1.2. Développement, anatomie et fonction de la moelle épinière

INTRODUCTION

neural dorsal. (A’-A’’) Mécanismes cellulaires impliqués dans la neurulation: sous l’influence des signaux de la notochorde, les microtubules des cellules du neurectoderme vont s’étirer, les faisceaux de filaments d’actine se concentrer dans le cytoplasme à l’apex des cellules et ainsi créer un épaississement de la plaque. S’en suivent alors la mise en place de microvillosités et une contraction des faisceaux d’actine, à l’origine du rétrécissement de l’apex des cellules créant l’enroulement de la plaque et des bourrelets neuraux qui finissent par fusionner et former le tube neural (A’). La fermeture du tube neural est facilitée par la différence des jonctions d’adhérences distinctes présentent au niveau des cellules du tube neural (N-CAM/N-cadhérine) et celles de l’ectoderme (L-CAM/E-cadhérine) (A’’).

Adapté de (A) UCLA. Patricia Phelps et (A’ et A’’) mitochondriefleur.free.fr

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

1

I) INTRODUCTION

Avant de décrire mes recherches, je donnerai un aperçu du développement embryonnaire du système nerveux chez les vertébrés, en me focalisant sur les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la différenciation des progéniteurs neuraux dans la moelle épinière et ceux contrôlant la diversification neuronale. J’exposerai ensuite l’état des connaissances sur les gènes Prdm, leur rôle dans le développement embryonnaire et leur implication dans des maladies humaines. Enfin, j’introduirai brièvement les modèles et approches expérimentales utilisés dans ce travail.

1. Développement du système nerveux des vertébrés 1.1. Généralités

Le système nerveux (SN) est un tissu complexe et très structuré. Il est subdivisé en deux principaux sous-systèmes que sont 1) le système nerveux central (SNC), composé de l’encéphale (cerveau, tronc cérébral et cervelet) et de la moelle épinière, et 2) le système nerveux périphérique (SNP), composé de tous les tissus nerveux externe au SNC (nerfs, ganglions, plexus entérique et récepteurs sensoriels). Notre SN s’acquitte de nombreuses tâches complexes dont nous avons plus ou moins conscience. Il possède trois fonctions principales que sont (1) la détection de stimuli internes et externes transmit au SNC via les nerfs sensitifs (fonction sensorielle), (2) l’intégration des informations sensorielles transmises à l’encéphale via les interneurones, c’est à dire l’analyse, l’enregistrement et la décision de répondre aux stimuli (fonction intégrative), et (3) la réponse à l’information sensorielle via une action motrice transmise par les neurones moteurs (fonction motrice). Il est constitué d’une grande diversité de types cellulaires, aux fonctions variées, classés en deux catégories : les neurones et les cellules gliales.

L’ensemble des neurones et des cellules gliales, qui constitue le SNC dérive de la plaque neurale, formée très tôt au cours du développement embryonnaire suite au processus d’induction neurale. Au cours de la neurulation, la plaque neurale s’épaissit, s’enroule sur elle même en formant des bourrelets neuraux qui après fusion, forme le tube neural (TN) (Figure 1). Ce dernier se régionalise ensuite selon l’axe antéro-postérieur (A/P) et dorso-ventral (D/V). A l’intérieur du tube neural, les progéniteurs neuraux vont proliférer, se différencier et donner différents types cellulaires. Les neurones, nouvellement formés, acquièrent progressivement une identité spécifique et migrent vers des régions précises. Durant la

primaires donnent naissance à cinq vésicules secondaires du cerveau: télencéphale, diencéphale, mésencéphale, métencéphale et myélencéphale. Chaque vésicule secondaire se développe en composants spécifiques du système nerveux adulte. La moelle épinière quant à elle provient du tube neural caudale et est divisée en 5 parties: cervicale, brachiale, lombaire, thoracique et sacrée.

Adapté d’après UCLA PE.Phelps (web site)

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

2 migration, les neurones étendent leurs prolongements vers des cibles spécifiques, puis leurs axones forment des synapses avec ces cibles (nerveuses, musculaires ou glandulaires) afin d’établir des connexions et le transfert d’informations entre les différentes parties de l’organisme. D’un point de vue morphologie externe, la partie rostrale (antérieure) du TN va, dans un premier temps, se bomber et former les 3 vésicules primaires du futur encéphale que sont le prosencéphale, le mésencéphale et le rhombencéphale. Ces vésicules primaires vont, dans un second temps, donner naissance aux 5 vésicules représentatives de l’encéphale des vertébrés que sont le télencéphale et le diencéphale (dérivés du prosencéphale), le mésencéphale, le métencéphale et myélencéphale (dérivés du rhombencéphale). Enfin, elles donneront respectivement naissance au cortex, au thalamus/hypothalamus, au tronc cérébral, au pont/cervelet et à la moelle allongée suite à la diversification neuronale. La partie caudale, quant à elle, garde un aspect tubulaire et donne naissance à la moelle épinière qui peut être subdivisée en 5 parties : cervicale, brachiale, thoracique, lombaire et sacrée (Figure 2). A l’intérieur de chacune de ces structures, une autre régionalisation se met en place, avec des neurones distincts selon leur position le long de l’axe dorso-ventral.

