Séquençage de l’ADN : Principe,indications et applications

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31

DOYENS HONORAIRES :

1962 – 1969 : Professeur Abdelmalek FARAJ 1969 – 1974 : Professeur Abdellatif BERBICH

1974 – 1981 : Professeur Bachir LAZRAK 1981 – 1989 : Professeur Taieb CHKILI

1989 – 1997 : Professeur Mohamed Tahar ALAOUI 1997 – 2003 : Professeur Abdelmajid BELMAHI

2003 – 2013 : Professeur Najia HAJJAJ – HASSOUNI

ADMINISTRATION :

Doyen

Professeur Mohamed ADNAOUI

Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et estudiantines

Professeur Mohammed AHALLAT

Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération

Professeur Taoufiq DAKKA

Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie

Professeur Jamal TAOUFIK

Secrétaire Général

Mr. Mohamed KARRA

UNIVERSITE MOHAMMED V

1-

ENSEIGNANTS-CHERCHEURS MEDECINS ET PHARMACIENS

Décembre 1984

Pr. MAAOUNI Abdelaziz Médecine Interne – Clinique Royale

Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajdi Anesthésie -Réanimation Pr. SETTAF Abdellatif pathologie Chirurgicale

Novembre et Décembre 1985

Pr. BENSAID Younes Pathologie Chirurgicale

Janvier, Février et Décembre 1987

Pr. LACHKAR Hassan Médecine Interne

Pr. YAHYAOUI Mohamed Neurologie

Décembre 1989

Pr. ADNAOUI Mohamed Médecine Interne –Doyen de la FMPR

Pr. OUAZZANI Taïbi Mohamed Réda Neurologie

Janvier et Novembre 1990

Pr. HACHIM Mohammed* Médecine-Interne

Pr. KHARBACH Aîcha Gynécologie -Obstétrique Pr. TAZI Saoud Anas Anesthésie Réanimation

Février Avril Juillet et Décembre 1991

Pr. AZZOUZI Abderrahim Anesthésie Réanimation –Doyen de la FMPO

Pr. BAYAHIA Rabéa Néphrologie

Pr. BELKOUCHI Abdelkader Chirurgie Générale Pr. BENCHEKROUN Belabbes Abdellatif Chirurgie Générale Pr. BENSOUDA Yahia Pharmacie galénique

Pr. BERRAHO Amina Ophtalmologie

Pr. BEZZAD Rachid Gynécologie ObstétriqueMéd Chef Maternité des Orangers

Pr. CHERRAH Yahia Pharmacologie

Pr. CHOKAIRI Omar Histologie Embryologie

Pr. KHATTAB Mohamed Pédiatrie

Pr. SOULAYMANI Rachida Pharmacologie – Dir. du Centre National PV Rabat

Pr. TAOUFIK Jamal Chimie thérapeutique V.D à la pharmacie+Dir du CEDOC+Directeur du Médicament

Décembre 1992

Pr. AHALLAT Mohamed Chirurgie Générale Doyen de FMPT

Pr. BENSOUDA Adil Anesthésie Réanimation

Pr. CHAHED OUAZZANI Laaziza Gastro-Entérologie Pr. CHRAIBI Chafiq Gynécologie Obstétrique Pr. EL OUAHABI Abdessamad Neurochirurgie

Pr. FELLAT Rokaya Cardiologie Pr. GHAFIR Driss* Médecine Interne

Pr. JIDDANE Mohamed Anatomie

Pr. TAGHY Ahmed Chirurgie Générale

Pr. ZOUHDI Mimoun Microbiologie

Mars 1994

Pr. BENJAAFAR Noureddine Radiothérapie

Pr. BEN RAIS Nozha Biophysique

Pr. CAOUI Malika Biophysique

Pr. CHRAIBI Abdelmjid Endocrinologie et Maladies Métaboliques Doyen de la FMPA

Pr. EL AMRANI Sabah Gynécologie Obstétrique Pr. EL BARDOUNI Ahmed Traumato-Orthopédie Pr. EL HASSANI My Rachid Radiologie

Pr. ERROUGANI Abdelkader Chirurgie Générale- Directeur CHIS -Rabat

Pr. ESSAKALI Malika Immunologie

Pr. ETTAYEBI Fouad Chirurgie Pédiatrique

Pr. HASSAM Badredine Dermatologie

Pr. IFRINE Lahssan Chirurgie Générale

Pr. MAHFOUD Mustapha Traumatologie – Orthopédie Pr. RHRAB Brahim Gynécologie –Obstétrique

Pr. SENOUCI Karima Dermatologie

Mars 1994

Pr. ABBAR Mohamed* Urologie Directeur Hôpital My Ismail Meknès

Pr. ABDELHAK M’barek Chirurgie – Pédiatrique Pr. BENTAHILA Abdelali Pédiatrie

Pr. BENYAHIA Mohammed Ali Gynécologie – Obstétrique Pr. BERRADA Mohamed Saleh Traumatologie – Orthopédie Pr. CHERKAOUI Lalla Ouafae Ophtalmologie

Pr. LAKHDAR Amina Gynécologie Obstétrique

Pr. MOUANE Nezha Pédiatrie

Mars 1995

Pr. ABOUQUAL Redouane Réanimation Médicale Pr. AMRAOUI Mohamed Chirurgie Générale Pr. BAIDADA Abdelaziz Gynécologie Obstétrique Pr. BARGACH Samir Gynécologie Obstétrique Pr. DRISSI KAMILI Med Nordine* Anesthésie Réanimation Pr. EL MESNAOUI Abbes Chirurgie Générale Pr. ESSAKALI HOUSSYNI Leila Oto-Rhino-Laryngologie

Pr. HDA Abdelhamid* Cardiologie - Directeur du Service de Santé des FAR

Pr. IBEN ATTYA ANDALOUSSI Ahmed Urologie Pr. OUAZZANI CHAHDI Bahia Ophtalmologie

Pr. SEFIANI Abdelaziz Génétique

Pr. ZEGGWAGH Amine Ali Réanimation Médicale

Décembre 1996

Pr. AMIL Touriya* Radiologie

Pr. BELKACEM Rachid Chirurgie Pédiatrie Pr. BOULANOUAR Abdelkrim Ophtalmologie Pr. EL ALAMI EL FARICHA EL Hassan Chirurgie Générale

Pr. GAOUZI Ahmed Pédiatrie Pr. MAHFOUDI M’barek* Radiologie

Pr. OUZEDDOUN Naima Néphrologie

Pr. ZBIR EL Mehdi* Cardiologie Directeur Hôp. Mil.d’Instruction Med V Rabat

Novembre 1997

Pr. ALAMI Mohamed Hassan Gynécologie-Obstétrique Pr. BEN SLIMANE Lounis Urologie

Pr. BIROUK Nazha Neurologie

Pr. ERREIMI Naima Pédiatrie

Pr. FELLAT Nadia Cardiologie

Pr. KADDOURI Noureddine Chirurgie Pédiatrique

Pr. KOUTANI Abdellatif Urologie

Pr. LAHLOU Mohamed Khalid Chirurgie Générale

Pr. MAHRAOUI CHAFIQ Pédiatrie

Pr. TAOUFIQ Jallal Psychiatrie Directeur Hôp. Arrazi Salé

Pr. YOUSFI MALKI Mounia Gynécologie Obstétrique

Novembre 1998

Pr. BENOMAR ALI Neurologie – Doyen de la FMP Abulcassis

Pr. BOUGTAB Abdesslam Chirurgie Générale Pr. ER RIHANI Hassan Oncologie Médicale

Pr. BENKIRANE Majid* Hématologie

Janvier 2000

Pr. ABID Ahmed* Pneumophtisiologie

Pr. AIT OUMAR Hassan Pédiatrie

Pr. BENJELLOUN Dakhama Badr.Sououd Pédiatrie

Pr. BOURKADI Jamal-Eddine Pneumo-phtisiologie Directeur Hôp. My Youssef

Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Al Montacer Chirurgie Générale Pr. ECHARRAB El Mahjoub Chirurgie Générale Pr. EL FTOUH Mustapha Pneumo-phtisiologie Pr. EL MOSTARCHID Brahim* Neurochirurgie

Pr. MAHMOUDI Abdelkrim* Anesthésie-Réanimation Pr. TACHINANTE Rajae Anesthésie-Réanimation Pr. TAZI MEZALEK Zoubida Médecine Interne

