Caractérisation de tissus cutanés superficiels hypertrophiques par spectroscopie multimodalité in vivo : instrumentation, extraction et classification de données multidimensionnelle

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Submitted on 24 Oct 2012

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modalité in vivo : instrumentation, extraction et classification de données multidimensionnelle. In-

génierie biomédicale. Université de Lorraine, 2012. Français. �tel-00745202�

Ecole doctorale IAEM Lorraine´ DFD Automatique Universit´e de Lorraine

Caract´ erisation de tissus cutan´ es cicatriciels

hypertrophiques par spectroscopie multi-modalit´ es in vivo : instrumentation, extraction et classification de donn´ ees

multi-dimensionnelles

TH` ESE

pr´esent´ee et soutenue publiquement le 18 avril 2012 pour l’obtention du

Doctorat de l’Universit´ e de Lorraine

Sp´ ecialit´ e Automatique, Traitement du Signal et des Images, G´ enie Informatique

par

Honghui LIU

Composition du jury

Rapporteurs : Franck Marzani Le2i-CNRS, Dijon Anne Humeau-Heurtier LISA, Angers

Examinateurs : Genevi`eve Bourg-Heckly Laboratoire, Jean Perrin, UPMC, Paris 6 Walter C.P.M. Blondel CRAN, Nancy

Fran¸cois Guillemin CRAN, Centre Alexis Vautrin, Nancy Invit´ e : H´elo¨ıse Gisquet CHU, Nancy

Centre de Recherche en Automatique de Nancy CNRS – UMR 7039 Universit´e de Lorraine

Remerciements

Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire ont été e ff ectués au Centre de Re- cherche en Automatique de Nancy (CRAN), Unité Mixte de Recherche Nancy-Université, CNRS (UMR 7039), dans le groupe thématique Ingénierie Pour la Santé (IPS), groupe dirigé par Monsieur le Professeur Didier WOLF..

Tout d’abord, je me tiens à remercier La Région Lorraine et Centre Alexis Vautrin pour leur "générosité". Sans leur financement, la présente thèse n’aurait jamais en lieu.

J’exprime ensuite mes profonds remerciements à mon directeur de thèse Monsieur le Pro- fesseur Walter BLONDEL pour m’avoir encadré en donnant beaucoup d’assistance et de conseils précieux tant du côté professionnelle que personnelle. Monsieur Blondel, je vous avais côtoyé depuis mon master en GBM à Faculté de Médecine. Pour plus de 4 ans, vous m’avez appris beaucoup de choses comme un prof, un directeur de recherche et un ami. Je vous remercie également pour votre patience et sourtout votre confiance sur mon travail qui m’a permis ainsi d’évoluer mes compétences et le sens d’autonomie.

Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur François GUILLEMIN d’avoir accepté de co-diriger ma thèse, ainsi que pour ses soutiens qui m’ont permis de mener à bien mon projet doctoral.

Je remercie aussi les membres du jury : Madame le Professeur Anne HUMEAU, Mon- sieur le Professeur Franck Marzani et Madame Geneviève BOURG-HECKLY, pour l’intérêt et le temps qu’ils ont consacré à évaluer mes travaux de recherche, ainsi que pour les remarques qu’ils ont apportés sur le manuscrit et la soutance.

Je souhaite également exprimer ma reconnaissance et ma sympathie à tous ceux qui m’ont ai- dée au cours de ces années et contribué à la réalisation de la présente thèse, plus particulièrement : Madame la Docteur Héloïse Gisquet, j’ai eu la chance de collaborer avec toi pendant la première année de ma thèse, notamment au sujet de l’expérimentation sur les cicatrices hypertro- phiques. Je te remercie pour toutes les contributions que tu as apporté sur la partie expérimentale de ma thèse. Ton efficacité et ta rigeur assure la bonne organisation de nos manipulations. Je te remerci également pour la grande enthousiasme de ta famille lors de la rencontre. J’ai un grand plaisir de vous avoir fait la connaissance.

Messieurs Christian Daul et Ernest Galbrun, je vous adresse ma gratitude pour le temps que vous m’avez consacré pour les répétitions de soutenance. Vos expériences et conseils m’ont permis de bien gérer le trac pendant la soutenance et de faire une présentation splendide.

Monsieur le Docteur Randu Ratu, je vous remercie pour votre gentillesse. Il est toujours intéressant de faire des échanges scientifiques et conversation avec vous.

Monsieur le Docteur Dominique DUMAS qui a participé à la réalisation des images en

microscopie confocale, et à Madame Anne-Laure LEBLANC pour son efficacité au sein de

l’animalerie. Sans oublier Le Docteur Agnès LEROUX et ses collaborateurs du service

d’Anatomie Pathologique du Centre Alexis Vautrin qui donnent leur soutien tecnnique lors de

sistance.

Je remercie aussi tous mes amis et collègues dans le laboratoire, Ricardo, Christophe, Grace, Achraf, Thomas, Marine, Gilberto, Carlos, Ebrahime, Vanessa, Julien, Yanis, Varis, Guntars, Khadidja, Hecene, etc. , pour leur constance de soutien moral. J’apprécie énormément les moments sympas que nous avons vécu ensemble pendant ces quelques années.

Votre camaraderie a rendu l’atmosphère générale du laboratoire des plus agréables. Cette at- mosphère fut propice à un plaisir indispensable pour venir au travail chaque jour L’amétié avec vous est une aubaine que j’ai apporté en plus de mon titre doctorat. Je souhaite sincèrement une bonne continuation pour vous tous et une autre rencontre quelque jour et quelque part dans le future.

Enfin, mes remerciements les plus chaleureux à mes parents pour leur soutien pendant toute

la durée de mes études.

À mes parents,

Table des matières

Table des figures ix

Liste des tableaux xiii

Liste des acronymes xv

Nomenclature xvii

Introduction 1

Chapitre 1 Contexte de l’étude et problématique scientifique 3

1.1 Préambule . . . . 3

1.2 Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique . . . . 5

1.2.1 Contexte scientifique . . . . 5

1.2.1.1 Optique biomédicale . . . . 5

1.2.1.2 Interactions lumière-tissus biologiques . . . . 6

1.2.2 Contexte clinique : dermatologie . . . . 13

1.2.3 La peau : description histologique et propriétés optiques . . . . 14

1.2.3.1 Epiderme . . . . 14

1.2.3.2 Derme . . . . 17

1.2.3.3 Hypoderme . . . . 18

1.2.4 Hypertrophie cutanée . . . . 19

1.2.4.1 Epidémiologie et causes . . . . 19

1.2.4.2 Physiopathologie . . . . 21

1.2.4.3 Diagnostic . . . . 21

1.3 Méthodes de spectroscopie point par point appliquées au diagnostic tissulaire in vivo . . . . 24

1.3.1 Spectroscopie d’autofluorescence . . . . 27

1.3.1.1 Fluorophores endogènes des tissus biologiques . . . . 28

1.3.1.2 Avantages et limites des méthodes existantes . . . . 29

1.4.3 Traitement des signaux et des données . . . . 39

Chapitre 2 Développement Instrumental 41 2.1 Etat de l’art des solutions technologiques pour les systèmes de spectroscopie op- tique fibrée in vivo . . . . 41