Le système nerveux périphérique dérive quant à lui des cellules de la crête neurale et des placodes. Les cellules de la crête neurale sont des cellules embryonnaires multipotentes qui se détachent du toit du TN lors de sa fermeture, qui prolifèrent et migrent dans l’embryon.

Elles sont à l’origine notamment de la majorité des neurones et de toutes les cellules gliales du SNP. Elle donnent aussi d’autres dérivés tels que des os et du cartilage de la tête et des mélanocytes de la peau (Pour Revue ; Bronner-Fraser, 1995 ; Barembaum et Bronner-Fraser, 2005 ; Crane et Trainor, 2006). Les placodes sensorielles crâniennes correspondent à des épaississements de l’ectoderme au niveau de la tête des embryons de Vertébrés. Elles contribuent à la formation des organes sensoriels, de l’adénohypophyse ou des ganglions sensoriels crâniens uniquement. Elles sont à l’origine d’un grand nombre de types cellulaires notamment des récepteurs et neurones sensoriels ainsi que des cellules gliales qui leur sont associées et sont donc indispensables à la formation du système nerveux sensoriel (Le Douarin et al, 1986; Baker et Bronner-Fraser, 2001, Schlosser, 2006, Schlosser, 2014).

1.2. Développement, anatomie et fonction de la moelle épinière

Le TN, récemment fermé, est constitué d’un neuroépithélium pseudo-stratifié, en bordure de la lumière du tube (futur canal de l’épendyme), composés de cellules pluripotentes

Figure 3: Organisation du tube neural et mouvements de migration intercinétiques du noyau des cellules du neuroépithélium. (A) Représentation schématique du tube neural juste après sa fermeture, constitué d’une seule couche de cellules en prolifération. (A’) Division symétrique et mouvements de migration intercinétiques du noyau des cellules. (A’’) Polarité apico-basale des cellules neuroépithéliales dans la ZV. (B) Représentation schématique du tube neural d’un embryon plus tardif avec une zone ventriculaire (ZV) contenant les cellules prolifératives (BrdU+ et PH3+), une zone intermédiaire (ZI) contenant les cellules progénitrices en cours de différenciation et une zone marginale (ZM) contenant les neurones différenciés (Tuj1 ou b-tubulin III positives). (B’) Division asymétrique et mouvements de migration intercinétiques du noyau des cellules dans la ZV. Après division, la 1ère cellule fille reprend un nouveau cycle cellulaire pour augmenter le pool de cellules progénitrices. La 2nd cellule fille entre en phase G0, devient quiescente et migre latéralement pour rejoindre la ZM. (B’’) Représentation schématique d’un neurone en cours de migration vers la zone marginale via une cellule de la glie radiaire.

A’, B’ et B’’ adapté de : http://www.embryology.ch/francais/vcns/histogenese01.html, et A’’ adapté de la thèse d’Emilie Peco.

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

3 (progéniteurs neuraux). Ce neuroépithélium est bordé à son extrémité dorsale et ventrale, de cellules indifférenciées ne proliférant plus, constituant le toit (« Root plate » ; RP) et le plancher (« Floor plate » ; FP) du TN (Figure 3A). Les cellules du neuroépithélium sont polarisées selon un axe apico-basal. Ainsi l’extrémité apicale constitue la surface interne du TN qui entoure le lumen. Le prolongement cellulaire ou pied apical permet l’adhésion des cellules adjacentes entre elles. Cette adhésion est dépendante de jonctions d’adhérence dont l’intégrité repose principalement sur les cadhérines associées à des protéines de liaison, les caténines (Aaku-Saraste et al., 1996). Ces jonctions permettent le maintien de la polarité apico-basale et la structure du neuroépithélium (Chenn et al., 1998; Gotz et Huttner 2005) . La membrane plasmique basale, quant à elle, ne contient pas de jonctions d’adhérences mais des récepteurs aux constituants de la matrice extracellulaire (Gotz et Huttner 2005).

