Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires
ةايحلا و ةعيبطلا مولع ةيلك تلا مولع و ةيقيبطتلا ايجولويبوركملا مسق ةيذغ
ماج هع يحي نب قيدصلا دمحم –
لجيج -
Université Mohammed Seddik Benyahia –Jijel- يملعلا ثحبلا و يلاعلا ميلعتلا ةرازو
République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche
Mémoire de fin d’études
En vue de l’obtention du diplôme : Master Académique en Biologie Option : Microbiologie Appliquée
Thème
Etude du comportement de Lactobacillus plantarum S10 dans différents laits aux différents taux de matière grasse et effets sur ses
potentiels probiotiques
Membres de Jury :
Président : Pr.Sifour Mohamed Examinateur : Dr.Dairi Sofiane Encadrant :Pr.Idoui Tayeb -
-
Présenté par :
Melle : BOUMEZAID Khadidja Melle : BOUSSELEM Nadjat Melle : LABOUDI Selma
Année Universitaire 2016-2017
Numéro d’ordre :……….
Je dédie ce modeste travail :
Avant tout, je remercie allah qui nous a aidés à élaborer ce modeste travail.
Aux êtres les plus chers à mon coeur, mes parents, qui ont toujours cru en moi et encouragée.
A mes sœurs Samira et Souad et Meriem qui m’ont soutenue durant les moments difficiles et à qui je souhaite beaucoup de réussite dans leur vie future.
A mes très chers frères Ismail et Khaled et Mohamed
A ma grand-père à qui je souhaite une longue et heureuse vie.
A toutes mes amies, en particulier : Nadjat, Selma,Wafa, Abla, Meriem
A Monsieur de primaire Arioua moussa
khadidja
Je dédie ce présent mémoire à mes parents :
Maman, toi qui m’as toujours protégé, encouragé, soutenu et poussé à donner le meilleur de moi-même, merci pour tout.
Papa, tu as toujours été là pour me guider, me remonter le moral et m’aider, merci à toi.
Ce mémoire n’est que le résultat de votre dévouement, votre amour et votre confiance
Je fais un clin d’œil à ma chère sœur : Asma et mon frère : Oussama Pour votre soutien moral, vous avez su supporter mon humeur
Pour m’avoir soutenu et aidé jusqu’à aujourd’hui. Puisse cette journée Vous apporter autant de fierté qu’à nos parents.
Je remercie également toute ma famille a quel je souhaite tout le bonheur du monde.
Un grand merci particulier à Fateh et Sawsan qu’ils étaient toujours dans le meilleur et le pire.
A toutes mes chères amies : Noussaiba, Meryem, Rokia, Meriem, Imen, Racha, Aicha, Chourouk, Malika,Ahlem,Nadjat et Khadidja.
Pour notre amitié et tous les bons moments passé et à venir, Pour votre présence, vos bons conseils et nos fous rires partagés . Un très grand merci à toutes.
Selma
Je dédie ce modeste travail :
Avant tout, je remercie allah qui nous a aidés à élaborer ce modeste travail.
Je dédie également mes très chers parents qui m’ont guidé durant les
moments les plus pénibles de ce long chemin, ma mère qui a été à mes côtés et ma soutenu durant toute ma vie, et mon père qui a sacrifié toute sa vie afin de me voir devenir ce que je suis, merci mes parents.
A mes chères sœurs : Nabila et Madiha et Yasmina A ma cher frère :Salah
A toutes mes amies, en particulier : Hayet,Selma,Khadidja, Zoulikha, Saida A Monsieur Naim chaouki
Nadjat
Remerciements
Avant tout nous remercions ALLAH tout puissant de nous avoir donné la force et le courage de mener à terme ce modeste travail.
Nous remercions nos parents, pour tout leur amour, leur encouragement et leur soutien …….
Nous remercions particulièrement et avec gratitude notre encadreur P
r.Idoui Tayeb pour ses précieux conseils, ses apports appréciables et ses
encouragements.
Nous tenons aussi à remercier les membres de jury qui ont accepté de juger notre travail de mémoire de fin d’études.
Nous tenons aussi à remercier M
r. Khanouf pour ses conseils scientifiques judicieux et son suivi durant la période de la réalisation de ce travail.
Enfin, nous adressons nos remerciements à toute personne ayant contribué
de prés ou de loin à la concrétisation de ce mémoire.
Numéro Titre Page Tableau 01 Principaux microorganismes utilisés comme probiotiques. 09 Tableau 2 Bactéries lactiques utilisées comme cultures starters dans les
produits fermentées.
12
Tableau 03 Composition de différents types de laits. 14 Tableau 04 Composition de la fraction lipidique dans le lait de vache. 14 Tableau 05 Composition moyenne en acide gras de lait de chèvre. 15 Tableau 06 Composition moyenne en acide gras de lait de chamelle. 16 Tableau 07 Diamètre des zones de lipolyse sur gélose MRS et gélose blanche. 29 Tableau 08 Composition des laits avant et après stérilisation. 39
Numéro Titre Pages Figure 01 Formes microscopiques de : (a)L. rhamnosus et(b)L. casei. 05 Figure 02 Arbre phylogénétique (séquences partielles d'ADNr 16S). 06 Figure 03 Indice d’acidité et taux de survie de L.plantarum : Cas du beurre de
vache.
31
Figure 04 Indice d’acidité et taux de survie de L.plantarum : Cas du beurre de chèvre.
32
Figure 05 Indice d’acidité et taux de survie de L.plantarum : Cas du beurre de chamelle.
32
Figure 06 Composition en acides gras du beurre de chèvre avant ensemencement.
33
Figure 07 Composition en acides gras du beurre de chèvre ensemencé par L.plantarum.
34
Figure 08 Composition en acides gras du beurre de chamelle avant ensemencement.
35
Figure09 Composition en acides gras du beurre de chamelle ensemencé par L.plantarum.
36
Figure10 Evolution du pH, acidité, viscosité et nombre de cellules : Cas du lait de vache ensemencé par L.plantarumS10.
37
Figure 11 Evolution du pH, acidité, viscosité et nombre de cellules : Cas du lait de chèvre ensemencé par L.plantarumS10.
38
Figure12 Evolution du pH, acidité, viscosité et nombre de cellules : Cas du lait de chamelle ensemencé par L.plantarumS10.
48
Figure 13 Evolution de la viscosité et nombrede cellules : Cas du lait de vache ensemencé par L.plantarumS10.
40
Figure 14 Evolution de la viscosité et nombrede cellules : Cas du lait de chèvre ensemencé par L.plantarumS10.
40
Figure 15 Evolution de la viscosité et nombrede cellules : Cas du lait de chamelle ensemencé par L.plantarumS10.
41 Figure 16 Survie de L.plantarum S10 dans les différentes matrices alimentaires. 42
Figure 17 Pourcentage d’ hydrophobicité de L. plantarumS10ré-isoléedes matrices alimentaires : cas des laits et du beurre de vache.
44
Figure 18 Pourcentage d’ hydrophobicité de L. plantarumS10ré-isoléedes matrices alimentaires : cas des laits et du beurre dechévre.
45
Figure 19 Pourcentage d’ hydrophobicité de L. plantarumS10ré-isoléedes matrices alimentaires : cas des laits et du beurre de chamelle.