Novembre 2000

Pr. AIDI Saadia Neurologie

Pr. AJANA Fatima Zohra Gastro-Entérologie

Pr. BENAMR Said Chirurgie Générale

Pr. CHERTI Mohammed Cardiologie

Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Selma Anesthésie-Réanimation

Pr. EL HASSANI Amine Pédiatrie Directeur Hôp. Chekikh Zaied

Pr. EL KHADER Khalid Urologie

Pr. EL MAGHRAOUI Abdellah* Rhumatologie

Pr. GHARBI Mohamed El Hassan Endocrinologie et Maladies Métaboliques Pr. MDAGHRI ALAOUI Asmae Pédiatrie

Décembre 2000

Pr. ZOHAIR ABDELAH* ORL

Décembre 2001

Pr. BALKHI Hicham* Anesthésie-Réanimation Pr. BENABDELJLIL Maria Neurologie

Pr. BENAMAR Loubna Néphrologie

Pr. BENAMOR Jouda Pneumo-phtisiologie

Pr. BENELBARHDADI Imane Gastro-Entérologie

Pr. BENNANI Rajae Cardiologie

Pr. BENOUACHANE Thami Pédiatrie

Pr. BEZZA Ahmed* Rhumatologie

Pr. BOUCHIKHI IDRISSI Med Larbi Anatomie Pr. BOUMDIN El Hassane* Radiologie

Pr. CHAT Latifa Radiologie

Pr. DAALI Mustapha* Chirurgie Générale Pr. DRISSI Sidi Mourad* Radiologie

Pr. EL HIJRI Ahmed Anesthésie-Réanimation Pr. EL MAAQILI Moulay Rachid Neuro-Chirurgie

Pr. EL MADHI Tarik Chirurgie-Pédiatrique Pr. EL OUNANI Mohamed Chirurgie Générale

Pr. ETTAIR Said Pédiatrie Directeur. Hôp.d’Enfants Rabat

Pr. GAZZAZ Miloudi* Neuro-Chirurgie

Pr. HRORA Abdelmalek Chirurgie Générale

Pr. KABBAJ Saad Anesthésie-Réanimation

Pr. KABIRI EL Hassane* Chirurgie Thoracique Pr. LAMRANI Moulay Omar Traumatologie Orthopédie

Pr. LEKEHAL Brahim Chirurgie Vasculaire Périphérique Pr. MAHASSIN Fattouma* Médecine Interne

Pr. MEDARHRI Jalil Chirurgie Générale Pr. MIKDAME Mohammed* Hématologie Clinique Pr. MOHSINE Raouf Chirurgie Générale

Pr. NOUINI Yassine Urologie Directeur Hôpital Ibn Sina

Pr. SABBAH Farid Chirurgie Générale

Pr. SEFIANI Yasser Chirurgie Vasculaire Périphérique Pr. TAOUFIQ BENCHEKROUN Soumia Pédiatrie

Décembre 2002

Pr. AL BOUZIDI Abderrahmane* Anatomie Pathologique

Pr. AMEUR Ahmed * Urologie

Pr. AMRI Rachida Cardiologie

Pr. AOURARH Aziz* Gastro-Entérologie

Pr. BAMOU Youssef * Biochimie-Chimie

Pr. BELMEJDOUB Ghizlene* Endocrinologie et Maladies Métaboliques

Pr. BENZEKRI Laila Dermatologie

Pr. BENZZOUBEIR Nadia Gastro-Entérologie Pr. BERNOUSSI Zakiya Anatomie Pathologique Pr. BICHRA Mohamed Zakariya* Psychiatrie

Pr. CHOHO Abdelkrim * Chirurgie Générale

Pr. EL ALAMI EL FELLOUS Sidi Zouhair Chirurgie Pédiatrique Pr. EL HAOURI Mohamed * Dermatologie

Pr. FILALI ADIB Abdelhai Gynécologie Obstétrique

Pr. HAJJI Zakia Ophtalmologie

Pr. IKEN Ali Urologie

Pr. JAAFAR Abdeloihab* Traumatologie Orthopédie

Pr. KRIOUILE Yamina Pédiatrie

Pr. MABROUK Hfid* Traumatologie Orthopédie Pr. MOUSSAOUI RAHALI Driss* Gynécologie Obstétrique Pr. OUJILAL Abdelilah Oto-Rhino-Laryngologie Pr. RACHID Khalid * Traumatologie Orthopédie Pr. RAISS Mohamed Chirurgie Générale

Pr. RGUIBI IDRISSI Sidi Mustapha* Pneumophtisiologie

Pr. RHOU Hakima Néphrologie

Pr. SIAH Samir * Anesthésie Réanimation

Pr. THIMOU Amal Pédiatrie

Pr. ZENTAR Aziz* Chirurgie Générale

Janvier 2004

Pr. ABDELLAH El Hassan Ophtalmologie

Pr. AMRANI Mariam Anatomie Pathologique Pr. BENBOUZID Mohammed Anas Oto-Rhino-Laryngologie Pr. BENKIRANE Ahmed* Gastro-Entérologie Pr. BOUGHALEM Mohamed* Anesthésie Réanimation

Pr. BOULAADAS Malik Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale Pr. BOURAZZA Ahmed* Neurologie

Pr. CHAGAR Belkacem* Traumatologie Orthopédie Pr. CHERRADI Nadia Anatomie Pathologique

Pr. EL FENNI Jamal* Radiologie

Pr. EL HANCHI ZAKI Gynécologie Obstétrique Pr. EL KHORASSANI Mohamed Pédiatrie

Pr. EL YOUNASSI Badreddine* Cardiologie

Pr. HACHI Hafid Chirurgie Générale

Pr. JABOUIRIK Fatima Pédiatrie

Pr. KHARMAZ Mohamed Traumatologie Orthopédie Pr. MOUGHIL Said Chirurgie Cardio-Vasculaire Pr. OUBAAZ Abdelbarre* Ophtalmologie

Pr. TARIB Abdelilah* Pharmacie Clinique Pr. TIJAMI Fouad Chirurgie Générale Pr. ZARZUR Jamila Cardiologie

Janvier 2005

Pr. ABBASSI Abdellah Chirurgie Réparatrice et Plastique Pr. AL KANDRY Sif Eddine* Chirurgie Générale

Pr. ALLALI Fadoua Rhumatologie

Pr. AMAZOUZI Abdellah Ophtalmologie

Pr. AZIZ Noureddine* Radiologie

Pr. BAHIRI Rachid Rhumatologie Directeur. Hôp. Al Ayachi Salé

Pr. BARKAT Amina Pédiatrie

Pr. BENYASS Aatif Cardiologie

Pr. DOUDOUH Abderrahim* Biophysique Pr. EL HAMZAOUI Sakina* Microbiologie

Pr. HAJJI Leila Cardiologie (mise en disponibilité)

Pr. HESSISSEN Leila Pédiatrie

Pr. JIDAL Mohamed* Radiologie

Pr. LAAROUSSI Mohamed Chirurgie Cardio-vasculaire Pr. LYAGOUBI Mohammed Parasitologie

Pr. RAGALA Abdelhak Gynécologie Obstétrique

Pr. SBIHI Souad Histo-Embryologie Cytogénétique Pr. ZERAIDI Najia Gynécologie Obstétrique

Avril 2006

Pr. ACHEMLAL Lahsen* Rhumatologie

Pr. AKJOUJ Said* Radiologie

Pr. BELMEKKI Abdelkader* Hématologie

Pr. BENCHEIKH Razika O.R.L

Pr. BIYI Abdelhamid* Biophysique

Pr. BOUHAFS Mohamed El Amine Chirurgie - Pédiatrique Pr. BOULAHYA Abdellatif* Chirurgie Cardio – Vasculaire Pr. CHENGUETI ANSARI Anas Gynécologie Obstétrique

Pr. DOGHMI Nawal Cardiologie

Pr. FELLAT Ibtissam Cardiologie

Pr. FAROUDY Mamoun Anesthésie Réanimation Pr. HARMOUCHE Hicham Médecine Interne Pr. HANAFI Sidi Mohamed* Anesthésie Réanimation Pr. IDRISS LAHLOU Amine* Microbiologie

Pr. JROUNDI Laila Radiologie

Pr. KARMOUNI Tariq Urologie

Pr. KILI Amina Pédiatrie

Pr. KISRA Hassan Psychiatrie

Pr. KISRA Mounir Chirurgie – Pédiatrique Pr. LAATIRIS Abdelkader* Pharmacie Galénique Pr. LMIMOUNI Badreddine* Parasitologie