Au cours du cycle cellulaire, les noyaux des cellules en prolifération subissent ce que l’on appelle la migration nucléaire intercinétique. Ce processus est dépendant de la polarité apico-basale des cellules neurales puisqu’il consiste en la migration constante du noyau entre le bord apical et le bord basal de la cellule et ce de manière coordonnée avec les différentes phases du cycle cellulaire (Hollyday, 2001 ; Frade, 2002). Ainsi, les noyaux en phase G1 s’éloignent progressivement de la lumière du TN, pour se localiser dans la partie basale du tube lorsqu’ils entrent en phase S. Ces cellules dites « en phase S » pouvent être mise en évidence par un marquage au BrdU (Bromodéoxyuridine). Les cellules entrent ensuite en phase G2 (noyau migre vers la lumière du TN), puis vont s’arrondir à la surface apicale et initier la phase M caractérisé par un marquage pH3⁺ (Phospho-Histone H3). Ces cellules filles, issues de divisions symétriques, entrent de nouveau en phase G1 et recommence un cycle cellulaire complet (Figure 3A’, 3A’’). Dés l’initiation de la neurogenèse, le mode de division cellulaire va changer. Les cellules neurales vont subir une série de divisions asymétriques aboutissant à la formation d’une part, de cellules filles indifférenciées (qui continuent de proliférer) et d’autre part, de cellules filles possédant une destinée prédéterminée, qui sortent de la phase G1 et entrent en phase G0 s’échappant ainsi du cycle cellulaire. Ces cellules appelées cellules quiescentes ou postmitotiques, vont migrer, perdre leur attachement à la surface apicale et rejoindre la surface externe basale. Le TN est alors composé de deux couches : la zone ventriculaire (ZV) constituée des cellules en prolifération et la zone intermédiaire (ZI) contenant les cellules postmitotiques. La première vague de mitose génère des neurones immatures appelés neuroblastes, qui vont se différencier en neurones, migrer et s’accumuler à la périphérie du TN pour former une nouvelle couche : la zone marginale (ZM) (Hollyday, 2001).

Figure 4: Structure de la moelle épinière. (A) Représentation schématique de la moelle épinière à maturité. Celle-ci est constituée d’une substance grise et d’une substance blanche. La substance grise (au centre) en forme de H, entourant le canal de l’épendyme est constituée des corps cellulaires de neurones. Chaque « aile » présente une corne dorsale sensitive, une corne latérale viscérale et une corne ventrale motrice qui se jettent dans la substance blanche. Celle-ci, en périphérie, est faite de faisceaux verticaux d’axones ascendants et descendants regroupés en cordon. Toutes ses fibres se rejoignent, sortent de la moelle et forment de chaque côté de la moelle une racine antérieure (ventrale) et une racine postérieure (dorsale). La racine postérieure porte un renflement, le ganglion rachidien qui porte les corps cellulaire des neurones sensoriels. Chaque racine dorsale s’associe avec une racine ventrale et forme ainsi un nerf spinal ou rachidien. (B) Diversité neuronale au sein de la moelle épinière. Dessin de Monsieur Ramon Y Cajal (1899) représentant les interactions neuronales (collatérales) dans la moelle épinière de poulet âgé de 15jours (post incubation).

(A) Adapté de :http://passeport.univ-lille1.fr/site/biologie/scbio/Reflexe/; (B) Modified from the photography take from the original.

Drawn on sheep/paper. P.Y.1899. S.R.Y Cajal Institute-CSIC-Madrid Spain.

B

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

4 Ces neurones primaires sont révélés par le marquage du facteur de transcription NeuroM, puis de la βIII-Tubuline pour les neurones différenciés plus tardifs (Figure 3B, 3B’). Les cellules du neuroépithélium initial se transforment progressivement en cellules de la glie radiaire. Celles-ci sont également à l’origine de la formation de neuroblastes suite à leur division asymétrique et sont indispensables à la migration des neuroblastes dans le TN (figure 3B’’ ; Revues : Paridaen et al., 2014 ; Laguesse et al., 2015). Plus tard, elles donnent naissance aux précurseurs des cellules gliales, les glioblastes, à l’origine des oligodendrocytes et des astrocytes. Suite à la régionalisation du TN, la différenciation, la migration neuronale et la mise en place des fonctions neuronales et gliales, la ME embryonnaire laisse place à la ME mature.

1.2.2. Structure interne et diversité neuronale de la moelle épinière

Sur une section transversale de la ME, on distingue deux régions désignées substance grise et substance blanche, autour du canal de l’épendyme contenant le liquide cérébrospinal.

