryons.

[0026] L’invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d’un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l’invention, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d’un procédé susmentionné, ce kit comprenant :

- une composition sous forme de lyophilisat, telle que décrite ci-dessus,

- et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules ou des embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercial tel que le milieu Upgraded B9 de CCD.

[0027] La présente invention sera davantage illustrée à l’aide de la description détaillée qui suit d’exemples de milieux de culture selon l’invention.

[0028] A titre de solution aqueuse telle que définie ci- dessus, le milieu de culture Upgraded B9 CCD disponible commercialement comprend principalement les compo- sés suivants :

- des sels minéraux : KCl, NaCl, MgSO₄, NaHCO₃, Na₂HPO₄, KH₂PO₄,

- les acides aminés essentiels, ainsi que d’autres acides aminés tels que l’acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine,

- des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate,

- des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C,

- des bases puriques et pyrimidiques,

- des antibiotiques : pénicilline G, streptomycine.

Formule n°1

[0029] Dans cette formule, le milieu de culture Upgra- ded B9 CCD correspondant à la solution aqueuse définie ci-dessus, éventuellement additionné d’insuline humaine (notamment d’insuline recombinante à raison de 5 mg/L, sur la base de 1 mg = 25 U), est complété par le lyophilisat contenant :

- de l’hémisuccinate d’hydrocortisone (7 x 10^-7 M, soit 350 mg/L),

- des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 mg/L), TGFα (25 mg/L), HGF (50 mg/L), GM- CSF (1,25 mg/L), GDF-9 (5 mg/L),

- du NAD/NADH (1mg/L) et du NADP/NADPH (1mg/L).

Formule n°2

[0030] Dans cette formule, le milieu de culture Upgra- ded B9 CCD, contenant éventuellement de l’insuline humaine, est complété par le lyophilisat contenant : - de l’hémisuccinate d’hydrocortisone (7 x 10^-7 M, soit

350 mg/L),

- des facteurs de croissance humains recombinants : EGF (50 mg/L), TGFα (25 mg/L), HGF (50 mg/L), GM- CSF (1,25 mg/L), GDF-9 (5 mg/L),

- IGF-1 (12,5 mg/L), IGF-2 (12,5 mg/L),

- et du NAD/NADH (1mg/L) et du NADP/NADPH (1mg/L).

A) PREPARATION D’UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N°1

[0031] Le milieu de culture doit être préparé extempo- ranément par mélange de deux flacons :

- un flacon A, qui se présente sous la forme d’une solution d’un volume de 10 ml et qui contient le milieu Upgraded B9 dans lequel est éventuellement dissoute l’insuline;

- un flacon B, qui se présente sous la forme d’un lyophilisat et qui contient l’hémisuccinate d’hydrocortisone et les facteurs de croissance, le NAD/NADH et le NADP/NADPH.

[0032] Au moment de l’emploi, reprendre le lyophilisat du flacon B par un faible volume (~ 0,5 ml) de la solution du flacon A. Transférer le contenu du flacon B ainsi dissous dans le flacon A. Homogénéiser. Cette opération dilue donc au dixième la concentration initiale des constituants du flacon B.

Fabrication du flacon A

[0033] Dans le cas de l’addition d’insuline, il convient de préciser qu’à l’état cristallin, les molécules d’insuline sont unies entre elles par des forces intermoléculaires qui ne se rompent qu’en milieu acide. Pour être mise en solution aqueuse, l’insuline doit donc être dissoute à pH 3 (HCI 0,1 N). Le pH de la solution est ensuite amené à 7,5 (NaOH 0,1N); cette opération doit être effectuée le plus rapidement possible, afin d’éviter des altérations de la molécule. Un léger précipité peut apparaître à pH5 ; il se redissout ensuite.

[0034] Préparer une solution à 100 U/ml. Ajouter la solution d’insuline au milieu Upgraded B9, dans les propor- tions de 1,25 ml pour 1 L, respectivement. Répartir en flacons de 10 ml qui seront fermés. Conserver la solution à +4°C. Le bulletin analytique de l’insuline, comportant, entre autres, l’activité et, éventuellement, les tests de sécurité, doit être joint ; celui-ci doit être communiqué par le fournisseur de l’insuline.