Pr. MANSOURI Hamid* Radiothérapie

Pr. OUANASS Abderrazzak Psychiatrie

Pr. SAFI Soumaya* Endocrinologie

Pr. SEKKAT Fatima Zahra Psychiatrie

Pr. SOUALHI Mouna Pneumo – Phtisiologie

Pr. TELLAL Saida* Biochimie

Pr. ZAHRAOUI Rachida Pneumo – Phtisiologie

Decembre 2006

Pr SAIR Khalid Chirurgie générale Dir. Hôp.Av.Marrakech

Octobre 2007

Pr. ABIDI Khalid Réanimation médicale

Pr. ACHACHI Leila Pneumo phtisiologie Pr. ACHOUR Abdessamad* Chirurgie générale

Pr. AIT HOUSSA Mahdi* Chirurgie cardio vasculaire Pr. AMHAJJI Larbi* Traumatologie orthopédie

Pr. AOUFI Sarra Parasitologie

Pr. BALOUCH Lhousaine* Biochimie-chimie Pr. BENZIANE Hamid* Pharmacie clinique Pr. BOUTIMZINE Nourdine Ophtalmologie Pr. CHARKAOUI Naoual* Pharmacie galénique Pr. EHIRCHIOU Abdelkader* Chirurgie générale

Pr. EL BEKKALI Youssef * Chirurgie cardio-vasculaire

Pr. ELABSI Mohamed Chirurgie générale Pr. EL MOUSSAOUI Rachid Anesthésie réanimation

Pr. EL OMARI Fatima Psychiatrie

Pr. GHARIB Noureddine Chirurgie plastique et réparatrice

Pr. HADADI Khalid* Radiothérapie

Pr. ICHOU Mohamed* Oncologie médicale

Pr. ISMAILI Nadia Dermatologie

Pr. KEBDANI Tayeb Radiothérapie

Pr. LALAOUI SALIM Jaafar* Anesthésie réanimation

Pr. LOUZI Lhoussain* Microbiologie

Pr. MADANI Naoufel Réanimation médicale

Pr. MAHI Mohamed* Radiologie

Pr. MARC Karima Pneumo phtisiologie

Pr. MASRAR Azlarab Hématologie biologique

Pr. MRANI Saad* Virologie

Pr. OUZZIF Ez zohra* Biochimie-chimie

Pr. RABHI Monsef* Médecine interne

Pr. RADOUANE Bouchaib* Radiologie

Pr. SEFFAR Myriame Microbiologie

Pr. SEKHSOKH Yessine* Microbiologie

Pr. SIFAT Hassan* Radiothérapie

Pr. TABERKANET Mustafa* Chirurgie vasculaire périphérique

Pr. TACHFOUTI Samira Ophtalmologie

Pr. TAJDINE Mohammed Tariq* Chirurgie générale

Pr. TANANE Mansour* Traumatologie orthopédie Pr. TLIGUI Houssain Parasitologie

Pr. TOUATI Zakia Cardiologie

Décembre 2008

Pr TAHIRI My El Hassan* Chirurgie Générale

Mars 2009

Pr. ABOUZAHIR Ali* Médecine interne

Pr. AGDR Aomar* Pédiatre

Pr. AIT ALI Abdelmounaim* Chirurgie Générale Pr. AIT BENHADDOU El hachmia Neurologie

Pr. AKHADDAR Ali* Neuro-chirurgie

Pr. ALLALI Nazik Radiologie

Pr. AMINE Bouchra Rhumatologie

Pr. BELYAMANI Lahcen* Anesthésie Réanimation

Pr. BJIJOU Younes Anatomie

Pr. BOUHSAIN Sanae* Biochimie-chimie

Pr. BOUI Mohammed* Dermatologie

Pr. BOUNAIM Ahmed* Chirurgie Générale

Pr. BOUSSOUGA Mostapha* Traumatologie orthopédique Pr. CHTATA Hassan Toufik* Chirurgie vasculaire périphérique

Pr. DOGHMI Kamal* Hématologie clinique

Pr. EL MALKI Hadj Omar Chirurgie Générale Pr. EL OUENNASS Mostapha* Microbiologie Pr. ENNIBI Khalid* Médecine interne

Pr. FATHI Khalid Gynécologie obstétrique

Pr. HASSIKOU Hasna * Rhumatologie

Pr. KABBAJ Nawal Gastro-entérologie

Pr. KABIRI Meryem Pédiatrie

Pr. KARBOUBI Lamya Pédiatrie

Pr. LAMSAOURI Jamal* Chimie Thérapeutique Pr. MARMADE Lahcen Chirurgie Cardio-vasculaire

Pr. MESKINI Toufik Pédiatrie

Pr. MESSAOUDI Nezha * Hématologie biologique Pr. MSSROURI Rahal Chirurgie Générale

Pr. NASSAR Ittimade Radiologie

Pr. OUKERRAJ Latifa Cardiologie

Pr. RHORFI Ismail Abderrahmani * Pneumo-phtisiologie

Octobre 2010

Pr. ALILOU Mustapha Anesthésie réanimation Pr. AMEZIANE Taoufiq* Médecine interne Pr. BELAGUID Abdelaziz Physiologie

Pr. CHADLI Mariama* Microbiologie

Pr. CHEMSI Mohamed* Médecine aéronautique Pr. DAMI Abdellah* Biochimie chimie

Pr. DARBI Abdellatif* Radiologie

Pr. DENDANE Mohammed Anouar Chirurgie pédiatrique

Pr. EL HAFIDI Naima Pédiatrie

Pr. EL KHARRAS Abdennasser* Radiologie

Pr. EL MAZOUZ Samir Chirurgie plastique et réparatrice

Pr. EL SAYEGH Hachem Urologie

Pr. ERRABIH Ikram Gastro entérologie Pr. LAMALMI Najat Anatomie pathologique

Pr. MOSADIK Ahlam Anesthésie Réanimation

Pr. MOUJAHID Mountassir* Chirurgie générale Pr. NAZIH Mouna* Hématologie biologique Pr. ZOUAIDIA Fouad Anatomie pathologique

Decembre 2010

Mai 2012

Pr. AMRANI Abdelouahed Chirurgie Pédiatrique Pr. ABOUELALAA Khalil* Anesthésie Réanimation Pr. BENCHEBBA Driss* Traumatologie Orthopédique Pr. DRISSI Mohamed* Anesthésie Réanimation Pr. EL ALAOUI MHAMDI Mouna Chirurgie Générale Pr. EL KHATTABI Abdessadek* Médecine Interne Pr. EL OUAZZANI Hanane* Pneumophtisiologie Pr. ER-RAJI Mounir Chirurgie Pédiatrique

Pr. JAHID Ahmed Anatomie pathologique

Pr. MEHSSANI Jamal* Psychiatrie

Pr. RAISSOUNI Maha* Cardiologie

*Enseignants Militaires Février 2013

Pr. AHID Samir Pharmacologie – Chimie

Pr. AIT EL CADI Mina Toxicologie

Pr. AMRANI HANCHI Laila Gastro-Entérologie Pr. AMOUR Mourad Anesthésie Réanimation Pr. AWAB Almahdi Anesthésie Réanimation Pr. BELAYACHI Jihane Réanimation Médicale Pr. BELKHADIR Zakaria Houssain Anesthésie Réanimation Pr. BENCHEKROUN Laila Biochimie-Chimie Pr. BENKIRANE Souad Hématologie biologique Pr. BENNANA Ahmed* Informatique Pharmaceutique Pr. BENSGHIR Mustapha* Anesthésie Réanimation Pr. BENYAHIA Mohammed* Néphrologie

Pr. BOUATIA Mustapha Chimie Analytique et Bromatologie Pr. BOUABID Ahmed Salim* Traumatologie Orthopédie

Pr. BOUTARBOUCH Mahjouba Anatomie

Pr. CHAIB Ali* Cardiologie

Pr. DENDANE Tarek Réanimation Médicale

Pr. DINI Nouzha* Pédiatrie

Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Mohamed Ali Anesthésie Réanimation Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Najwa Radiologie

Pr. ELFATEMI Nizare Neuro-Chirurgie

Pr. EL GUERROUJ Hasnae Médecine Nucléaire Pr. EL HARTI Jaouad Chimie Thérapeutique

