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Texte intégral

(1)Étude structurale et fonctionnelle d’un nouvel ARN non codant, Asgard, contrôlant l’autorenouvellement des cellules souches embryonnaires Vincent Giudice. To cite this version: Vincent Giudice. Étude structurale et fonctionnelle d’un nouvel ARN non codant, Asgard, contrôlant l’autorenouvellement des cellules souches embryonnaires. Biologie cellulaire. Université Claude Bernard - Lyon I, 2013. Français. �NNT : 2013LYO10271�. �tel-01153148�. HAL Id: tel-01153148 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01153148 Submitted on 19 May 2015. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

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(3) . . . . . . . . . . . . . . THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON Délivrée par L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1. ECOLE DOCTORALE : BMIC. DIPLOME DE DOCTORAT (arrêté du 7 août 2006) soutenue publiquement le 18 décembre 2013 par M. GIUDICE Vincent. TITRE :. "Étude structurale et fonctionnelle d’un nouvel ARN non codant, Asgard, contrôlant l’autorenouvellement des cellules souches embryonnaires.". Directeur de thèse : M. SAVATIER Pierre. MEMBRES DU JURY : M. GILLET Germain (Président du jury) Mme ROUGEULLE Claire (Rapporteur) M. PUCEAT Michel (Rapporteur) M. AUBOEUF Didier (Examinateur) M. BOURILLOT Pierre-Yves (Examinateur).

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(5) Remerciements Une thèse est avant toute chose une aventure humaine. Cette aventure, je l'ai vécue avec des personnes formidables que je souhaiterai remercier ici. Tout d'abord, un grand merci à mes deux chefs : - Pierre qui a placé sa confiance en moi dès le master et qui m'a guéri de la virgulite aigüe. Pierre, tu es un chef humain, proche de nous et tu nous fais entièrement confiance, et pour ça je ne peux qu'être admiratif. - Pierre-Yves qui a été un co-encadrant formidable. Tu m'as appris énormément de choses et nos discussions que ce soit sur le plan technique, à propos de mes projets de thèse ou sur le plan humain, notamment à propos de mon avenir m'ont énormément apporté. Merci pour tout. Bon je suis quand même déçu de ne pas avoir réussi à te faire apprécier les chats! Je me souviendrai d'une phrase formidable que Pierre-Yves, après le résultat (négatif) du concours pour la bourse ministérielle, à une période où je remettais mon avenir en question, m'a dit : "Ne t'inquiètes pas Pierre et moi on te fait confiance, on ne va pas te lâcher et on va te trouver un financement". Là je me suis dit que j'allais tout faire et donner le maximum pour eux. Encore une fois merci ! Je voudrais ensuite remercier les anciens et nouveaux doctorants de l'équipe : -Pierrot et Yann : mes deux lapins. En fait vous êtes indissociables. On a formé un trépied tous les trois. Je suis arrivé au labo quelques mois après Pierrot et quelques mois avant Yann. On finit quasiment en même temps nos thèses. De nombreuses années vécues à vos côtés, on s'est vu évoluer, grandir, avancer nos projets, avancer dans notre vie... Plus que des collègues, de véritables amis. Je ne peux qu'être heureux d'avoir passé toutes ces années avec vous ! Et gardez moi une chambre d'ami à l'endroit de vos prochains post-doc. -Fabrice : le ptit nouveau. Je n'oublierai pas tous tes conseils pour faire sauter les PV et si jamais j'ai un souci je viens te voir ! -Irène qui m'a apporté énormément pendant mon année de master, avant de partir à Singapour et qui m'a confié son projet sur Klf4 et Klf5. Maintenant qu'elle est revenue c'est à moi de lui confier mon projet Asgard et je sais qu'il sera entre de bonnes mains avec elle. Merci également pour m'avoir initié à la musique turque : Dum tek tek !.

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(7) - Diana qui est une personne formidable. Nos discussions me manquent énormément. Tu m'as apporté tellement de choses sur le plan technique et humain et je savais que je pouvais compter sur toi à tout moment. Merci pour toutes ces années. - Sophie : on est arrivé le même jour au labo. Tu es quelqu'un de bien et je sais que je peux compter sur toi en cas de coup dur. Je n'ai qu'un mot à rajouter : bon courage pour ta thèse ! -Pierre-Marie : le binôme, l'autre Z. Merci pour ces années de colocation de bureau. Vous êtes toutes et tous pour moi de véritables ami(e)s mais de toute façon vous savez tous ce que je pense de vous ! Et on gardera contact ! Promis. Merci à tous les autres membres de l'équipe (présents ou passés) sans qui rien ne tournerait. rond. (un. peu. comme. les. facteurs. qui. permettent. le. maintien. de. l'autorenouvellement finalement...) : Marielle, Hongwei, Magali, Edwige (spécial merci pour ton aide ces derniers mois !!!), Anaïs, Maxime, Suzy (tu es un peu la maman de tous les thésards de l'équipe!), Murielle, Virginie, Aga... Merci également à l'équipe de Bertrand Pain avec qui on a énormément collaboré ces derniers temps. Un merci tout particulier à Christian, Pauline, Aurélie, Cécile qui sont des ingénieurs du tonnerre ! Merci à Colette et Henry pour m'avoir accueilli dans leur laboratoire et merci Henry et Jennifer pour m'avoir fait confiance pour le café-débat. Merci à tous les autres membres du labo (vous citer tous serait beaucoup trop long mais j'ai une pensée pour chacun d'entre vous...).. Au cours de l'aventure qu'est la thèse, la famille est également essentielle. J'aimerai remercier ma petite bretonne, Fanny, sans qui j'aurai sûrement craquer dans les moments difficiles. Tu as eu le courage de me supporter dans les moments difficiles et même de me rebooster en demandant sans cesse : "Il sort quand ton article Klf ?". Bon maintenant que le manuscrit de thèse est fini et que l'article est presque sorti, tu peux reprendre le bureau ! Je te le laisse !.

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(9) Merci à mes parents et mes frères qui m'ont soutenu tout au long de mes études que ce soit financièrement ou humainement ! Je ne vous le dis pas souvent mais j'ai de la chance de vous avoir à mes côtés ! Vous avez eu confiance en moi et j'espère ne pas vous avoir déçu ! Merci à toute ma famille pour leur soutien ! Un merci spécial à Patrice pour nos discussions très intéressantes sur le monde de la recherche au cours des repas familiaux ! Merci à mes deux chats qui ont participé à l'écriture de la thèse. Voici une de leurs phrases retrouvée sur le tapuscrit : . Un merci tout particulier à Yoann, Pierre-Yves et Anne pour leur amitié profonde et indéféctible ! Enfin un merci à toutes les personnes qui m'ont fait apprécié la communication et vulgarisation scientifique ces dernières années : les membres du C@fé des Sciences, de StripScience, de Podcast Science, du service Science et Société de l'Université de Lyon.... Je dédie cette thèse à mes grands-parents qui m'ont soutenu au cours de mes premières années d'étude..