2.1.1 Sources d’excitation . . . . 42

2.1.1.1 Excitations simple et multiple pour l’autofluorescence . . . . 42

2.1.1.2 Excitation pour réflectance di ff use . . . . 44

2.1.1.3 Sources d’excitation multi-modalitée . . . . 45

2.1.2 Sondes fibrées . . . . 45

2.1.2.1 Spectroscopie de réflectance diffuse . . . . 46

2.1.2.2 Spectroscopie d’autofluorescence . . . . 47

2.1.3 Systèmes d’acquisition spectroscopique . . . . 48

2.2 Instrumentation existante . . . . 49

2.2.1 Cahier des charges pour la poursuite du développement instrumental . . . 53

2.2.1.1 Puissance d’excitation pour l’autofluorescence . . . . 53

2.2.1.2 Excitation large bande pour réflectance diffusse . . . . 53

2.2.1.3 Automatisation complète des mesures . . . . 54

2.2.1.4 Objectifs de développement . . . . 54

2.3 Travaux réalisés : améliorations apportées sur le système instrumental . . . . 56

2.3.1 Optimisation de la puissance de lumière incidente (sur le tissu) . . . . 56

2.3.2 Solution technique pour une bande d’excitation unique en RD . . . . 59

2.3.3 Solution logicielle pour une Interface utilisateur unique . . . . 59

2.3.4 Intégration du système et rack transportable . . . . 60

2.4 Caractérisation métrologique et calibrage de l’instrumentation . . . . 60

2.4.1 Etalonnage du détecteur en longueur d’onde . . . . 63

2.4.2 Correction de la réponse spectrale du système . . . . 63

2.4.3 Normalisation de la puissance de la source d’excitation . . . . 65

2.5 Conclusion du chapitre . . . . 65

Chapitre 3 Étude préclinique in vivo sur tissus hypertrophiques 69 3.1 Modèle préclinique de cicatrice cutanée hypertrophique . . . . 69

3.1.1 Choix du modèle . . . . 69

3.1.1.1 Modèles in vitro et ex vivo . . . . 70

3.1.1.2 Modèles in vivo . . . . 70

3.1.2 Technique d’induction de cicatrice hypertrophique . . . . 71

3.1.3 Mise au point du modèle et du protocole . . . . 72

3.1.3.1 Etude préliminaire et validation du modèle . . . . 72

3.1.3.2 Di ffi cultés liées aux mesures spectroscopiques . . . . 73

3.2 Expérimentation . . . . 75

3.2.1 Organisation des expérimentations . . . . 75

3.2.2 Mesures spectroscopiques . . . . 76

3.3 Analyses histologiques . . . . 78

3.3.1 Matériels et méthodes . . . . 78

3.3.2 Résultats . . . . 78

3.4 Conclusion . . . . 80

Chapitre 4 Sélection et classification de données spectroscopiques 83 4.1 Etat de l’art sur le traitement des données spectroscopiques en vue d’une classifi- cation tissulaire . . . . 83

4.1.1 Prétraitement des spectres . . . . 85

4.1.2 Classification . . . . 86

4.1.2.1 Jeux de données d’apprentissage . . . . 87

4.1.2.2 Extraction de caractéristiques . . . . 88

4.1.2.3 Sélection de caractéristiques discriminantes . . . . 95

4.1.2.4 Méthodes de Classification (supervisée) . . . . 99

4.2 Solutions méthodologiques développées . . . 109

4.2.1 Présentation des données spectrales . . . 109

4.2.2 Algorithme de prétraitement . . . 110

4.2.3 Extraction/Sélection des caractéristiques discriminantes pour la classification116 4.2.3.1 Solution précédente et problèmes posés . . . 116

4.2.3.2 Solution développée pour notre étude . . . 117

4.2.4 Classification supervisée . . . 122

4.3 Résultats et Discussion . . . 123

cipales utilisées pour la classification ( l’étude de [Diaz, 2009]) 149

Table des figures

1.1 Schéma du principe de réflection/réfraction (Loi de Snell-Descartes) . . . . 7

1.2 Coefficients d’extinction en fonction de la longueur d’onde pour les principaux chromophores de la peau . . . . 9

1.3 Coefficients d’extinction en fonction de la longueur d’onde pour les principaux chromophores de la peau . . . . 10

1.4 Diagramme de Jablonsky simplifié . . . . 10

1.5 Illustration de la structure de la peau humaine . . . . 14

1.6 Schéma de la structure de l’épiderme . . . . 15

1.7 Spectres de coe ffi cient d’extinction molaire pour les deux types de mélanine dans la peau humaine . . . . 16

1.8 Image d’une coupe histologique du derme . . . . 18

1.9 Représentation schématique montrant les profondeurs de pénétration de la lumière en fonction des longueurs d’onde au sein des di ff érentes couches cutanées. . . . . 19

1.10 Photographes d’exemples de cicatrice hypertrophique et de chéloïde . . . . 20

1.11 Images de coupes histologiques de peau saine et de peau cicatricielle hypertro- phique prélevées sur des oreilles de lapin dans le cadre de notre étude pré-clinique 22 1.12 Exemple de 4 courbes de ROC . . . . 24

1.13 Représentation schématique des principaux éléments constitutifs d’un système de spectroscopie fibré solue spatialement . . . . 25

1.14 Schéma illustrant les multiples zones d’exploration permises par l’utilisation de plusieurs distances interfibres . . . . 26

1.15 Spectres d’absorption et d’émission de quelques fluorophores endogènes . . . . 31

1.16 E ffi cacité de di ff usion pour les phères de polymère de 1 et 2µm de diamètre . . . 33

2.1 Exemple de spectres d’intensité d’émission par sources LEDs . . . . 43

2.2 Exemple de spectre d’intensité caractéristique d’une lampe mercure-argon . . . . 44

2.3 Présentation schématique de la distribution spatiale des photons (“Banana Shape”) dans un milieu semi-infini . . . . 46

2.4 Représentation schématique de la configuratin Fastie Ebert . . . . 49

2.5 Diagramme de la configuration Czerny Turner . . . . 49

2.6 Représentation schématique illustrant la formation des images spectrales pour trois fibres réceptrices et le découpage en zone de la matrice CCD. . . . 50

2.7 Représentation schématique de l’ancien système spectroscopique bimodal réalisé pour une étude en tissue cancéreux de la vessie . . . . 51

2.8 Représentation schématique de l’instrumentation développée pour la spectroscopie

bimodale . . . . 51

2.17 Schéma-bloc illustrant le fonctionnent pour le nouveau système développé . . . . 61 2.18 Exemple de contenu d’un fichier de configuration pour le programme développé . 62 2.19 Photographie des parties du système avant leur intégration . . . . 62 2.20 Photographies des parties du système après leur intégration dans un rack trans-

portable . . . . 63 2.21 Principe de la correction par rapport à la réponse spectrale non-linéaire du sys-

tème, appliquée à chaque voie (fibre) de mesure . . . . 64 2.22 Exemple de facteurs de correction de la réponse spectrale obtenus à l’excitation

de 360nm . . . . 65 2.23 Courbes typiques moyenne , minimale et maximale de variation de la puissance

relative au cours du temps d’utilisation de la lampe Xénon 300W . . . . 66 3.1 Photographie de plaies réalisées sur la face ventrale d’une oreille de lapin sous

anesthésie générale . . . . 72 3.2 Photographie d’un exemple de cicatrice hypertrophique 28 jours après le prélèvement 72 3.3 Schéma représentant les épaisseurs mesurées pour le calcul de l’indice d’élévation

cicatricelle . . . . 73 3.4 Pièces accessoires utilisées pour l’expérimentation . . . . 74 3.5 Organisation chronologique de l’expérimentation . . . . 76 3.6 Image illustrant les parties du système après l’intégration dans un rack transportable 79 3.7 Images des coupes illustrant la Densité Cellulaire pour les tissus sain, cicatriciel

hypertrophique et cicatriciel normal . . . . 80 4.1 Organigramme des fonctions de prétraitement implémentées pour nos spectres

d’intensité d’autofluorescence . . . . 86 4.2 Schéma illustrant la projection des données caractéristiques sur l’axe d’une com-

posante principale . . . . 89 4.3 Interprétation géométrique des corrélations des variables . . . . 95 4.4 Schéma-bloc simple de la méthode “filter” . . . . 96 4.5 Schéma-bloc de la méthode “wrapper” qui utilise le résultat obtenu par l’algorithme

de classification pour évaluer l’optimalité des caractéristiques . . . . 98

4.6 Explication géométrique de l’approche d’ADL . . . 100

4.7 Distributions de deux classes de données en fonction de leur variance et covariance 102

4.8 Exemple de classification k-ppv d’un objet S . . . 103

4.9 Représentation schématique de la structure d’un neurone artificiel . . . 104

4.10 Structure de réseau neuronal à 3 couches . . . 105

4.11 Organisation de nos données spectrales dans une matrice 3D M

. . . 109 4.12 Parties constitutives d’une courbe typique de spectre d’autofluorescence excité à