Pr. EL JOUDI Rachid* Toxicologie

Pr. EL KABABRI Maria Pédiatrie

Pr. EL KHANNOUSSI Basma Anatomie Pathologie

Pr. EL KHLOUFI Samir Anatomie

Pr. EL KORAICHI Alae Anesthésie Réanimation Pr. EN-NOUALI Hassane* Radiologie

Pr. ERRGUIG Laila Physiologie

Pr. GHFIR Imade Médecine Nucléaire

Pr. IMANE Zineb Pédiatrie

Pr. IRAQI Hind Endocrinologie et maladies métaboliques

Pr. KABBAJ Hakima Microbiologie

Pr. KADIRI Mohamed* Psychiatrie

Pr. LATIB Rachida Radiologie

Pr. MAAMAR Mouna Fatima Zahra Médecine Interne

Pr. MEDDAH Bouchra Pharmacologie

Pr. MELHAOUI Adyl Neuro-chirurgie

Pr. MRABTI Hind Oncologie Médicale

Pr. NEJJARI Rachid Pharmacognosie

Pr. OUBEJJA Houda Chirurgie Pédiatrique Pr. OUKABLI Mohamed* Anatomie Pathologique Pr. RAHALI Younes Pharmacie Galénique

Pr. RATBI Ilham Génétique

Pr. RAHMANI Mounia Neurologie

Pr. REDA Karim* Ophtalmologie

Pr. REGRAGUI Wafa Neurologie

Pr. RKAIN Hanan Physiologie

Pr. ROSTOM Samira Rhumatologie

Pr. ROUAS Lamiaa Anatomie Pathologique Pr. ROUIBAA Fedoua* Gastro-Entérologie Pr. SALIHOUN Mouna Gastro-Entérologie

Pr. SAYAH Rochde Chirurgie Cardio-Vasculaire Pr. SEDDIK Hassan* Gastro-Entérologie

Pr. ZERHOUNI Hicham Chirurgie Pédiatrique

Pr. ZINE Ali* Traumatologie Orthopédie

Avril 2013

Pr. EL KHATIB Mohamed Karim* Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale

MAI 2013

Pr.BOUSLIMAN Yassir Toxicologie

MARS 2014

Pr. ACHIR Abdellah Chirurgie Thoracique Pr. BENCHAKROUN Mohammed * Traumatologie- Orthopédie Pr. BOUCHIKH Mohammed Chirurgie Thoracique Pr. EL KABBAJ Driss * Néphrologie

Pr. EL MACHTANI IDRISSI Samira * Biochimie-Chimie

Pr. HARDIZI Houyam Histologie- Embryologie-Cytogénétique

Pr. HASSANI Amale * Pédiatrie

Pr. HERRAK Laila Pneumologie

Pr. JANANE Abdellah * Urologie

Pr. KOUACH Jaouad* Génycologie-Obstétrique Pr. LEMNOUER Abdelhay* Microbiologie

Pr. MAKRAM Sanaa * Pharmacologie

Pr. OULAHYANE Rachid* Chirurgie Pédiatrique Pr. RHISSASSI Mohamed Jaafar CCV

Pr. SABRY Mohamed* Cardiologie

Pr. SEKKACH Youssef* Médecine Interne

Pr. TAZI MOUKHA Zakia Génécologie-Obstétrique

AVRIL 2014

Pr.ZALAGH Mohammed ORL

PROFESSEURS AGREGES :

DECEMBRE 2014

Pr. ABILKASSEM Rachid* Pédiatrie

Pr. AIT BOUGHIMA Fadila Médecine Légale

Pr. BEKKALI Hicham * Anesthésie-Réanimation Pr. BENAZZOU Salma Chirurgie Maxillo-Faciale Pr. BOUABDELLAH Mounya Biochimie-Chimie

Pr. BOUCHRIK Mourad* Parasitologie Pr. DERRAJI Soufiane* Pharmacie Clinique Pr. DOBLALI Taoufik* Microbiologie Pr. EL AYOUBI EL IDRISSI Ali Anatomie

Pr. EL GHADBANE Abdedaim Hatim* Anesthésie-Réanimation Pr. EL MARJANY Mohammed* Radiothérapie

Pr. FEJJAL Nawfal Chirurgie Réparatrice et Plastique Pr. JAHIDI Mohamed* O.R.L

Pr. LAKHAL Zouhair* Cardiologie

Pr. OUDGHIRI Nezha Anesthésie-Réanimation Pr. RAMI Mohamed Chirurgie Pédiatrique Pr. SABIR Maria Psychiatrie

Pr. SBAI IDRISSI Karim* Médecine préventive, santé publique et Hyg.

AOUT 2015

Pr. MEZIANE Meryem Dermatologie Pr. TAHRI Latifa Rhumatologie

JANVIER 2016

Pr. BENKABBOU Amine Chirurgie Générale Pr. EL ASRI Fouad* Ophtalmologie Pr. ERRAMI Noureddine* O.R.L

JUIN 2017

Pr. ABI Rachid* Microbiologie Pr. ASFALOU Ilyasse* Cardiologie

Pr. BOUAYTI El Arbi* Médecine préventive, santé publique et Hyg. Pr. BOUTAYEB Saber Oncologie Médicale

Pr. EL GHISSASSI Ibrahim Oncologie Médicale Pr. OURAINI Saloua* O.R.L

Pr. RAZINE Rachid Médecine préventive, santé publique et Hyg. Pr. ZRARA Abdelhamid* Immunologie

* Enseignants Militaires

2- ENSEIGNANTS – CHERCHEURS SCIENTIFIQUES

Pr. ABOUDRAR Saadia Physiologie

Pr. ALAMI OUHABI Naima Biochimie – chimie

Pr. ALAOUI Katim Pharmacologie

Pr. ALAOUI SLIMANI Lalla Naïma Histologie-Embryologie

Pr. ANSAR M’hammed Chimie Organique et Pharmacie Chimique

Pr. BARKIYOU Malika Histologie-Embryologie

Pr. BOUHOUCHE Ahmed Génétique Humaine

Pr. BOUKLOUZE Abdelaziz Applications Pharmaceutiques Pr. CHAHED OUAZZANI Lalla Chadia Biochimie – chimie

Pr. DAKKA Taoufiq Physiologie

Pr. FAOUZI Moulay El Abbes Pharmacologie

Pr. IBRAHIMI Azeddine Biologie moléculaire/Biotechnologie Pr. KHANFRI Jamal Eddine Biologie

Pr. OULAD BOUYAHYA IDRISSI Med Chimie Organique

Pr. REDHA Ahlam Chimie

Pr. TOUATI Driss Pharmacognosie

Pr. ZAHIDI Ahmed Pharmacologie

Mise à jour le 10/10/2018 Khaled Abdellah



A ma très chère mère

Tu représentes pour moi le symbole de la bonté par excellence, la source

de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas cessé de m’encourager

et de prier pour moi.

Ta prière et ta bénédiction m’ont été d’un grand secours pour mener à

bien mes études.

Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour exprimer ce que

tu mérites pour tous les sacrifices que tu n’as cessé de me donner depuis ma

naissance, durant mon enfance et même à l’âge adulte.

Tu as fait plus qu’une mère puisse faire pour que je suis le bon chemin

dans ma vie et mes études.

Je te dédie ce travail en témoignage de mon profond amour. Puisse

Dieu, le tout puissant, te préserver et t’accorder santé, longue vie et

bonheur.

A mon très cher père

Tu es pour moi l’homme idéal, l’exemple que j’admire, pour toutes les

peines et les sacrifices que tu as consentis pour mon éducation et ma

formation.

Ce travail ne saurait exprimer mon amour filial, mon respect et ma

profonde reconnaissance.

Aucune expression, ni aucune dédicace ne pourrait exprimer ce que tu

représentes dans ma vie, mais j’espère que tu trouveras ici dans ce modeste

travail le fruit de tant de sacrifices.

A mes grands parents maternels

A la mémoire de mes grands parents paternels,

A mes tantes et mes oncles

A tous les membres de ma famille, petits et grands

Veuillez trouver dans ce modeste travail l’expression de mon affection

la plus sincère.

A Monsieur Berbich Abdesselam

Votre modestie, votre sérieux et votre compétence professionnelle

seront pour moi un exemple dans l’exercice de notre profession.

Un grand merci à vous

A tous ceux qui ‘ont aidé dans la réalisation de ce travail.

A mes amis(es)

Je ne peux trouver les mots justes et sincères pour vous exprimer mon

affection et mes pensées, vous êtes pour moi des frères et sœurs et des amis

sur qui je peux compter.

En témoignage de l’amitié qui nous uni et des souvenirs de tous les

moments que nous avons passé ensemble, je vous dédie ce travail et je vous

souhaite une vie pleine de santé et de bonheur.