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(11) Résumé Les cellules souches embryonnaires (ES) sont isolées à partir de la masse cellulaire interne (ICM) d’un embryon pré-implantatoire. Ces cellules sont capables (i) de se multiplier in vitro à l’infini sans modification de leurs caractéristiques, une propriété appelée autorenouvellement, et (ii) de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires primitifs, ectoderme, mésoderme et endoderme, une capacité qui définit la pluripotence (Smith, 2001). Chez la souris, le Leukemia Inhibitory Factor (LIF) joue un rôle clé dans le maintien des cellules ES à l’état pluripotent (Smith et al., 1988). Le LIF agit en activant le facteur de transcription STAT3 via les kinases Jak. Cette activation est nécessaire et suffisante au maintien des cellules ES en autorenouvellement en présence de sérum (Matsuda et al., 1999; Niwa et al., 1998). Une étude du transcriptome de STAT3 réalisée au laboratoire a permis d’identifier plusieurs gènes cibles de ce facteur, parmi lesquels des facteurs de transcription, des serine/thréonine kinases, des protéines de la matrice extracellulaire, et des régulateurs du cycle cellulaire (Bourillot et al., 2009). STAT3 active également l’expression de plusieurs gènes inconnus. L’un d’eux, le gène 1456160_at, est fortement exprimé dans les cellules ES de souris et son expression diminue après induction de la différenciation de ces cellules. Ce gène a été appelé Asgard pour Another Self-renewal GuARDian.. La caractérisation et le séquençage de ce gène ont permis de mettre en évidence qu'Asgard est transcrit en microARN. De nombreux microARNs jouent un rôle clé dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules ES et dans le contrôle de la différenciation. Des expériences d’inhibition et de surexpression ont permis de montrer que Asgard est impliqué dans la régulation de la différenciation endoderme versus mésoderme. Des analyses préliminaires ont permis d’identifier Pbx3, FoxA2 et Sox17 comme cibles potentielles. Bien que les mécanismes d’action d'Asgard restent à confirmer, ce travail a permis d’identifier un nouveau gène clé de l'autorenouvellement des cellules ES de souris. . Mots-clés : cellules souches embryonnaires, ARN non codants, microARN, voie de signalisation LIF/STAT3, Asgard, différenciation, autorenouvellement, Klf4, Klf5.

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(13) Résumé Chez la souris, le Leukemia Inhibitory Factor (LIF) joue un rôle clé dans le maintien des cellules souches embryonnaires (ES) à l’état pluripotent. Le LIF agit en activant le facteur de transcription STAT3 via les kinases Jak. Cette activation est nécessaire et suffisante au maintien des cellules ES en autorenouvellement en présence de sérum. Une étude du transcriptome de STAT3 réalisée au laboratoire a permis d’identifier plusieurs gènes cibles de ce facteur, parmi lesquels plusieurs gènes inconnus. L’un d’eux, le gène 1456160_at, est fortement exprimé dans les cellules ES de souris et son expression diminue après induction de la différenciation. Ce gène a été appelé Asgard pour Another Self-renewal GuARDian. La caractérisation et le séquençage de ce gène ont permis de mettre en évidence qu'Asgard code pour un microARN. De nombreux microARNs jouent un rôle clé dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules ES et dans le contrôle de la différenciation. Des expériences d’inhibition et de surexpression ont permis de montrer que Asgard est impliqué dans la régulation de la différenciation endoderme versus mésoderme. Des analyses préliminaires ont permis d’identifier Pbx3, FoxA2 et Sox17 comme cibles potentielles. Bien que les mécanismes d’action du microARN Asgard restent à confirmer, ce travail a permis d’identifier un nouveau gène clé de l'autorenouvellement des cellules ES de souris.. Mots-clés cellules souches embryonnaires, ARN non codants, microARN, voie de signalisation LIF/STAT3, Asgard, différenciation, autorenouvellement, Klf4, Klf5, endoderme, mésoderme. Title Characterization of a novel non coding RNA, Asgard, which controls the self-renewal of mouse embryonic stem cells.. Abstract The Leukemia Inhibitory Factor (LIF) activates the transcription factor STAT3, which results in the maintenance of mouse embryonic stem cells in the undifferentiated state by inhibiting mesodermal and endodermal differentiation. We identified several target genes of STAT3 by transcriptomic analysis. Among them, we focused on an unknown gene referred as 1456160_at on Affymetrix array. This gene is highly expressed in embryonic stem cells and its expression level decreases during differentiation. We named this gene Asgard for Another Self-renewal GuARDian. Its characterization and sequencing revealed that Asgard encodes for a microRNA sequence. Several microRNAs have been shown to play key role in the maintenance of self-renewal of mouse ES cells and in the control of differentiation. Inhibition and overexpression assays showed that Asgard inhibits endodermal differentiation in order to maintain self-renewal. Through preliminary analysis, we identified Pbx3, FoxA2 and Sox17 as potential targets of the microRNA Asgard. Our work enables us to identify a new key gene of self-renewal of mouse ES cells.. Keywords embryonic stem cells, non coding RNA, microRNA, LIF/STAT3 signalling pathway, Asgard, differentiation, self-renewal, Klf4, Klf5, endoderm, mesoderm Thèse préparée au laboratoire INSERM U846, 18 avenue du Doyen Lépine 69500 BRON.

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(15) Table des matières. @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@N. @

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(38) Table des Figures &$52 J@24"2&34&15 3 3 ++5+ 3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@O &$52 K@.& 3 3&$-+&34&.-2"$5+-4+ 3 ++5+ 3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@Q &$52 L@/+ 3 +#M 4 +#N-3+2"$5+4&.- 3 ++5+ 3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@JL &$52 M@9-4%!3 3,&2.3 43&+ -&-$@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@JQ &$52 N@ -4 24&.- -42 3+-3 4+ -.95 0+52&0.4 - @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@KM &$52 O@/+ +&-B-3+ .-42/+ +2 02.$2,,4&.- ++5+&2 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@KP &$52 P@ -4 24&.- -42 + 3,&2.3 4+ -.95 0+52&0.4 - @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@LL &$52 Q@"$5+4&.-"0&$"-"4&15 +0+52&0.4 - 02+ 3,&2.3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@LP &$52 R@.-42/+ +&##"2 -&4&.-02+ 3,&2.3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@LR &$52 JI@"$5+4&.-59+ ++5+&2 02+ 3,&2.3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@MM &$52 JJ@/+ 3,&2.3-3+2 02.$2,,4&.- ++5+&2 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@MR &$52 JK@24"2&34&15 35$!- JMNOJOIC4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@OL &$52 JL@

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(59) &34 3&+ 30.4 -4& ++ 3A3$2@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@RJ. L .

