— LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°3 Mars-Avril 2007
INTRODUTION
Le nombre et la sévérité croissante des manifestations des toxi-infections alimentaires dans le monde entier ont considérablement augmenté la conscience publique au sujet de la sécurité alimentaire [1]. Au Maroc, bien que plusieurs efforts aient été employés pour l’amélioration de la sécurité et de la qualité des aliments;
les toxi-infections alimentaires restent une des principales causes de morbidité. Entre 2000 et 2004, 7 118 cas de toxi-infections alimentaires ont été rapportés dont plus de 86% sont d’origine bactérienne [2].
La contamination des aliments d’origine animale et principalement des produits de la pêche est responsable de 10 % des cas de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) [3].
Vibrio spp. dans les produits de la pêche:
Risques et prévention
Résumé: Vibrio est un genre bactérien autochtone de l’environnement aquatique. Certaines espèces de ce genre sont fréquemment isolées dans les eaux côtières à climats tempéré et tropical.
Les fruits de la mer sont identifiés comme une source de bactéries pathogènes qui posent des problèmes de santé publique, particulièrement les espèces du genre Vibrio. Il y a approximativement 70 espèces connus dans le genre Vibrio. Deux espèces de vibrions présentent des risques de toxi- infections alimentaires pour l’homme, V. cholerae et V. parahaemolyticus. La prévention des infections humaines à vibrions, consécutives à la consommation des produits de la pêche, est étroitement associée à l’amélioration des méthodes d’identification des souches pathogènes.
Mots clés : fruits de la mer - Vibrio cholerae - Vibrio parahaemolyticus -toxi-infection alimentaire - Homme .
N. Cohen1*, H. Karib2
1 Laboratoire de Microbiologie et d’Hygiène des Aliments et de l’Environnement, Institut Pasteur Maroc.
2 Département H.I.D.A.O.A., Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II.
*Correspondance: Email adresse: [email protected], Téléphone: + 212 7 02 02 10,
Article de synthèse
Les poissons et fruits de la mer constituent la deuxième source de protéines animales derrière les viandes. Au Maroc, en 2000, 900 milles tonnes de poissons et fruits de mer ont été produits, soit 0.7% de la production mondiale [4].
Actuellement, en raison de l’évolution récente de la réglementation européenne (CEE n° 2073/2005), la recherche des Vibrio pathogènes pour l’homme dans les produits de la pêche destinés à l’exportation est exigée par le ministère de l’Agriculture et des pêches Maritimes. Ce règlement relatif aux critères microbiologiques préconise la mise au point de méthodes fiables pour l’évaluation des risques liés aux Vibrio dans les produits de mer. En effet, depuis quelques années, l’incidence des infections à Vibrio suite à l’ingestion des produits de la pêche est en constante et régulière progression dans le monde [5, 6]. Cette progression pourrait être directement liée à une concentration des eaux côtières en vibrions, consécutive à l’anthropisation du littoral. Mais il est vraisemblable que la modification des habitudes alimentaires, avec l’augmentation de la consommation des produits de la mer et notamment des produits crus, ainsi que la mondialisation des échanges commerciaux des produits alimentaires y contribuent de façon substantielle [7].
Cet article se veut une revue non exhaustive des toxi-infections dues à l’ingestion des produits de pêche contaminés par les bactéries du genre Vibrio. Il s’intéressera particulièrement aux espèces les plus impliquées en pathologie humaine à savoir, V.
cholerae et V. parahaemolyticus.
Les VIbRIONs RespONsabLes De TIaC Taxonomie et caractères culturaux
Dès 1773, Otto Fridrich Muller avait observé 6 espèces de vibrions qu’il appelait V. Uncola., V. rugula, V. bacillus, V.
ondula, V. serpens, V. spirillum. Pasteur, vers 1863, attribuait le processus de putréfaction à 6 types de vibrions (V. Uncola, V. rugula, V. trumulans, V.prolifer, V. subtilis, V. bacillus).
Mais il revenait à Koch après observation de Pacini en 1855 de formes vibrionées dans les selles de 4 cholériques, d’isoler et de rapporter la maladie cholérique à Vibrio comma, le Vibrion cholérique en 1893 à Alexandrie. C’était la première maladie décrite rapportée à un vibrion ; il fallut ensuite attendre 67 ans pour que Fujino en 1950 authentifie une intoxication alimentaire due à un autre type de Vibrio, Vibrio parahemolyticus. La taxonomie a bien sûr fait son œuvre dans cette famille des Vibrionaceae, le genre Vibrio comprenant à ce jour plus de 70 espèces et ce nombre ne cesse de s’accroître. Dans le milieu marin, mais également dans l’eau douce, un grand nombre de vibrions ne sont pas encore décrits. Quant aux vibrions pathogènes, nous commençons à les appréhender un peu mieux et surtout à mieux connaître leurs différentes modalités écologiques chez l’hôte et dans l’environnement, les études avec le Vibrion cholérique ayant servi de locomotive.