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Fabrication du flacon B

[0035] Une solution aqueuse préparée extemporané- ment contenant l’hémisuccinate d’hydrocortisone et les facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 3,5 mg d’hémisuccinate d’hydrocortisone, 500 ng d’EGF, 250 ng de TGFα, 500 ng d’HGF, 12,5 ng de GM-CSF, 50 ng de GDF-9, 10 mg de NAD/NADH et 10 mg de NADP/NADPH.

Les flacons sont immédiatement lyophilisés. Conserver le lyophilisat à + 4°C.

Conditions de fabrication

[0036] Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile.

B) PREPARATION D’UN MILIEU DE CULTURE POUR LES APPLICATIONS SUSMENTIONNEES SELON LA FORMULE N°2

[0037] IGF-1 et IGF-2 sont ajoutés à la solution initiale contenant les autres constituants du flacon B, pour ob- tenir 125 ng de chacun par flacon, puis l’ensemble est lyophilisé.

[0038] Les conditions de fabrication et de conservation sont les mêmes que celles du milieu préparé selon la formule n°1.

C) PREPARATION D’UN MILIEU CONTENANT DE L’HYDROCORTISONE ET DES FACTEURS DE CROISSANCE

[0039] Dans une première étape, un lot expérimental de milieu contenant le glucocorticoïde et des facteurs de croissance a été préparé. Ce milieu de culture était cons- titué de milieu Upgraded B9 complété seulement par de l’insuline humaine, de l’hémisuccinate d’hydrocortisone, de l’EGF, du TGFα, et de l’IGF-1 humains.

[0040] Pour compléter un flacon de 10 ml de milieu Upgraded B9, appelé flacon A, nous avons utilisé : - 12,5 ml d’une solution aqueuse d’insuline humaine

à 100 U/ml. Cette solution était présentée sous la forme d’un flacon de 10 ml, appelé ici flacon B. Les tests de sécurité (virus et prions) avaient été préa- lablement effectués.

- un flacon de lyophilisat d’une capacité de 1,2 ml, appelé ici flacon C, contenant l’hémisuccinate d’hydrocortisone (3,5mg) et les facteurs de croissance et de différenciation humains recombinants EGF (500 ng), TGFα (250 ng), et IGF-1 (125ng). Pour la préparation de ce flacon, l’hémisuccinate d’hydrocortisone (1,4 mg), l’EGF (200 mg), le TGFα (100 mg), et l’IGF-1 (50mg) ont été dissous dans 400 ml d’une solution aqueuse d’albumine humaine sécuri- sée (1 g/L). Cette solution a été passée sur filtre de 0,2 mm, puis répartie dans 393 flacons de 5 ml, à

raison de 1 ml par flacon. Ces derniers ont été lyo- philisés. Toutes ces opérations ont été effectuées en milieu stérile.

Revendications

1. Compositions pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour le développement d’embryons, éventuellement après décongélation des follicules, ou embryons, ca- ractérisées en ce qu’elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes im- pliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH, lesdits facteurs de croissance étant choisis parmi :

- le facteur de croissance hépatique, encore dé- signé HGF,

- le facteur de croissance de transformation α, encore désigné TGFα,

- le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF,

- le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF et/ou HB-EGF,

- les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF, tels que le GDF-9, - les facteurs de croissance semblables-à-l’insuline, encore désignés IGF, tels que l’IGF-1 et/ou l’IGF-2.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle contient au moins trois facteurs de croissance, ou tous les facteurs listés dans la revendication 1.

3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caracté- risée en ce que les concentrations en facteurs de croissance sont nanomolaires.

4. Composition selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les concentrations en fac- teurs de croissance sont comprises entre environ 0,25 mg/L et environ 60 mg/L, notamment entre environ 0,5 mg/L et environ 50 mg/L.

5. Composition selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production éner- gétique chez les mammifères, est un composé de la famille des glucocorticoïdes, tel que l’hydrocortisone ou un dérivé de la même famille, sous forme hydrosoluble.

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6. Composition selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu’elle comprend de l’hydrocor- tisone sous forme de sel tel qu’un hémisuccinate.