45
Figure 20 Pourcentages d’auto-agrégation de la souche ré isolée des laits fermentés et beurre fermenté de vache.
48
Figure 21 Pourcentages d’auto-agrégation de la souche ré isolée des laits fermenté et beurre fermenté de chèvre.
49
Figure 22 Pourcentages d’auto-agrégation de la souche ré isolée des laits fermentés et beurre fermenté de chamelle.
50
Figure 23 Pourcentage de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait entier fermenté, écrémé fermenté et beurre fermenté de vache.
52
Figure 24 Pourcentage de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait entier fermenté, écrémé fermenté et beurre fermenté de chèvre.
54
Figure 25 Pourcentage de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait entier fermenté, écrémé fermenté et beurre fermenté de chamelle.
56
Figure 26 Pourcentage de survie de L.plantarumdans les milieux acides (cas des laits fermentés et beurre de vache).
62
Figure 27 Pourcentage de survie de L.plantarumdans les milieux acides (cas des laits fermentés et beurre de chèvre).
64
Figure 28 Pourcentage de survie de L.plantarumdans les milieux acides (cas des laits fermentés et de la crème de chamelle).
65
Figure 29 Effet des sels biliaires sur la croissance de L.plantarum S10 ré-isolée des laits entier fermenté, écrémé fermenté, beurre fermenté de vache
et du bouillon MRS.
66
Figure30 Effet des sels biliaires sur la croissance de L.plantarum S10 ré-isolée des laits entier fermenté, écrémé fermenté, beurre fermenté de chèvre et du bouillon MRS
67
Figure 31 Effet des sels biliaires sur la croissance de L.plantarum S10 ré-isolée des laits entier fermenté, écrémé fermenté, beurre fermenté de chamelle et du bouillon MRS
67
Numéro Titre Page Photo 01 Activité lipolytique de L.plantarumS10 sur gélose : (a) MRS 5% du
beurre de chamelle et (b) blanche 3% beurre de chèvre.
30
Photo 02 Photomicrographie d’auto-agrégation de la souche réisolée de lait entier fermenté, ecrémé ferenté et beurre fermentée (origine : vache).
48
Photo 03 Photomicrographie d’auto-agrégation de la souche réisolée de lait entier fermenté, écrémé ferementé et beurre fermenté (origine : chévre).
49
Photo 04 Photomicrographie d’auto-agrégation de la souche réisolée de lait entier fermenté, ecrémé ferenté et beurre fermenté (Origine : chamelle).
50
Photo 05 Photomicrographie d’auto-agrégation de la souche ré-isolé du bouillon MRS.
50
Photo 06 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait entier fermenté de vache).
52
Photo 07 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait écrémé fermenté de vache.
52
Photo 08 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du beurre fermenté de vache.
53
Photo 09 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du bouillon MRS.
53
Photo 10 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré isolée du lait entier fermenté de chèvre.
54
Photo 11 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré isolée du lait écrémé fermenté de chèvre.
54
Photo 12 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré isolée du beurre fermenté de chèvre.
55
Photo 13 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait entier fermenté de chamelle.
56
Photo 14 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée du lait écrémé fermenté de chamelle.
56
Photo 15 Photomicrographie de la co-agrégation de la souche ré-isolée da la crème fermentée de chamelle.
57
Photo 16 Photomicrographie des tissus : (a)épithéliales et (b)mucus. 58 Photo 17 Photomicrographie de l’adhésion de la souche aux cellules
épithéliles (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine bovine).
58
Photo 18 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux cellules épithéliles (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine
caprine).
59
Photo 19 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux cellules épithéliles (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine
cameline).
59
Photo 20 Photomicrographie d’adhésion de la souche ré-isolé du bouillon MRS aux cellules épithéliles .
59
Photo 21 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux mucus (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine bovine).
60
Photo 22 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux mucus (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine caprine).
61
Photo 23 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux mucus (souche ré-isolée des matrices alimentaires d’origine cameline).
61
Photo 24 Photomicrographie d’adhésion de la souche aux mucus (souche ré-isolée du bouillon MRS).
61
Liste des abréviations BL : Bactérie Lactique
CPG : chromatographie en phase gazeuse DO : Densité optique
EPS : Exopolysaccharides
FAO : l’Organisation des Nations Unis pour l’alimentation et l’Agriculture K OH : Potassium alcoolique
LB :Luria Bertani
MRS : Man Rogosa et Sharpe pH : Potentiel d’Hydrogéne PBS : Phosphate Buffer Saline
1 Le marché mondial des aliments fermenté a connu une explosion notamment sur les thèmes des acides gras, de la richesse en fibres et des qualités probiotiques. Un produit probiotique est un produit dont l’allégation santé est liée à l’incorporation de microorganismes vivants ayant un effet bénéfique sur la santé de l’hôte. Les laits fermentés constituent un domaine historique d’observation des microorganismes probiotiques. Parmi les probiotiques les plus utilisés, le groupe de bactéries lactiques (LB), ces dernières peuvent être consommées soit en tant que composante alimentaire, soit en préparation non alimentaire (Dunne et al., 2001 ; Rodgers, 2008).
Parmi les bactéries lactiques, les Lactobacillus spp et les bifidobactéries sont les plus couramment utilisés comme probiotiques. Pour survivre dans l'intestin, ils doivent être tolérants au faible pH et à la toxicité des sels biliaires. Pour la colonisation, ils doivent présenter une bonne hydrophobicité et une meilleure capacité d'agrégation (Collado et al., 2007 ; Zago et al., 2011). Des souches de Lactobacillus plantarum ont été isolées de nombreuse matrices alimentaires à savoir les produits laitiers, la viande, le poisson et de nombreux légumes (Pisano et al., 2010; Zhang et al., 2012).
Cependant les espèces du genre Lactobacillus isolées des produits laitiers sont probablement les candidats les plus appropriés pour une utilisation comme probiotiques dans les produits fermentés (Mathara et al., 2008 ; Georgieva et al., 2009).
Les technologies laitières représentent toutefois le principal secteur d’application des bactéries lactiques. En Algérie, un intérêt particulier a été donné aux bactéries lactiques locales (Cheriguene et al., 2006 ; Idoui, 2008), et jusqu’à l’heure actuelle, aucun travail n’a été mené sur l’effet combiné de la matrice alimentaire laitière (matière grasse) et la conservation sur les aptitudes technologiques et probiotiques des bactéries lactiques.
Cette problématique nous a été intéressante, ainsi nous nous sommes proposé de répondre à la problématique posée. Le but de notre travail est d’évaluer l’activité lipolytique de L.plantarum S10 d’origine animale, par la suite tester certains propriétés probiotiques après sons ré-isolement de trois laits fermentés (Vahe, chèvre, chamelle). Notre présent manuscrit est structuré en trois parties, la première est consacrée à une synthèse bibliographique articulée autour de deux chapitres, qui traitent le groupe des bactéries lactiques, leurs principales caractéristiques, leurs utilisations en tant que ferments lactiques, les bactéries lactiques probiotiques et leurs applications en technologie des laits fermentés. La seconde partie du manuscrit est réservée aux méthodes utilisées pour la réalisation de ce travail, elle donne des détails sur l’évaluation de l’aptitude lipolytique de L.plantarum S10, son utilisation pour la fermentation de trois laits et beurres d’origines bovine,
2 caprine et cameline, les méthodes de ré-isolement de la souche de ces matrices alimentaires et enfin les méthodes utilisées pour l’évaluation de quelques aptitudes probiotiques.
