5 Conclusions et perspectives
5.1 Conclusions
Au début de ce travail, l’obtention d’acides aminés porteurs d’un noyau aromatique riche en électron marqués au moyen de fluor-18 était un véritable challenge.
Habituellement, ce genre de composés était préparé par voie électrophile. La méthode proposée par Namavari est relativement simple puisqu’elle nécessite uniquement une étape de marquage sur un précurseur organostannique suivie de l’hydrolyse des groupements protecteurs. Malgré un rendement attractif de 40 % en FDOPA 1 [104], la faible quantité de fluor [18F]F2 généré au moyen du cyclotron (240 mCi soit 8,8 GBq) permet seulement la préparation de 70,3 mCi (2,6 GBq) de FDOPA 1 après 50 minutes de synthèse. De plus, l’activité spécifique en fin de synthèse est de maximum 1,1 mCi/µmol (39 MBq/µmol).
Diverses voies nucléophiles sont décrites dans la littérature.
Comparativement à l’approche électrophile, cette voie présente de nombreux avantages en terme notamment d’activité disponible en fin de de synthèse et d’activité spécifique. Une synthèse d’acide aminé par cette voie constituerait de ce point de vue un progrès indéniable. Parmi les approches nucléophiles, celle décrite en 2004 par C. Lemaire [160] (Figure 175) semblait la plus simple et la plus prometteuse à mettre en œuvre pour synthétiser ces composés à haute activité. Le but de ce travail a donc consisté à améliorer cette synthèse pour permettre son implémentation sur un module de synthèse de type FASTlab développé par GE et utilisant des composants à usages uniques. Cependant, trois points de cette radiosynthèse étaient problématiques et devaient être améliorés préalablement à toute automatisation.
Pour mener à bien celle-ci, il était indispensable de pouvoir :
Remplacer l’acide bromhydrique gazeux par un réactif plus simple à manipuler
Préparer un nouveau catalyseur chiral pour pouvoir réaliser la réaction à RT
Utiliser des groupements protecteurs pour la fonction phénol plus labiles.
Notons que ce dernier point est de loin le moins critique
Figure 175 : Voie de synthèse des acides aminés marqués au fluor-18
En ce qui concerne le premier de ces points, l’objectif fixé a été atteint.
Nous avons montré dans la partie 4.2 de ce travail que l’utilisation d’acide halogéné concentré en solution aqueuse en lieu et place d’acide halogénés gazeux permettait d’automatiser très facilement cette partie de la synthèse. De ce fait, une nouvelle méthode de synthèse des halogénures de benzyles sur support solide a été mises au point (Figure 176).
Figure 176 : Préparation des halogénures de [18F]fluorobenzyle
La transformation de l’aldéhyde en halogénure de [18F]fluorobenzyle implique deux étapes (réduction et halogénation (Figure 177)). Elles sont toutes les deux rapides (2’) et quasi-quantitatives (> 95 %) sur support solide. Dans tous les cas, la réduction est toujours réalisée à température ambiante tandis que la réaction d’halogénation nécessite parfois le chauffage de la cartouche à 60°C. Le dérivé halogéné est décroché du support solide par un faible volume (2 – 3 mL) de solvant organique (éther, dichlorométhane, toluène, …) et l’excès d’acide aisément éliminé par une purification en ligne. Du fait des faibles volumes nécessaire à l’élution aucune étape additionnelle d’évaporation n’est requise. Cette méthode rapide, simple
à mettre en œuvre et très facile à automatiser est applicable à de nombreux composés. Ce mode de préparation fournit d’excellents rendements en dérivé halogénés au départ du [18F]fluorobenzaldéhyde correspondant. Les réactifs mis en œuvre sont facilement accessibles et peu coûteux : borohydrure de sodium en poudre et acides halogénés en solution aqueuse (HI 57%, HBr 48%, HCl 37%) ou dans l’acide acétique (HBr/AcOH 33%). La préparation des halogénures a été implémentée sur un module de synthèse (FASTlab) provenant de chez GE. Par cette méthode, les dérivés halogénés nécessaires à la synthèses de la FTYR 2 et de la FDOPA 1 sont obtenus avec d’excellents rendements en moins de 25 minutes au départ du [18F]fluorure, et d’un sel d’ammonium quaternaire (> 40% pour l’halogénure de 2-[18F]fluoro-4,5-diméthoxybenzyle 12 et > 60% pour l’halogénure de 2-[18F]fluoro 4-méthoxybenzyle 24.
La préparation des halogénures de 4-[18F]fluorobenzyle 28 a également été réalisée moyen du module de synthèse. Pour l’halogénation, la cartouche a été chauffée au moyen d’un flux d’air à 60°C produit par un pistolet à air chaud commandé par l’opérateur. Le dérivé halogéné est disponible après 30 minutes avec un rendement compris entre 40 % et 45 %. En attendant d’équiper le module d’un système permettant de chauffer la cartouche C18 piloté par le software, cette synthèse n’a pas été optimisée.