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(61) Liste des abréviations. cellules ES : cellules souches. piRNA : piwi RNA. embryonnaires snoRNA : small nucleolar RNA EpiSC : cellules souches épiblastiques pri-miARN : primary miARN cellules iPS : cellules souches pluripotentes induites ICM : masse cellulaire interne (inner cell. pre-miARN : precursor miARN miARN : microARN. mass). lncRNA : long non coding RNA. LIF : Leukemia Inhibitory Factor. ChIP : immunoprécipitation de la. MEFs : fibroblastes embryonnaires de. chromatine. souris. MET : transition mésenchyo-épithéliale. EB : corps embryoïdes (embryoid bodies). TEM : transition épithélio-. BMP4 : Bone Morphogenic Protein STAT3 : Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Id : Inhibiteur de différenciation. mésenchymateuse OSK : cocktail de reprogrammation Oct4/Sox2/Klf4 OSKM : cocktail de reprogrammation Oct4/Sox2/Klf4/c-myc. Fzd : Frizzled PcG : protéines du groupes Polycomb Cdk : kinases dépendantes des cyclines Dcr ou Di : Dicer RB : rétinoblastome D8 : DGCR8 Fgf : Fibroblast growth factor Klf : Krüppel-like Factor siRNA : small interfering RNA Asgard : Another Self-renewal GuARDian. M .

(62) . .

(63) . INTRODUCTION. N .

(64) . Figure 1. Caractéristiques des cellules ES. Les cellules ES sont dérivées à partir de la masse cellulaire interne d’un embryon. Elles ont deux caractéristiques principales qui sont : •. la capacité d’auto-renouvellement : les cellules ES prolifèrent à l’infini sans inhibition de contact. •. la pluripotence : les cellules ES peuvent se différencier en cellules des 3 feuillets embryonnaires qui sont l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme.. O .

(65) I. Les cellules souches embryonnaires . I.1 Qu’est ce qu’une cellule souche embryonnaire ? Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont dérivées à partir des cellules de la masse cellulaire interne (ICM) d’un embryon au stade blastocyste (Evans and Kaufman, 1981) (Martin, 1981). Ces cellules possèdent trois propriétés fondamentales (Figure 1): - l’auto-renouvellement : In vitro, les cellules ES prolifèrent à l’infini, sans inhibition de contact, tout en restant pluripotentes et indifférenciées. On parle d’auto-renouvellement permanent. Dans des conditions de cultures correctes, les cellules ES peuvent, contrairement aux cellules cancéreuses, rester en auto-renouvellement tout en gardant un caryotype stable (Smith, 2001). - la pluripotence : Les cellules ES sont pluripotentes, c'est-à-dire qu’elles ont la capacité de se différencier, in vitro et in vivo, dans les trois feuillets embryonnaires, qui sont l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. In vitro, le test standard, pour vérifier la pluripotence des cellules ES, consiste à induire la différenciation de ces cellules en les cultivant en suspension, en absence des agents permettant leur maintien à l’état indifférencié (LIF (Leukemia Inhibitory Factor) et/ou MEFs (fibroblastes embryonnaires de souris), servant de cellules nourricières). Dans ces conditions, les cellules ES s’organisent spontanément en agrégats, ou structures tridimensionnelles, et se différencient en mimant les premiers stades du développement embryonnaire (Doetschman et al., 1985). Ces structures, appelées corps embryoïdes (EB), sont composées de cellules des trois feuillets embryonnaires. L’injection de cellules ES, dans des souris immunodéprimées, donne lieu à la formation de tératomes. Ces tumeurs bénignes, sont composées de cellules des trois feuillets embryonnaires. Un autre test de pluripotence, in vivo, consiste en la formation d’animaux chimériques (Bradley et al., 1984). En effet, après injection de cellules ES dans la cavité d’un blastocyste, ces dernières s’intègrent dans l’ICM et contribuent à la formation de tous les tissus de la souris chimère, y compris de la lignée germinale. Cette caractéristique des cellules ES permet, en pratique, leur utilisation pour créer des animaux transgéniques. P .

(66) Figure 2. Voies de signalisation régulant les cellules ES. A. Représentation schématique de la voie de signalisation du LIF montrant l’activation des gènes cibles c-myc, Eed, Pim-1, Pim-3, Klf4 et Klf5 par les dimères de STAT3 phosphorylé. B. La voie de signalisation LIF/STAT3 permet l’inhibition de la différenciation en endoderme et mésoderme. La voie BMP4/Smad/Id permet l’inhibition de la différenciation en ectoderme.. Q .

(67) - la tumorigénicité : Les cellules ES prolifèrent à l’infini, sans inhibition de contact. Dans des conditions normales de culture, ces cellules n’entrent pas en sénescence et n’ont pas de blocage du cycle cellulaire. De plus, comme nous l’avons vu précédemment, lorsque les cellules ES sont injectées dans des souris immunodéprimées, elles forment des tératomes. Enfin, ces cellules possèdent une forte activité télomèrase qui permet de conserver la longueur des télomères (Stewart et al., 2006). Ces caractéristiques sont partagées avec des cellules cancéreuses. La caractéristique qui permet de faire la distinction entre ces cellules, est le fait que les cellules ES conservent un phénotype et un caryotype normal.. I.2 Différents facteurs régulent l'auto-renouvellement des cellules ES. Plusieurs facteurs, extrinsèques ou intrinsèques, contrôlent le maintien de l’autorenouvellement, et de la pluripotence des cellules ES.. a. Les voies de signalisation impliquées dans le maintien des cellules ES en auto-renouvellement Pour se maintenir en auto-renouvellement les cellules ES de souris sont cultivées en présence de LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (Smith et al., 1988) et de BMP4 (Bone Morphogenic Protein) (Ying et al., 2003). La voie de signalisation de LIF implique un hétérodimère LIF-Receptor / gp130 qui phosphoryle et active le facteur de transcription STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) (Niwa et al., 1998). Ceci induit alors son homodimérisation et sa translocation nucléaire (Burdon et al., 2002) (Figure 2). La voie de signalisation LIF/STAT3 est impliquée dans l’inhibition de la différenciation des cellules ES en mésoderme et endoderme et dans le maintien de l’auto-renouvellement (Burdon et al., 1999) (Figure 2). La voie du BMP4 conduit, par l’intermédiaire de l’activation des facteurs Id (inhibiteur de différenciation), à l’inhibition de la différenciation en ectoderme et également au maintien de l’auto-renouvellement (Ying et al., 2003). Plusieurs gènes cibles directs de STAT3 ont été identifiés dans les cellules ES de souris : junB (Duval et al., 2000; Matsuda et al., 1999), c-myc (Cartwright et al., 2005), socs3 (Auernhammer et al., 1999), Pim1, Pim3 (Aksoy et al., 2007), Eed, Jmjd1, Dax1, Grg5 (Sekkaï et al., 2005; Ura et al., 2008). c-myc, Pim1, Pim3 et Eed semblent contribuer au R .