Une troisième partie est réservée pour la présentation des résultats, leur interprétation et discussion.
Finalement, une conclusion générale permet de récapituler les principaux résultats de ce travail avec une présentation des principales perspectives envisagées pour la poursuite de cette thématique de recherche.
I.1.Les bactéries lactiques
I.1.1. Données sur les bactéries lactiques: Les bactéries lactiques (BL), sont l'un des groupes les plus représentatifs des procaryotes, elles possédent le statut GRAS (Generally Regarded As Safe) (Drouault et al., 2001 ; Bharti et al., 2011). Elles sont considérées comme un groupe important de bactéries probiotiques (Espeche et al., 2012).
Les bactéries lactiques sont des Gram-positif, qui forment un groupe hétérogène composé de coques et de bacilles, immobiles et non sporulantes, acidotolérantes, fastidieuses, non pathogènes, anaérobie facultatives et peuvent pousser dans des conditions d’aérobie
(Guidone, 2013 ; Heping Zhang et al
.,
2014 ; Deepansh Sharma et al., 2016).Elles sont exigeantes en facteur de croissance, généralement incapables de produire la catalase ou cytochromes nécessaires pour la dégradation de l'oxygène et la phosphorylation oxydative (Helanto et al., 2009 ; Holzapfel et al., 2014). Certaines bactéries lactiques sont dites homofermentaires car elles produisent très majoritairement de l’acide lactique alors que d’autres sont dites hétérofermentaires et produisent de l’acide lactique en même temps que d’autres composés tels que l’acétate et l’éthanol, l’anhydride carbonique et l’acide formique (Drouault et al., 2001 ; Mozzi et al., 2010 ).
Certaines souches des bactéries lactiques sécrètent des composés protéiques antimicrobiens, appelés bactériocines, qui peuvent inhiber la croissance des pathogénes, d’autres synthétisent les vitamines essentielles telle que B1, B2, B6, B12, niacine, acide folique et l'acide pantothénique, et synthétisent des enzymes qui augmentent la digestibilité des protéines (Khalil et al., 2007 ; Mezaini et al., 2009 ; Vidhyasagar et al., 2013). En outre, ses bactéries sont considérées comme faiblement lipolytiques par comparaison avec d'autres espèces bactériennes (Karam et al., 2012).
I.1.2.Origine des bactéries lactiques: Les bactéries lactiques sont largement répandues dans la nature (sols, eaux, ensilages, déchets, surface des végétaux), les muqueuses des mammifères et dans le tractus digestif (intestin, bouches, vagin et surface de la peau) et apparaissent naturellement sous forme de microflore indigène dans le lait cru, produits laitiers, fruits de mer, poissons, céréales, viandes et produits à base de viande (Helanto et al., 2009 ; Iehata et al., 2009 ; Mozzi et al., 2010).
I.1.3. Classification des bactéries lactiques: La classification des BL en différents genres est généralement basée sur la morphologie, mode de fermentation du glucose, croissance à différentes températures, configuration de l'acide lactique produit, capacité à croître à des concentrations élevées de sel, et la tolérance acide ou alcaline, marqueurs chimiotaxonomiques tels que la composition en acides gras et les constituants de la paroi cellulaire sont également utilisés dans la classification (Fennema et al., 2004).
La taxinomie actuelle, repose sur une taxinomie phylogénétique qui a été révélée par de nombreux travaux sur les séquences d'ARNr 16S et le séquençage du génome entier (Fennema et al., 2004 ; Mocanu et al., 2012 ).
Les bactéries lactiques se trouvent dans deux phylums distincts, à savoir Firmicutes et Actinobacteria. Dans le phylum des Firmicutes, les genres les plus importants sont, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus et Weissella et sont des organismes à faible teneur en GC (31-49%). En outre l'ordre Lactobacillales pourrait être divisé en six familles, 36 genres et plus de 200 espèces à la fin de 2011. Dans le phylum Actinobacteria, les BL appartiennent au genre Bifidobacterium, qui a une teneur élevé en GC (58-61%) (Mocanu et al., 2012 ; Heping et al., 2014 ; Holzapfel et al., 2014).
I.1.4. Le genre Lactobacillus
I.1.4.1.Les caracteristiques : Les lactobacilles présentent le genre prédominant des BL, englobent plus de 25 espèces, occasionnellement des réducteurs de nitrate, utilisent le lactose, le glucose et d'autres sucres comme source de carbone et produisent du lactate via un métabolisme homofermentatif, produisant plus de 85% d'acide lactique à partir du glucose, ou hétérofermentatif, produisant de l'acide lactique, du CO2, d'éthanol et / ou d'acide acétique en quantités équimolaires.
Ces bactéries produisant des acides peuvent se développer à des environnements à faible pH et inhibent la croissance d'autres microorganismes (Al kassaa et al., 2013 ; Herbel et al., 2013;
Arena et al., 2014 ; Raman et al., 2016). La figure 01, illustre l’aspect microscopique des cellules bactériennes du genre Lactobacillus.
I.1.4.2.Habitat : Les lactobacilles sont courants dans les habitats alimentaires tels que le vin, le lait, la viande, les fruits, les légumes et les céréales, on les trouve aussi dans la bouche, le tractus intestinal et le vagin de nombreux animaux (Al kassaa et al., 2013 ; Arena et al., 2014 ; Raman et al., 2016).
Figure 01. Formes microscopiques de : (a) L. rhamnosus et (b)L. casei (Malago et al., 2011 ; Roduit, 2011).
I.1.5. L’espéce Lactobacillus plantarum : L’espéce L. plantarum est une bactérie lactique polyvalente, mésophile, nitrate réductase positive, pyruvate oxydase positive, , capable de métaboliser les composés phénoliques, capable de produire des composés antifongiques et de réduire et d’éliminer les microorganismes potentiellement pathogènes par synthèse d'agents antimicrobiens et par la compétition pour les sites récepteurs de la muqueuse intestinale (Neethu et al., 2015 ; GöranMolin et al., 2017 ; Kadhim et al., 2017).
Certain souches de L. plantarum produisent les exopolysaccharides (EPS) qui peuvent être intéressantes à deux égards, une application industrielle pour les aliments fermentés (légumes, saucisses, etc.) en tant qu'agent textural et comme nouvelle souche potentiellement probiotique (Tallon et al., 2003 ; Turchi et al., 2013).
L’espéce se rencontre dans une gamme de niches environnementales car elle a la capacité de s'adapter à de nombreuses conditions (Maaike et al., 2006 ; Floros et al., 2013). La figure 2, illustre la position phylogénétique de L. plantarum.
a b
Figure 02. Arbre phylogénétique (séquences partielles d'ADNr 16S), montrant la relation phylogénétique du L. plantarum à un ensemble de bactéries représentatives des bactéries lactiques.
Bacillus subtilis a été employé pour enraciner l’arbre. La barre de balance représente les distances calculées entre les séquences (Maaik et al., 2006).