La seconde limitation de cette synthèse concernait la réaction d’alkylation, uniquement réalisable avec une bonne énantiosélectivité à 0°C. Cette contrainte de température compliquait fortement l’automatisation, c’est pourquoi six catalyseurs de PTC ont été testés dont deux ont été préparés spécifiquement dans le but de ce travail (figure 177).
Figure 177 : Structure des catalyseurs chiraux 39 et 40
Le catalyseur 39 a aisément été préparé en 3 étapes avec un rendement de 25 % au départ de la cinchonidine 21 selon une procédure décrite dans la littérature.
Le catalyseur diphénique 40 est nettement plus difficile à préparer et sa synthèse
nettement plus complexe. Sa préparation au départ de l’acide (R)-3,3’,4,4’,5,5’
hexaméthoxydiphényl-2,2’-dicarboxylique 43 n’était que très mal documentée dans la littérature. La première étape de la synthèse nécessite la préparation du diacide racémique 43 au départ de l’acide 3,4,5-triméthoxybenzoïque 46 via un couplage de Ullmann ainsi qu’une résolution du mélange racémique au moyen de la quinidine pour obtenir l’énantiomère R. La voie de synthèse du catalyseur présentée dans l’article de Maruoka n’a malheureusement pas pu être suivie. Une nouvelle voie de synthèse s’inspirant des données reprises dans un brevet [200] a donc été utilisée.
Cette approche a permis d’obtenir le catalyseur 40 avec un rendement de 4 % au départ de l’acide 3,4,5-triméthoxybenzoïque 46.
A température ambiante, ces deux catalyseurs possèdent une énantiosélectivité remarquable. Tous les deux fournissent des excès énantiomérique supérieur à 95 % que ce soit pour la synthèse de la FDOPA 1, de la FTYR 2 ou de la 4-FPhe 3. Leur efficacité à température élevée est même extraordinaire puisque le catalyseur diphénique fournit un excès énantiomérique supérieur à 90 % à 90°C.
Le catalyseur diphénique 40 peut être utilisé avec de nombreux solvants de type éthers (éthers diéthylique, éther diisopropylique, …) ou de type aromatique (toluène, xylène, …). Par contre les solvants chlorés sont à éviter, l’excès énantiomérique est généralement faible (< 73%). Dans la majorité des cas, la réaction est complète après 5 minutes.
La troisième limitation de cette synthèse concerne l’hydrolyse des groupements protecteurs méthyliques qui nécessite des conditions dures (HI 57%, 180°C, 20 minutes). L’automatisation serait grandement facilitée si les substrats de départ possédaient des groupements protecteurs plus labiles. C’est pourquoi au cours de ce travail nous avons évalué de nouveaux groupement protecteurs du type éther, ester ou de de type acétal. Un certain nombre de précurseurs ammoniums de la FTYR 2 et nitré de la FDOPA 1 porteurs de ces groupements protecteurs ont été préparés.
Parmi ces résultats, les sels d’ammoniums quaternaires porteurs des fonctions éther benzyloxyméthylique et éther cyclopentylique n’ont pas pu être obtenus et ce contrairement aux dérivés nitrés correspondants dont la pureté s’est avérée insuffisante que pour réaliser la réaction de marquage. La synthèse des précurseurs porteurs de ces fonctions devra donc être améliorée avant toute évaluation en radiochimie.
En radiochimie, les précurseurs porteurs des fonctions ester benzoïque, éther 4-méthoxybenzylique ou acétals ne résistent pas aux conditions de synthèse ou n’ont pas pu être marqués. Les fonctions éther benzyliques et allylique sont
compatibles avec la synthèse mais n’ont pas pu être hydrolysée avec succès même dans des conditions dures (HBr 48%, 180°C, 20 minutes).
Par contre le précurseur porteur de la fonction isopropylique semble le plus avantageux. En effet, le groupement éther isopropylique n’est pas hydrolysé dans les différentes conditions de la synthèse et peut être aisément éliminé au moyen d’une solution aqueuse d’acide chlorhydrique 12M (140°C, 5 minutes) et ce avec un bon rendement (76 %). Cependant, la synthèse du précurseur ammonium quaternaire s’est avérée difficile et des essais complémentaires sur le précurseur nitré devront être réalisés.
Sur base des améliorations de synthèses décrites ci-avant, la préparation de la FDOPA 1 et de la FTYR 2 a pu être implémentée avec succès dans un module FASTlab modifié par adjonction d’un second four permettant de réaliser l’hydrolyse des groupements protecteurs à haute température (< 200°C) et d’un système permettant le refroidissement du brut d’hydrolyse en fin de synthèse (Figure 178).