440nm . . . 112 4.13 Comparaison des spectres avant et après la suppression d’artéfact par un filtre de

médian . . . 113 4.14 Exemple de spectres erronés . . . 114 4.15 Comparaison de spectres avant et après le lissage par un filtre polynomial . . . . 115 4.16 Comparaison de spectres avant et après la correction spectrale . . . 116 4.17 Comparaison des formes entre les spectres normal et aberrant mesurés dans cette

étude . . . 118 4.18 Comparaison des variations spectrales (écart-type) entre les individus hypertro-

phique et non-hypertrophique . . . 120 4.19 Comparaison par morceaux des spectres moyens (excités à 360nm et mesurés au

5

CEF S) pour les tissus HT et NHT . . . 121 4.20 Schéma illustrant la méthode de comparaison des e ffi cacités en termes de classifi-

cation entre deux caractéristiques quelconques . . . 121 4.21 Schéma illustrant les profondeurs d’exploration permises par les CEFS 440µm et 670µm

pour une excitation de 420nm, en correspondance avec les épaisseurs profondeurs

moyennes ± EC des couches explorées pour les tissus cutanés (sains, cicatriciels

hypertrophiques et non-hypertrophiques) de notre étude . . . 126

A.1 Spectre étalon de la lampe de calibrage (DH 2000-CAL, Ocean Optics). . . 148

Liste des tableaux

1.1 Indices de réfraction mesurées ex vivo par réfractomètre pour différentes couches

cutanées dans le corps humain [Ding et al., 2006] . . . . 8

1.2 Définition des caractéristiques d’un test de dépistage . . . . 23

1.3 Pics de longueurs d’onde d’excitation et d’émission des principaux chromophores et fluorophores endogènes des tissus biologiques . . . . 30

1.4 Performance de di ff érentes techniques spectroscopiques pour la classification des tissus lésionaux et sains dans l’oesophage de Barret . . . . 37

1.5 performance des différentes techniques spectroscopiques pour séparer les SIL de non-SIL . . . . 37

2.1 Caractéristiques techniques du système d’acquisition spectroscopique . . . . 53

2.2 Comparaison de puissance P à la sortie de fibre d’excitation avant et après les modifications apportées . . . . 59

3.1 Paramètres utilisés pour la mesure spectroscopique in vivo . . . . 77

3.2 Nombre de cicatrices hypertrophiques apparues dans l’étude . . . . 78

3.3 Nombre de cicatrices hypertrophiques apparues dans l’étude . . . . 79

3.4 Nombre de cicatrices hypertrophiques apparues en fonction du site anatomique . 80 4.1 Valeurs de S

et S

obtenues pour les caractéristiques sélectionnées en utilisant classifieur k-ppv avec valeur de k différentes. . . 123

4.2 Caractéristiques sélectionnées pour la classification finale . . . 124

4.3 Performance générale des 3 méthodes testées pour la classification des tissus hy- pertrophiques et non-hypertrophiques . . . 124

4.4 Rappel des pics et bandes spectrales d’émission de plusieurs fluorophores rapportés dans les études sur la peau pour les longueurs d’onde d’excitation liées à nos caractéristiques extraites . . . 125

4.5 Valeurs moyennes de sensibilité et de spécificité obtenues pour les 3 méthodes de classification en utilisant toutes les caractéristiques optimales ou seulement les caractéristiques communes . . . 127

B.1 Caractéristiques extraites des spectres pour chaque excitation en autofluorescence et des spectres en RD dans l’étude de [Diaz, 2009] . . . 150

B.2 Nombre de caractéristiques finalement retenues après la méthode de sélection dans l’étude de [Diaz, 2009] . . . 151

B.3 Nombre de composantes principales (CPs) utilisées pour la classification dans

l’étude de [Diaz, 2009] . . . 151

Liste des acronymes

ACP Analyse en Composantes Principales ou « Principal Component Analysis », PCA ADL Analyse Discriminante Linéaire ou « Linear Discriminant Analysis », LDA AF Autofluorescence

B classe des tissus Bénins

CCD « Charged Couple Device » ou Dispositif à Transfert de Charge CIS Carcinome In Situ ou carcinome intra-épithélial

DBG Dysplasie de Bas Grade DEL Diode Electroluminescente DHG Dysplasie de Haut Grade

FAD « Flavine Adenine Dinucleotide »

FCTB Facteur de Croissance Transformant Beta ou « Transforming Growth Factor beta », (T GF − β)

FOLV Filtre Optique Linéairement Variable FP Faux Positif

FN Faux Négatif

FWHM « Full Width at Half Maximum » ou largeur à mi-hauteur H classe de tissus Hypertrophiques

Hb Désoxy-hémoglobine HbO

Oxy-hémoglobine

IEC Indice d’Elevation Cicatricielle IMC Imagerie Microscopique Confocale IR InfraRouge

k-ppv k-plus proches voisins ou « k Nearest Neighbour »,(k-NN)

LASER « Light Amplification by Simulated Emission of Radiation » ou Amplification de la

Lumière par Emission Stimulée de Rayonnement,(ALESR)

ON Ouverture Numérique ou « Numerical Aperture » RD Réflectance Di ff use ou DR Di ff use Reflectance

ROC « Receiver Operating Characteristic » ou courbe caractéristique d’efficacité RSB Rapport Signal sur Bruit ou SNR « Signal to Noise Ratio »

SAF Spectroscopie d’Autofluorescence

SDE Spectroscopie de Di ff usion ou Élastique« Elastic Scattering Spectroscopy », (ESS) SDS Spectroscopie par Diffusion Simple ou « Light Scattering Spectroscopy »(LSS) Se Sensibilité ou « Sensitivity »

Sp Spécificité ou « Specificity »

SRD Spectroscopie Réflectance Diffuse ou DRS « Diffuse Reflectance Spectroscopy » STM Spectroscopie Trimodale ou « Trimodal Spectroscopy »(TMS)

SVM Séparateur à Vaste Marge ou « Support Vector Machine »( ou Machine à Vecteur de Support (MVS))

TCO Tomographie de Cohérence Optique ou « Optical Coherence Tomography »(OCT) TOD Tomographie Optique en Di ff usion ou « Optical Di ff usion Tomography »(ODT) TOF Tomographie Optique en Fluorescence ou « Optical Fluorescence Tomography »(OFT) PDT « Photodynamic Therapy » ou Thérapie PhotoDynamique (TPD)