I.1.5.1.Les caractéristiques de l’espéce Lactobacillus plantarum: Les études ont montré que les souches de genre Lactobacillus et particuliérement celles de l’espéce plantarum ont plusieurs origines :
Les L.plantraum d’origine humaine : Elles ont été isolées de la salive humaine, écouvillons humains rectaux, des selles infantiles, selles d'adultes en bonne santé et elles sont codées perspectivements : WCFS1, NCIMB 8826 ; LS/07 ; PH04 ; 9-41-A. Ces souches présentent les caractéristques suivantes (de Vries et al., 2006 ; Wiley et al., 2014 ; Maria et al., 2015) :
- La WCFS1 possède environ 50 gènes spécifiques, capable de s'adapter à différents environnements et substrats de croissance, possède au moins une enzyme montrant l'activité d'estérase de feruloyl et tolère l'oxygène mais se développe bien dans des conditions anaérobies ; - La LS/07 réduit les acides biliaires totaux dans le sérum ;
-La PH04 possède un effet abaissant le cholestérol, une activité d'hydrolase de sels de bile, peut résister aux antibiotiques et ne produit pas la β-glucuronidase ;
-La 9-41-A représente un agent thérapeutique potentiel pour lutter contre l'hyperlipidémie et diminuer le gain de poids corporel excessif.
Les L.plantraum d’origine animale : Elles ont été isolées du contenu intestinal de porcelets.
Une seule souche interessante est codée Biocenol LP96. Cette souche présente les caractéristques suivantes (Salaj et al., 2013) :
-Peut être utilisée pour améliorer le profil lipidique ; - Peut contribuer à un équilibre microbien plus sain.
Les L.plantraum d’origine alimentaire : Elles ont été isolées du lait caillé, d'aji-narezushi (un poisson traditionnel fermenté par l'acide lactique), la boisson fermentée indigène raabadi.
Elles sont codées perspectivements : MTCC 9510 ; AN6 ; RYPR1, RYPC7. Ces souches présentent les caractéristques suivantes (Bindhumol et al., 2010 ; Kuda et al., 2013 ; Yadav et al., 2016) :
-La MTCC 9510 est anaérobie facultative ;
- L’AN6 posséde la plus forte activité, abaissant le cholestérol, plus résistante à l'acide aux sels et à la bile que la souche NBRC15891T, ainsi, elle est utilisée comme espéce probiotique ;
-La RYPR1et la RYPC7 montrent une bonne survie à pH 2, une bonne tolérance aux acides, en outre la RYPR1 est capable de déconjuger les sels biliaires, ont une bonne adhésion aux cellules épithéliales, donc la colonisation, présente une réduction la plus élevée du cholestérol, utilisées pour prévenir l'hypercholestérolémie, ainsi elles possèdent un excellent potentiel probiotique.
Cependant les caractéristiques des autres souches sont (Gross et al., 2008 ; Skeie et al., 2008 ; Neethu et al., 2015 ) :
- Le INF15D dégrade la sérine et l'asparagine pour accumuler le formate, l'acide succinique et l'acide aspartique ;
-Le CJLP55 est un bon candidat probiotique ;
-Le 299v ne contrecarre pas les changements induits par la phytohémagglutinine dans le microbiote intestinal.
I.2. Les bactéries lactiques probiotiques
I.2.1. Définition et potentiel probiotique : La définition la plus acceptée du terme, est celle de la consultation mixte FAO/OMS(2002) qui définit les probiotiques comme « des micro-organismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent des effets bénéfiques sur la santé de l'hôte ».
Les probiotiques peuvent être des bactéries, des moisissures et des levures, mais la plupart des probiotiques sont des bactéries, parmi ces bactéries, les bactéries lactiques sont les plus populaires des microorganismes listés. Parmi les espèces utilisées dans la préparation probiotique, on a répertorié Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophillus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Bifidobacterium et Escherichia coli Nesle (Kamlesh et al., 2011 ; Turchi et al ., 2013). Le tableau 01, regroupe les principaux microrganismes probiotiques.
Tableau 01 : Principaux microorganismes utilisés comme probiotiques (Robinson et al., 2002 ; Tannoket al., 2005 ).
Lactobacillus Bifidobacterium Autres bactéries
lactiques
autre
L. amylovorus B. adolescentis Enteroccocus faecium Aspergillus orizae
L. acidophilus B. animalis Enteroccocus feacalis Bacillus cereus (toyoi )
L. brevis B. bifidum Lactococcus lactis Clostridium butyricum
L. casei B. breve Sporalactobacillus inulinus
E. coli souche ( Nissle)
L. crispatus B. infantis Streptococcus salivarius Pediococcus acidilactici
L. delbrueckii
spp. bulgaricus
B. lactis Propionibacterium freudenreichii
L. fermentum B. longum Saccharomyces cerevisiae
L. johnsonii Saccharomyces boulardii
L. gallinarum Streptococcus salivarius
L. gasseri Streptococcus thermophilus
L.paracasei L. plantarum L. reuteri
L. rhamnosus
L. salivarius
I.2.2. Les critères de sélection des souches probiotiques : Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la souche microbienne. Le choix des probiotiques dépend de leurs propriétés et du type d’utilisation. Selon le rapport de la FAO/OMS (2002) et Hai (2015), les principaux critéres de sélection d'une bonne souche probiotique sont les suivants : - Les critères de sécurité de la souche et qui comportent :
Identification taxonomique précise ;
Souche caractérisée par les techniques phénotypiques et génotypiques ;
Historique de non pathogénicité et non-invasion de l’épithélium ;
Pas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques.
- Les critères fonctionnels de la souche et qui comportent :
Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestive ;
Adhésion aux cellules épithéliales et la capacité de persistance ;
Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides organiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composées inhibiteurs) et antagonisme envers les pathogènes ;
Immunomodulation ;
Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé ; - Les critères technologiques de la souche et qui regroupent :
Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit fini ;
Conservation des propriétés probiotiques après production ;
Non modification des propriétés organoleptiques du produit fini.
Nous évoquons quelques aptitudes probiotiques sur lesquelles notre travail expérimental a été basé, la capacité d’adhésion, l’autoagrégation, la co-agrégation et l’hydrophobicité :
I.2.2.1. L’adhèrence aux cellules épithéliales et la colonisation de l’intestin : L’adhérence des bactéries probiotiques à la muqueuse intestinale est la première étape de la colonisation intestinale, les cellules épithéliales de l'intestin grêle sont recouvertes d'une couche relativement épaisse de mucus, ce dernier contient des récepteurs qui reconnaissent des protéines d'adhérence spécifiques.
L'adhérence, ou l'association étroite des bactéries aux cellules épithéliales donnera le temps aux probiotiques de persister dans le tractus gastro-intestinal et influencer l'hôte, et par suite la colonisation temporelle des surfaces des muqueuses. Cette colonisation, permettra l'exclusion concurrentielle des bactéries pathogènes, une protéction des cellules épithéliales, ainsi qu’une immunomodulation (Collado et al., 2008 ; Bejar et al., 2011).
En outre, l'adhésion bactérienne au mucus intestinal et aux épithéliums semble être importante pour l'équilibre de la microflore intestinale, l’activité enzymatique bactérienne intestinale et la stabilisation de la perméabilité intestinale (Taheri et al., 2009; Osmanagaoglu et al., 2010 ; Deepika et al., 2012).