Les Vibrio sont des bacilles à Gram négatif, droits ou incurvés, d’un diamètre compris entre 0,5 et 0,8 µm et une longueur comprise entre 1,4 et 2,6 µm. Ils présentent une
mobilité polaire due à un seul flagelle. Ils sont aéro-anaérobies facultatifs. Toutes les espèces de Vibrio, à l’exception de V.
metschnikovii et de V. gazogenes, sont positives pour le test de l’oxydase. La plupart des espèces fermentent le glucose, sans production de gaz. A l’exception des espèces, V. cholerae et V. mimicus, qui sont halotolérantes, les espèces de Vibrio sont halophiles et requièrent du sodium pour leur croissance.
Elle poussent abondamment en milieux peptonés simples et croient aisément sur le milieu “marine agar” et sur la gélose Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose (TCBS). Le pourcentage en guanine – cytosine de l’acide désoxyribonucléique (ADN) des Vibrio et compris entre 38 et 51 %. Les Vibrio donnent sur gélose trypticase soja, au bout de 24 h, des colonies de 2 à 3 mm de diamètre, circulaires à bords réguliers, légèrement convexes et transparentes. Avec l’age les colonies s’opacifient;
deviennent lisses et luisantes de type S. Les Vibrio ont des propriétés qui permettent leur « électivité » sur les différents milieux :1) Ils croient à valeurs de pH allant de 7,5 à 9,2; 2)Ils cultivent à de fortes concentrations en NaCl, du fait de leur caractère halophile ; 3) Leur croissance n’est pas entravée par l’utilisation d’inhibiteurs tels que les sels biliaires, citrate de sodium, thiosulfate de sodium..., ce qui fait d’eux des sources potentielles d’erreurs d’identification avec les entérobactéries, dont les milieux sélectifs sont propices au développement des Vibrio. Les caractères biochimiques sont étudiés en galerie classique pour entérobactérie ou en API 20E.
Facteurs de croissance et de survie
Les vibrions halophiles présentent un besoin en sel qui peut varier de 0,1 à 30 %. L’espèce la plus importante et la première décrite comme responsable de diarrhées, type intoxication alimentaire, est V. parahemolyticus [8, 9, 10]. Les vibrions croient à des valeurs de température comprises entre 10°C et 43°C, avec une température optimale de croissance de 37°C.
Les vibrions sont facilement détruits par la chaleur [11], et une bonne réfrigération est indispensable pour empêcher leur prolifération [12, 13].
Le pH optimal de croissance des vibrions est 7.6 avec des valeurs de survie allant de 5 à 9,6. Le jus de citron fraîchement serré s’est avéré efficace pour inactiver le Vibrio. Le Vibrio accroît avec ou sans oxygène, mais la croissance est optimale
— LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°3 Mars-Avril 2007 dans des conditions aérobies. L’activité de l’eau (aw)
optimale pour la croissance étant entre 0,940 et 0,988 donc Sensible au séchage. L’épuration ne semble pas avoir d’effet sur la réduction de la charge en Vibrio des mollusques et crustacés [14].
Facteurs de virulence
Le tableau I, résume les facteurs de virulence des principales espèces de vibrions non cholériques
Tableau I: Facteurs de virulence des principales espèce de vibrions non cholériques
Facteurs Espèces Syndromes
Entérotoxines Vibrio cholerae
(nonO1/nonO139) gastroentérite
Hémolysine
Vibrio cholerae (nonO1/nonO139) Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus
gastroentérite gastroentérite lésions tissulaires
Capsule polysaccharidique
Vibrio cholerae (nonO1/nonO139) Vibrio vulnificus
septicémie septicémie
Vibrio cholerae
Sur la base de l’antigène O, les vibrions cholériques, sont divisés en deux sérotypes. Le choléra est typiquement associé au sérotype O1, mais le sérotype O139 a aussi été responsable de plusieurs cas de choléra en Asie [14]. Ces sérotypes produisent comme principal facteur de virulence, la toxine cholérique (CT) laquelle, de part l’importance de la diarrhée qu’elle provoque, entraîne la dissémination du vibrion cholérique dans l’environnement et la contamination d’autres personnes. La toxine CT est composée de 5 sous unités B de 11 600 Da et d’une sous-unité A de 27 200 Da. La sous unité B permet la fixation de la toxine au ganglioside GM1 alors que la sous-unité A est clivée en deux sous unités A2 et A1 cette dernière active la production d’AMP cyclique qui stimule les pompes entraînant un déséquilibre électrolytique et une production d’eau dans la lumière intestinale. Les sous unités A et B de la toxine cholérique sont codées par l’opéron ctxAB qui est porté par un phage lysogénique [15].
Les vibrions non cholériques (non O1 et non O139) ne produisent pas de toxine analogue à la toxine cholérique et sont donc incapables d’entraîner une épidémie. En revanche, ils possèdent d’autres facteurs de virulence qui sont à l’origine des différents syndromes observés lors des infections qu’ils provoquent. Les entérotoxines, produites par une minorité de souches de V. cholerae non O1/non O139, sont des entérotoxines thermostables (ST) de 17 acides aminés dont la séquence présente 50% d’homologie avec l’entérotoxine STa des souches entérotoxinogènes d’Escherichia coli.
En revanche, la plupart des souches non O1/non O139, produisent une hémolysine/cytolysine identique à celle produite par les souches de V. cholerae O1, biotype ElTor.