UV UltraViolet VP Vrai Positif

VPP Valeur Prédictive Positive

VPN Valeur Prédictive Négative

VN Vrai Négatif

Nomenclature

Grandeurs

A Absorbance

c

Célérité de la lumière dans le vide, 3.10

m.s

[C] Concentration molaire, mol.L

d Diamètre, mm

E Énergie, J

F

Fibre réceptrice F

Fibre excitatrice g Facteur d’anisotropie

h Constante de Planck, 6,64.10

J.s I Intensité lumineuse, W.sr

L Longueur, mm

LISR Logarithme Inverse du Spectre de Réflectance N Nombre d’unités ou d’évènements

n Indice de réfraction

n

Indice de réfraction du milieu du faisceau incident n

Indice de réfraction du milieu du faisceau transmis

p Probabilité

R Coe ffi cient de réflexion

R(λ) Réflectance

R

Rapport d’intensité spectrales à 615 nm à 565 nm

r Rayon, mm

r

Distance entre fibre d’excitation et de réception, mm S

Etat fondamental d’une molécule

S

Etat substable d’une molécule

S

Etat excité d’une molécule fluorescente.

s Facteur de dilatation d’une fonction d’ondelette

t Durée, ms

V Volume, m

v vitesse, m.s

w

poids de calcul

z Coordonnée spatiale suivant la direction de profondeur z

distance d’extrapolation

Symboles grecques

θ

Angle critique au delà duquel la transmission n’est plus possible

θ

Angle d’incidence formé entre la normale à l’interface et le rayon incident θ

Angle de réflection formé entre la normale à l’interface et le rayon réfléchi θ

Angle de réfraction formé entre la normale à l’interface et le rayon réfracté ξ, ξ

, ξ

Fonction Transformation liées à chaque neurone artificiel

Indices

abs d’absorbtion ou absorbé(e)

calc Calculé(e)

calib Calibré(e)

em d’émission ou émis(e)

ex d’excitation

o d’origine

mes mesuré(e)

ref référentiel(le)

ϕ Un milieu optique

Notations mathématiques

¯

x moyenne de variable

ψ

(t) Fonction d’Ondelette

ψ

[t] Fonction d’Ondelette Discrète

̺[t] Coefficient d’ondelette

Introduction

Au cours des vingt dernières années, la spectroscopie tissulaire est devenue une méthode diag- nostique de plus en plus importante dans le domaine biomédical. Le principe de cette technique dite de " biopsie optique " repose sur l’exploitation des interactions entre la lumière et le tissu biologique, qui concernent principalement l’absorption, la fluorescence et la di ff usion élastique des photons. Cette méthode consiste à faire l’analyse des mesures spectrales de ces interactions lumière-tissu, associées aux différentes conditions biologiques ou pathologiques, afin d’en extraire des informations (biochimiques et/ou structurales) intéressantes pour le diagnostic, notamment de cancers. L’intérêt clinique de l’approche spectroscopique provient de la nature non-ionisante de la lumière utilisée, du caractère non-traumatique (non-invasif) de la mesure, de sa grande sen- sibilité [Valette, 2002], ainsi que de sa capacité de mise en oeuvre in vivo, en clinique, au moyen de systèmes à fibres optiques. La plus développée jusqu’à présent, la Spectroscopie d’Autofluo- rescence (SAF) présente une grande sensibilité à la composition biochimique des tissus, lié au développement précoce de pathologies. La Spectroscopie de Réflectance Di ff use (SRD), malgré une moindre spécificité de mesure, nécessite des instruments plus simples et faciles à mettre en oeuvre pour la clinique. Par ailleurs, comparée à la technique d’AF, le temps nécessaire pour la mesure en RD est plus court, et le rapport signal sur bruit(RSB) est bien meilleur.

Les spectres mesurés par ces deux méthodes spectroscopiques portent des informations liées respectivement à la nature biochimique et morphologique du tissu. L’objectif est alors de recher- cher les déformations significatives de ces spectres en lieu avec la progression pathologique des tissus afin de faire la distinction entre les tissus normaux et ceux pathologiques. Un grand nombre d’études dans la littérature montrent que la combinaison de ces informations complémentaires (AF et RD) peut augmenter la sensibilité et la spécificité du diagnostic et donc sa fiabilité.

Le sujet d’étude de cette thèse est donc le développement d’une méthode spectroscopique bimodale pour la caractérisation des tissus biologiques in vivo. Cette étude multidisciplinaire concerne des tâches liées à :

– l’instrumentation : conception d’un système de spectroscopie bimodale (autofluorescence et diffusion élastique) fibrée, résolue spatialement pour des expérimentations tissulaires in vivo ;

– l’expérimentation : mise en place d’un modèle préclinique et validation d’un protocole expérimental de mesures ;

– le traitement de signaux : développement méthodologique pour corriger et débruiter les spectres ;

– le traitement de données : extraction de signatures spectrales discriminantes ; sélection

de caractéristiques et adaptation de méthodes de classification adéquates pour nos jeux de

données (faible taille d’échantillon).

L’étude expérimentale sur tissus hypertrophiques in vivo est présentée au chapitre 3, avec des informations détaillées sur le contexte clinique, sur le modèle préclinique adopté, ainsi que sur le protocole expérimental.

Au début du chapitre 4, les méthodes de traitement de données spectroscopiques utilisées

dans la littérature sont recensées. A partir d’une part, des problèmes à résoudre qui y sont men-

tionnnés pour la classification spectroscopique et d’autre part, compte tenu des spécifictés de

notre étude, nous proposons quelques méthodes innovatrices pour améliorer le résultat de classi-

fication de nos données. Les résultats obtenus par ces méthodes sont discutés à la fin du chapitre.

1

Contexte de l’étude et problématique scientifique

C ^e chapitre présente, en première partie l’application médicale dans laquelle s’inscrivent nos travaux (la dermatologie) ainsi que les principaux éléments de la structure histologique et de la composition biochimique de la peau humaine.

La deuxième partie consacrée à la présentation d’une pathologie cutanée “l’hypertrophie cica- tricielle”, constitue le contexte médical et scientifique de notre étude. Les modifications structu- rales au cours de l’évolution de cette maladie sont présentées et corrélées à plusieurs constituants de la peau, ce qui présente un intérêt potentiel en termes de détection et de caractérisation in vivo du tissu hypertrophique par spectroscopie multimodalités.

La dernière partie propose un état de l’art des méthodes de spectroscopie tissulaire appliquées au diagnostic in vivo.

1.1 Préambule

Depuis plusieurs années, notre équipe consacre une partie de ses activités au développement d’outils de diagnostic par méthodes spectroscopiques atraumatiques pour détecter, localiser et identifier des cellules ou tissus pathologiques, plus spécialement en cancérologie. Les travaux antérieurs à cette thèse concernent le diagnostic in vivo de lésions pré-cancéreuses et de cancers épithéliaux et plus particulièrement les pré-cancers cutanés : tissus hyperplasiques, dysplasiques et Carcinomes In Situ (CIS).

A la suite des bons résultats obtenus dans le cadre des travaux précédemment réalisés, nous avons souhaité élargir le champ d’application de la technique de spectroscopie fibrée multi- modalités en conduisant une étude originale sur la classification spectroscopique in vivo de tissu chéloïdal ou cicatriciel hypertrophique.