I.2.2.2. Aptitudes à l’auto-agrégation, la coagrégation et le taux d’hydrophobicité: Elles sont considérées comme un critère important du choix d’un probiotique. L’'hydrophobicité, l'auto- agrégation, et la coagrégation jouent un rôle important, dans la stabilité de l'émulsion, réduisent la
contamination par les pathogènes, et fournissent des activités biologiques dans les matrices alimentaires (Xiao et al., 2012).
Les microorganismes probiotiques doivent présenter une bonne hydrophobicité de surface, ce qui leur permettra la colonisation du tube digestif, et cela est lié à la présence de molécules hydrophobes, comme les protéines de surface, les protéines des parois, les protéines membranaires cytoplasmiques et les lipides de la surface cellulaire, tandis que les surfaces hydrophiles sont liées à la présence de polysaccharides. Cependant, il a été prouvé que l'hydrophobicité de la surface des cellules bactériennes était associée à des capacités d'auto-agrégation pour la plupart des souches, et que l'adhésion aux hydrocarbures était liée aux propriétés d'autoagrégation élevées (Kos et al., 2003 ; Ronald et al., 2016 ).
L'agrégation entre les micro-organismes de la même souche (autoagrégation), ou entre les différentes espèces et souches (coagrégation), est une propriété fondamentale du choix d’un probiotique. C’est à travers ces propriétés que les souches peuvent apporter les effets biologiques attendus tels que l’inhibition des pathogénes, la protection des cellules epithéliales par occupation de sites et formation d’un film de couverture (Juàrez et al., 2005 ; Turchi et al., 2013).
II.1. Les aliments probiotiques
Les microorganismes probiotiques sont utilisés depuis bien longtemps dans les produits alimentaires, ces aliments probiotiques doivent contenir un nombre suffisant de bactéries vivantes. Ce n’est qu’après ces conditions minimales remplies que des effets positifs des probiotiques pourront être observés. Le nombre de cellules probiotiques qui arrive vivant dans l’intestin dépend de la souche, de la dose ingérée, des facteurs liés à l’hôte et de l’aliment vecteur ou de la matrice alimentaire (Roduit, 2011 ; Song et al., 2012 ). Le tableau ci-dessous regroupe quelques données sur quelques produits lactofermentés.
Tableau 02. Bactéries lactiques utilisées comme cultures starters dans les produits fermentées (Kongo, 2013 ; Rigobelo, 2012).
Catégorie Nom de produit Bactéries lactiques probiotiques
Légumes, fruits fermentés
Burongmustasa Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum Burongpipino Leu. mesenteroides,
L. brevis,
Pediococcus cerevisiae, L.plantarum
Burongmanga Leu. mesenteroides, L. brevis,
P.cerevisiae, L. plantarum
Fromage Kesongputi Lactococcus lactis
Poissons fermentés et produits de pêche
Balao-balao Burong-isda Burongtalangka
Leu. mesenteroides, P.cerevisiae,
L. plantarum
Leu. mesenteroides, E. faecalis, P. cerevisiae, L. plantarum, P.
acidilactici,
Leu. mesenteroides, E. faecalis, P. cerevisiae, L. plantarum
viandes Fermentés, saucisses
Burongkalabi Burong babi
L. plantarum
L. plantarum
Riz fermenté, manioc, sucre canne, noix de coco,
le soja
Suka
Toyo
Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus
P. halophilus, E. faecalis, L.
delbrueckii
Produits laitiers
fromage, yaourt, kéfir Fromage, lait de beurre aigre
crème, laiterie cultivée produits
Fromage, laiterie cultivée
produits, crème aigre, babeurre
Fromage, yaourt
Lactobacillus spp
Lactococcus spp
Leuconostoc spp
Streptococcus thermophilus Pediococcus
II.1.1. Les laits et laits fermentés comme matrices alimentaires de probiotiques II.1.1.1.Les laits
II.1.1.1.1. Définition du lait : Selon la définition établie par le Congrès International de la Répression des Fraudes Alimentaires à Genève « le lait est le produit intégral de la traite totale et interrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir du colostrum » (Debry, 2001).
Le lait est un liquide alimentaire opaque, blanc mat légèrement bleuté ou plus ou moins jaunâtre, à odeur peu marquée et au gout douceâtre, sécrété après parutions par la glande mammaire des animaux mammifères femelles pour nourrir leurs nouveaux nés (Robinson 2002).
II.1.1.1.2. Les propriétés physico-chimiques du lait : Les propriétés physico-chimiques du lait sont plus ou moins stables, elles dépendent soit de l’ensemble des constitutions comme la densité, soit des substances en solution comme le point de congélation ou encore des concentrations en ions comme le pH (acidité).
Les principales propriétés physico-chimiques du lait, utilisées dans l’industrie laitière sont (vignola, 2002 ; Fredot, 2004) :
La densité du lait varie entre 1,028 et 1,035 pour une moyenne de 1,032 à 15°C ;
Le point de congélation -0,530°C, permet de soupçonner une addition d’eau au lait ;
Le point d’ébullition est de 100,5°C ;
L’acidité est de 15 à 17 °D dans des conditions normales.
II.1.1.1.3. Les différents types de laits et leurs compositions : L’appellation lait est réservée au lait de vache, ainsi, l’origine animale doit toujours accompagnée le mot lait. Les laits produits par les vaches, les buffles, les brebis, les chèvres et les chameaux sont utilisés dans diverses parties du monde pour la consommation humaine (Kongo, 2013). Les principaux composants de n’importe type de lait sont les protéines, le lactose, la matière grasse, les sels minéraux, les vitamines et les enzymes (Robinson, 2002). Le tableau 03, regroupe la composition de quelques types de laits.
Tableau 03. Composition de différents types de laits (Roudaut, 2005 ; Kongo, 2013).
Matière grasse Caséine lactose Albumine Minéraux Eau %
Vache 3.75 3.0 4.75 0.4 0.75 87.3
Chèvre 6.00 3.3 4.60 0.7 0.84 84.5 Brebis 9.00 4.6 4.70 1.1 1.00 79.6
Chamelle 3.00 3.5 5.50 1.7 1.50 84.8 Buffle 6.00 3.8 4.50 0.7 0.75 85.0
La matière grasse laitière est présente dans le lait cru bovin sous la forme de petits globules de diamètre compris entre 0,1 et 15 µm, revêtus d'une membrane dérivé des cellules sécrétrices. Le principal composant lipidique du lait de vache est le triglycéride (environ 98%), le reste, environ 2%
est représenté par des di glycérides, mono glycérides, cholestérol, phospholipides, acides gras libres,
… (Robinson, 2002).
La composition globale de la matière grasse du lait est significativement influencée par la race de vache, le régime de la vache, le stade de la lactation et la saison. La composition de la fraction lipidique de lait de vache est illustrée par les données du tableau 04.
Tableau 04. Composition de la fraction lipidique dans le lait de vache (Dicks et al., 2009).
Composants Contenu(%) Triacylglycerols 97-98 Diacylglycerols 0.3-0.6
Monoacylglycerols 0.02-0.04 Free fatty acids 0.1-0.5
Cholesterol 0.2-0.4 Phospholipids 0.2-1.0
Par ailleurs, le taux butyrique moyen dans le lait de chèvre est de 33g/kg. La matière grasse est constituée en majorité de triglycérides, en effet ils représentent 97% de la matière grasse totale, les mono-et les di glycérides ne représentent que 0,5%. La matière grasse du lait de chèvre est produite principalement à partir des acides gras volatils (Haenlein, 2004 ; Barlowska et al., 2009).