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(69) maintien des cellules ES à l’état indifférencié. En 2009, une analyse du transcriptome de STAT3 dans les cellules ES de souris, réalisée par notre équipe, a permis d’identifier 58 nouveaux gènes cibles directs de STAT3. Une analyse fonctionnelle de ces gènes par interférence à l’ARN a permis d’en identifier 22 dont l’expression contribue au maintien des cellules ES à l’état indifférencié (Bourillot et al., 2009). Parmi ces 22 gènes se trouvent les gènes Klf4 et Klf5. La protéine Klf4 forme, avec Klf5 et Klf2, un réseau moléculaire permettant le maintien de l’état indifférencié des cellules ES en activant l’expression du facteur de pluripotence Nanog (Jiang et al., 2008). Au sein de notre équipe, nous avons étudié le rôle de Klf4 et Klf5 dans l’inhibition de la différenciation des cellules ES de souris. (Aksoy, Giudice et al., article en annexe). Enfin, très récemment, deux gènes cibles de STAT3, Gbx2 et Tcfp2l1, ont été identifiés comme ayant un rôle primordial dans le maintien de l’état indifférencié des cellules ES de souris (Martello et al., 2013; Tai and Ying, 2013; Ye et al., 2013).. Une autre voie de signalisation joue également un rôle dans le contrôle de l’autorenouvellement des cellules ES. Il s’agit de la voie Wnt/β-catenin. Dans cette voie, la protéine Wnt se fixe à un récepteur composé des protéines Fzd (Frizzled), Lrp5 et Lrp6. Ceci entraîne l’inhibition de l’activité enzymatique de la protéine GSK3. Cette protéine phosphoryle la protéine β-catenin, entraînant ainsi la dégradation de cette dernière. L’inhibition de la protéine GSK3, par la voie Wnt, permet la stabilisation et le maintien de l’activité de la β-catenin. Par la suite, cette protéine est transloquée dans le noyau où elle forme des complexes avec différents facteurs de transcription de la famille Tcf afin de réguler l’expression de gènes cibles. Parmi les 1369 gènes sur lesquels se fixe la protéine Tcf3, 942 sont également fixés par les protéines du noyau de pluripotence (Oct4, Nanog, Sox2) (Marson et al., 2008). Cependant Tcf3, contrairement aux gènes du noyau de pluripotence, semble avoir un rôle d’inhibiteur du maintien des cellules ES à l’état indifférencié. En effet, l’inhibition de Tcf3 entraîne l’augmentation de l’expression de marqueurs d’auto-renouvellement Nanog, Klf4, Dazl, Esrrb et la diminution de l’expression de marqueurs de différenciation tels que Fgf5, Krt8 ou Jun (Yi et al., 2008). En 2011, Wray et al. ont montré que l’inhibition de la protéine GSK3, par des petites molécules chimiques, entraîne l’interaction de la β-catenin avec Tcf3, ce qui conduit au blocage de l’activité répressive de Tcf3, sur les gènes d’auto-renouvellement (Wray et al., 2011). Cependant, la β-catenin peut, dans le noyau, interagir avec une autre protéine de la JI .

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(71) famille des Tcf : Tcf1. Une étude de 2011 a montré que cette interaction était nécessaire au maintien de l’auto-renouvellement des cellules ES par la voie de signalisation Wnt. En effet, l’inhibition de Tcf1, dans des cellules ES cultivées en présence de Wnt3a à la place du LIF, entraîne une augmentation du nombre de cellules différenciées d’un facteur 2 (70% de cellules en auto-renouvellement à 35%) (Yi et al., 2011). L’inhibition de Tcf3 dans les cellules Tcf1-/- permet d’obtenir à nouveau 70% de cellules en auto-renouvellement. La voie Wnt/β-catenin permet donc le maintien de l’auto-renouvellement des cellules ES par deux mécanismes complémentaires : •. L’inhibition de Tcf3 et de son effet répresseur sur les gènes d’autorenouvellement.. •. L’activation de Tcf1 et de la transcription de ses gènes cibles.. Parmi les gènes inhibés par Tcf3 se trouve Esrrb (Martello et al., 2012). Des études récentes de ce gène l’ont décrit comme un gène clé du contrôle de l’auto-renouvellement des cellules ES de souris. En effet, l’inhibition de l’expression de ce gène induit la différenciation des cellules ES (Martello et al., 2012) et, inversement, la surexpression d’Esrrb permet le maintien en auto-renouvellement des cellules ES cultivées en absence de LIF (Festuccia et al., 2012). La découverte du rôle essentiel de ce gène dans le contrôle de l’auto-renouvellement des cellules ES, renforce l’importance de la voie de signalisation Wnt/β-catenin pour le maintien de ces cellules à l’état indifférencié.. b. Le noyau de pluripotence des cellules ES Parmi les principaux facteurs intrinsèques, permettant le maintien des cellules ES à l’état indifférencié, se trouvent les facteurs de transcription Oct4, Nanog et Sox2. Ces trois protéines forment ce que l’on appelle le « noyau de pluripotence ». En 2000, Niwa et al. ont montré que le maintien d’un niveau stable de l’expression d’Oct4, dans les cellules ES, est essentiel pour préserver l’auto-renouvellement (Niwa et al., 2000). En effet, ils ont observé qu’une surexpression, ou inhibition, de 50% du niveau d’expression d’Oct4, induit la différenciation des cellules ES : - en endoderme extra-embryonnaire et mésoderme en cas de surexpression d’Oct4, JJ .