Environ 70% des souches de V. cholerae non O1/non O139 possèdent une capsule polysaccharidique. Cette capsule,
constituée entièrement de sucres augmente la capacité de la bactérie à résister à la phagocytose et leur permet ainsi de provoquer des septicémies particulièrement chez les sujets immuno-déprimés [16]. Il existe aussi des V. cholerae non 01/
non O139 qui possèdent une toxine de type cholérique et qui sont isolés de malades diarrhéiques, ces vibrions ne possèdent pas de facteurs d’attachement et en général ne donnent pas lieu à diffusion. Il s’agit d’épidémies très localisées, le plus souvent familiales.
V. parahaemolyticus
L’adhésion aux cellules intestinales est considérée comme une étape essentielle dans la pathogénie des bactéries entéropathogènes. Cependant, les facteurs d’adhésion de V. parahaemolyticus sont encore mal connus. V.
parahaemolyticus présente des pili dont l’antigénicité varie selon les souches et une hémagglutinine désignée sous le sigle cHA (cell-associated hemagglutinin). La capsule semble jouer un rôle dans l’adhésion car les souches produisant de grandes quantités de polysaccharides capsulaires adhèrent plus fortement aux cellules intestinales humaines Int-407. La présence de bile stimule la synthèse d’antigènes capsulaires et contribue à l’adhésion des souches de V. parahaemolyticus aux cellules intestinales. Les clones responsables de pandémies possèdent une séquence génétique particulière (la séquence ORF8 du phage f237) qui coderait pour une protéine d’adhésion [17].
Les souches de V. parahaemolyticus qui peuvent lyser les hématies humaines produisent donc une hémolysine, la toxine TDH (thermostable direct hemolysin). La résistance à la chaleur de cette toxine est complexe. En effet, elle est inactivée par un chauffage à 60-70 °C, mais elle est réactivée lorsque la température dépasse 80 °C. Ce paradoxe, connu sous le nom d’effet Arrhenius, est lié à des changements de conformation des chaînes protéiques. La toxine TDH est constituée de deux sous-unités identiques, de 189 acides aminés, possédant un pont disulfure proche de l’extrémité COOH-terminale et dont le poids moléculaire est de 21 kDa.
Les souches produisant de fortes quantités de toxine TDH hébergent dans leur chromosome les gènes tdh1 et tdh2.
Les deux gènes contribueraient au phénotype Kanagawa positif, mais le gène tdh2 est plus fortement exprimé et serait responsable de la synthèse de plus de 90 p. cent de la quantité de toxine [18].
La toxine TRH (thermostable related hemolysin), codée par les gènes trh (trh1 et trh2) est voisine, mais non identique, à la toxine TDH. La toxine TRH est plus thermosensible que la toxine TDH (elle est inactivée de manière irréversible par un chauffage de 10 minutes à 60 °C). Les gènes trh codent pour une protéine de 189 acides aminés, possédant un pont disulfure à son extrémité carboxy-terminale et présentant environ 62,4 p. cent d’homologie de séquence avec les sous- unités de la toxine TDH. Les gènes trh ont été mis en évidence chez environ 35 p. cent des souches de V. parahaemolyticus isolées de cas cliniques et non cliniques, dont 24 p. cent sont dépourvues de gènes tdh. La toxine TRH pourrait jouer un rôle important dans le pouvoir pathogène et elle expliquerait
la survenue de diarrhées chez des patients dont les selles ne renferment que des souches Kanagawa-négatives [17].
Autres hémolysines : Une hémolysine thermolabile de 398 acides aminés, désignée par les sigles TLH (thermolabile haemolysin) ou LDH (lecithin-dependent haemolysin), a été mise en évidence chez des souches de V.
parahaemolyticus, son rôle dans la virulence est inconnu [17].
Altération de la perméabilité intestinale: Environ 5,6 p. cent des souches isolées de cas cliniques, ne produisent ni toxine TDH ni toxine TRH. Lynch et al. (2005) ont montré que les souches de V. parahaemolyticus provoquent une altération de la perméabilité de l’intestin [19]. Cette altération de la perméabilité intestinale est indépendante de la production des toxines TDH et TRH. Ces observations suggèrent que d’autres facteurs de pathogénicité, encore non caractérisés, sont synthétisés par les souches de V. parahaemolyticus.
MeThODes De DeTeCTION eT De CaRaCTeRIsaTION
La recherche des vibrions potentiellement pathogènes pour l’homme dans les produits de la pêche est abordée dans les laboratoires d’hygiène alimentaire, en raison de l’évolution actuelle de la réglementation sanitaire concernant ces produits.
Une surveillance bactériologique des produits de la pêche est nécessaire pour prévenir les infections à Vibrio d’origine alimentaire, et nécessite l’emploi de méthodes d’analyses fiables et standardisées. Or il n’existe pas aujourd’hui de méthode de référence réellement efficace pour la recherche et le dénombrement des vibrions dans les aliments. Par ailleurs, l’utilisation des tests biochimiques ne permet pas toujours l’identification au niveau de l’espèce et il est souvent nécessaire de recourir aux techniques moléculaires [20].