Tableau 05. Composition moyenne en acide gras de lait de chèvre (Haenlein, 2004).
Nature des acides gras
Teneur g/Kg
C4:0 butyric 0.13 C6:0 caproic 0.09 C8:0 caprylic 0.10 C10 :0 capric 0.26 C12 :0 lauric 0.12 C14 :0 myristic 0.32 C16 :0 palmitic 0.91 C18 :0 stearic 0.44 C16 : 1 palmitoleic 0.08 C18 : 1 oleic 0.98 C18 :2 linoleic 0.11 C18 :3 linolenic 0.04
Cependant, comme le lait des autres espèces de mammifères, la fraction lipidique du lait camelin est constituée essentiellement de triglycérides, qui représentent 97à 98 %de la matière grasse totale. La composition fait ressortir une faible teneur en acides gras à chaine courte et moyenne (de C4 à C12), et une teneur relativement élevée en C14 ;0, C16 :1, C18 :0 et C18 :1. Donc une bonne digestibilité de cette matière grasse, critère relativement important sur le plan nutritionnel (Siboukeur, 2007). La composition de la matière grasse du lait des camelins est dans le tableau 06.
Tableau 06. Composition moyenne en acide gras de lait de chamelle.
Nature des acides gras
Teneur g/Kg
C4:0 0.60 C6:0 0.22 C8:0 0.21 C10 :0 0.25 C12 :0 0.19 C14 :0 13.11 C14 :1 0.70 C15 :0 0.10 C16 : 0 31.45 C16 : 1 11.62 C18 :0 16.12 C18 :1 20.70 C18 :2 1.91 C18 :3 1.33 C20 :0 0.49 C4-C12 : 2.47
II.1.1.2. Les laits fermentés comme matrices probiotiques
II.1.1.2.1. Définition et données sur les laits fermentés : Un lait fermenté est un produit laitier obtenu par fermentation lactique. Cette fermentation du lait (entier, partiellement écrémé, enrichi ou modifié) est réalisée grâce à la présence de ferments lactiques, c'est-à-dire des souches bactériennes spécifiques. Sans danger pour la santé, ces micro-organismes peuvent être encore présents dans le produit lors de sa consommation. Leur présence est d'autant plus intéressante que ces bactéries lactiques peuvent avoir des effets bénéfiques pour l'organisme (Song et al., 2012 ; Souza et al., 2013 ; Yerlikaya, 2014) .
Les laits fermentés, sont les véhicules les plus populaires pour la livraison des probiotiques dans le corps, en raison de leur bonne compatibilité, leurs profils sensoriels agréables et attrayants, ainsi que leur consommation élevée à travers le monde (Roduit, 2011). La fabrication de laits fermentés probiotiques n'est pas une tâche facile, le long du traitement et stockage, les bactéries probiotiques
sont soumises aux stress tels que l'oxygène, les acides, le froid et les contraintes osmotiques, ce dernier peut être causé par un niveau élevé de sucre ajouté au lait avant le processus de fermentation, ce qui peut entraîner un retard de fermentation (Song et al., 2012 ; Maganha et al., 2013 ).
a. Le Maasai, un lait fermenté par L. plantarum: La consommation de lait fermenté est largement associée à la présence de lactobacilles dans la formulation, en raison des caractéristiques sensorielles souhaitables promues par ces microorganismes, associés à des avantages pour la santé des consommateurs (Souza et al., 2013). L. plantarum a une longue histoire d’utilisation sécuritaire dans une variété de produits fermentés, elle est impliquée dans le développement de la saveur et de l’arome des produits (Molin, 2001 ;Vries et al., 2006 ).
Parmi les laits fermentés par L. plantarum, le lait fermenté traditionnel ‘Maasai’ du Kenya. cette espèce est caractérisée par sa capacité de fermenter les différents glucides, de produire des enzymes telles que la ϐ-galactosidase et les peptidases, qui sont pertinentes pour la technologie des produits laitiers. Le ‘Maasai’ est fabriqué à partir de lait entier, non-pasteurisé, il est fermenté spontanément pendant au moins 5 jours, bien qu'une période plus longue soit habituellement préférée (Mathara et al., 2004 ; Mathara et al., 2008).
b. La viabilité des probiotiques dans les laits fermentés : Les produits laitiers fermentés sont les matrices alimentaires les plus convenables à véhiculer les bactéries probiotiques vers le tractus digestif (Kadhim et al., 2017).
Le niveau minimum pour les bactéries probiotiques dans les laits fermentés peut varier selon la souche utilisée, néanmoins, un nombre minimum de107UFC / ml ou 107UFC / g du produit est recommandé (maganha et al., 2014). Le maintien de ce niveau est un objectif difficile à atteindre, pour cette raison, lors de la formulation initiale, l'industrie prend en considération certains paramètres afin de compenser la baisse de viabilité tout au long du stockage (Paulo sousa e silva et al., 2014 ).
Il y à, cependant, de nombreuses variables internes et externes à l'environnement de laits fermentés qui peuvent nuire à l'intégrité et à l'efficacité du probiotique. La durée de conservation, l'acidité, le pH, la teneur en oxygène dissous, le potentiel redox, la concentration en sucre, la teneur en solides, la température de stockage et la présence de microorganismes inhibiteurs sont les principaux facteurs qui affectent la viabilité des probiotiques dans les matrices alimentaire, cependant, les principaux facteurs de perte de la viabilité des probiotiques ont été attribués à la diminution du pH du milieu et à l'accumulation des acides organiques (Tamim,2005 ; Shori,2016).
En plus de la viabilité dans la matrice alimentaire, la souche probiotique est appelée à maintenir sa viabilité le long du tractus digestif, ainsi, la pharmacocinétique des probiotiques s'est concentrée plus sur la comparaison des souches bactériennes avant et après l'ingestion que sur l'obtention de données sur les taux de survie bactérienne. L. plantarum NCIMB 8826 a montré une capacité élevée de survie dans l'iléon, atteignant un pic de population de 108 UFC / ml après 2 heures (Malago et al., 2011 ; de verie et al., 2005).
II.1.1.2.2. Activité lipolytique de L. plantarum: Les bactéries lactiques sont considérées comme faiblement lipolytiques par rapport à d'autres groupes de bactéries (exemple, Pseudomonas, Bacillus et Achromobacter) (Marschan, 2007 ;Medina et al., 2004). Certaines souches probiotiques de BL peuvent hydrolyser les triglycérides avec libération des acides gras essentiels, qui sont précieux pour la santé de consommateur (Medina et al., 2004).
La lipase de L. plantarum purifiée était optimale à pH 7,5 et à 35 °C, elle conserve environ 40% de l'activité maximale à pH 5,0 et à 15 °C. L'enzyme est stable à 65 °C et est irréversiblement inactivée à 75 ° C pendant 2 min. Par ailleurs, l'activité la plus élevée a été déterminée sur la tributyrine, de même, la trilaurine et la tripalmitine ont également été hydrolysées. Ainsi, L. plantarum est considérée comme une bonne source d'enzymes d'estérase qui présentait une activité maximale à pH 6,0 et à 40°C. En outre, elle a présenté une préférence pour le p-nitrophényle butyrate, mais, elle hydrolyse plus efficacement l'acétate de p-nitrophényle (Brod et al., 2010 ; Esteban-Torres et al.,2014).