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(73) - en cellules trophoblastiques lorsque l’expression d’Oct4 est inhibée. L’effet de l’inhibition d’Oct4 sur les cellules ES a été confirmé dans une étude de 2006 (Ivanova et al., 2006). Dans le but de comprendre le rôle de différents gènes dans le contrôle des cellules ES, les auteurs de cette étude ont inhibé l’expression, un par un, de 65 gènes différents. Ils ont alors observé que l’inhibition d’Oct4, mais également de Sox2 ou Nanog, entraîne la différenciation des cellules ES de souris. Dans cette étude, il a également été montré que Nanog bloque la différenciation des cellules ES en endoderme, mésoderme et trophectoderme ; contrairement à Oct4 qui bloque uniquement la différenciation en trophectoderme. De plus, la surexpression de Nanog, contrairement à celle d’Oct4, permet le maintien des cellules ES, en auto-renouvellement, malgré leur culture dans des conditions de différenciation (Chambers et al., 2003). Sox2 est également impliqué dans l’inhibition de la différenciation des cellules ES de souris en trophectoderme (Masui et al., 2007). Ce blocage passe par l’activation de l’expression d’Oct4. En effet, l’inhibition de Sox2 entraîne l’activation de répresseurs d’Oct4, ce qui conduit à la différenciation des cellules en trophectoderme. Ces trois gènes (Oct4, Nanog et Sox2) constituent ce que l’on appelle le « noyau de pluripotence » : ils agissent ensemble pour contrôler l’auto-renouvellement et la pluripotence des cellules ES humaines et murines. Oct4, Sox2 et Nanog forment une boucle d’autorégulation positive, dans laquelle chaque gène active sa propre expression ainsi que celle des deux autres gènes (Loh et al., 2006). De plus, ces facteurs de transcription se fixent ensemble sur les promoteurs de nombreux gènes dans les cellules ES de souris, afin d’activer l’expression des gènes impliqués dans le maintien de la pluripotence (Esrrb, Tcf3…), dans la prolifération cellulaire (n-Myc…) ou dans la réponse aux dommages causés sur l’ADN (Rif1, Trp53bp1…). Ils vont également inhiber l’expression des gènes de différenciation comme Dkk1 par exemple (Loh et al., 2006). Oct4, Nanog et Sox2 se fixent également tous les trois, sur les promoteurs de deux microARNs qui sont miR-137 et miR-301 (Boyer et al., 2005).. JK .

(74) Nanog. Klf2 Klf4. Klf5. Mésoderme. Prolifération. Endoderme. Figure 3. Rôles de Klf4 et Klf5 dans la régulation des cellules ES. Représentation schématique du réseau moléculaire entre les facteurs KLF2, KLF4, KLF5 et Nanog et son rôle dans l’inhibition de la différenciation en mésoderme et en endoderme dans les cellules ES de souris.. JL .

(75) c. Klf4 et Klf5 : deux gènes clés de la pluripotence D’autres facteurs intrinsèques sont essentiels au maintien des cellules ES en autorenouvellement. C’est le cas notamment de Klf4 et Klf5 qui codent pour deux protéines, KLF4 et KLF5, membres de la famille des facteurs de transcription Krüppel-like factor. En 2005, Li et al. ont étudié l’action de Klf4 dans les cellules ES de souris (Li et al., 2005). Ils ont alors remarqué que la surexpression de Klf4 permet le maintien de l’expression d’Oct4 à un niveau élevé dans les cellules cultivées en condition de différenciation. La protéine Klf4 forme, avec Klf5 et Klf2, un réseau moléculaire permettant le maintien de l’état indifférencié des cellules ES en activant l’expression du facteur de pluripotence Nanog (Jiang et al., 2008) (Figure 3). Nanog est un gène clé de la pluripotence capable de bloquer la différenciation des cellules ES (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003). Lorsqu’ils sont surexprimés, Klf4 et Klf5 forcent les cellules ES à s’autorenouveller à l’état indifférencié, même en l’absence de LIF (Ema et al., 2008). Klf4 est aussi l’un des quatre gènes clés permettant de reprogrammer les cellules somatiques en cellules iPS (induced pluripotent stem cells) (Takahashi and Yamanaka, 2006). Klf4 peut d’ailleurs être remplacé par Klf5 dans cette fonction (Nakagawa et al., 2008) ce qui indique une redondance fonctionnelle entre ces deux facteurs. Klf4 et Klf5 ont été décrits comme étant essentiels au maintien de l’état indifférencié des cellules ES (Ema et al., 2008; Parisi et al., 2008). Pareillement, nous avons observé que l’atténuation de l’expression de Klf4 et Klf5 par interférence à l’ARN induit une augmentation importante de la différenciation spontanée des cellules ES. De plus l’expression de ces deux gènes diminue fortement après seulement 24h de culture en conditions favorisant la différenciation (Bourillot et al., 2009). . I.3 Caractéristiques du cycle cellulaire des cellules ES La cellule dispose de systèmes de régulation lors du passage de la phase G1 à la phase S (phase de réplication de l’ADN), puis de la phase G2 à la phase M (mitose). Ce contrôle est dépendant de l’activité des cyclines, des Cdk (kinases dépendantes des cyclines) ainsi que de protéines inhibitrices des Cdk comme p21cip1 ou p27kip1 (White and Dalton, 2005).. JM .

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(77) Dans les cellules différenciées, le passage de la phase G1 à la phase S est régulé par la protéine du rétinoblastome (RB). Son activité est dépendante de son état de phosphorylation. Lorsqu’elle est hypophosphorylée, la protéine RB empêche l’entrée de la cellule en phase S en séquestrant les facteurs de transcription de la famille E2F. Au cours de la phase G1, la protéine RB est phosphorylée par des complexes cycline D1/Cdk4, cycline D2/Cdk4 et cycline D3/Cdk4. Cette phosphorylation entraîne le relargage des facteurs de transcription E2F, l’activation consécutive des complexes cycline E/Cdk2, aboutissant à l’entrée en phase S. Le cycle cellulaire des cellules ES (souris et Homme) est caractérisé par une phase G1 très courte (1,5 h) (Burdon et al., 2002). De plus les cyclines D1, D2 et D3 sont peu ou pas exprimées et la kinase Cdk4 est inactive (Filipczyk et al., 2007; Savatier et al., 1996). En revanche, les complexes cycline E/Cdk2 sont présents en quantités très importante pendant toutes les phases du cycle (Stead et al., 2002) et la protéine RB reste phosphorylée en permanence (Savatier et al., 1994). Ainsi, le cycle cellulaire des cellules ES peut être considéré comme un cycle simplifié dans lequel l’expression et l’activité des complexes cycline E/Cdk2 est constitutive.. I.4 Etat de pluripotence naïf et amorcé. Deux sortes de cellules souches peuvent être dérivées à partir d’un embryon, selon son stade de développement. A partir de la masse cellulaire interne (ICM) d’un blastocyste de souris, il est possible d’obtenir des cellules souches embryonnaires (ES) et de les maintenir en culture à un stade dit « naïf ». A partir d’un embryon au stade épiblaste, nous pouvons dériver des cellules souches épiblastiques (EpiSC) et de les bloquer à un stade dit « amorcé » (Nichols and Smith, 2009). Ces deux sortes de cellules partagent toutes les caractéristiques essentielles des cellules souches. En effet, elles sont capables de s’auto-renouveller en culture, elles sont pluripotentes et forment des tératomes lorsqu’elles sont injectées dans des souris immunodéprimées. Cependant, elles sont différentes sur de nombreux points. Comme nous l’avons vu précédemment, les cellules ES de souris, à l'état naïf, peuvent, lorsqu’elles sont injectées dans un blastocyste, coloniser l’embryon et contribuer à la formation de tout l’organisme. De plus, ces cellules expriment des marqueurs génétiques spécifiques de l’ICM, tels que Rex1 ou Stella. Au contraire, les cellules EpiSC, amorcées, ne JN .