La matière grise, en forme de H ou de papillon, située au centre de la ME, est constituée des corps cellulaires des neurones moteurs (MNs) et intermédiaires ou interneurones (INs). Elle comporte des cornes antérieures motrices et postérieures sensitives qui rejoignent la substance blanche. Celle-ci, située en périphérie, est faite de faisceaux verticaux de fibres myélinisées (axones myélinisés des cellules nerveuses) dont certains sont ascendants et d’autres descendants. Les axones des différents MNs sortent des cornes ventrales, se regroupent entre eux et forment les racines motrices en sortant de la ME. Chaque racine sensitive dorsale, contient un ganglion rachidien (ou spinal) qui renferme les corps cellulaires des neurones sensoriels dérivés des crêtes neurales. Chaque racine sensitive est associée à une racine motrice formant ainsi un nerf spinal (ou rachidien) de chaque coté de la ME. Chaque nerf correspond alors à des territoires précis et déterminés d'innervation de la peau, des muscles, des viscères et des articulations (Figure 4A).

Il existe au sein de la ME des vertébrés des milliers de types neuronaux distincts situés à proximité les uns des autres (Figure 4B). Ces neurones peuvent être regroupés et classés suivant de multiples critères tels que les neurotransmetteurs qu’ils utilisent (neurones excitateurs ou inhibiteurs) ou encore leur localisation selon les axes A/P et D/V et les connexions qu’ils établissent avec leurs cibles (MNs, INs sensoriels et moteurs et leurs sous- types).

Membre

Flanc

PGC LMCl LMC HMC m MMC Dorsal

Membre Ventral

Moelle épinière

Membre

Antérieur Flanc

Branchiale Thoracique Lombaire

Membre Postérieur

Figure 5: Organisation des divers pools de motoneurones en colonnes motrices le long des axes rostro/caudal et dorso/ventral. Les colonnes motrices sont générées dans des positions spécifiques le long de l’axe R/C de la moelle épinière. Les colonnes motrices latérales (LMC) sont générées au niveau brachial ou lombaire, et innervent les muscles des membres. Au niveau thoracique, les colonnes pré-ganglionnaires (PGC) innervent la chaîne ganglionnaire sympathique (scg), tandis que les colonnes motrices hypaxiales (HMC) innervent les muscles intercostaux de la paroi abdominale (flanc).

Les colonnes motrices médianes (MMC) sont présentes tout le long de l’axe R/C de la moelle épinière et innervent les muscles du dos (axial). Ces colonnes sont réparties latéralement dans la partie ventrale de la moelle épinière selon l’axe D/

V, où les colonnes LMC se subdivisent en 2 colonnes fonctionnelles qui innervent les muscles ventraux (LMCm) et dorsaux (LMCl) des membres.

D’après (Murakami et Tanaka, 2011)

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

5 1.2.2.1. Les neurones inhibiteurs et excitateurs

Tous les neurones du SNC sont dotés de milliers synapses définies par une zone de contacts fonctionnelles entre 2 neurones ou entre un neurone et un autre type cellulaire tel que les cellules musculaires. Ces synapses ont pour fonction de transmettre un message nerveux sous forme de potentiel d’action, d’un neurone présynaptique à un neurone postsynaptique.

La composition de ses synapses (neurotransmetteurs et récepteurs) permet de regrouper les neurones en 2 grands types neuronaux: les excitateurs et les inhibiteurs.

Dans le SNC, la majorité des neurotransmetteurs sont des acides aminés. Les synapses des neurones excitateurs contiennent des récepteurs au glutamate, excitateur majeur du SNC associé à l'apprentissage et la mémoire (représentant environ 50% des neurones excitateurs), et des récepteurs à l’acétylcholine, déclenchant la contraction musculaire et l'excrétion de certaines hormones. Dans le système nerveux central, il est entre autre impliqué dans l'éveil, l'attention, la colère, l'agression, la sexualité et la soif. Les synapses des neurones inhibiteurs contiennent en majorité des récepteurs au GABA (acide gamma-aminobutyrique) qui contribue au contrôle de la locomotion, la vision et aussi de l'anxiété, et des récepteurs à la glycine, inhibiteur localisé plus particulièrement dans la moelle épinière.

Bien que ces neurotransmetteurs possèdent des fonctions antagonistes, un même neurone peut produire plusieurs neurotransmetteurs. Au sein de la moelle épinière, les MNs expriment des récepteurs activés par le glutamate, la noradrénaline, la sérotonine et l'acétylcholine. Les INs quant à eux sont principalement inhibiteurs et secrètent du GABA et/ou de la glycine.

Néanmoins, il existe des INs excitateurs qui secrètent du glutamate et des INs modulateurs qui secrètent de l'acétylcholine.