7. Composition selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’elle se présente sous forme de lyophilisat.

8. Lyophilisats définis dans la revendication 7, contenant :

- au moins deux facteurs de croissance définis dans l’une des revendications 1 à 4, ou la totalité de ces facteurs,

- un composé de la famille des corticoïdes défi- nis dans la revendication 5 ou 6, tel que l’hémi- succinate d’hydrocortisone,

- et, le cas échéant, du NAD/NADH et du NADP/

NADPH.

9. Application des compositions ou lyophilisats selon l’une des revendications 1 à 8, en tant qu’adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour le développement d’embryons, éventuellement après décongélation des follicules, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l’une des revendications 1 à 6, en association avec les élé- ments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi la sérum albumine humaine, ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergé- tiques telles que le glucose, le pyruvate, et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des pro- téines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B et/ou de la vitamine C.

10. Procédé de préparation de milieux de culture in vitro définis dans l’une des revendications 1 à 7, carac- térisé en ce qu’il comprend une étape de mélange d’une composition selon l’une des revendications 1 à 6, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d’une composition susmentionnée sous forme de lyophilisat selon les revendications 7 ou 8, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 9.

11. Milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocy-

tes contenus dans lesdits follicules, ou pour le dé- veloppement d’embryons, éventuellement après dé- congélation des follicules, ou embryons, lesdits milieux étant tels qu’obtenus par mise en oeuvre d’un procédé selon la revendication 10, et étant caracté- risés en ce qu’ils comprennent une composition se- lon l’une des revendications 1 à 6, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 9.

12. Procédé in vitro de maturation des follicules de mam- mifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus parti- culièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 11, avantageusement pendant environ 3 jours à environ 6 jours.

13. Kit pour la préparation extemporanée d’un milieu selon la revendication 11, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d’un procédé défini dans la revendication 12, caractérisé en ce qu’il comprend :

- une composition sous forme de lyophilisat selon les revendications 7 ou 8,

- et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, ou embryons, tels que définis dans la revendication 9.

Claims

1. Compositions for the in vitro culture of follicles in the course of development for the maturation of ovocytes contained in said follicles, or for the development of embryos, if desired after thawing of the follicles, or embryos, characterized in that they comprise at least two growth factors in association with at least one compound of the family of corticoids im- plied in energy production in mammals, and, as the case may be, with at least one key co-enzyme of the energy metabolism, such as NAD/NADH and NADP/

NADPH, said two growth factors being selected from:

- the hepatocyte growth factor, also called HGF, - the transforming growth factor α, also called TGFα,

- the granulocyte-macrophage colony stimulating factor, also called GM-CSF,

- the epidermal growth factor, also called EGF

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and/or HB-EGF,

- the growth-differentiation factors, also called GDF, such as GDF-9,

- the insulin-like growth factors, also called IGF, such as IGF-1 and/or IGF-2.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it contains at least three growth factors, or all the factors listed in claim 1.

3. Composition according to one of claims 1 or 2, char- acterized in that the concentrations of growth fac- tors are nanomolar.

4. Composition according to one of claims 1 to 3, char- acterized in that the concentrations of growth fac- tors are comprised between about 0.25 mg/L and about 60 mg/L, particularly between about 0.5 mg/L and about 50 mg/L.

5. Composition according to one of claims 1 to 4, char- acterized in that the compound of the family of cor- ticoids implicated in the energy production in mammals, is a compound of the family of glucocorticoids, such as hydrocortisone, or of a derivative of the same family, in water soluble form.

6. Composition according to one of claims 1 to 5, char- acterized in that it comprises hydrocortisone in the form of a salt such as a hemisuccinate.

7. Composition according to one of claims 1 to 6, char- acterized in that it is present in the form of a lyophi- lizate.

8. Lyophilizates defined in claim 7, containing:

- at least two growth factors defined in one of claims 1 to 4, or all of them,

- a compound of the family of corticoids defined in claim 5 or 6, such as hydrocortisone hemisuccinate,

- and, as the case may be, NAD/NADH and NADP/NADPH.

9. The use of compositions or lyophilizates according to one of claims 1 to 8, as adjuvants effective for the preparation of in vitro culture media for follicles in the course of development for the maturation of the ovocytes contained in said follicles, or for the development of embryos, eventually after thawing the follicles, or embryos, said in vitro culture media com- prising a composition according to one of claims 1 to 6, in association with elements conventionally used in the field of culturing follicles, or embryos, said elements being selected particularly from human albumin serum, or bovine, as the case may be recombinant, and/or mineral salts, and/or energetic

molecules such as glucose, pyruvate and lactate and/or amino acids for the biosynthesis of proteins, and/or purine and pyrimidine bases for the biosynthesis of nucleic acids, and/or phospholipids or cholesterol for the formation of cellular membranes, and/or vitamins, such as vitamins of the B group and/or vitamin C.