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(79) peuvent pas participer à la formation d’embryon chimérique. De plus, ces cellules expriment des marqueurs génétiques de l’épiblaste, tels que Brachyury ou Fgf5. D’autres différences caractérisent les deux états de pluripotence : - Les cellules ES de souris, dérivées à partir d’un embryon femelle, possèdent deux chromosomes X actifs. Les cellules amorcées, quant à elles, possèdent un chromosome X actif et l’autre inactif. - Le maintien en auto-renouvellement de ces deux sortes de cellules n’est pas dépendant des mêmes voies de signalisation. En effet, les cellules à l’état naïf sont dépendantes de la voie de signalisation LIF/STAT3 tandis que les cellules amorcées sont dépendantes de la voie de signalisation Fgf/Activine. - Enfin, les cellules à l’état naïf peuvent facilement être cultivées en condition uni-cellulaire, ce qui n’est pas le cas des cellules amorcées. Les cellules ES humaines, partagent de nombreux points communs avec les cellules EpiSC : faible clonogénicité, dépendance à la voie de signalisation Fgf/activine, inactivation d’un chromosome X dans les lignées femelles… (Silva et al., 2008; Xu et al., 2005). Les cellules ES humaines sont donc considérées comme des cellules amorcées. Cette différence, entre les cellules ES humaines et murines, peut être expliquée par une particularité du développement embryonnaire des rongeurs. En effet, les embryons murins ont la capacité de rentrer en diapause : les embryons arrêtent leur développement jusqu’à ce que les conditions environnementales et/ou métaboliques soient favorables. Le LIF joue un rôle essentiel dans ce phénomène de diapause (Lopes et al., 2004). Aucunes lignées de cellules ES à l’état naïf n’ont été dérivées à partir d’embryons d’espèces animales n’effectuant pas de diapause. En 2008, l’équipe d’A.Smith a mis au point un milieu de culture minimum permettant d’homogénéiser et de stabiliser la population de cellules ES à un état fondamental de pluripotence (« ground state »). Il s’agit du milieu 2i LIF, dans lequel les cellules ES sont cultivées en absence de sérum et en présence de LIF et de deux inhibiteurs pharmacologiques : le PD032 qui inhibe la voie ERK et le CHIR qui inhibe quant à lui la protéine GSK3β (Ying et al., 2008). Dans ce milieu, seules les cellules à l’état naïf sont capables de s’auto-renouveller ; les cellules amorcées se différencient.. JO .

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(81) Dans cette première partie, nous nous sommes intéressés à différents mécanismes impliqués dans le maintien des cellules ES en autorenouvellement. Depuis quelques années, de nombreuses études ont mis en évidence l’implication des ARN non codants dans la plupart de ces mécanismes. Dans les chapitres suivants, nous allons étudier les différents rôles des ARN non codants, et plus particulièrement des microARNs, dans le domaine des cellules souches embryonnaires.. JP .

(82) Figure 4. Synthèse des mircoARNs et silencing. Le transcrit primaire pri-miARN est transformé en pre-miARN par le complexe Drosha et DGCR8. Le premiARN est alors transporté dans le cytoplasme où il est clivé par Dicer pour donner des miARNs matures. Ces derniers inhibent l’expression de leurs gènes cibles en dégradant l’ARNm ou en inhibant la traduction de l’ARNm selon le degré de complémentarité.. JQ .

(83) II. Les ARNs non codants : mise en évidence et modes de synthèse II.1 Les petits ARN non codants. a. Définition et modes de synthèses Les petits ARN non codants sont des molécules d’ARNs de 20 à 30 nucléotides, généralement associés aux protéines du complexe Argonaute. Ces ARNs régulent la répression post-transcriptionnelle de leurs ARNs messagers cibles. Il existe plusieurs catégories de petits ARN non codants (microARN, siARN endogènes, piARN…) qui divergent par leur mode de synthèse et leurs mécanismes d’action. D’autres ARNs non codants, les snoARN, se distinguent par leurs tailles beaucoup plus importantes que celles des petits ARNs non codants (60 à 300 nucléotides). En ce qui concerne les microARNs, leurs gènes sont d’abord transcrits en un primiARN (« primary miARN ») qui est ensuite modifié en pre-miARN (« precursor miARN ») par un complexe constitué des protéines Drosha et DGCR8 (« microprocessor complex »). Le pre-miARN adopte une structure secondaire de type épingle à cheveux puis est transporté dans le cytosol. Enfin, une enzyme de la famille Dicer clive le pre-miARN en microARNs (Figure 4). Les siARNs endogènes, quant à eux, sont transcrits dans les deux sens sur le génome. Ils forment alors une molécule d’ARN double brin dans le noyau. Cet ARN est exporté ensuite dans le cytoplasme, où il est pris en charge, tout comme les microARNs, par une enzyme de la famille Dicer (Figure 4). Les snoARNs (small nucleolar ARN) sont des petits ARNs non codants très conservés au cours de l’évolution. Ils peuvent être synthétisés directement par l’ARN polymérase de type II, ou ils peuvent être produits suite à l’excision d’un intron de gène codant ou non. Chez les mammifères, les snoARNs sont généralement mono-cistroniques. Au cours de leur maturation, ces ARNs non codants passent par les corps de Cajal où ils sont modifiés chimiquement avant d’être transportés dans les nucléoles. Il existe 2 familles de snoARNs ayant chacune un motif nucléotidique différent : •. Motif C/D (nomenclature SNORD + un nombre). Ces snoARNs contiennent 2. séquences conservées : RUGAUGA (motif C) vers l’extrémité 5’ du snoARN et CUGA (motif D) vers l’extrémité 3’. JR .