1.2.2.2. Diversité neuronale selon les axes A/P et D/V

Les MNs, générés et localisés dans la partie ventrale de la ME, sont repartis latéralement en MNs distincts selon l’axe D/V et en 5 colonnes motrices principales le long de l’axe A/P. Les MNs qui innervent les muscles du dos sont présent tout le long de l’axe A/P et forment la colonne motrice médiale (MMC). Au niveau thoracique, on observe 2 colonnes distinctes, la colonne pré-ganglionnaire (PGC) composée des MNs qui innervent la chaîne ganglionnaire sympathique et la colonne motrice Hypaxial (HMC) constitués des MNs qui innervent les muscles intercostaux et muscles de la paroi abdominale. Enfin, les MNs innervant les muscles des membres antérieurs et postérieurs forment les colonnes motrices latérales (LMC) dans les parties brachiale et lombaire. Ces dernières sont elles-mêmes subdivisées en LMC médianes (LMCm) et les LMC latérales (LMCl) dont les MNs innervent

mitotiques (zone intermédiaire, ZI) issus de populations de progéniteurs neuraux distincts régionalisés selon l’axe dorso- ventral au sein de la zone ventriculaire (ZV).

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

6 respectivement les muscles ventraux ou dorsaux des membres (figure 5). Enfin, chaque colonne est constituée de MNs spécifiques pour chaque muscle, ce qui augmente encore la diversité des MNs

Les INs dorsaux, générés et localisés dans la partie dorsale de la ME, sont divisés principalement selon l’axe D/V en 6 types d’INs précoces et 2 tardifs respectivement nommés dI1-dI6 et dIL^A et ^B. Nous ne connaissons pas de sous-types d’INs pour l’ensemble de domaines dorsaux mais leur identification est en plein essort. En effet, il a récemment été décrit que les INs dI1 sont subdivisés en 2 sous-populations nommées dI1c et dI1i (Wilson et al., 2008 ; Ding et al., 2012). Les dI3 se subdivisent en dI3 dorsaux (projetant vers la racine dorsale) et les dI3 ventraux projetant sur les MNs (Avraham et al., 2010 ; Bui et al., 2013).

Les INs dI5 se subdivisent en dI5 Phox2a+ et dI5 Phox2a- (Xu et al., 2013). Enfin, les interneurones dI6 peuvent être divisés en dI6 Dmrt3+, dI6 Wt1+ et dI6 ? (Andersson et al., 2012 ; Vallstedt et Kullander 2013). La différenciation neuronale de chaque sous-type d’INs sensoriels et les interactions exactes qu’ils établissent sont encore mal connues.

Nous possédons cependant plus d’informations concernant les INs ventraux. Ces derniers sont classés en 4 types, les INs V0-V3. Ils possèdent tous au moins 2 sous-types d’INs connus plus ou moins caractérisés. Les V0 se subdivisent en V0V, V0D, V0C et V0G ; les V1 en cellules de Renshaw (RC), en INs inhibiteurs ascendants (IaINs) et V1?; les V2 se divisent en V2a, V2b et V2c et enfin les V3 en V3V et V3D. Ces INs forment des interactions inhibitrices et/ou excitatrices entre eux ainsi qu’avec les MNs localisés entre les V2 et les V3 et sont principalement impliqués dans la régulation de la motricité (Figure 6 ; Snapshot : Alaynick et al., 2011). Une étude récente a permis d’identifier et de démontrer la répartition différentielle de ces diverses sous-populations d’INs ventraux selon l’axe rostro-caudal (Francius el al., 2013).

La ME est donc constituée de milliers de types neuronaux distincts provenant d’un nombre restreint de populations progénitrices neuronales elles-mêmes issues d’une population homogène de progéniteurs neuraux qu’est le neuroépithélium du TN.

1.2.3. Fonction de la moelle épinière

La diversité neuronale est essentielle à la fonction de la ME qu’est le transport d’influx nerveux entre les divers organes de l’organisme et le reste du SNC. Pour cela, la ME utilise 3 types de circuits. Le circuit ascendant véhicule les informations sensorielles relatives à la perception de l’environnement provenant de la périphérie via les ganglions spinaux et les cornes dorsales, vers le thalamus et le reste de l’encéphale (le tronc cérébral, le cervelet et le

la moelle épinière, un ou plusieurs interneurones (rouge) relaient l’influx nerveux du neurone sensitif au neurone moteur (bleu), qui transmet à son tour le message nerveux de la moelle épinière à l’effecteur qu’est le muscle qui obéit alors à la commande motrice afin d’éloigner le membre de la source de douleur.