Les motivations de cette orientation thématique applicative sont les suivantes :

les essais cliniques initialement envisagés n’ont pu être mise en place pour la période de la présente thèse ;

– l’opportunité d’élargir l’étude de l’efficacité de notre méthode de biopsie optique pour la première fois au traitement et au diagnostic de cicatrices hypertrophiques cutanées dans le cadre d’un travail collaboratif avec le service de chirurgie maxillo-faciale du CHU de Nancy ( chirurgienne esthétique en année recherche M2R en pharmacologie, Héloïse Gisquet) ; L’objectif de cette étude est de développer et valider une méthode innovante pour carac- tériser la cicatrice hypertrophique ou chéloïde cutanée par spectroscopie bimodale (Au- tofluorescence et Réflectance Di ff use). Cette méthode permettrait par ailleurs d’e ff ectuer des études pharmacodynamiques associées au développement de cicatrices hypertrophiques sans passer par la voie de biopsies mécaniques.

En fait, l’hypertrophie tissulaire est un développement important de taille de tissu à cause d’altérations fonctionnelles et ceci de manière très variable. Elle est différente de l’hy- perplasie (étudiée dans les thèses précédentes) par le nombre de cellules (plus important pour l’hyperplasie) et l’acroissement de taille cellulaire (plus grosses pour l’hypertrophie).

Cependant, l’hypertrophie cellulaire et l’hyperplasie peuvent à la fois conduire à une hyper- trophie tissulaire ou organique (augmentation de volume de tissu ou d’organe). La cicatrice hypertrophique ou chéloïde concerne donc un phénomène hypertrophique au niveau de la cicatrisation. Elle est considérée comme une tumeur dermique fibreuse bénigne résultant d’une cicatrisation pathologique qui se traduit par une production excessive, donc un phé- nomène d’hyperplasie, de divers constituants du tissu conjonctif [Marneros and Krieg, 2004]. Les cicatrices hypertrophiques ou chéloïdiales, en général, ne sont pas malignes en tant que telles ; mais dans certaines conditions, elles vont conduire à des problèmes plus graves comme des risques de cancers, tel que le sarcome Kaposi [Oluwasanmi et al., 1969].

L’étude de ce type de lésion présente un intérêt particulier par rapport à une application

ultérieure de la méthode développée en oncologie, grâce à une connaissance plus approfon-

die de caractéristiques spectrales d’états tissulaires bénins.

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique

1.2 Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique

1.2.1 Contexte scientifique 1.2.1.1 Optique biomédicale

Les travaux de recherche dans le domaine de l’optique biomédicale étudient l’application de la photonique aux tissus biologiques, en particulier à visée d’explorations diagnostiques in vivo.

Les axes d’étude dans ce domaine exploitent :

– les effets de la lumière sur les cellules et les tissus biologiques afin de traiter une pathologie et notament : la chirurgie LASER en dermatologie ou en chirurgie vasculaire, la photothé- rapie et la thérapie photodynamique (PDT).

– la manière dont les photons interagissent avec les di ff érents constituants des tissus, ce qui consiste à exploiter les variations de certaines propriétés mesurables de la lumière, telles que l’absorption, la fluorescence ou la diffusion (élastique et inélastique), afin d’obtenir des images structurelles/fonctionnelles des tissus ou de les caractériser à partir des para- mètres spectraux mesurés ou calculés. Les travaux de recherche essentiels dans ce domaine concernent le développement de nouvelles méthodes diagnostiques qui soient atraumatiques et utilisables in vivo.

Par rapport à d’autres techniques biomédicales d’exploration utilisant les ultrasons, les RX ou la résonnance magnétique (échographie, radiologie, IRM,etc.), les méthodes optiques possèdent des avantages importants :

– les photons dans la bande NUV-visible-IR fournissent des irradiations non-ionisantes et sécurisées d’intérêt pour les applications médicales ;

– les spectres d’intensité recueillis suite aux interactions optiques entre lumière et tissus four- nissent des informations liées aux caractéristiques morphologiques et/ou biochimiques des tissus ;

– une étude spectroscopique permet d’explorer simultanément plusieurs phénomènes photo- physiques dont les informations sont complémentaires pour un examen global ;

– les instruments nécessaires pour les mesures spectroscopiques sont relativement moins com- plexes avec un prix plus abordable ; les procédures d’acquisition sont simples et rapides.

En contre-partie, elles présentent des inconvénients liés à la nature des mesures, tels que : – des profondeurs d’exploration limitées par l’absorption de la lumière due à la présence

importante de chromophores (comme l’eau et l’hémoglobine) dans les tissus biologiques ; – un problème inverse (c’est à dire retrouver les paramètres optiques exacts à partir de

spectres d’intensité mesurés sur la suface du tissu) difficile à résoudre compte tenu de la forte di ff usion et de la complexité des modèles.

[Wagnieres et al., 1998] ont divisé les méthodes de diagnostic optique en deux catégories,

spectroscopie et imagerie, selon l’instrument utilisé et/ou l’application clinique finale.

Sung et al., 2003; Mauna Kea Technologies, 2007; Tuchin, 2007], la Tomographie Optique en Di ff usse ou en Fluorescence (TOD ou TOF) [Taroni et al., 2005; Enfield et al., 2007], exploitent des phénomènes d’interaction lumière-tissu à des longueurs d’onde specifiques, et créent des images des tissus, en topographie ou en section. Les instruments utilisés pour l’imagerie possèdent typiquement une source monochromatique et une conception optique sans contact (c’est à dire, la source lumineuse est projetée sur le tissu) pour avoir une plus large surface d’exploration. Dans la mesure où les tissus normaux et pathologiques présentent des caractéristiques di ff érentes (intensité lumineuse, durée de vie de fluores- cence, etc.), les lésions et les tissus sains peuvent être identifiés par des contrastes d’image.

Donc, les techniques d’imagerie sont plus adéquates pour la localisation de tumeurs. En revanche, afin d’obtenir des images spectrales les plus contrastées possible, les longueurs d’onde d’excitation et de détection doivent être optimisées a priori pour une application donnée, ce qui nécessite de recourir souvent à la méthode spectroscopique. [Qu et al., 1995;

Forrer et al., 1995; Coghlan et al., 2000; Zellweger et al., 2001]

Dans le cadre des travaux de recherche dans notre laboratoire (IPS), nous voulons développer une méthode de diagnostic simple et non-invasive pour aider le clinicien au guidage biopsique et à la détermination plus précise de marges chirurgicales en péri-opération. La technique spectroscopique est donc une direction principale à cette fin applicative.

1.2.1.2 Interactions lumière-tissus biologiques

Réflexion/réfraction Lorsque la lumière passe d’un milieu d’indice de réfraction donné à un autre, une partie de l’énergie lumineuse pénètre dans le nouveau milieu avec un changement de direction de propagation (réfraction), et une autre partie reste dans le milieu d’origine en suivant une autre direction déterminée par la loi de Snell Descartes (réflexion).

Cette loi annonce que :

– les rayons réfractés et réfléchis sont dans le plan d’incidence,

– l’angle de réflexion par rapport à la normale θ

est équivalent à celui du faisceau incident

θ

et du même côté de l’interface,

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique

Figure1.1 – Schéma du principe de réflection/réfraction (Loi de Snell-Descartes)

– les indices de réfraction n

et n

de chacun des milieux et les angles d’incidence θ

et de réfraction θ

sont liés par la relation de Snell-Descartes (Equ. 1.1) :

n

· sin θ

= n

· sin θ

(1.1)

Pour un couple d’indices n

et n

, un angle critique θ

peut être déterminé. Il est défini par θ

= arcsin(

i

) (pour θ

= 90 ˚), est un angle au delà duquel la transmission n’est plus possible.

Dans une étude en optique biomédicale, on veut généralement maximiser la transmission de lumière à l’interface air-tissu, afin d’optimiser l’e ff et d’excitation ou thérapeutique.