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(85) •. Motif H/ACA (nomenclature SNORA + un nombre). La boîte H est une. séquence conservée de type ANANNA, située dans la séquence charnière entre les deux épingles à cheveux du snoARN. Le motif ACA est quant à lui situé dans la queue du snoARN. En général, les snoARNs s’associent à des protéines pour former un complexe ribonucleo-protéique. Ceci va permettre d’entraîner des modifications covalentes de leurs ARNs cibles (ajout d’un groupement 2’-O-methyl ou pseudouridination).. b. Découverte et mise en évidence de la fonction des microARNs Le premier microARN a été découvert en 1993, par Lee et al., chez C.Elegans (Lee et al., 1993). Il s’agit de lin-4, qui est un inhibiteur de lin-14 au cours du développement embryonnaire. Chez C.Elegans, le développement embryonnaire est composé de 4 étapes, nommées L1 à L4. La protéine Lin-14 est essentielle au bon déroulement de l’étape L1 (Ambros and Horvitz, 1984). Cependant, son expression doit être inhibée afin de pouvoir passer à l’étape L2. En effet, si l’expression de lin-14 reste élevée, l’embryon reste en phase L1 (Ambros and Horvitz, 1984). Le microARN lin-4 joue donc un rôle essentiel, dans le contrôle du développement embryonnaire de C. Elegans, en inhibant l’expression de lin-14. Depuis, plus de 24000 microARNs, qui ont des rôles très variés, ont été découverts chez différentes espèces. Parmi ceux là, certains microARNs, comme let-7 qui a été découvert en 2000 chez C.Elegans (Reinhart et al., 2000), sont très conservés au cours de l’évolution (Pasquinelli et al., 2000). La plupart des microARNs sont soumis à une régulation spatio-temporelle et ont des rôles très variés (Ambros, 2004). Ainsi, chez la souris par exemple, le miR-181 est exprimé préférentiellement dans les lymphocytes B, et la surexpression de ce microARN dans les cellules hématopoïétiques entraîne un biais de leur différenciation en lymphocyte B (Chen et al., 2004). Les microARNs jouent également un rôle important dans de nombreuses maladies comme les cancers. C’est le cas notamment des microARNs miR-15 et miR-16, dont l’expression est diminuée dans deux tiers des leucémies lymphoïdes chroniques, suite à la délétion du locus 13q14 (Calin et al., 2002). Dans le cas du syndrome de Tourette, une KI .

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(87) mutation sur le site reconnu par le microARN miR-189, au niveau du gène SLITRK1, entraîne l’apparition de la maladie (Abelson et al., 2005). Comme nous le verrons plus tard, les microARNs ont également des rôles essentiels dans la régulation et le contrôle des cellules ES.. II.2 Mise en évidence du rôle des siARNs et snoARNs dans les cellules souches embryonnaires La présence de siARNs endogènes dans les cellules ES a été mise en évidence en 2008 par Babiarz et al. (Babiarz et al., 2008). Cependant, leurs fonctions restent encore méconnues. Malgré cela, on peut supposer qu’ils ont un rôle essentiel dans le contrôle du devenir des cellules ES car la délétion de Dicer entraîne des dérégulations beaucoup plus importantes, au niveau de l’auto-renouvellement et de la pluripotence des cellules ES, que la délétion de DGCR8 qui impacte uniquement la bio-synthèse des microARNs. Concernant les snoARNs, on a montré que les SNORD 12, 29, 31, 74, 101 et 104 sont fortement exprimés dans les cellules ES de souris. Au cours de la différenciation neuronale, leur expression diminue de 10 à 30 fois (Skreka et al., 2012). Selon les auteurs de l’étude, bien que les rôles de ces snoARNs ne soient pas encore identifiés, ils pourraient être impliqués dans le blocage de la différenciation neuronale des cellules ES. Inversement, SNORD 115 est faiblement exprimé dans les cellules ES mais son niveau d’expression augmente fortement au cours de la différenciation en cellules nerveuses et plus précisément en neurones (environ 100 fois) (Skreka et al., 2012). En effet SNORD 115 est faiblement exprimé dans les astrocytes et oligodendrocytes. De plus, une altération de son fonctionnement serait la cause de maladie comme le syndrome de Prader-Willi.. KJ .

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(89) II.3 Les longs ARN non codants (lncARN). a. Définition Les longs ARNs non codants (lncARN) sont des ARNs dont la taille est supérieure à 200 nucléotides. Ils sont transcrits, tout comme les ARN messagers (ARNm), par l’ARN polymerase de type II. Ils ont également une queue polyA à leur extrémité 3’. Les lncARN sont localisés à différents endroits sur le génome. Ils peuvent être situés : •. Dans les introns de gènes codant pour une protéine.. •. Au même niveau que des exons de gènes codant pour une protéine mais orientés en anti-sens.. •. Entre deux gènes codants pour des protéines.. b. Découverte et mise en évidence de la fonction des lncARNs Le premier long ARN non codant a été découvert en 1990 par Brannan et al. (Brannan et al., 1990). Il s’agit de H19, un gène soumis à empreinte parentale ayant de nombreuses fonctions notamment au cours du développement embryonnaire (Poirier et al., 1991). Depuis, plusieurs longs ARN non codants ont été découverts et étudiés. Il s’avère qu’ils ont des rôles très divers et variés : •. Inactivation du chromosome X (Xist, Tsix) (Brown et al., 1991; Lee et al., 1999). •. Modification de l’empreinte épigénétique (H19, Air) (Brannan et al., 1990; Sotomaru et al., 2002). •. Trans-régulation génétique (HOTAIR) (Rinn et al., 2007). •. Transport nucléaire (Nron) (Willingham et al., 2005). •. Certains lncARNs contiennent des séquences reconnues par des microARNs. Ils peuvent ainsi bloquer ces derniers afin d’empêcher leur action sur leurs ARNm ciblés. Ces lncARNs sont appelés « ARN éponge ».. En 2009, Gutmann et al. ont analysé les marques épigénétiques d’activation de transcription dans 4 lignées différentes de cellules de souris (Guttman et al., 2009). Ils ont KK .