A toute personne qui a contribué de près ou de loin à la réalisation de ce

travail

A notre maître et président de thèse

Monsieur le professeur M.ZOUHDI

Professeur de Microbiologie

Vous avez bien voulu nous faire honneur en acceptant de présider le

Jury de cette thèse.

Vos qualités humaines et professionnelles sont pour nous un exemple à

suivre.

A notre maître et rapporteur de thèse

Monsieur le professeur Y.SEKHSOKH

Professeur de Microbiologie

Vous avez bien voulu nous confier ce travail riche d’intérêt et nous

guider à chaque étape de sa réalisation.

Vous nous avez toujours réservé le meilleur accueil, malgré vos

obligations professionnelles.

Vos encouragements inlassables, votre amabilité, votre gentillesse

méritent toute admiration.

Nous saisissons cette occasion pour vous exprimer notre profonde

gratitude tout en vous témoignant notre respect.

A notre maître et juge de thèse

Monsieur le professeur A.Gaouzi

Professeur de Pédiatrie

Vous avez accepté avec grande amabilité de juger cette thèse.

Cet honneur nous touche infiniment et nous tenons à vous exprimer

nos sincères remerciements et notre profond respect.

A notre maître et juge de thèse

Mme le professeur S.EL Hamzaoui

Professeur de Microbiologie

Nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en

acceptant de juger ce travail.

Veuillez accepter, maître, l’expression de notre profond respect et de

notre reconnaissance.

A notre maître et juge de thèse

Mme le professeur S.Tellal

Professeur de Biochimie

Nous vous remercions pour votre estimable participation dans

l’élaboration de ce travail.

Permettez-nous de vous exprimer notre admiration pour vos qualités

humaines et professionnelles.

Veuillez trouver ici l’expression de notre grand respect et nos vifs

remerciements.

ABREVIATIONS

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNase : Désoxyribonucléase

AMP : Adénosine monophosphate

AmpliSeq : Amplification sequencing

APS : Adénosine 5’-phosphosulfate

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : Acide ribonucléique messager

ARNr 16S : Acide ribonucléique ribosomique 16S

ARNr 23S : Acide ribonucléique ribosomique 23S

ATP : Adénosine triphosphate

C : Cytosine

CEA : Commissariat à l'énergie atomique

CFTR : Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

Chip : Chips (Puces)

CMD : Cardiomyopathie dilatées

CMH : Cardiomyopathie hypertrophiques

CNRS : Centre national de la recherche scientifique

CO2 : Dioxyde de Carbone

DATP : Désoxy adénine triphosphate

DCTP : Désoxy cytosine triphosphate

DdATP : Didésoxy adénine triphosphate

DdCTP : Didésoxy cytosine triphosphate

DdGTP : Didésoxy guanine triphosphate

DdNTPs : Didésoxy ribonucléotides

DdTTP : Didésoxy thymine triphosphate

DGTP : Désoxy guanine triphosphate

DNTP : Désoxyribonucléotides

DTTP : Désoxy thymine triphosphate

EFS : Etablissement français du sang

Em PCR : Emulsion Polymerase Chain Reaction

Env : Environ

ESHG : European Society of Human Genetic

Etc : Et cetera Ex : Exemple FC : Flow cell G : Guanine Gb : Gigabase GS : Génome sequencer

Gyr A : Gyrase A gène

H : Heure

H+ : Ion hydrogène

Hg : Génome humain

Hiseq : Hight throughput sesuencing

HRM : High Resolution Melt

INCa : Institue National du Cancer

INRa : Institut national de la recherche agronomique

IV : Quatre

IWGSC : Consortium international de séquençage du génome du blé

Kb : Kilobase

Mb : Mégabase

MDA : Multiple Displacement Amplification

Ml : Millilitre

NA : Nucleic Acid

Na2S : Sulfure de sodium

Nacl : Chlorure de sodium

NGS : Next Generation Sequencing

O2 : Dioxygène

Obj : Objectif

OH : Hydroxyde

P : Phosphore

PacBio : Pacific Biosciences

Pb : Pair de base

PCR : Polymerase Chain Reaction

PEG : polyéthylène glycol

PGM : Personal Genome Machine

pH : Potentiel hydrogène

PhiX174 : Bactériophage phi X 174

PPi : Anion pyrophosphate

R : Rough

RAM : Résistance aux antimicrobiens

RCA : Rolling Circle Amplification

S : Smooth

SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline

SBS : Sequencing By Synthesis

Sem : Semaine

SiRNA : Small interfering RNA

SMS : Single Molecule Sequencing

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

T : Thymine

TC : Thérapie ciblé

TGC : Tomato Genome Consortium

Tm : Melting of temperature (température de fusion)

TM : Thread mills

U : Uracile

UCSC : Universidad Catolica Santiago de Guayaquil

USB : Universal Serial Bus

USD : United States Dollar

VHB : Virus de l’hépatite B

VHC : Virus de l’hépatite C

VIH : Virus de l'immunodéficience humaine

Vs : Versus

X : Profondeur

XXe : Vingtième siècle

ZMW : Zéro Mode Waveguide

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Gregor Johann Mendel (1822 - 1884) ... 2 Figure 2: Fred Griffith (1877 - 1941) ... 5 Figure 3: Streptococcus pneumoniae après coloration de Gram ... 6 Figure 4: Expérience de Griffith ... 7 Figure 5 : Expérience d’Oswald Avery et Colin Macleod ... 9 Figure 6 : Evolution des progrès du séquençage ... 10 Figure 7: Watson et Crick devant la maquette de la double hélice de l’ADN ... 16 Figure 8: Structure de l’ADN ... 16 Figure 9: Structure de dATP et de ddATP. ... 18 Figure 10 : Température de fusion moléculaire d'un fragment d'ADN ... 19 Figure 11: Différentes étapes du séquençage ... 21 Figure 12: Dénaturation de l’ADN à la chaleur. ... 26 Figure 13: Marquage de L’ADN. ... 27 Figure 14: Altération de l’ADN par l’hydralazine. ... 27 Figure 15: Brins d’ADN de tailles différentes dans les quatre tubes. ... 28 Figure 16: Autoradiogramme après traitement chimique des fragments. ... 28 Figure 17: Technique de Maxam et Gilbert. ... 29 Figure 18: Amplification et dénaturation de l’ADN. ... 30 Figure 19: Ajout d’un ADN amorcé dans les quatre récipients. ... 30 Figure 20: Ajout des ddNTPs. ... 31 Figure 21: A - Electrophorèse en gel standard. B - Séquençage à l'aide de fluorophores. ... 32 Figure 22: Couverture et profondeur de séquençage ... 37

Figure 23 : Système de séquençage Roche/ 454 ... 39 Figure 24: Pyroséquençage luminométrique en temps réel. ... 40 Figure 25: Chaine de réaction d’une incorporation de nucléotide dans la molécule d’ADN. 41 Figure 26:Solexa. ... 42 Figure 27: Ajout des adaptateurs spécifiques aux extrémités d’ADN ... 42 Figure 28: Flow Cell. ... 43 Figure 29: Amplification en pont de la technologie Illumina. ... 44 Figure 30: Aperçu de la technologie de séquençage Illumina. ... 45 Figure 31: SOLiD technology. ... 46 Figure 32: Différence entre séquençage par synthèse et séquençage par ligation. ... 46 Figure 33 : Etape d’amplification et fixation sur lame. ... 48 Figure 34 : Cycles de ligation. ... 48 Figure 35: Fonctionnement du séquençage par ligation. ... 49 Figure 36: Ion Torrent... 51 Figure 37: Incorporation d’un désoxyribonucléotide provoque la libération d'hydrogène et de

pyrophosphate. ... 51

Figure 38: Polonator G007 ... 53 Figure 39 : Comparaison entre séquençage de deuxième et troisième génération ... 54 Figure 40: Helioscope single molecule sequencer. ... 55 Figure 41: Evolution du prix du séquençage. ... 59

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Avantages et inconvénients du séquençage de première génération ... 33 Tableau II : Caractéristiques des méthodes du séquençage ... 49 Tableau III : Comparaison entre les trois méthodes du séquençage de deuxième génération 50 Tableau IV : Avantages et inconvénients de l’Ion torrent ... 52 Tableau V : Caractéristiques de l’acquisition des données avec les séquenceurs haut débit en

comparaison du séquençage Sanger (première ligne) ... 57

Tableau VI : Avantages et faiblesses du NGS par rapport aux méthodes de séquençage