10. Process for the production of in vitro culture media defined in one of claims 1 to 7, characterized in that it comprises a step of mixing a composition according to one of claims 1 to 6, as the case may be after dissolution in a suitable volume of a composition mentioned above in the form of a lyophilizate according to claims 7 or 8, with a solution containing elements conventionally used in the field of culturing follicles, or embryos, said elements being as defined in claim 9.

11. In vitro culture media for follicles in the course of development for the maturation of ovocytes contained in said follicles, or for the development of embryos, eventually after thawing the follicles, or embryos, said media being as obtained by practicing a process according to claim 10, and being charac- terized in that they comprise a composition accord- ing to one of claims 1 to 6, in association with elements conventionally used in the field of culturing follicles, or embryos, said elements being as defined in claim 9.

12. In vitro process for the maturation of mammal folli- cles in the course of development for the maturation of the ovocytes contained in said follicles, and more particularly of human follicles, as the case may be after thawing previously frozen follicles, character- ized in that it comprises the step of in vitro culture of follicles from the female, and more particularly from women, in a culture medium according to claim 11, preferably for about 3 days to about 6 days.

13. Kit for the extemporaneous preparation of a medium according to claim 11, particularly in the scope of practicing a process defined in claim 12, character- ized in that it comprises:

- a composition in the form of a lyophilizate according to claims 7 or 8,

- and, as the case may be, an aqueous solution containing elements conventionally used in a field of culturing follicles, or embryos, as defined in claim 9.

Patentansprüche

1. Zusammensetzungen für die In-vitro-Kultur von Fol- likeln während der Entwicklung im Hinblick auf die

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Reifung der Oozyten, die in den Follikeln enthalten sind, oder zur Entwicklung von Embryonen, eventuell nach dem Auftauen der Follikel oder Embryonen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Wachstumsfaktoren umfassen, in Assoziation mit mindestens einer Verbindung der Familie der Corticoide, die an der Energieproduktion beim Säu- ger beteiligt sind, und gegebenenfalls mit mindestens einem Schlüsselcoenzym des Energiestoff- wechsels, wie etwa NAD/NADH und NADP/NADPH, wobei die zwei Wachstumsfaktoren ausgewählt sind aus:

- dem Hepatozyten wachstumsfaktor, auch als HGF bezeichnet,

- dem transformierenden Wachstumsfaktor α, auch als TGFα bezeichnet,

- dem Granulocyte-Macrophage-Colony-stimulating-Faktor, auch als GM-CSF bezeichnet, - dem epidermalen Wachstumsfaktor, auch als EGF und/oder HB-EGF bezeichnet,

- den Wachstums- und Differenzierungsfakto- ren, auch als GDF bezeichnet, wie etwa GDF-9, - den insulinähnlichen Wachstumsfaktoren, auch als IGF bezeichnet, wie etwa IGF-1 und/

oder IGF-2.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass sie mindestens drei Wachs- tumsfaktoren oder alle Faktoren, die in Anspruch 1 aufgelistet sind, enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, da- durch gekennzeichnet, dass die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren nanomolar sind.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentra- tionen der Wachstumsfaktoren im Bereich zwischen etwa 0,25 mg/L und etwa 60 mg/L, insbesondere zwischen etwa 0,5 mg/L und etwa 50 mg/L liegen.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Familie der Corticoide, die an der Energiepro- duktion beim Säuger beteiligt sind, eine Verbindung der Familie der Glucocorticoide ist, wie etwa Hydro- cortison oder ein Derivat der gleichen Familie in was- serlöslicher Form.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Hydrocorti- son in Form von Salz, wie etwa einem Hemisuccinat, umfasst.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Form eines Lyophilisats aufweist.