Techniques classiques de détection
Plusieurs méthodes de détection des vibrions dans les produits de la pêche sont proposées, 1) Norme AFNOR V45-111:
Recherche de V. parahaemolyticus dans les eaux conchylicoles et dans les coquillages marins vivants; 2) Norme ISO 8914 : Directive générale pour la recherche de V. parahaemolyticus ; 3) Projet de norme : Protocole provisoire de détection de V.
cholerae et de V. parahaemolyticus. Ce protocole avait été rédigé à la demande de la Direction Générale de l’Alimentation, en France, dans le but de normaliser les protocoles d’étude et de recherche de V. cholerae et de V. parahaemolyticus dans les produits de la mer entre les différents laboratoires vétérinaires de contrôle, dans l’attente de la publication d’une norme ISO pour la recherche des Vibrio spp. présumés pathogènes par voie digestive.
La recherche des vibrions dans les aliments et l’eau se fait en plusieurs étapes. La première consiste en un pré- enrichissement : l’essai est réalisé à partir 25 g d’échantillons diluées dans 225 ml d’eau peptonée alcaline à 2% de NaCl, puis incubés 24 h à 41°C. La deuxième étape : partir du bouillon d’enrichissement, un isolement sur milieux gélosés sélectifs. Plusieurs milieux sont proposés : la gélose Thiosulfate, au citrate, à la bille et au saccharose (TCBS), la gélose Cellubiose, Polymyxin B, colistin, (CPC), gélose
CPC modifiée (mCPC) et la gélose CC. Les colonies sont réisolées sur gélose nutritive à 2% de NaCl pour l’étape de la confirmation. Cette étape consiste en l’identification des colonies isolées par la recherche de l’oxydase, de l’ADH et de la LDC. L’identification est poursuivie sur les souches oxydase positives, ADH négatives et LDC positives avec l’ensemencement d’une galerie Enterobacteriaceae API 20 E et d’une galerie de croissance en sel constituée d’une série de tubes d’eau peptonée alcaline contenant 0, 3, 6, 8 et10 % de NaCl.
D’un autres côté, les méthodes de numération présentent d’une part, un intérêt pour établir une corrélation entre les facteurs environnementaux et le risque de contamination humaine et permettent d’autre part de juger de la qualité de l’échantillon par rapport aux critères de qualité microbiologique des produits de la mer. Parmi les méthodes normalisées de numération nous pouvons citer : 1) PR XP CEN ISO/TS 21872-1 Microbiologie des aliments Méthode horizontale pour le dénombrement des Vibrio pathogènes Partie 1 : dénombrement de Vivrio parahaemolyticus; 2) PR XP ISO/TS 21872-2 : Microbiologie des aliments Méthode horizontale pour le dénombrement des Vibrio pathogènes Partie 2: dénombrement des Vibrio pathogènes à l’exclusion de V. parahaemolyticus.
Méthodes moléculaires
Ces dernières années, il a été démontré que les vibrions peuvent réagir à des conditions environnementales défavorables en entrant dans une phase viable mais non cultivable. Lorsque les bactéries sont exposées à des conditions défavorables, qu’il s’agisse de salinité, de température ou de privation d’éléments nutritifs, elles peuvent subir des lésions et ne pas pouvoir être décelées par les méthodes bactériologiques classiques. Toutefois, si les conditions redeviennent favorables, elles peuvent revenir à leur état “normal” et être à nouveau cultivées. Ce phénomène a pour conséquence évidente que les examens systématiques d’échantillons prélevés dans l’environnement pour la recherche de ces pathogènes peuvent être négatifs, alors qu’il y a effectivement présence de bactéries virulentes.
En plus la fréquence des caractères biochimiques atypiques des souches de vibrion isolées de l’environnement, fait que les méthodes classiques d’identification bactérienne peuvent conduire à une confusion entre les espèces. A ce titre les méthodes PCR permettent de mettre en évidence des souches de V. parahaemolyticus atypiques pour le saccharose par la mise en évidence d’une séquence R72H selon la méthode décrite par lee et al. (1995) et Robert-Pillo et al. (2002) [21,22]. Des PCR spécifiques des espèces V. cholerae et V.
mimicus, basées sur l’amplification de séquences de l’espace intergénique 16-23S, peuvent également être utilisées pour mettre en évidence des souches de V. mimicus atypiques pour le saccharose [23].
Les Vibrio spp. dits pathogènes ne le sont pas toujours. La majorité des souches environnementales ne disposent pas des facteurs de colonisation nécessaires à l’adhérence et à la pénétration, de toxines appropriées ou d’autres déterminants
— LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°3 Mars-Avril 2007 de la virulence nécessaires au déclenchement de la maladie.
D’où l’intérêt des techniques PCR pour la détection des gènes de virulence des souches appartenant aux espèces V.
parahaemolyticus et V. cholerae. Les gènes codant pour deux hémolysines, TDH et TRH, sont à rechercher par PCR chez V. parahaemolyticus [24]. De même les gènes ctxA et ctxB, codant pour la production de la toxine cholérique, peuvent être recherchés sur toutes les souches identifiées comme V.
cholerae [25, 26].