D’après :http://motricitehumaine.free.fr/reflexe.php

Figure 8: Migration et fonctions des interneurones. (A) Au jour embryonnaire E10, six populations d’interneurones dorsaux post-mitotiques sont spécifiées, chacune d’entre elles exprime une combinaison différente de facteurs de transcription. Les sous-types d’INs dorsaux (dI) dI1, dI2 et dI3v et dI6 migrent ventralement, les dI3d dorsalement et les dI4 et un sous-ensemble de cellules dI5 migrent latéralement vers la corne dorsale profonde (lames IV-V). Les corrélations précises entre les domaines de progéniteurs et la position des neurones dans la moelle épinière adulte ne sont pas connus dans la plupart des cas. Trois autres populations de neurones sont générées plus tardivement, à partir du stade E12. Les INs dI1 tardifs expriment Lmx1b et se déposent au fond de la corne dorsale près des cellules dI1 générés plus tôt. Ces 2 types d’INs sont impliqués dans la proprioception. Les INs dIL^A et dIL^B migrent vers les lames superficielles de la corne dorsale, où ils transmettent la détection de la douleur et de la température. (B) Schéma des circuits neuronaux dans une moelle épinière de souris à E18. Les axones des neurones sensoriels du système nerveux périphérique projettent des ganglions de la racine dorsale vers des lames spécifiques dans la corne dorsale et vers la périphérie. La douleur et la température sont détectées par les neurones nociceptifs (rouge), et les messages sont transmis aux couches I et II. Le toucher est quant à lui médié par des mécanorécepteurs (vert) de la périphérie qui se connectent aux lames III-V.

La proprioception, qui est le sens kinesthésique de la position et du mouvement, qui fournit les informations de position des membres et du corps, est médiéé par les neurones sensoriels qui se projettent à travers la corne dorsale jusqu’aux neurones moteurs situés ventralement (en bleu). Les neurones moteurs sont également reliés directement aux muscles en périphérie et contrôle le mouvement (rose). Enfin, les cellules de Renshaw (indiqués en jaune et indiquées par R) reçoivent des entrées excitatrices par les collatérales des neurones moteurs et inhibent en retour les neurones moteurs.

Les chiffres en romains indiquent les lames de la corne dorsale.

Adapté de Caspary et Anderson (2003) avec la permission de Nature Publishing Group, K.Lewis (2006)

A

B

cerveau). Les racines ventrales motrices (ou antérieures) permettent, quant à elles, l’acheminement des influx moteurs, c’est à dire « des ordres » du cerveau vers la périphérie et principalement les muscles, et forment le circuit descendant. Enfin, la ME est le centre de coordination de certains réflexes. Une partie de la substance grise possède un fonctionnement autonome. Ainsi, les informations liées à la perception ne sont pas conduites directement au cerveau mais traitées par la ME, qui répond alors par une action réflexe. C’est le cas du réflexe de retrait (Figure 7), lorsque l’on approche un membre d’une source de chaleur, la ME prend en compte l’information et envoie une réponse directe aux muscles pour s’éloigner de cette source. Les informations sont ensuite transmises au cerveau qui analyse, enregistre et garde en mémoire ces informations.

1.2.3.1. Les interneurones dorsaux et la transmission des informations sensorielles

Au sein de la moelle épinière, les INs des cornes dorsales regroupés en 6 couches distinctes appelées lamina I à VI, constituent le premier relais des informations sensorielles (toucher, chaleur, douleur…) du SNC. Les neurones sensoriels nocicepteurs innervent les INs des couches I-II, tandis que les neurones mécanosensoriels interagissent avec INs des lames III, IV et V. Ces INs spinaux sont divisés en 2 groupes distincts, les INs relais et les INs d’association.

Les INs relais sont impliqués dans les transmissions somatosensorielles avec l’encéphale et sont tous des excitateurs glutamatergiques. Les INs dI1-dI2, principalement commissuraux, innervent leurs cibles en projetant leurs axones de l’autre coté de la ME, c’est à dire controlatéralement. On les retrouve dans la couche I et la corne dorsale profonde. Les INs relais dI3 ispsilatéraux (ventraux) migrent vers et projettent dans la partie ventrale de la ME. Les INs d’association, composés des INs dI4, inhibiteurs (GABA/glycinergiques) et des INs dI5 excitateurs (glutamatergiques), projettent principalement le long des voies ipsilatérales dans les couches III, IV et V et forment un système fermé qui intègre les informations sensorielles dans la ME. Les interneurones tardifs dIL^A, inhibiteurs (GABA/glycinergiques) et dIL^B, excitateurs (glutamatergiques), projettent quant à eux vers les couches I et II (Gross et al, 2002 ; Helms et Johnson, 2003 ; Alaynick et al., 2011) (Figure 8).