Les lipases microbiennes ont une valeur industrielle potentielle en raison de leurs spécificités au substrat et leurs capacités à rester actives dans les matrices alimentaires (Lopes et al., 2002). La production maximale de lipase de L.plantarum a été atteinte à un pH de 5,5 et à 30 °C, elle était encore significative pour les faibles valeurs de pH, la température et la concentration en glucose (Lopes et al., 1999).
II.1.1.3. Applications des probiotiques en alimentation
L'amélioration de la qualité nutritionnelle, principalement des produits laitiers est induite par l'utilisation des probiotiques, en augmentant le nombre de bactéries dans le milieu, ou empêchant la multiplication des mauvaises souches. Ces organismes sont également utilisés pour des procédés tels que la conservation des aliments, la production d’alcool et l'amélioration du goût ou de la texture de certains aliments (Roduit, 2011).
Egalement, les probiotiques jouent un rôle important sur la qualité et la composition de la flore intestinale soit par stimulation de la croissance des micro-organismes bénéfiques importantes pour le processus de la digestion ou par inhibition des agents pathogènes présentent dans le système digestif. Celle-ci doit notamment jouer un rôle mécanique sur le transit intestinal et la fonction digestive, participer à l’élaboration de substances on enzymes indispensables à l’organisme, participer à l’absorption de minéraux, vitamines, enzymes, médicaments, etc (Roduit, 2011 ; Anthoula et al., 2013).
L’intégralité de ce travail a été réalisée au laboratoire de microbiologie de la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l'Université de Jijel, durant la période Avril – Juin de l’année 2017.
III. 1. Matériel
Pour la réalisation des différentes parties expérimentales, on s’est servi du matériel suivant : III.1.1. Souches bactériennes :
La souche bactérienne utilisée lors de la réalisation de différentes parties expérimentales est une souche lactique de Lactobacillus plantarum fourni par Mr. Khanouf. Elle a comme origine le rumen de chèvre locale, elle est identifié génétiquement et codée S10.
De mêmes trois souches pathogènes à savoir, Escherichia coli, Listeria innocua et Staphylococcus aureus ont été utilisées au cours de cette étude pour effectuer le test de la co-agrégation avec la souche lactique in -vitro.
III.1.2. Les matrices alimentaires :
Trois types de lait ont été utilisés au cours de la réalisation de notre étude expérimentale, il s’agit du lait de vache, du lait de chèvre et du lait de chamelle. Ces laits ont été procurés auprès des revendeurs.
Les laits écrémés et les beurres des mêmes espèces animales ont été utilisés comme matrices alimentaires au cours de cette étude.
III.1.3. Les cellules épithéliales intestinales :
Nous avons utilisé les tissus épithéliaux duodénal du poulet, ainsi que son mucus et ce pour étudier la capacité d’adhésion in vitro de notre souche lactobacillaire.
III.2.Méthodes
III.2.1.Evaluation de l’activité lipolytique in vitro
III.2.1.1.Revivification, vérification de la viabilité de la souche et examen microscopique : La souche est cultivée sur bouillon MRS et incubée à 37°C, son développement se traduit par un trouble et une pastille blanche au fond des tubes. La viabilité de la souche est vérifiée sur gélose MRS, pour se faire, les boites de Pétri contenant la gélose MRS préalablement coulée et solidifiée sont ensemencées en stries, l’incubation est faite à 37°C pendant 24h. Une fois les colonies sur gélose, elles étaient soumises à une coloration de Gram, pour vérifier le Gram de la culture et sa forme (Idoui et al., 2009).
III.2.1.2. Recherche de l’activité lipolytique sur gélose MRS :
L’activité lipolytique de L.plantarum S10, est recherchée sur gélose MRS tamponnée à pH 7 additionnée de 1%, 3% et 5% de Tween 20 ou 80 (sources lipidiques artificielles) ou des mêmes doses des beurres de vache, de chèvre et de chamelle (sources lipidiques naturelles). Après avoir coulé et solidifié les différentes préparations MRS, des disques de papier Wattman stérile ont été déposés en surface de chaque boite gélosée, puis chaque disque reçoit 100μl de la culture jeune. De même, nous avons cherché à mettre en évidence une éventuelle activité lipolytique du surnageant de culture de la même souche, en appliquant la même technique, mais les disques sont remplacés par des puits (Karam et al., 2012).
Après une incubation à 37°C pendant 2 jours, la lipolyse est révélée par une zone d’éclaircissement entourée d’un dépôt autour des disques ou des puits et pour une bonne confirmation, les boites ont été inondées par du sulfate de cuivre. Après une période de repos, le caractère lipolytique est estimé par mesure des halos claires autour de chaque disque (culture) ou puits (surnageant) (Roudj et al., 2009).
III.2.1.3. Recherche de l’activité lipolytique sur gélose blanche :
L’activité lipolytique a été recherchée sur gélose blanche pH 6 et additionnée des mêmes doses de tween et matières grasses déjà citées en haut. La même technique décrite en III.2.1.2. a été appliquée pour l’évaluation de cette activité.
III.2.1.4. Recherche de l’activité lipolytique par détermination de l’indice d’acidité :
Pour réaliser ce test, les beurres de vache, de chèvre et de chamelle ont été ensemencés par la culture lactique à raison de 5%. Les échantillons ont été incubés à 37°C et l’indice d’acidité a été déterminé après ensemencement (0h), puis après, 24h, 48h et 72h.
Deux grammes (2g) de chaque échantillon du beurre sont introduit dans un Erlen Meyer additionné de 20ml de solvant isobutanol puis 20ml de potasse alcoolique et enfin 3 gouttes de la solution de phénol phtaléine. Le dosage est réalisé à l’aide d’acide chlorhydrique 0.5 N jusqu’au virage de l’indicateur à l’incolore. Un témoin est réalisé de la même manière et dans les mêmes conditions mais sans matière grasse (Lecheb et al.,2015).
L’indice d’acide est calculé par la formule suivante :
I a= V HCl témoin – V HCl essai x 56, 1 x NHCl /P
Avec :
V : Volume en millilitre de la soude dornic utilisé pour le titrage ; N : La normalité de la solution de la soude ;
P : Poids en gramme de la prise d’essai.
III.2.1.5. Recherche de l’activité lipolytique par analyse de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse(CPG) :
La détermination de la composition en acide gras de la matière grasse des beurres de vache, de chèvre et de chamelle a été faite sur les matrices brutes et après ensemencement par L.plantarum S10 et incubation à 37°C pendant 48h.
Une masse de 20 mg de chaque échantillon de beurre a été placée dans un tube avec bouchon à vis puis additionnée de 0.5 ml d’heptane. Après agitation, un volume correspond à 0.2 ml de NaOH à 2 mol/l dans le méthanol a été ajouté au contenu du tube. Il a été ensuite porté au bain Marie, agité puis additionnée de 0.2 ml d’HCl à 2 mol/l, après une nouvelle agitation, ce mélange a été transvasé dans un petit tube en verre, abandonné dans un endroit pour décanter.
Un volume de 100µl de la phase supérieure a été prélevé, placé dans un tube en verre et évaporé en milieu ventilé. Enfin, le contenu du tube a été repris dans 50µl d’heptane. Après extraction à l’heptane, les esters méthyliques ont été ensuite analysés par CPG sur des colonnes polaires pour obtenir le profil en acide gras (Karleskind, 1992).