La méthode PCR quantitative en temps réel a été développée récemment pour détecter et quantifier V. cholerae non O1/
et nonO139 et V. parahaemolyticus, à partir des espèces présentes dans l’eau et les produits de la pêche.
epIDeMIOLOGIe habitat
Les Vibrio spp. ont pour habitat les milieux aquatiques et notamment les eaux des estuaires et les eaux côtières. Ils sont capables de coloniser de nombreux organismes marins : poissons, mollusques, crustacés, éponges, coraux, algues, zooplancton….
V. cholerae est une bactérie saprophyte retrouvée dans lenvironnement , particulièrement dans les eaux saumâtres des estuaires, les lits des fleuves , au contact du zooplancton (copépodes), des algues marines et des plantes aquatiques dans la plupart des zones côtières des régions tempérées ou tropicales du monde. Elle survit dans l’eau de mer pendant 50, 10 à 12 jours réspéctivement à des valeurs de températures allant de 5 à 10 °C et de 30 à 32°C. Ce qui explique sa présence en tant que bactérie saprophyte et sa persistance limitée aux zones intertropicales. Les souches de sérovar O1 (LPS) semblent particulièrement adaptées à lintestin humain. La virulence et le caractère épidémique des souches pathogènes proviendraient de l’acquisition séquentielle par la souche O1 de gènes de virulence portés par des phages, des transposons ou des plasmides, et codant des toxines et des pili. L’histoire du choléra illustre la dynamique d’adaptation d’un agent pathogène à son hôte en fonction de l’environnement, de la résistance naturelle et du comportement des populations qu’il infecte.
Comme tous les vibrions, V. parahaemolyticus est présent dans l’environnement marin et isolé surtout des eaux dont la température est supérieure à 10 °C. Sa multiplication est favorisée par une température supérieure à 20 °C et une salinité modérée (15 à 25 g par litre). A des températures inférieures à 10 °C, l’isolement de V. parahaemolyticus devient difficile car la bactérie rentre dans un état viable non cultivable. La réversion vers la forme normale est favorisée par une augmentation graduelle de la température de l’eau. La répartition géographique est vaste et V. parahaemolyticus a été isolé des eaux côtières
de très nombreux pays répartis dans les cinq continents.
Au Maroc, les espèces V. cholerae et V. parahaemolyticus ont été mise en évidence dans les estuaires et les eaux côtières de la Méditerranée, et de l’Atlantique [27].
Tableau II. Les manifestations cliniques des TIAC à Vibrio Espèces de Vibrio Manifestations cliniques
Dose infectieuse
(Log 10) Vibrio Cholerae
Choléra: diarrhée abondante, crampes abdominales,
Vomissements, déshydratation 3 à 6
Vibrio parahaemolyticus Diarrhée, douleurs abdominales, nausées, vomissements 5 à 9
TIaC à Vibrio
Le Tableau II résume Les manifestations cliniques des TIAC à Vibrio
À New York, entre 1980-1994, 339 foyers de toxi- infections alimentaires associées aux produits de la pêche ont été rapportés, avec 3959 malades, 76 hospitalisations, et 4 décès. Les mollusques et crustacés, sont les produits de la pêche les plus impliqués soit 64%, et dans 148 cas l’agent étiologique a été confirmé, les 4 décès ont été provoquée par V. vulnificus [28]. Plusieurs espèces de Vibrio sont responsables d’une proportion significative de TIAC suite à la consommation des mollusques et crustacés crus ou insuffisament cuits [29]. Une étude en Floride des TIAC suite à la consommation de mollusques et de crustacés crus a classé les espèces de Vibrio suivantes dans l’ordre décroissant de la fréquence ; V. parahaemolyticus, V. cholerae non-O1/non-O139, V. vulnificus , V. hollisae V.
fluvialis et V. cholerae O1 [30].
Au Taiwan, les bactéries les plus communément impliquées dans les TIAC sont V. parahaemolyticus avec 35% des manifestations [31]. Au Japon V. parahaemolyticus est responsable de 50 à 70 % des maladies liées à la consommation des produits de mer ce qui en fait un véritable problème de santé publique. En France une épidémie est survenue en 1997, touchant 44 patients suite à l’ingestion de fruits de mer [32]. Trois foyers d’infections à V. cholerae liées à l’ingestion de mollusques, à l’origine de 14 cas, ont été identifiés aux USA en avril 1991 [32]. En 1995, il a été répertorié 3 cas de choléra au Canada liés à la consommation des fruits de mer [33]. Selon le rapport du CDC (Center for diseases control and prevention) et durant la période 1990-2000, il a été recensé aux USA et au Canada 19 épidémies à V. parahaemolyticus regroupant 740 cas faisant suite à l’ingestion de mollusques bivalves [15]. On pointera deux épidémies spectaculaires, une en mai 1997, ayant touchés 209 personnes suite à l’ingestion d’huîtres et une autre en juin 1998 regroupant 416 cas toujours liés à la consommation d’huîtres [34]. De nombreuses épidémies ont aussi été rapportées en Inde en 1996 [35].