C’est un équilibre fragile entre les contrôles excitateurs et inhibiteur, principalement entre les neurones GABA et glutamatergiques, au sein de la corne dorsale, qui détermine finement

Figure 9 : Représentation schématique des circuits neuronaux spinaux impliqués dans le processus de locomotion chez la souris. Les interneurones et motoneurones interagissent selon un patron central pour former un circuit, capable de produire une alternance droite/gauche et flexion/extension, appelé locomotion fictive. Des études génétiques et moléculaires ont défini le ou les rôles de plusieurs classes d'interneurones situés dans le cordon ventral de la moelle. Des souris mutantes dépourvues d’interneurones inhibiteurs V0 Dbx1+, projetant controlatéralement, affichent une alternance gauche/droite désorganisée. L'utilisation de la toxine diphtérique, pour abolir les projections ipsilatérales des interneurones excitateur V2a Chx10+, perturbe également l'alternance gauche/droite; les animaux présentent notamment une cadence plus élevée lors de la transition gauche/droite synchrone lors de la course contrairement aux souris sauvage (WT). La perte ou inactivation des neurones inhibiteurs V1 En+, projetant ipsilatéralement, entraîne un ralentissement marqué de la locomotion, alors que l'inactivation des interneurones excitateur V3 Sim+ projetant controlatéralement perturbe la régularité du rythme. L'inactivation des INs V0c Pitx2+, perturbe la locomotion lors de nage, en raison de l’altération de l’intégration du feedback sensoriel. Les interneurones glutamatergiques Vx Hb9+, projetant ipsilatéralement, sont rythmiquement actifs lors de la locomotion, bien que cette population soit encore très mal définit. Les INs dl4 Ptf1a+ forment des contacts présynaptiques inhibiteurs sur les neurones sensoriels proprioceptives glutamatergiques dans la partie dorsale de la moelle épinière. Enfin, les classes d'interneurones dl3 et dl6 font des liens directs sur les neurones moteurs. Toutefois, l’étude de leurs rôles précis restent encore à approfondir.

D’après Alaynick et al., 2011.

l'intégration correcte des messages sensoriels nociceptifs, proprioceptifs… (Fenselau et al., 2011 ; Bardoni et al., 2013).

1.2.3.2. Les interneurones ventraux et les mouvements de locomotion

Au sein de la partie ventrale de la ME, les interactions spécifiques entre les interneurones excitateurs et inhibiteurs et les motoneurones, forment des circuits neuronaux appelés les CPG (Central Pattern Generators), impliqués dans la locomotion répétitive c’est à dire la marche ou la nage. Cette activité stéréotypée comporte la rythmicité, la vitesse de locomotion, l’alternance gauche-droite, l’alternance des fléchisseurs et des extenseurs et l’alternance des membres antérieurs et postérieurs (Goulding, 2009). Les circuits neuronaux associés à cette activité sont composés principalement des INs ventraux et des MNs. Bien que l’on connaisse moins de chose sur le rôle des INs dorsaux dans la locomotion, leur présence et leur importance dans les circuits de locomotion sont montrées (Figure 9).

Les V0 et V3 sont des INs commissuraux, connus pour être indispensables à l’alternance gauche-droite. En effet, la perte physique fonctionnelle des différentes populations impliquées dans les connexions commissurales inhibitrices induit une perte totale de l’alternance gauche-droite (Kjaerulff et Kiehn, 1997, Lanuza et al,. 2004 ; Goulding, 2009). Les interneurones V3 établissent également un rythme de locomotion solide et équilibré durant la marche de souris (Zhang et al., 2008 ; Grossmann et al., 2010).

Les V1 et V2 sont des INs non-commissuraux ou ipsilatéraux. Les INs V1, notamment les RC et les IaINs sont connus pour réguler la vitesse des mouvements de locomotion chez les vertébrés (Gosgnach et al., 2006). Les RC reçoivent des collatérales (prolongements d’axones) des MNs de la corne ventrale et forment une boucle fermée en émettant une synapse inhibitrice sur les MNs. Les MNs s'autoinhibent donc par l'intermédiaire des RC. Ces différentes connexions permettent aux RC de réguler la transmission de faibles stimulations, la contraction musculaire et l’activité des MNs. Des études récentes, portant sur l’interaction des INs V1 inhibiteurs et des MNs, montrent effectivement que les RC sont indispensables au maintien des MNs, puisque leur perte entraine une dégénérescence précoce des MNs (Ramírez-Jarquín et al., 2013 ; Figure 10). Les V2a (une sous-population des V2) sont des INs excitateurs innervants les V0 ainsi que les MNs, jouants ainsi un rôle dans l’alternance gauche-droite lors de la course (Crone et al., 2008). Les V2b sont des INs inhibiteurs qui projettent directement sur les MNs. De récentes études menées par l’équipe du Prof.