Figure 178 : Schéma de synthèse de la FDOPA 1 et de la FTYR 2
Au moyen de ce module amélioré, la synthèse de la 6-[18F]fluoro-L-DOPA 1 et de la 2-[18F]fluoro-L-tyrosine 2 est rapide puisque celle-ci est généralement terminée endéans l’heure de synthèse. Les rendements corrigés de la décroissance sont de 50 % pour la FTYR 2 et de 45 % pour la FDOPA 1. Pour ces deux acides aminés les excès énantiomériques obtenus avec le catalyseur diphénique 40 sont supérieurs à 96 % et supérieur à 94 % avec le catalyseur à base de cinchonidine 39.
Hormis l’étape de récupération du fluor et de marquage qui était déjà implémentée sur le module au début de ce travail, toutes les autres étapes de la synthèse ont été
optimisée d’un point de vue temps et rendement. Par exemple, l’étape d’hydrolyse des groupements protecteurs nécessite de travailler à 180°C durant 20 minutes. Dans ce travail, nous avons montré que la déprotection des acides aminés est possible à 140°C durant 9 minutes pour la FTYR 2 et à 160°C durant 13 minutes pour la FDOPA 1. Cette radiosynthèse simplifiée peut maintenant être mise en œuvre sans problème par un opérateur possédant une formation minimum.
Un dernier point non négligeable, est que la synthèse recourt uniquement à l’utilisation de matériel disposable, facilement stérilisable. Le manifold, les récipients de 11 et 13 mm, le réacteur de marquage, les différents tuyaux, le spike et la pochette d’eau sont obtenus auprès de GE et satisfont aux normes GMP. Le réacteur d’hydrolyse peut être stérilisé par irradiation gamma et les cathéters sont garantis stériles par le fournisseur. Les cassettes peuvent être préparées par un opérateur qualifié dans des conditions GMP sous flux laminaire en classe « C » avant utilisation.
Les étapes de ce processus entièrement automatisé sont résumées dans le tableau suivant (Tableau 51).
FTYR 2 FDOPA 1
Etape Temps
Min:sec T° Activité Temps
Min:sec T° Activité Activité dans le
module 0:0 RT 1 Ci
37 GBq 0:0 RT 1 Ci
37 GBq Fin de la fixation
sur la QMA 2:30 RT 2:30 RT
Fin de l’élution du
18F 3:30 RT 3:30 RT
Fin de
l’évaporation 13:10 120°C 13:10 120°C
Fin du marquage 15:40 140 °C 15:40 140 °C
Fin de la fixation
sur C18 18:22 RT 18:22 RT
Fin de la
réduction 20:50 RT 20:50 RT
Fin de
l’halogénation 22:10 RT 22:10 RT
Fin de l’élution de l’halogénure de benzyle (toluène)
24:12 RT 24:12 RT
Fin de
l’alkylation 29:12 RT 29:12 RT
Fin de l’ajout de HI et de l’évaporation du
toluène
35:25 RT →
140°C 35:25 RT →
140°C Fin de l’hydrolyse 44:25 140°C 48:20 160°C Fin de la synthèse
sur FASTlab 48:24 RT 52:13 RT
Fin de la purification
(HPLC)
58:30 RT 340 mCi
12,9 GBq 62:30 RT 300 mCi 11,1GBq Tableau 51 : Déroulement de la synthèse
de la FDOPA 1 et de la FTYR 2 sur le module FASTlab
Toutes les étapes de la synthèse se déroulent à température ambiante à l’exception des étapes de marquages et d’hydrolyses des groupements protecteurs.
La voie de synthèse nucléophile proposée dans ce travail permet d’obtenir des quantités importantes de FDOPA 1 (> 1 Ci (37 GBq)) et de FTYR 2 (> 1,5 Ci (55,5 GBq)) avec une haute activité spécifique (> 20 Ci/µmol soit 318 GBq/µmol) et ce en limitant au maximum la dose recue par l’opérateur lors de ces synthèse à très haute activité (185 GBq / 5 Ci).
5.2 Perspectives
L’acide iodhydrique est toujours utilisé pour réaliser l’hydrolyse des groupements protecteurs éther méthyliques. Des précurseurs possédant d’autres groupements protecteurs sur la fonction phénol plus facilement hydrolysables ont été envisagés. Parmi ceux-ci, le groupement éther isopropylique semble prometteur mais le précurseur ammonium quaternaire est difficile à préparer. D’autres substrats de marquage dont les phénols sont protégés par des éthers cyclopentylique et éthers benzyloxyméthylique restent encore à préparer et à tester.
La purification sur HPLC semi-préparative doit être automatisée pour que l’entièreté de la synthèse puisse être réalisée sans l’intervention d’un opérateur. Des essais préliminaires laissent envisager la possibilité de réaliser cette étape au moyen du même FASTlab ayant servi à la synthèse
L’automatisation de la préparation de la 2-[18F]fluoro-L-phénylalanine 4 et de la 4-[18F]fluoro-L-phénylalanine 3 devrait pouvoir également être réalisée sur base de cette stratégie