Tableau III. Durée de survie de V. cholerae [37]
Aliments Temps de survie
En jours
Poisson entreposé à 3–8°C 14–25
Crevettes congelées 180
Légumes en humidificateur, 20°C 10
Carottes 10
Chou-fleur 20
Eau de rivière 210
Au Maroc plusieurs cas de gastroentérites liées à la consommation des produits de pêche sont répertoriés chaque année. Le diagnostic étiologique n’étant pas connu pour de nombreuses gastroentérites, elles peuvent vraisemblablement être liées à ces vibrions. D’un autre côté, il a été rapporté que les TIAC à Vibrio au Maroc sont toutes dues à la consommation des mollusques bivalves récoltés de manière clandestine [36].
aliments associés
Différents types d’aliments ont pu être associés à la transmission du choléra, et notamment les boissons, les fruits et légumes (Tableau III). Les crustacés et mollusques marins crus, non cuits ou ayant subi des reports de contamination après cuisson ont été rapportés comme principal véhicule de V. cholerae 01 et non-01. Les poussées épidémiques de V. parahaemolyticus ont surtout été associées aux reports de contamination ou à des fruits de mer cuits conservés trop longtemps ou à une température trop élevée. Au Japon ce sont les poissons crus qui constituent le véhicule majeur d’infection à V. parahaemolyticus. Pour tous les autres vibrions, c’est la consommation de coquillages crus, et notamment d’huîtres, qui est la cause principale d’infection. Un aspect important est le taux de croissance remarquable des vibrions dans les produits de la pêche crus, même à des températures faibles.
Cela permet aux vibrions, même s’ils sont initialement peu nombreux, de se multiplier de façon spectaculaire si les condition hygiéniques durant la récolte, le traitement, la distribution et le stockage laissent à désirer.
Facteurs de risque
Fléau traditionnel, en Afrique et en Asie, le choléra est un exemple de maladie à la fois connue et émergente. Le choléra se transmet habituellement par l’eau, mais la voie alimentaire constitue également une nouvelle voie de contamination. En Amérique latine les fruits de mer crus ou insuffisamment traités constituent des voies épidémiologiques importantes de transmission de la maladie. Les conditions sanitaires des pays affectés, aggravées par leurs situations économique et politique, ont entraîné une rapide propagation de l’épidémie. Plusieurs cas de toxi-infections alimentaires à V.
parahaemolyticus ont été rapportés cette dernière décennie.
Le sérotype le plus fréquemment isolé est 03 :K6 responsable
d’épidémies au USA et en Asie entre 1996 et 1999 indique le caractère clonal de la souche et le caractère pandémique de l’épidémie [13]. On note de plus le caractère saisonnier de ces TIAC, en effet, la majorité des cas surviennent lors des mois chauds. Cette évolution peut être due à l’augmentation de la densité des vibrions dans l’eau et par conséquent, dans les produits de la mer fraîchement récoltés, mais également à leur multiplication dans des aliments mal conservés, crus ou recontaminés après cuisson. Les vibrions sont des bactéries à croissance rapide, soit un temps de génération de 8 à 10 minutes à 37°C pour V. parahaemolyticus. L’augmentation de la consommation des produits de la mer pendant toute l’année et l’état de santé du consommateur, sont des facteurs à prendre en considération. Il est important de noter que les indicateurs classiques de contamination fécale ne permettent pas d’évaluer le risque lié aux vibrions vue qu’ils appartiennent à l’écosystème marin [14].
Plusieurs études sur la qualité des produits de la pêche ont été réalisées au Maroc [27, 36, 38]. Ces études ont montré des prévalences plus ou moins variables selon l’espèce de vibrions, avec une fréquence d’isolement particulièrement plus importante dans les crustacés et les mollusques bivalves.
Les mollusques bivalves ou lamellibranches sont des invertébrés qui filtrent l’eau et concentrent les particules et les micro-organismes. De plus, ce sont des aliments consommés souvent crus ou insuffisamment cuits.
pROphyLaxIe
Malgré la complexité accrue liée à l’écologie particulière des Vibrio, plusieurs moyens de prévention sont à mettre en œuvre :
En zones contaminées, seule une prophylaxie sanitaire peut prévenir les infections humaines: éviter la consommation des coquillages crus et des poissons crus, éviter la contamination croisée d’autres denrées alimentaires (lavage des mains après la manipulation de produits de la mer, séparation entre les denrées alimentaires et les coquillages ou les poissons crus).
Dans le cas des produits de mer consommés crus ou insuffisamment cuits, le fait d’empêcher une multiplication des Vibrio entre le site de récolte et l’assiette du consommateur est un moyen efficace de prévention, facile à mettre en œuvre, notamment par le respect de la chaîne du froid. Nous proposons l’entreposage à basse température comme moyen de maîtrise des vibrions pathogènes dans les aliments. Toutefois, cette méthode n’est pas suffisamment fiable pour pouvoir être appliquée dans la pratique commerciale.
Les vibrions étant facilement détruits par la chaleur ; une cuisson suffisamment prolongée suffit par conséquent à éliminer la plupart des vibrions. Toutefois la pratique commerciale qui consiste à passer les huîtres à l’eau bouillante pour en faciliter l’ouverture ne suffit pas à en garantir la salubrité.
Le pH optimal de croissance des vibrions est 7.6 avec des valeurs de survie allant de 5,0-9,6. Le du jus de citron fraîchement serré s’est avéré efficace pour inactiver le Vibrio.