8. Lyophilisate, definiert in Anspruch 7, enthaltend:

- mindestens zwei Wachstumsfaktoren, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, oder die Gesamtheit dieser Faktoren,

- eine Verbindung der Familie der Corticoide, definiert in Anspruch 5 oder 6, wie etwa Hydro- cortison-Hemisuccinat,

- und gegebenenfalls NAD/NADH und NADP/

NADPH.

9. Anwendung der Zusammensetzungen oder Lyoph- ilisate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Adju- vanzien, die Effektoren für die Herstellung von In- vitro-Kulturmedien für Follikel während der Entwick- lung im Hinblick auf die Reifung der Oozyten, die in den Follikeln enthalten sind, oder für die Herstellung von Embryonen sind, eventuell nach dem Auftauen der Follikel oder Embryonen, wobei die In-vitro-Kul- turmedien eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfassen, in Assoziation mit den Elementen, die herkömmlich im Rahmen der Follikel - oder Embryonenkultur verwendet werden, wobei die Elemente i nsbesondere a usgewählt s ind a us gegebenenfalls rekombinantem, humanem oder bo- vinem Serumalbumin und/oder Mineralsalzen und/

oder Energiemolekülen, wie etwa Glucose, Pyruvat und Lactat und/oder Aminosäuren für die Biosynthe- se der Proteine und/oder Purin- und Pyrimidinbasen für die Biosynthese der Nukleinsäuren, und/oder Phospholipiden oder Cholesterol zur Bildung der Zellmembranen und/oder Vitaminen, wie etwa Vit- aminen der Gruppe B und/oder Vitamin C.

10. Verfahren zur Herstellung von In-vitro-Kulturmedi- en, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt zum Mi- schen einer Zusammensetzung nach einem der An- sprüche 1 bis 6 ümfasst, gegebenenfalls nach Auf- lösen in einem geeigneten Volumen einer oben ge- nannten Zusammensetzung in Form eines Lyophili- sats nach den Ansprüchen 7 oder 8 mit einer Lösung, die die Elemente enthält, die herkömmlich im Rah- men der Follikel- oder Embryonenkultur verwendet werden, wobei die Elemente so sind, wie in Anspruch 9 definiert.

11. In-vitro-Kulturmedien für Follikel während der Ent- wicklung im Hinblick auf die Reifung der Oozyten, die in den Follikeln enthalten sind, oder zur Entwick- lung von Embryonen, eventuell nach dem Auftauen der Follikel oder Embryonen, wobei die Medien so sind, wie durch Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 10 erhalten, und dadurch gekennzeich- net, dass sie eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Assoziation mit den Ele- menten umfassen, die herkömmlich im Rahmen der In-vitro-Fertilisation oder der Follikel- oder Embryo-

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nenkultur verwendet werden, wobei die Elemente so sind, wie in Anspruch 9 definiert.

12. In-vitro-verfahren zur Reifung der Follikel von Säu- gern während der Entwicklung im Hinblick auf die Reifung der Oozyten, die in den Follikeln enthalten sind, und ganz besonders der humanen Follikel, gegebenenfalls nach dem Auftauen von zuvor einge- frorenen Follikeln, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt zur In-vitro-Kultivierung von Folli- keln, die bei dem Weibchen und insbesondere bei der Frau entnommen wurden, in einem Kulturmedi- um nach Anspruch 11, vorteilhafterweise für etwa 3 Tage bis etwa 6 Tage, umfasst.

13. Kit zur Herstellung eines Mediums nach Anspruch 11 unmittelbar vor der Verwendung insbesondere im Rahmen der Durchführung eines in Anspruch 12 definierten Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

- eine Zusammensetzung in Form eines Lyoph- ilisats nach den Ansprüchen 7 oder 8,

- und gegebenenfalls eine wässrige Lösung, die die Elemente enthält, die herkömmlich im Rah- men der ’ Follikel- oder Embryonenkultur verwendet werden, wie in Anspruch 9 definiert.

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RÉFÉRENCES CITÉES DANS LA DESCRIPTION

Cette liste de références citées par le demandeur vise uniquement à aider le lecteur et ne fait pas partie du document de brevet européen. Même si le plus grand soin a été accordé à sa conception, des erreurs ou des omissions ne peuvent être exclues et l’OEB décline toute responsabilité à cet égard.

Littérature non-brevet citée dans la description

• ROY SHYAMAL K. Biology of Reproduction, 1993, vol. 48 (3), 553-557 [0007]