Introduction ...1 Partie 1 : Historique et généralités ...4

1 Historique ...5 1.1Séquençage de l’ADN ...5 1.2Expérience de Griffith ...5 1.3Evolution des progrès du séquençage ... 10 2 Généralités ... 11 2.1De la biologie moléculaire au génie génétique... 11 2.2Définitions ... 11 2.2.1 Biologie moléculaire ... 11 2.2.2 Biotechnologie ... 12 2.2.3 Génie génétique ... 13

Partie 2 : Séquençage de l’ADN ... 14

1 Définition ... 15 2 Acteurs du séquençage ... 15 2.1Acide désoxyribonucléique ... 15 2.2Désoxyribonucléotides dNTPs ... 17 2.3Didésoxyribonucléotides DdNTPs ... 17 2.4Amorces ... 18 2.5ADN polymérase ... 18 3 Notion de température de fusion ou Tm ... 19 4 Etapes du séquençage ... 20 5 Intérêt général du séquençage ... 22 6 A quoi sert le séquençage ? ... 23

6.1Test héréditaire ... 23 6.2Identification judiciaire ... 23 6.3Thérapie génique ... 24 7 Automatisation du séquençage ... 24

Partie 3 : Séquençage de première génération ... 25

1 Technique de Maxam et Gilbert ... 26 2 Technique de Sanger ... 29 3 Avantages et inconvénients ... 33

Partie 4 : Séquençage de nouvelle génération ... 34

1 Développement et caractéristiques du séquençage de nouvelle génération (NGS) ... 35 2 Paramètres clé du séquençage de nouvelle génération (NGS) ... 36 3 Séquençage de seconde génération ... 37 3.1Trois grandes technologies du séquençage NGS ... 38 3.1.1 Pyroséquençage 454 de Roche ... 38 3.1.2 Solexa d’Illumina ... 41 3.1.3 Solid d’Applied Biosystems ... 45 3.1.4 Caractéristiques des méthodes du séquençage ... 49 3.1.5 Comparaison entre les méthodes du séquençage de deuxième génération... 50 3.2Cadets de la seconde génération ... 50 3.2.1 Ion torrent de Life Technologies ... 50 3.2.2 Polonator G007 ... 52 4 Séquençage de troisième génération ... 53 4.1HeliScope d’Helicos ... 54 4.2Technologies des nanopores ... 55 4.3Plateforme de Pacific Biosciences ... 56

4.4Starlight ... 57 5 Comparaison du séquençage Sanger et séquenceurs haut débit ... 57 6 Avantages et inconvénients du NGS ... 58 7 Baisse des prix de séquençage ... 59 8 Au Maroc ... 60 9 Limitations actuelles des méthodes de séquençage à haut débit ... 61

Partie 5 : Applications du séquençage à haut débit ... 62

1 En microbiologie ... 63 1.1En bactériologie ... 63 1.2En virologie ... 65 1.3En mycologie ... 67 2 En oncologie ... 69 2.1En oncogénétique constitutionnelle ... 69 2.2Diagnostic moléculaire des tumeurs solides ... 70 3 Biologie évolutive ... 72 4 Génétique médicale ... 72 4.1Maladies génétiques ... 73 5 Thérapies ciblées ... 75 6 Médecine légale ... 75 7 En agriculture ... 75 Conclusion ... 78 Résumés ... 80 Bibliographie et Webographie ... 84

1

2

Depuis la description des lois de Mendel en 1865, les connaissances en génétique ont connu des bouleversements exponentiels, avec une accélération très nette durant les deux dernières décennies.

Figure 1: Gregor Johann Mendel (1822 - 1884) [1].

En bactériologie, la plupart des systèmes mis au point sont basés sur l’amplification de l’acide désoxyribonucléique (ADN) qui est une molécule extrêmement stable contrairement aux ARNm instables et qui ont une durée de vie très courte [2,3].

Le séquençage est le processus utilisé pour la connaissance de la séquence d’ADN qui est le génome contenu dans chacune de nos cellules, il contient l'information nécessaire à l'expression des gènes, une information importante aux yeux des biologistes.

Plusieurs méthodes existent et s'améliorent toujours plus avec le temps, nous en sommes aujourd'hui à la troisième génération de ces outils de séquençage [4] .

Mendel est un botaniste germanophone de nationalité autrichienne, communément reconnu comme le père

fondateur de la génétique. Il est à l'origine de ce qui est actuellement

appelé les lois de Mendel, qui définissent la manière dont les gènes se transmettent de génération en génération.

3

Le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est la détermination de la succession linéaire des bases A, C, G et T qui constituent la molécule d’ADN. La lecture de cette séquence permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci.

La séquence de l’ADN permet de nombreuses applications dans plusieurs domaine comme la médecine dans le diagnostic, les études génétiques, l’étude de paternité, la criminologie, la compréhension des mécanismes physiopathologiques, la synthèse des médicaments et les enquêtes épidémiologiques [5].

Nous développerons dans ce rapport les différentes méthodes du séquençage de l’ADN utilisées et les multiples usages de cette technique.

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1 Historique :

1.1 Séquençage de l’ADN :

En 1977 deux méthodes de séquençage ont été développées indépendamment, l'une par l'équipe de Walter Gilbert aux Etats-Unis, et l'autre par Frederick Sanger au Royaume-Uni.

L'approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980.

Le virus bactériophage φX174 de la famille des Microviridae était le premier organisme séquencé par la méthode de Sanger en 1977 [6,7].

L'amélioration de la technique de production des amorces, l'amplification des brins et la généralisation des traceurs fluorescents ont permis d'améliorer considérablement les techniques de séquençage. L'apparition des séquenceurs automatiques a notamment permis l'automatisation de ces technologies et a contribué à la finalisation du génotypage humain en

2003. Actuellement, le séquençage du génome d’un individu se fait en quelques jours pour un

coût d’environ 500 euros [9].

1.2 Expérience de Griffith :

Figure 2: Fred Griffith (1877 - 1941).

Médecin et bactériologue anglais, devenu célèbre par l'expérience scientifique qui porte son nom. Griffith mis en évidence l'absorption d'un

facteur génétique par une souche de pneumocoques

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En 1928, Fred Griffith travaille sur deux souches de pneumocoques afin de trouver un vaccin contre la pneumonie, cette expérience n’avait au départ rien à voir avec la recherche des facteurs héréditaires.

Les Streptococcus pneumoniae, sont des bactéries de forme sphérique regroupées par paires et recouvertes d’une capsule. Lors de la coloration de Gram elles apparaissent Gram + (violette) au microscope photonique.

Figure 3: Streptococcus pneumoniae après coloration de Gram [10].

Une des souches utilisée par Griffith donne en culture sur boite gélosée des colonies d’aspect lisse (colonie de type S : Smooth), grâce à sa capsule (enveloppe de polysaccharides qui protège la bactérie contre les attaques du système immunitaire) cette bactérie est pathogène et entraîne des infections pulmonaires.

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L’autre souche donne des colonies d’aspect rugueux (colonie de type R : Rough), cette bactérie est non pathogène et sans capsule.

Figure 4: Expérience de Griffith [11].

Expérience1: Injection de pneumocoques de souches S virulentes capsulées.

 La souche S est mortelle pour la souris lorsqu'elle lui est injectée.

 Analyse du sang de la souris : Présence de très nombreux pneumocoques S vivants.

Expérience2 : Injection de pneumocoques de souche R non virulentes.

 La souche R n'est pas nocive lorsqu'elle est injectée à la souris.  Analyse du sang de la souris : Absence de tout pneumocoque.

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 Cette différence entre les deux souches est due à une mutation chez la bactérie R du gène codant l'enzyme responsable de la synthèse de la capsule.

Expérience3 : Injection de pneumocoques de souche S tuée par la chaleur = Capsule détruite.

 L’injection de bactéries S tuées par la chaleur n'est plus létale pour la souris.  Analyse du sang de la souris : Absence de tout pneumocoque.

Expérience 4: Injection de bactéries de types S chauffés et mélangées à des bactéries R

vivantes.

 La souris meurt de septicémie.

 Analyse du sang de la souris : Présence de très nombreux pneumocoques S vivants. Les bactéries R, au contact des bactéries S tuées ont donc acquis un caractère pathogène qu'elles ne le possédaient pas précédemment. Il y a eu donc un transfert d’une substance chimique entre les bactéries R vivantes et les bactéries S mortes, qui confère aux bactéries R de nouvelles propriétés génétiques.