La prévention passe également par la surveillance continue des zones aquacoles et conchylicoles et par une formation et
10 — LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°3 Mars-Avril 2007
[1] Forsythe,S.J., 2000. Food safety Assurance in the EU. Food safety resources on the worldwide web. Codex- Food Hygiene: 23p.
[2] Cohen, N., H. Ennaji, M. Hassar, and H.
Karib. 2006. The Bacterial quality of red meat and offal in Casablanca (Morocco). Mol. Nutr.
Food Res. 50:557-562
[3] Anonymous. Morocco foodborne disease outbreaks, searchable data. 2005. Yearly Reports 2000, 2001, 2002, 2003, 2004.
[4] Anonymous. Rapport du département des pêches maritimes, 2006, Yearly Reports [5] Center for Disease Control and Prevention, (CDC) 1999. Outbreak of Vibrio parahaemolyticus infections associated with eating raw oysters and clams harvested from Long Island Sound – Connecticut, New Jersey and New York, 1998. Morbid Mortal Weekly Reports 48, 48-51.
[6] Hara-Kudo Y., K. Sugiyama,M. Nishibuchi, A. Chowdhury, J. Yatsuyanagi, Y. Ohtomo, A.
Saito, H. Nagano, T. Nishina,H. Nakagawa, H. Konuma, M. Miyahara, and Susumu Kumagai, 2003. Prevalence of Pandemic Thermostable Direct Hemolysin-Producing Vibrio parahaemolyticus O3:K6 in Seafood and the Coastal Environment in Japan. Appl.Enviro.
Microbiol., 69: 3883-3891
[7] Tantillo, G.M., Fontanarosa, M., DI Pinto, A. & Musti, M. 2004. Updated perspectives on emerging vibrios associated with human infections. Letters in Appl. Microbiol. 39, 117- 126.[8] Battey J., Wallace R., Allan B. and Keeffer.
1970. Gastro-enteritis in Australia caused by a marine Vibrio. Med. J. Austr. 1, 430-433 [9] Bockemuhl J., Amedome A. and Triemer, 1975. Vibrio parahemolyticus gastro-enteritis during the El Tor cholera epidemic in Togo, Amer.
J. Trop. Med. Hyg.,24, n°l, 101-104
[10] Boudon A., Richard C., Lecorre.C. and Colomb P. 1973. Premier cas autochtone de syndrome diarrhéique à Vibrio parahemolyticus en France : données bactériologiques, cliniques et épidémiologiques. Méd. et Mal. Infect. 13, n°7, 443-44
[11] Blake P.A., Allegra D.T., Snyder J.D. 1980.
Cholera- a possible epidemic focus in the U.S.
New Eng. J. Med. 302: 305-309
[12]Bradshaw J.G., Shah D.B., Wehby A.J., Peeler J.T., Twedt R.M. 1984.Thermal inactivation of the Kanagawa hemolysin of Vibrio parahaemolyticus in buffer and shrimp. J. Food Sci. 49:183-187.
[13] Huss, H.H. 1996. Assurance de la qualité des produits de mer. FAO, 334 : 13-17.
[14] Ministry of Health by ESR. 2001. Vibrio cholerea. Microbial path data sheets www.nzfsa.
gov.nz/science/data-sheets/vibrio-cholerae.pdf.
[15] China B., Deschaetzen M. and Daube G.
2003. Les mollusques bivalves, des aliments dangereux? Ann. Méd. Vét. 147:413-422.
[16] Fournier J.M. & Quilici M.L. 2002.
Infections à vibrions non cholériques. Encycl.
Méd. Chir. (éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS, Paris, tous droits réservés), Maladies infectieuses, 8-026-F15. Fr. 7p.
[17] Euzéby J.P.M. 2005, Vibrio parahaemolyticus http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/vv/
parahaemolyticus.html
[18].Nishibuchi M., Kaper J.B.1995.
Thermostable direct hemolysin gene if Vibrio parahaemolyticus : a virulence gene acqured by a marine bacterium. Infect. Immun., 63 :2093- 2099.
[19] Lynch T., Livingstone S., Buenaventura E., Lutter E., Fedwick J., Buret A.G., Graham D.
and DeVinney R. 2005. Vibrio parahaemolyticus disruption of epithelial cell tigh junctions occurs independently of toxin production. Infect.
Immun. 73:1275-1283.
[20] Hirsch M. 2002. Evaluation des risques liés à la consommation de produits de la pêche importés. AFSSA, DERNS/Enr.22/Ind.D.
Maisons-Alfort, France.
[21] Lee C.Y., Pan S.F. and Chen C.H. 1995.
Sequence of a cloned pR72H fragment and its use for detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish with the PCR. Appl. Environ. Microbiol.
61:1311-1317.
[22] Robert-Pillot A., Guénolé A. and Fournier J.M. 2002. Usefulness of R72H PCR assay for differentiation between Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus species: validation by DNA-DNA hybridization. FEMS Microbiol.
Lett., 215: 1-6.
[23] Chun, J., Huq A., and Colwell R.R. 1999.
Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus.
Appl. And Environ. Microbiol. 65: 2202-2208.
[24] Robert-Pillot A., Guénolé A., Lesne J., Delesmont R., Fournier J.M. and Quilici M.L.