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(91) alors mis en évidence plus de 1200 séquences d’ARN, de taille supérieure à 5kb, potentiellement transcrites mais non traduites. De plus, ces séquences sont très conservées au cours de l’évolution. La fonction de ces longs ARN non codants identifiés reste encore à découvrir. Dans les cellules ES, quelques fonctions de longs ARN non codants ont déjà été identifiées.. II.4 Mise en évidence de la fonction des longs ARNs non codants dans les cellules ES. En 2008, une analyse de micro-array a permis d’identifier 174 lncARNs différentiellement exprimés au cours de la différenciation des cellules ES (Dinger et al., 2008). Parmi ceux là, 12 lncARNs ont un profil d’expression, au cours de la différenciation, semblable aux gènes du noyau de pluripotence Oct4 et Sox2. On peut alors penser que ces lncARNs sont régulés de la même manière que les ARNm des gènes de pluripotence et qu’ils ont un rôle clé dans le maintien des cellules ES en auto-renouvellement. En 2010, Wu et al. ont analysé les marqueurs de régulation épigénétique au niveau des ilots CpG des promoteurs des lncARNs (Wu et al., 2010). Au cours de la différenciation des cellules ES de souris, de nombreux gènes de lncARNs perdent la marque épigénétique répressive H3K27me3 (environ 75%) et sont alors transcrits. Inversement, environ 40% des promoteurs de lncARNs possédant une marque active de transcription (H3K4me3) la perdent au cours de la différenciation. Ce mécanisme de régulation épigénétique est identique à celui régulant l’expression de certains gènes clés dans le maintien des cellules ES de souris comme Nanog par exemple (Villasante et al., 2011). On peut donc supposer que les lncARNs contrôlent les cellules ES de la même manière que ces gènes. L’expression de certains lncARNs est régulée par les gènes du noyau de pluripotence comme le montre l’étude de Sheik-Mohamed et al. en 2010 (Sheik Mohamed et al., 2010). Au cours de leurs recherches, ils ont étudié 2 lncARNs (AK028326 et AK141205) dont l’expression est contrôlée, respectivement, par les gènes Oct4 et Nanog. En effet après l’inhibition d’Oct4, le niveau d’expression du lncARN AK028326 diminue d’environ 70%, tandis qu’après l’inhibition de Nanog, le niveau d’expression du lncARN AK141205 augmente de 2 fois. Ils ont par la suite montré, grâce à des expériences d’inhibition, de surexpression et d’analyse de marqueurs de différenciation par PCR quantitative, que ces KL .

(92) . Figure 5. Interaction entre des lncARNs et le noyau de pluripotence. Les longs ARN non codant AK028326 et AK141205 ont deux actions opposées dans le contrôle des cellules ES : •. Le lncARN AK028326 active les gènes de pluripotence Oct4 et Nanog. Ceci permet alors de favoriser l’auto-renouvellement tout en inhibant la différenciation. L’expression de cet ARN non codant est activée par Oct4. On a alors une boucle de régulation positive entre Oct4 et AK028326.. •. A l’inverse, le lncARN AK141205 favorise la différenciation des cellules ES. Son expression est inhibée par le facteur de transcription Nanog.. KM .

(93) deux lncARNs ont des rôles inverses dans le contrôle des cellules ES. En effet, AK028326 activerait les gènes Oct4 et Nanog et serait impliqué dans l’inhibition de la différenciation trophoblastique. A l’inverse AK141205 permettrait d’induire la différenciation des cellules ES en endoderme (Figure 5). Enfin certains lncARNs interagissent directement avec le gène de pluripotence Sox2 (Ng et al., 2012). Dans cette étude, on a montré que les lncARNs ES1 et ES2 pourraient permettre la formation d’un complexe protéique en fixant les protéines Sox2 et Suz12. Le complexe ainsi formé pourrait alors permettre l’inhibition des gènes cibles du facteur de transcription Sox2 impliqués dans la différenciation neuronale grâce au recrutement du complexe répressif Polycomb (PRC2) par l’intermédiaire de Suz12. L’inhibition des gènes cibles se ferait alors par la mise en place de la méthylation H3K27me3 au niveau de leurs promoteurs.. a. lncARN et inactivation du chromosome X Dans les lignées de cellules ES de souris dérivées à partir d’un embryon femelle, un des marqueurs de l’état naïf de pluripotence est l’absence d’inactivation d’un des deux chromosomes X. Cette inactivation se retrouve dans les cellules dites amorcées comme les cellules ES humaines (Nichols and Smith, 2009). Le long ARN non codant Xist est le principal acteur de l’inactivation du chromosome X. Cet ARN est synthétisé à partir du chromosome X qui sera inactivé. Xist, par l’intermèdiaire de modifications épigénétiques de la chromatine, induit la répression transcriptionnelle du chromosome à partir duquel il sera synthétisé. Dans les cellules ES de souris, Tsix, qui est également un long ARN non codant, est exprimé par les chromosomes X inhibant ainsi l’expression de Xist par l’intermédiaire de modifications épigénétiques. En effet on a montré que l’inhibition de Tsix dans les cellules ES de souris en auto-renouvellement entraîne une forte diminution de la quantité de marques épigénétiques répressives dans la région 5’ de Xist (H3K9me3 et méthylation CpG) et, inversement, on observe une augmentation de la quantité de marques épigénétiques activatrices (H3K4me3 et H3K9ac) (Navarro et al., 2006). KN .

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(95) En 2008, un autre aspect de la régulation de Xist a été découvert (Navarro et al., 2008). Dans cette étude, on a montré que les protéines du noyau de pluripotence, Oct4, Sox2 et Nanog, se fixent directement sur le premier intron du gène Xist, ce qui a pour conséquence de bloquer son expression. En effet l’inhibition de Nanog, et à plus grande échelle celle d’Oct4, entraîne une augmentation de la transcription de Xist (respectivement de 4 et 10 fois). Au cours de la différenciation, la perte d’expression des trois gènes du noyau de pluripotence entraîne une forte augmentation de l’expression de Xist, i.e. jusqu’à 1000 fois plus que dans les cellules ES de souris. La plupart des cellules ES humaines contiennent un chromosome X inactivé. Cependant cette inactivation est instable et peut varier au cours des différents passages en culture. En effet les cellules ES humaines ont tendance à perdre l’expression de Xist au cours du temps. Une étude récente a permis de découvrir un nouvel ARN non codant, Xact (X active coating transcript), recouvrant le chromosome X actif dans les cellules ES humaines (Vallot et al., 2013). Ainsi, dans ces cellules, le chromosome X inactif est recouvert par Xist, tandis que le chromosome actif est recouvert par Xact. Au cours des passages successifs, l’expression de Xist diminue et les deux chromosomes sont recouverts par Xact. Ils deviennent alors actifs. Au cours de la différenciation, l’expression de Xact diminue fortement dès le jour 5, jusqu’à être complètement inhibé au jour 10. Inversement, au cours de la reprogrammation de cellules différenciées en cellules iPS, on observe une forte surexpression de Xact. L’expression du lncARN Xact est donc liée à l’état de pluripotence des cellules ES humaines. Chez la souris, le promoteur de Xact n’est pas conservé et l’ARN n’est pas transcrit. Ceci peut expliquer les différences au niveau des mécanismes d’inactivation du chromosome X entre la souris et l’Homme. Xact est le premier lncARN à être associé à un phénomène d’activation du chromosome. En effet, ces derniers sont généralement associés à des phénomènes de répression.. b. linc-RoR Certains lncARNs sont plus fortement exprimés dans les cellules iPS que dans les cellules ES humaines. Parmi ceux là, on trouve le lncARN linc-RoR (Regulator Of Reprogramming). Les premières analyses effectuées sur cet ARN non codant ont montré qu’il joue un rôle essentiel dans les mécanismes de reprogrammation. En effet, après infection KO .