Les phénomènes physiques de réfraction et réflexion sont causés par le changement de vitesse de la lumière dans les di ff érents environnements physiques du milieu. Ce changement de vitesse est déterminé par un indice de réfraction qui est le rapport entre les vitesses de la lumière dans le milieu v

(λ) et dans le vide c

(Equ. 1.2) [Jackson, 2001] :

n(λ) = c

v

(λ) (1.2)

Les tissus biologiques contenant principalement de l’eau (n

= 1.33) et des protéines (n

= 1.6), leur indice de réfraction varie entre 1.35 et 1.5. La différence des indices de réfraction entre le tissu et l’air (n

≈ 1) ou entre couches de tissus donne lieu à la réfrac- tion/réflexion au niveau des interfaces. Ce phénomène est important en optique biomédicale, parce qu’il conditionne non seulement la portion de lumière pénétrant dans le tissu pour y in- teragir, mais aussi l’intensité du signal lumineux sortant du milieu biologique pour la détection.

La réflectivité ou réflectance, fraction de flux énergétique incident réfléchi, à l’interface air-tissu

est typiquement entre 5 et 25%. Le tableau (Tab. 1.1) [Ding et al., 2006] recense les valeurs

d’indices de réfraction mesurées pour di ff érentes couches de la peau humaine, comprises entre

633 1, 396

1.3 − 1.6 et dépendantes de la longueur d’onde. Ce tableau montre d’une part, que l’indice de réfraction varie en fonction de la longueur d’onde de la lumière pénétrant dans la peau et d’autre part, que la variation est plus importante en fonction des couches (n

= 1, 55 pour la couche cornée ; 1, 447 pour l’épiderme ; 1, 390 pour le derme). Lors de développement pathologique, des caractéristiques morphologiques des tissus (dimension, densité cellulaire, etc) peuvent changer, ce qui modifie l’indice de réfraction (valeurs globales des indices dans ces trois couches) et donne une réponse spectrale di ff érente par rapport au tissu normal.

Absorption Quand les photons se propagent dans les tissus, une partie de leur énergie peut être absorbée par le milieu biologique. Cette partie d’énergie absorbée est ensuite convertie soit en une autre forme d’énergie par l’émission de fluorescence, soit en chaleur. A l’échelle macroscopique, la quantité énergétique absorbée ∂I est en général déterminée une équation décrivant la relation entre la lumière absorbée et les propriétés optiques du milieu qu’elle traverse [Bohren and Huffman, 2004] :

∂I(λ) = − µ

(λ) · I

(λ) · ∂l (1.3) où ∂l est la distance parcourue dans le milieu par un faisceau d’intensité I

à l’entrée du milieu et µ

est le coe ffi cient d’absorption. En intégrant l’équation (1.3) sur l, nous obtenons la loi de Beer-Lambert :

I

λ) = I

(λ) e

(1.4)

Le coefficient d’absorption µ

est défini comme la probabilité d’absorption d’un photon à

une longueur d’onde donnée par distance unitaire dans un milieu, qui s’exprime en fonction du

coefficient d’extinction molaire ε (en L · mol

· cm

) et de la concentration molaire [C] (en

mol · L

) tel que [Jacques, 2005] :

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique

µ

(λ) = ε(λ) · [C] (1.5)

Une grandeur physique en fonction de µ

et largement utilisée pour caractériser l’absorption d’un milieu homogène est l’absorbance ou densité optique A(λ) qui est diéfinie telle que :

A(λ) = − log

I(λ)

I

(λ) = µ

(λ) · l (1.6)

Cependant, les milieux biologiques contiennent éventuellement plusieurs absorbeurs et l’ab- sorbance A(λ) d’un mélange de n espèces absorbantes est alors la somme des absorbances indi- viduelles (Equ.1.7) :

A(λ) =

n

!

i=1

A

(λ) =

n

!

i=1

ε

(λ) · [C]

=

n

!

i=1

µ

(λ)

· l (1.7)

Figure1.2 – Coefficients d’extinction en fonction de la longueur d’onde pour les principaux chromophores de la peau : hémoglobine, eau, eumélanine et phéomélanine [Srinivas and Kumaresan, 2011]

Au sein des tissus biologiques, l’hémoglobine et l’eau sont deux principaux absorbeurs dans la bande de longueur d’onde NUV-visible-IR (bande spectrale d’intérêt pour notre étude). La concentration de ces chromophores détermine l’absorbance des di ff érentes couches tissulaires.

Pour certains tissus spécifiques, tels que la peau, d’autres types de chromophores (mélanine

notamment) peuvent être présents et à l’origine d’absorption de la lumière dans des bandes

spectrales spécifiques. La figure 1.3 présente la variation des coe ffi cients d’extinction de ces di ff é-

rents chromophores de la peau humaine (eau, hémoglobine, mélanine) en fonction de la longueur

d’onde dans la bande 300 − 1000nm [Srinivas and Kumaresan, 2011].

Figure1.3 – Coefficients d’extinction en fonction de la longueur d’onde pour les principaux chromophores de la peau : hémoglobine, eau, eumélanine et phéomélanine [Srinivas and Kumaresan, 2011]

Fluorescence Dans les tissus biologiques, certaines molécules peuvent émettre une lumière (fluorescence) après absorption d’une énergie lumineuse. Le mécanisme quantique de ce phéno- mène physique est traduit par des étapes de transition énergétique schématisés par le diagramme de Jablonsky (Fig.1.4) :

Figure 1.4 – Diagramme de Jablonsky simplifié représentant les différentes transitions énergétiques possibles entre les états singulets S⁰ (état stable), S¹et S² (états excités) et l’état triplet T¹.

Par définition, une molécule ne peut exister que dans un certain nombre d’états d’énergie discrets correspondant à des configurations électroniques données. La molécule est dite à son état fondamental ou stable (S

) lorsque l’énergie du cortège électronique est la plus faible.

– Un photon d’énergie E

= h

ex

(E

énergie du photon, h constante de Planck, c

célérité de la lumière dans le vide et λ

longueur d’onde d’excitation) est émis par une

source d’excitation lumineuse (lampe, laser. . . ) et absorbé par une molécule, ce qui a pour

conséquence de faire passer cette molécule de son état fondamental S

à un niveau d’éner-

gie électronique supérieur S

ou S

par exemple. Ces niveaux d’énergie sont par nature

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique instables.

– L’état excité de la molécule dure un laps de temps très court ( ≈ 10

s). Pendant cette période, le fluorophore subit des changements : il est sujet à de nombreuses interactions avec son environnement et aux variations des conditions physico-chimiques du milieu étu- dié [Ramanujam, 2000] [Valeur, 2001]. L’énergie correspondant à l’état S

est partiellement dissipée sous forme de chaleur ou de transfert entre fluorophores, ce qui produit l’état de relaxation singulet S

(processus non radiatifs).

– La molécule, dite excitée, est le siège d’une série de réactions jusqu’à son retour à l’état stable. Ces réactions permettent à cette molécule de se débarrasser de son surplus énergé- tique par émission d’un photon de fluorescence. Le retour de l’état S

à l’état S

peut donc se faire de deux façons :

1. Il peut s’effectuer par une transition radiative, c’est-à-dire par l’émission d’un photon d’énergie h

em

< h

ex

. La longueur d’onde du photon de fluorescence émis λ

sera plus grande que la longueur d’onde λ

du photon incident qui aura excité la molécule : ce phénomène est appelé déplacement de Stokes.