2004. Occurrence of the tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolates from waters and raw shellfish collected in two French coastal areas and from seafood imported into France. Int.
J. Food. Microbiol. 91, 319-325.
[25] Fields I.P., Popovic T., Wachsmuth K.
and Olsvik O. 1992. Use of polymerase Chain Reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 Strains from the Latin American cholera epidemic. J. Clin. Microbiol., 30:2118- 2121.
[26] Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B., Uhlen M., Popovic T., Wachsmuth K. and Fields I.P.
1993. Use of automated sequencing of polymerase Chain Reaction-Generated to identify types of
cholera toxin submit B in Vibrio cholerae O1 Strains. J. Clin. Microbiol., 31:22-25.
[27] Bouchriti N., EL Marrakchi A. and Goyal S.M. 1997. Microbial pollution of seawater and shellfish in Morocco. In Japar Sidik B., Yusoff F.M., Mohd Zaki M.S. and Petr T. Eds. Fisheries and Environment: Beyond 2000. Universiti Petanian Malaysia., P.339-359.
[28] Wallace B.J., Guzewich J.J., Cambridge M., Altekruse S. and Morse D.L. 1999. Seafood- associated disease outbreaks in New York, 1980- 1994: implications for control. American J.
Preve. Med., 17, 48-54
[29] Rippey, S. R. 1994. Infectious diseases associated with molluscan shellfish consumption.
Clin. Microbiol. Rev. 7:419-425
[30] Klontz,K.C., L. Williams, L.M. Baldy, and M. Campos. 1993. Raw oyster-associated Vibrio infections: Linking epidemiologic data with laboratory testing of oysters obtained from a retail outlet. J. Food Protect. 56:977-979.
[31]Pan TM., TK. Wang, CL. Lee, SW. Chien and CB. Horng. 1997. Food-borne disease outbreaks due to bacteria in Taiwan, 1986 to 1995. J. Clin.
Microbiol. 35:1260-1262.
[32] Lemoine T., Germanetto P., and Giraud P. 1999. Toxi-infection alimentaire collective à Vibrio parahaemolyticus. [en ligne] Adresse URL: http://www.invs.sante.fr/beh/1999/9910.
[33] Werker D.H., King A.S., Kelly M.T. and Matheson T. 1996. Le cholera en Colombie britannique. RMTC., 22:75-78.
[34] Smith Dewaal C., Barlow K., Alderton L. and Jacobson M.F. 2001. Outbreak alert: centre for sciences in public Interest (CSPI): Wachington, 48p.
[35] Okua J., Ishibashi M. Hayakawa E., Nishino T., Takeda Y., Mukhopadhyay A.K., Garg S., Bhattacharya S.K., Nair G.B., and Nishibuchi M. 1997. Emergence of unique O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcuta, India, and isolation of stains from the same clonal group from southeast Asian travellers arriving in Japan.
J. Clin. Microbiol., 35:3150-3155.
[36] Bouchriti N., Hamouda A., Karib H., Oumokhtar B. and Yaakoubi I. 2001.
Appréciation de la qualité bactériologique des huîtres Crassostrea gigas commercialisées à Rabat. Animalis, 2:26-35.
[37] Mitscherlich E., Marth E.H. 1984. Microbial Survival in the environment. Springer-Verlag.
[38] Cohen N., Karib H., Lemée L., Guénolé A., Ait Saïd J. and M.L. Quilici. 2007. Prévalence des vibrions potentiellement pathogènes dans les produits de pêche commercialisés à Casablanca (Maroc)» Rev. de Méd. Vét. Article in press.
R é f é R e n c e s
une sensibilisation des médecins, afin qu’ils informent leurs patients présentant une pathologie prédisposante (cirrhose du foie, hémochromatose, diabète, antécédents de chirurgie gastrique, cancer, sida, traitement par immunodépresseurs ou corticostéroïdes) du risque auquel ils s’exposent en consommant les produits de la mer.
Pour garantir la sécurité des produits de la pêche, il faut réaliser des tests bactériologiques spécifiques dans le cadre d’un système de contrôle. L‘étude des caractères morphologiques, culturaux et biochimiques des V. cholerae et V. parahaemolyticus ne permet pas toujours de faire la distinction entre les espèces et l’alternative à ces méthodes d’identification est la recherche par la technique PCR de séquences génomiques spécifiques de l’espèce, et des gènes associés à la virulence.
CONCLUsION eT peRspeCTIVes
Afin de fixer les priorités dans un programme national de salubrité des aliments, il est nécessaire de bien évaluer le fardeau que représentent les TIAC. Dans ce contexte la surveillance de ces maladies doit occuper un rang de priorité.
V. cholerae et V. parahaemolyticus, constituent un réel problème de santé publique en raison de la fréquence de leur isolement dans les produits de la pêche.
La surveillance de l’eau et des fruits de mer devrait permettre la détection des isolats potentiellement pathogènes notamment durant les mois chaud. Cependant, la recherche systématique de ces vibrions ne peut être envisagée que si les techniques d’analyse et de dénombrent sont suffisamment performantes et permettent de préciser la signification sanitaire de leur présence dans les aliments.