 Ce phénomène a été appelé transformation bactérienne.

La nature de la substance chimique découverte par Griffith sera comprise en 1944 par l’équipe d’Oswald Avery à l'Institut Rockefeller de New-York [12].

La grande question était de savoir quelle était cette substance chimique pouvant passer d'une bactérie à l'autre.

Deux hypothèses s'affrontaient, la première qui faisait presque consensus chez les biologistes, soutenait qu'il devait s'agir de protéines, la seconde soutenue par une minorité, penchait plutôt pour l'acide désoxyribonucléique.

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Expérience d’Oswald Avery et Colin Macleod :

Les bactéries S mortes étaient broyées (on les brise en morceaux et en les passant au blender) et traitées avec une enzyme digestive avant de les mélanger aux R vivantes.

 Si l'enzyme utilisée était une protéase (enzyme qui digère les protéines), les bactéries R se transformaient en bactéries S virulentes.

 Si l'enzyme utilisée était une ADNase (enzyme qui détruit l'ADN), alors la transformation des R en S ne se faisait pas. La souris survivait.

Figure 5 : Expérience d’Oswald Avery et Colin Macleod [10].

 Conclusion : C'est bien l'ADN et non les protéines qui provoque la transformation de la bactérie R par l’intégration dans sa cellule d’un fragment d’ADN provenant de la bactérie S.

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1.3 Evolution des progrès du séquençage :

Figure 6 : Evolution des progrès du séquençage [5]. PCR Emulsion (2003) Premier séquençage de l’ARNr 16S bactérien (1994) RCA (1998) Séquençage massif Parallèle (2000) Séquenceurs de nouvelle génération (2007) Séquençage du premier animal Caernohabditis elegans(1998) Séquençage par hybridation (1988) Séquençage par spectrométrie de masse (1996) Séquençage en temps réel d’un seul ADN (1996)

Suivi 4 mois plus tard de celui de Craig Venter (2007) Premier séquençage

d’un être humain, James Watson Premier séquençage d’un être vivant le bactériophage PhiX174 (1977) Méthode de Sanger (1977) Pyroséquencage (1998) Séquençage après traitement par bisulfite (1992)

Premier chromosome humain séquencé (1999)

PCR (1985)

Le génome humain est séquencé dans sa totalité

(2006) MDA (2002) Méthode de Maxam-Gilbert (1977) Séquençage du premier génome bactérien Haemophilus Influenzae (1995)[14]. Polony (1999)

11

2 Généralités :

2.1 De la biologie moléculaire au génie génétique:

La biologie a connu deux révolutions majeures au cours du XXe siècle, d'abord celle qui conduit de la biologie traditionnelle à la biologie moléculaire, ensuite, la révolution du génie génétique qui mène la biologie moléculaire à l'ère des biotechnologies dans laquelle nous vivons. Ces deux transitions sont non seulement scientifiques et technologiques, mais aussi culturelles, elles mettent en place deux nouvelles visions de la vie.

2.2 Définitions :

2.2.1 Biologie moléculaire :

 La biologie moléculaire est apparue au XXe

siècle, à la suite de l'élaboration des lois de la génétique, la découverte des chromosomes et l'identification de l'ADN comme support chimique de l'information génétique.

 La biologie moléculaire est une discipline scientifique au croisement de la génétique, de la biochimie et de la physique, dont l'objet est la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au niveau moléculaire. Le terme « biologie moléculaire » est utilisé pour la première fois en 1938 par Warren Weaver, c’est une science qui se consacre à l'étude des acides nucléiques (ADN et ARN) [13] elle permet d'analyser la structure du génome et les altérations de celui-ci (mutations).

 Tous les agents infectieux connus (bactéries, virus, champignons, parasites) sont détectables par cette méthode et parfois elle est le seul outil capable de détecter un nouvel agent pathogène.

 Cette science a plusieurs applications que ça soit dans le domaine médical ou autres. Les principales applications médicales de la biologie moléculaire portent sur les maladies génétiques, deux stratégies sont utilisées :

a) La stratégie directe qui est la mise en évidence du défaut génétique, elle permet un

12

b) La stratégie indirecte qui porte sur la mise en évidence du chromosome portant le

défaut génétique, elle ne permet qu’un diagnostic probable. Exemples de technique de biologie moléculaire:

 Clonage.

 Extraction des acides nucléiques.

 Digestion de l’ADN par les enzymes de restriction.  Séparation de l’ADN et l’ARN sur gel d’agarose.  Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide.

 Visualisation de l’ADN: Coloration au bromure d’éthidium.

 Transfert de l’ADN, l’ARN et les protéines sur membranes de nitrocellulose.  Marquage des sondes, hybridation et autoradiographie.

 PCR et PCR en temps réel.  Séquençage d’ADN.

2.2.2 Biotechnologie :

La biotechnologie est définie comme l’application de la science et de l’ingénierie à l’utilisation des fonctions biologiques d’organismes vivants sous leur forme naturelle ou modifiée pour des applications dans la médecine, l’agriculture, l’industrie et la protection de l’environnement.

Les différents domaines d’application de la biotechnologie :

 La biotechnologie verte touche à l’agriculture et l’alimentation, elle utilise le génie génétique pour transférer certains gènes d’une espèce de plante à une autre et améliorer de façon ciblée la résistance aux insectes, aux champignons, aux virus et aux herbicides.

 La biotechnologie rouge est liée à la médecine et concerne la conception d’organismes pour produire des antibiotiques, le développement de thérapies à travers les manipulations du génome, le diagnostic à l’aide de puces à ADN ou de biocapteurs, etc.

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 La biotechnologie bleue se concentre sur l’utilisation des processus et des organismes de la biologie marine.

 La biotechnologie blanche ou industrielle regroupe les applications industrielles, par l’emploi de systèmes biologiques comme alternative aux procédés chimiques classiques. Les premières utilisations sont dans les secteurs des polymères, des carburants, des dissolvants, de la construction, du textile, et de tous les produits à dominante chimique.

2.2.3 Génie génétique :

 Le génie génétique c’est la manipulation du génome d’un organisme par le biais de la biotechnologie, c’est un ensemble de techniques visant à isoler un ou plusieurs gènes d’un organisme et à déterminer la séquence exacte pour pouvoir réaliser un transfert éventuel dans un autre organisme [14].

 Le génie génétique est un processus qui modifie la constitution génétique d'un organisme en supprimant ou en introduisant de l'ADN directement dans l'organisme hôte ou dans une cellule qui est ensuite fusionnée ou hybridée avec l'hôte.

 Le génie génétique est un champ très actif de la recherche car les applications possibles sont multiples, notamment en santé humaine (correction d’un gène porteur d’une mutation délétère, production de protéines thérapeutiques, élimination de séquences virales persistantes, etc.), en agriculture biotechnologique (mise au point de nouvelles générations de plantes génétiquement modifiées, etc.) ou encore pour la mise au point d’outils destinés à la recherche (par exemple pour explorer la fonction d’un gène).

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1 Définition :

Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer la séquence nucléotidique d’un gène ou d’un fragment de gène [15], ce procédé repose sur la synthèse d’un brin d’ADN par une ADN polymérase, il a été mis au point pour la première fois en 1977 [16].

La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour survivre et se reproduire. La détermination de cette séquence est utile pour les recherches visant à savoir comment vivent les organismes que pour des sujets appliqués.

En médecine, elle peut être utilisée pour identifier, diagnostiquer et potentiellement trouver des traitements à des maladies génétiques.

En biologie, l'étude des séquences d'ADN est devenue un outil important pour la classification des espèces.

2 Acteurs du séquençage :

2.1 Acide désoxyribonucléique:

L’acide désoxyribonucléique (ADN) est une molécule présente dans toutes les cellules vivantes, elle renferme l’ensemble des informations nécessaires au développement et au fonctionnement d’un organisme. C’est aussi le support de l’hérédité car il est transmis lors de la reproduction, il porte l’information génétique et constitue le génome des êtres vivants.

 Structure de l’ADN :

L’ADN est une macromolécule composée de nucléotides, sa structure a été découverte en 1953 par Watson et Crick [17].

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Figure 7: Watson et Crick devant la maquette de la double hélice de l’ADN.