2. Il peut également s’e ff ectuer en passant par l’état triplet T

. La transition radiative, faisant passer la molécule de T

à S

, est appelée phosphorescence. Il s’agit d’une transition interdite car elle met en jeu deux niveaux de multiplicité di ff érente et sa probabilité est inférieure d’un facteur 10

à 10

à celle de la fluorescence [Valette, 2002].

Les fluorophores sont également caractérisés par deux paramètres qui leur sont propres : rendement quantique de fluorescence Φ et une durée de vie de fluorescence τ . Le rendement quantique est simplement le rapport entre le nombre de photons émis N

et le nombre de pho- tons absorbés N

(Eq.1.8). Il décrit l’efficacité d’excitation d’un fluorophore.

Φ (λ) = N

(λ)

N

(λ) (1.8)

La durée de vie est définie par le temps moyen qu’un fluorophore a passé dans son état ex- cité. Ces deux paramètres déterminant l’intensité de fluorescence détectée sont sensibles à des facteurs variables, tels que l’environnent biochimique. De plus, l’intensité de fluorescence varie en fonction de la concentration et du coefficient d’absorption de ces fluorophores (à la longueur d’onde d’excitation). Ainsi, une mesure de la variation d’intensité spectrale de fluorescence (en spectroscopie résolue temporellement ou spatialement) reflète la variation de l’ensemble de ces facteurs et peut être utilisée pour caractériser différents types de tissus biologiques.

Di ff usion élastique Macroscopiquement, les tissus biologiques possédant des indices de ré-

fraction globaux di ff érents de celui de l’air(n

≈ 1.410 et n

= 1), une partie de la lumière

incidente est réfléchie au niveau de l’interface air-tissu. A l’échelle microscopique, la composi-

tion biologique hétérogène des tissus biologiques (cellules, noyaux, cytoplasmes, matrices extra-

cellulaires . . . ) avec des constituants de taille, de formes et d’indice de réfraction variables a

σ

= 2π

3

d

λ

( n

− 1

n

+ 2 )

(1.9)

où d et n sont respectivement le diamètre et l’indice de réfraction des particules di ff usantes.

La dépendance quadratique par rapport à la longueur d’onde ( ∝

) décrit que ce phénomène est plus accentué pour la lumière dans le bleu et l’UV. Ce paramètre peut être multiplié par le nombre N ou la densité volumique ρ de particules, afin de déduire le coe ffi cient de di ff usion µ

, qui définit la probabilité de di ff usion pour un groupe de particules. Ce paramètre est largement utilisé, dans les études spectroscopiques, pour décrire les propriétés optiques des milieux biolo- giques diffusants à l’échelle macroscopique. Dans les tissus biologiques, certains constituants et en particulier un grand nombre d’organites intracellulaires sont de dimension typique inférieure aux longueurs d’onde utilisées en spectroscopie optique (300 − 900nm environ), et entraînent donc ce régime de diffusion isotrope.

Dans le cas où la taille des éléments di ff usants est comparable ou plus grande que la longueur d’onde, la théorie de Mie décrit ce phénomène. Dans ce régime, la section e ffi cace d’une particule est donnée par une somme de fonctions harmoniques (Equ.1.10) :

σ

= λ

2π

∞

!

N=1

(|a

|

+ |b

|

) (1.10)

a

et b

sont deux solutions de la di ff usion de Mie aux conditions limites :

|a

| = Ψ

(nx) Ψ

(x) − n Ψ

(nx) Ψ

(x)

Ψ

(nx)ζ

(x) − n Ψ

(nx)ζ

(x) (1.11)

|b

| = n Ψ

(nx) Ψ

(x) − Ψ

(nx) Ψ

(x)

n Ψ

(nx)ζ

(x) − Ψ

(nx)ζ

(x) (1.12) où Ψ et ζ sont les fonctions de Riccati-Bessel et avec n l’indice de réfraction de l’élément di ff usant, et x le paramètre de sa taille défini par :

x = 2πr

λ (1.13)

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique La section e ffi cace de la di ff usion de Mie possède une solution analytique simple pour une particule sphérique de rayon r avec une onde incidente plane de nombre d’onde k telle que (Equ.

1.14) :

σ

= 10π

3 r

(kr)

(1.14)

avec

k = ω

c = 2πf

c = 2π 1

cT = 2π 1

λ (1.15)

Si la dimension des particules r est très inférieure à la longueur d’onde, la di ff usion revient au régime de Rayleigh, avec une dépendance en

. De ce fait, la diffusion de Rayleigh est un cas limite de Mie en fonction de taille de di ff useur. En revanche, lorsque r est très supérieur à longueur d’onde, la di ff usion n’est plus dépendante de la longueur d’onde, ce qui est le cas pour la réfraction simple (optique géométrique).

Dans les tissus biologiques, la taille moyenne des cellules est comparable aux longueurs d’onde utilisées (350 − 900nm), la di ff usion créée dans ce milieu suit donc le régime de Mie et est fonction de la longueur d’onde λ (le coe ffi cient de di ff usion µ

décroit de façon monotone avec la longueur d’onde entre 350 − 1000nm). Au cours de certaines pathologies, la dimension des particules diffu- santes r, donc la di ff usion globale du milieu biologique, peut changer significativement [Tuchin, 2007]. Ainsi, la mesure spectroscopique de di ff usion élastique permet de détecter ce changement microscopique, exploitable pour le diagnostic.

1.2.2 Contexte clinique : dermatologie

En médecine, la dermatologie est une branche d’étude très importante, qui concerne la peau mais aussi les muqueuses et les phanères (ongles, cheveux, poils). Nos travaux concernent la peau qui est un des organes les plus importants du corps en regard de sa surface et de sa masse. En effet, véritable interface avec le monde extérieur, elle est par nature directement exposée aux facteurs pathologiques comme des infections, aux rayons solaires nocifs et aux blessures. Les ma- ladies cutanées présentent de grandes diversités morphologiques et touchent des populations de tous âges. De plus, de nombreuses maladies systémiques (touchant l’ensemble de l’organisme et non un seul organe) telles que le diabète, certaines maladies hormonales ou inflammatoires (plus spécifiquement celles atteignant le collagène) ont un retentissement plus ou moins important sur la peau et provoquent ainsi des symptômes cutanés [Jamison et al., 2006].

Du fait de l’incidence élevée des affections cutanées et de leur polymorphisme, leur dépistage

et/ou diagnostic est toujours basé sur une évaluation visuelle des lésions afin d’identifier des élé-

ments symptomatiques correspondants. Cette méthode diagnostique plutôt subjective manque à

la fois de spécificité et de sensibilité, compte tenu de la grande variété des maladies pouvant af-

fecter la peau humaine [Jamison et al., 2006]. Le cas échéant, l’analyse d’un échantillon tissulaire

prélevé par biopsie précise définitivement le diagnostic clinique initial. Cette méthode invasive et

traumatique nécessite le prélèvement du tissu suspect et une série de procédures préparatoires

pour l’analyse anatomopathologique. Par rapport aux autres maladies présentant un plus grand

taux de mortalité, comme celles touchant le coeur, le cerveau et le système respiratoire, il existe

1.2.3 La peau : description histologique et propriétés optiques

Préalablement à la présentation de méthodes spectroscopiques applicables au diagnostic des maladies cutanées, cette section vise à décrire les propriétés histologiques et optiques essentielles de la peau. [Anderson and Parrish, 1981] ont détaillé les structures constitutives et certaines propriétés optiques de la peau humaine dans leur publication en 1981.

Histologiquement, la peau humaine normale se compose de trois couches principales (Fig.1.5) : l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Ces trois couches constitutives composées de types cellu- laires et de substances biochimiques di ff érentes remplissent chacune diverses fonctions vitales et possèdent des propriétés optiques di ff érentes.