Le programme utilisé est le suivant :
Une phase stationnaire : le dimethyl polysiloxane ;
Un programme de température : gradient 65 °C à 250 °C ;
Mode d’injection : Split ;
Pression : 26,8 KPa ;
Flux total : 17,4 ml/min ;
Flux de la colonne : 0,76 ml/min.
III.2.2.Préparation des matrices fermentées
III.2.2.1.Préparation et contrôle des matrices alimentaires (laits et beurres) :
Nous commençons tous d’abord par la préparation de chaque échantillon de lait dans des flacons de capacité de 250 ml, par la suite, chaque échantillon est stérilisé dans le bain Marie 3 fois à 80°C pendant 15 min, puis refroidis. Les échantillons stérilisés et ceux témoins (laits crus) sont transportés vers la laiterie IGILAIT, ou les paramètres suivants ont été déterminés par un
appareil superlactose: Le taux de lactose, taux de protéines, taux de matière grasse, taux de matière non-grasse, taux de matière minérale, densité, et point de congélation.
L’efficacité du traitement thermique a été vérifiée par une technique de coloration simple à la fushine.
Par ailleurs, les beurres ont été traités de la même manière et l’absence de contaminant a été vérifiée par observation microscopique. Pour se faire, pour chaque beurre, un volume a été centrifugé et la phase liquide intermédiaire a été récupérée, puis examiner sous microscope (Idoui et al., 2009).
III.2.2.2.Ensemencement :
Après stérilisation et refroidissement des échantillons, chaque flacon a été ensemencé par L.
plantarum S10 à raison de 5% et le tout a été incubé à 37°C.
III.2.3.Evaluation de quelques performances de la culture III.2.3.1.Aptitude acidifiante :
L’estimation de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution de pH des différentes matrices en fonction du temps d’incubation et d’autre part à doser simultanément l’acide lactique produit par L.plantarum S10 :
Détermination de l’acidité Dornic :
Après incubation à 37°C pendant 2h, 4h, 6h, 8h et 24h, 10 ml de chaque laits entier et écrémé de chaque espèce animale a été prélevé puis titrer par la soude Dornic (NaOH N /9) en présence de 5 gouttes de phénolphtaléine, jusqu’au virage de la couleur au rose pale persistant au moins 10 seconde. Le volume de la soude utilisé est détérminé, et les résultats sont exprimé en degré dornic (°D),
Sachant que (Larpent, 1997) :
Acidité (°D)= VNaOH .10 Mesure du pH :
Le pH est déterminé par immersion de l’électrode du pH-mètre dans les échantillons avant ensemencement des laits, après ensemencement (0h), puis après, 2h, 4h, 6h et 24h d’incubation à 37°C. Le chiffre affiché sur écran du pH mètre a été noté (Al-Otaibi, 2009).
III.2.3.2. Viscosité au cours de la fermentation :
La viscosité est déterminée par la formule physique connue aux mêmes moments de la mesure du pH. Elle peut nous renseigner sur l’évolution des composants de la matrice, c'est-à-dire, une augmentation de la fluidité du produit ou au contraire, une augmentation de l’aspect épaississant.
Pour se faire, après chaque intervalle de temps de fermentation, un volume connu en ml est prélevé et le poids équivalent est noté. Le calcule est effectué par la formule suivante (Rheotest, 2010) :
viscosité = 𝑝𝑜𝑖𝑑𝑠
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 .
III.2.3.3. Viabilité de la souche au cours de la fermentation :
La viabilité est déterminée en comptant le nombre de cellules viables pendant les intervalles d’incubation à 37°C (0h, 2h, 4h, 6h, 8h et 24h), en utilisant la cellule de Malassez. La technique de la micro-dilution a été utilisée (10-7) pour suivre le nombre de cellules au cours de la fermentation lactique.
Sur une microplaque, 900µl d’eau distillée stérile ont été déposés dans chaque micro-tubes, par la suite le premier micro-tube reçoit 100 µl de l’échantillon, ce qui nous donnera la première dilution, à partir de laquelle, la dilution 10-7 a été obtenue.
Une fois la dilution choie est préparée (10-7), la chambre de la cellule de Malassez est rempli par capillarité par un volume de 50 µl. Enfin, l’observation a été faite à l’objectif 10 où les cellules viables ont été dénombrées.
Le nombre des cellules viables est déterminé selon l’équation suivante donnée comme suit :
nombre de cellules=∑nombre de cellules calculé sous microscope x102 x 103x l’inverse de dilution.
100 : nombre de cellules de rectangle dans la cellule de Malassez ; 103 : 1 mm3=103 ml ;
1 : 1 mm3 : volume de la cellule de Malassez.
III.2.4.Evaluation de l’effet matrices alimentaires sur quelques aptitudes probiotiques
III.2.4.1. Préparation des matrices alimentaires :
A travers les résultats obtenus dans la partie III.2.3, nous avons repris les mêmes protocoles expérimentaux, en utilisant les mêmes matrices alimentaires pour évaluer leurs impacts sur la viabilité et les performances probiotiques de notre souche.
Les laits écrémés et ceux entiers des trois espèces animales sont inoculés avec la souche à raison de 5% et l’incubation est faite pendant 24h. Après cette période de fermentation, les cellules bactériennes sont récupérées à partir de la phase aqueuse, puis transférées sur bouillon MRS.
Encore une fois, les cellules sont récupérées par centrifugation à 6000 trs pendant 15 min, après une période d’incubation de 18h. La culture sur bouillon MRS a été préparée dans les mêmes conditions et avec le même taux d’ensemencement, et elle est utilisée comme culture témoin.
Cependant, les beurres des trois espèces animales sont inoculés à même taux d’ensemencement (5%), et incubés à 37°C/ 24heures. Les échantillons sont centrifugés et les cellules récupérées de la phase aqueuse et transférées sur bouillon MRS.
III.2.4.2. Aptitudes probiotiques de la souche ré -isolée des matrices alimentaires
Cette partie est dédiée à l’étude de l’effet de la matrice alimentaire sur le maintien des performances probiotiques de L.plantarum S10.
Les cellules bactériennes récupérées des matrices alimentaires en fin de fermentation, ainsi que celles récupérées du bouillon MRS ont été soumises aux tests probiotiques suivants :
II.2.4.2.1.Test d’hydrophobicité :
L’adhésion aux cellules épithéliales est généralement évaluée et estimée par le test d’hydrophobicité des cellules. L’évaluation de l’hydrophobicité des cellules bactériennes a été faite selon la méthode décrite par Iyer et al. (2010).
Pour la réalisation de ce test quatre solvants sont utilisées : le xylène, le toluène, le chloroforme et l éthyle acétate.
Le culot bactérien a été récupéré par centrifugation à 6000 trs /15 min suivi de deux lavages successifs avec le PBS. Chaque culot bactérien a été resuspendu dans 1.2 ml de tampon urée phosphate magnésium (pH : 6.5). La densité optique initiale de la suspension a été ajustée approximativement à 10-4 à 450 nm (Do initiale). Ensuite 0.6 ml de chaque solvant a été ajouté doucement à 3 ml de la suspension bactérienne puis incubée à 37°C pendant 10 min. Ce mélange a
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