La molécule d’ADN est constituée de quatre bases : La cytosine (C), la thymine (T), dérivent de la pyrimidine tandis que l’adénine (A) et la guanine (G) dérivent de la purine. Cette molécule est composée d’un double brin orientés dans le sens 5’ vers 3’ et reliés entre eux par des liaisons hydrogènes entre les bases purines d’un brin et les bases pyrimidines de l’autre brin. Les bases sont complémentaires deux à deux, deux liaisons hydrogènes relient l’adénine et la thymine tandis que trois liaisons hydrogènes relient la cytosine et la guanine, les deux brins sont complémentaires et antiparallèles.

17

L'ADN cible est extrait de l’échantillon qu’on veut analyser (cultures cellulaires ou d'organismes, prélèvements sanguins, squames, biopsies, salive, cheveux ...) puis, il sera purifié en ADN que l’on souhaite amplifier et qui peut être utilisé dans le séquençage.

2.2 Désoxyribonucléotides dNTPs :

Les désoxyribonucléotides sont les briques de l'ADN (A, C, G ou T), ils sont attachés les uns aux autres grâce à des liaisons chimiques nécessitant la présence d'un groupement OH particulier sur le carbone 3' du ribose.

Les nucléotides sont composés d’un acide phosphorique, d’un aldopentose et d’une base hétérocyclique azotée (purine ou pyrimidine).

Ils sont utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du nouveau brin d’ADN complémentaire.

Ces nucléotides doivent être en concentration très faible; car plus leur concentration est élevée plus on observe d’amplifications parasites et surtout plus la polymérase commet des erreurs de réplication.

2.3 Didésoxyribonucléotides DdNTPs :

Sont des nucléotides privés du groupement OH en position 3', leur incorporation dans une chaîne d'ADN interrompt définitivement sa synthèse qui continue normalement sur le 3-OH.

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Figure 9: Structure de dATP et de ddATP.

2.4 Amorces :

Ce sont des fragments courts d'ADN capables de s'hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases sur l’un des deux brins d'ADN.

La taille de ces amorces est généralement d’une vingtaine de désoxyribonucléotides.

2.5 ADN polymérase :

La Taq Polymérase est une enzyme purifiée à partir d'une bactérie thermophile,

Thermus aquaticus vivant à proximité des sources d'eau chaude à 80°C.

Cette enzyme possède une activité exonucléase 5'➔3' mais sans activité 3'➔5' ce qui rend impossible la correction d'erreur lors de la copie.

L’ADN polymérase a pour rôle de copier l'ADN en synthétisant un brin complémentaire au brin matrice, elle ne fonctionne qu'en ajoutant des nucléotides à une amorce déjà présente (un A est toujours positionné en face d'un T et un C toujours en face d'un G).

19

3 Notion de température de fusion ou Tm :

Quand un ADN double brin est chauffé au-delà d'une certaine température, les deux brins se séparent par rupture des liaisons hydrogènes et deviennent simple brin, la valeur de la température correspondant à ce phénomène s'appelle la température de fusion ou Tm ("melting temperature").

En pratique, la Tm correspond à la température où 50 % de l'ADN est sous forme simple brin et 50 % sous forme double brin.

Figure 10 : Température de fusion moléculaire d'un fragment d'ADN [18].

Cette Tm dépend de plusieurs facteurs:

 La composition en bases : Les appariements AT (deux liaisons hydrogènes) sont moins stables que les appariements GC (trois liaisons hydrogène) en milieu salin (NaCI).

20

 La composition en sels du milieu: Une diminution de la concentration en sels du milieu diminue la force ionique et par conséquent diminue le Tm et inversement.  La quantité de misappariements (ou mismatches) : On considère qu'il y a une

diminution du Tm de 1°C pour 1 % de mismatches dans l'ADN.

 La longueur du fragment : Cet effet est minime quand la taille des fragments hybridés est supérieure à 500 Pb.

 La présence d'agents "déstabilisants" (par exemple la formamide et l'urée).

La Tm est calculé par des logiciels informatiques (bioinformatiques) ou approché par une formule plus pratique : 2°C par base nucléotidique A ou T + 4°C par base G ou C.

4 Etapes du séquençage :

 le séquençage se passe dans un tube à essai en présence des acteurs de la synthèse

d'ADN: -ADN à séquencer, -Nucléotides, -Amorce,

-ADN polymérase.

 L'ADN polymérase utilise aléatoirement les nucléotides présents dans le milieu pour

copier le brin matrice en synthétisant un ADN de séquence complémentaire.

 Lorsque l'ADN polymérase choisit par hasard un didésoxynucléotide (ce qui est rare

puisqu'il y en a moins que des nucléotides) et qu'elle l'incorpore dans la chaîne en synthèse, celle-ci s'interrompt prématurément. Chaque didésoxynucléotide est marqué par un fluorochrome différent (A vert, T rouge, G jaune et C bleu), une chaîne qui se termine par exemple par un A sera verte.

 Puisqu'un grand nombre de réactions de synthèse ont lieu dans le tube, il existe

statistiquement des chaînes de toutes les tailles (correspondant à un arrêt de la synthèse à chaque nucléotide) et beaucoup de fragments d'une même taille. Ces chaînes commencent

21

toutes au même endroit sur l'ADN matrice, toutes celles qui possèdent la même longueur se terminent par le même didésoxynucléotide marqué.

 Il est alors possible de séparer les chaînes d'ADN obtenues en fonction de leur taille

sur un gel d'acrylamide en présence d'un courant électrique.

Plus les chaînes sont courtes, plus elles migrent loin et tous les fragments d'une même taille migrent à la même distance.

On obtient alors une succession de bandes colorées, chacune correspondant au dernier nucléotide incorporé. Il suffit de lire la succession des couleurs pour connaître l'ordre des nucléotides.

22

5 Intérêt général du séquençage :

En 2001, 95 % de l’ADN humain était séquencé et en 2006 il a était finalisé [20,21]. Par ailleurs, les génomes de nombreux agents infectieux de mammifères et de plantes ont également été séquencés dans leur totalité, leur connaissance a modifié considérablement les recherches biomédicales et biologiques en ouvrant de vastes panoramas dans le domaine de la médecine (diagnostic, thérapeutique, prédiction, pronostic, prévention. . .) et dans de nombreuses autres disciplines biologiques (anthropologie, agronomie, environnement. . .).

Les techniques de séquençage évoluent et leurs applications s’élargissent. Par ailleurs, cette technique a pu se démocratiser dans de nombreux laboratoires, en partie depuis la description de la Polymerase Chain Reaction (PCR) en 1985, suivie de sa diffusion très large dans les laboratoires de biologie moléculaire. Depuis 2000, outre la PCR que nous ne décrirons pas, de nouvelles techniques de séquençage se sont développées. Elles constituent un progrès technologique révolutionnaire [5].

Principaux centres de séquençage participant au projet génome humain :

Etats-Unis:

- Washington University School of Medicine Genome Sequencing Center. - Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center.

- Joint Genome Institute.

- Stanford Human Genome Center.

- University of Washington Genome Center.

Europe:

- Sanger Center.

- Max Planck Institute for Molecular Genetics. - The Institute for Molecular Biology.

23 Asie-Australie:

- National Yang-Ming University Genome Research Center.

- Human Genome Center, Institute of Genetics, Chinese Academy of Science. - Kelo University School of Medicine Sequencing Team [22].

6 A quoi sert le séquençage ?

6.1 Test héréditaire :

Lorsqu'une simple vérification des groupes sanguins et des gènes récessifs ne suffit pas à déterminer la parenté on utilise indirectement le séquençage génétique.

Chez chaque individu des séquences de nucléotides non codantes (appelées ADN répétitif) se répètent un certain nombre de fois, différent selon les individus. Ces séquences répétées sont appelées minisatellites; leur taille qui correspond au nombre de répétitions varie généralement de 5 à 50.On a deux tailles différentes de minisatellites transmises par chaque parent, la comparaison de ceux-ci avec les géniteurs potentiels conduit à la découverte du père biologique.

Afin d'augmenter les probabilités du lien de parenté recherché, ces mesures de minisatellites sont étendues à plusieurs chromosomes, cela permet actuellement aux laboratoires d'analyse d'assurer une fiabilité supérieure à 99%.

6.2 Identification judiciaire :

La médecine légale utilise les mêmes minisatellites afin de constituer une empreinte génétique spécifique à chaque individu, celle-ci est ensuite comparée aux preuves biologiques de l'enquête comme par exemple du sang, du sperme, des cheveux ou de la salive.

Cette méthode permet d'inculper ou de relaxer un suspect avec une quasi-certitude écartant tout risque d'erreur judiciaire.