Figure 1.5 – Illustration de la structure de la peau humaine comprenant 3 couches constitutives : épiderme, derme et hypoderme [URGO, 2010]

.

1.2.3.1 Epiderme

Description histologique L’épiderme est la couche superficielle de la peau dont la surface

(stratum corneum ou couche cornée) est formée de cellules mortes kératinisées. Son épaisseur

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique varie, en fonction de la localisation anatomique, de 0.05mm (partie couvrant les paupières) à 1.5mm (au niveau de la paume et de la plante du pied). Les kératinocytes constituent de 90 à 95%

de la population épidermique. Le rôle des kératinocytes consiste à produire de la kératine, qui garantit une imperméabilité de la peau. Les kératinocytes prolifèrent dans l’assise basale puis se di ff érencient progressivement pour former les di ff érentes couches de l’épiderme en migrant depuis la profondeur vers la surface où elles desquament. En général, l’épiderme est constitué de quatre couches cellulaires (Fig.1.6).

Figure1.6 – Schéma de la structure de l’épiderme montrant 4 couches et ses cellules constitutives [Olivry, 2009]

.

La couche basale est une zone de jonction entre l’épiderme et le derme. Elle est séparée de la couche adjacente dermique par une membrane basale ondulée, qui contribue principalement à la cohésion structurale de l’épithélium. Cette couche basale est principalement constituée de ké- ratinocytes en activité mitotique et de cellules migrantes. Les kératinocytes basaux contiennent de fins réseaux de filaments de kératine, rendant le cytosquelette su ffi samment flexible pour per- mettre la division et la migration. On y trouve les mélanocytes, cellules responsables de la couleur de la peau et du bronzage.

La couche épineuse (stratum spinosum) est composée de 5 à 15 strates de kératinocytes vo- lumineux et polygonaux ou épineux, qui lui donne son nom de couche. On trouve de nombreux granules de mélanine et des macrophages disséminés parmis les kératinocytes.

La couche granuleuse constitue la dernière couche de cellules nucléées de l’épiderme. Elle est formée de 1 à 4 strates cellulaires aplaties dont le noyau commence à dégénérer. Le cytoplasme des cellules de la couche granuleuse contient des grains de kératohyaline (ou profilaggrine), pré- curseur de la kératine, et des lipides qui permettent l’élaboration de la graisse épidermique.

La couche cornée (stratum corneum) est la couche la plus superficielle de l’épiderme. Elle se

compose de 20 à 30 strates de cellules et peut occuper jusqu’aux trois quarts de l’épaisseur de

l’épiderme. La kératine et les membranes plasmiques épaissies des cellules de la couche cornée

protègent la peau contre l’abrasion et la pénétration. La couche cornée est composée de cellules

La mélanine, un polymère important dans l’épiderme, possède des propriétés absorbantes accrues pour les rayonnements UV. Elle est produite par les mélanocytes de la couche basale et di ff usée entre les kératinocytes de la couche épineuse, créant un filtre optique empêchant une grande partie de la lumière UV ( Fig.1.7) d’entrer dans les couches plus profondes de la peau. Sa concentration et sa sécrétion varient en fonction de la zone et du temps d’exposition au rayonne- ment solaire. La mélanine est le chromophore majeur déterminant le comportement optique de cette couche (épiderme) non-vascularisée.

Figure 1.7 – Spectres de coefficient d’extinction molaire pour les deux types de mélanine dans la peau humaine : eumélanine (ligne foncé) et phéomélanine (ligne claire) [OMLC, 2004]

.

D’autres molécules aromatiques, spécifiquement l’acide urocanique, complètent la fonction protectrice contre les radiations d’UV, mais leur quantité dans la peau, comparée à celle de la mélanine, est relativement petite. De plus, leur synthèse est fortement liée aux phénomènes phy- siologiques, comme la transpiration pour l’acide urocanique. Donc, leur influence sur les spectres mesurés sur cette couche peut être négligée, lorsque l’on étudie les propriétés optiques de l’épi- derme.

En plus de ces chromophores, on trouve également au sein de l’épiderme plusieurs fluoro-

phores endogènes, notament : tyrosine, tryptophane et kératine. La tyrosine et le tryptophane

1.2. Photodiagnostic tissulaire et problématique clinique sont des acides aminés présents dans les cellules de l’épiderme, qui possèdent des bandes d’ex- citation maximale vers 280nm (240 − 320 nm), et fluorescent dans la bande de 300 à 350 nm.

L’intensité de fluorescence émise par ces deux molécules est relativement petite par rapport à celle des fluorophores dans les couches plus profondes, parce qu’elles présentent des rendements quantiques faibles. Cependant, elles constituent les seules sources de fluorescence e ffi cacement ex- citables dans cette couche, ce qui permet de détecter l’hyper-prolifération cellulaire, par exemple un épaissement de l’épiderme. La kératine possède des propriétés mécaniques et biochimiques di ff érentes. Pour la peau, la kératine principalement confinée dans la couche épidermique (où le mécanisme de kératinisation est important) possède des caractéristiques spectrales relativement proches de celles du collagène [Wu and Qu, 2006b]) : excitation dans l’UV-bleu et émission de fluorescence dans le vert. Néanmoins, l’e ff et d’absorption dans l’UV par la mélanine inhibitant l’excitation de la kératine et la fluorescence intense provenant du collagène dans la couche infé- rieure ne peuvent pas toujours être distingués au sein des spectres d’AF mesurés à la surface de la peau.

Dans l’épiderme, un régime de di ff usion de Mie prédomine du fait de la présence des parti- cules di ff usantes de taille du même ordre de grandeur que la longueur d’onde. La lumière a ainsi tendance à s’y propager vers l’avant. Cette propriété d’anisotropie dépend de la longueur d’onde et est plus prononcée dans le domaine rouge et IR [W. and van der Leun J., 1984].

1.2.3.2 Derme

Description histologique Le derme constitué du tissu conjonctif donne une structure flexible à la peau et lui permet de résister à des contraintes mécaniques. Son épaisseur varie selon les régions corporelles et peut atteindre un millimètre. Le derme est irrigué par des capillaires dis- persés dans cette couche et nourrit en même temps la couche épidermique par diffusion. La couche dermique assure aussi la thermorégulation, l’élimination des agents toxiques et étrangers, ainsi que la cicatrisation. On distingue normalement 2 couches constitutives pour le derme : derme papillaire et derme réticulaire (Fig.1.8).

Le derme papillaire est la couche supérieure du derme. Il tient son nom de sa surface en papilles qui forment des saillies alternant avec des prolongements épidermiques. Cette structure renforce la liaison inter-couches par une interface plus vaste entre derme papillaire et la dernière couche de l’épiderme (couche basale), et facilite le passage des nutriments du derme à l’épi- derme. On trouve un grand nombre de vaisseaux sanguins et de neurofibres dans cette couche fine conjonctive.

Le derme réticulaire, plus profond, occupe environ 80% du volume du derme. Il est plus dense et élastique, grâce à des fibres protéiques formant des matrices entrecroisées qui tiennent la structure et donne de la force et de l’extensibilité à la peau. Deux de ces protéines structurales sont le collagène et l’élastine. Leurs synthèse et renouvellement sont assurés par les fibroblastes dont la quantité augmente significativement lors de la cicatrisation. Le derme réticulaire est abondamment vascularisé dans sa partie la plus superficielle.

Propriétés optiques Le derme est une couche riche en vaisseaux sanguins qui prennent en

charge la fonction nutritionnelle de la peau. Ces vaisseaux se concentrent plutôt au-dessous de la