Goulding, ont montré que les dérivés des V2b et des V1 sont des composants indispensables des CPG qui coordonnent l'activité motrice fléchisseurs-extenseurs (Zhang et al., 2014).

Figure 10: La perte des cellules de Renshaw entraine la dégénérescence des motoneurones. Représentation schématique du circuit spinal local contrôlant l’excitation des neurones moteurs (MNs, violets) dans des conditions physiologiques (A), montrant les interneurones Ia inhibiteurs (bleus) reliant les deux cornes ventrales, les cellules de Renshaw (rouges) et les interneurones cholinergiques excitateurs V0c (jaunes). (B) Une augmentation de l’excitabilité des neurones moteurs due à la perte des cellules de Renshaw (roses), peut conduire à une dégénérescence des MNs.

D’après Ramirez-Jarquin et al., 2013

1.2.3.3 Lésions et maladies associées à la moelle épinière

Une dérégulation des circuits neuronaux dorsaux et/ou ventraux ou tous types de lésions de la ME peuvent être associés à des pathologies tels que : l’hyperalgésie, des maladies neuromusculaires (ex : Parkinson), la paralysie totale ou partielle des membres... Par exemple, des études récentes portant sur la sclérose latérale amyotrophique ou SLA, caractérisée par la dégénérescence des MNs, suggère que les circuits neuronaux inhibiteurs et notamment les RC pourraient être utilisés comme cibles pharmacologiques pour le traitement de cette maladie (Mazzocchio et al., 2010 ; Ramírez-Jarquín et al., 2013). La perte ou l’altération des neurotransmetteurs et/ou de la balance entre les neurones excitateurs (ex : Glutamatergiques) et inhibiteurs (ex : GABAergiques) au sein du SNC peuvent également être associée à certaines maladies. Par exemple, la "maladie d'Alzheimer" est associée à un manque d'acétylcholine dans certaines régions du cerveau. Le glutamate serait aussi associé à cette maladie dont les premiers symptômes se font sentir au niveau de la mémoire. La perte de dopamine entraîne la rigidité musculaire typique de la maladie de Parkinson. Une augmentation du niveau de GABA dans le cerveau par l’utilisation de drogues est prescrite pour le traitement de crises d'épilepsie et pour calmer les tremblements associés de la maladie d'Huntington, mais également pour calmer l’anxiété. Enfin, la noradrénaline joue un rôle dans les troubles de l'humeur comme la maniaco-dépression.

Une meilleure compréhension des programmes transcriptionnels contrôlant la prolifération, la différenciation, l’identité neuronale et la mise en place de ces circuits neuronaux est donc indispensable à l’amélioration voir la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour restaurer ou activer ces circuits neuronaux dans des cas de lésion de ME ou de maladies neuromusculaires.

1.3. Mécanismes moléculaires contrôlant la balance entre prolifération et différenciation des progéniteurs neuraux

A la fermeture du TN, les progéniteurs neuraux prolifèrent de façon intense. Une balance parfaite, entre la prolifération et la différenciation des progéniteurs dans le temps et l’espace, est nécessaire pour le maintien d’un pool de progéniteurs indispensable au bon développement du SNC. Le contrôle de la prolifération, qui permet une coordination entre la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale, dépend de la polarité apico-basale des progéniteurs, de l’orientation des divisions cellulaires et de la position du noyau au sein des progéniteurs. La voie de signalisation Notch et de nombreux facteurs de transcription dont les facteurs proneuraux ainsi que les régulateurs du cycle cellulaire tels que des cyclines, des

Figure 11. Les divisions symétriques/asymétriques sont déterminées par l’orientation du fuseau mitotique et l'héritage de déterminants cellulaires. (A, B) Les division symétriques donnent 2 progéniteurs neuraux tandis que les divisions asymétriques engendrent un progéniteur neural et une cellule se différenciant en neurone. (C) L'orientation du fuseau dans la division symétrique versus asymétrique est régulée par des protéines centrosomales et les complexes protéiques d’orientation du fuseau dans les divisions verticales et obliques des progéniteurs des vertébrés. (D) Les déterminants cellulaires peuvent être équitablement (symétrique, gauche) ou inégalement (asymétrique, droite) répartis entre les cellules filles. (E, F) Exemples d'asymétries entre les cellules filles qui ont été produites par héritage asymétrique des différents centrioles ± âgées et de la membrane ciliaire (E) et de la protéine PAR3 et de divers composants de la voie de signalisation Notch (F).

D’après Paridaen et Huttner , 2014.

kinases et leurs inhibiteurs… jouent également un rôle important dans le contrôle de la neurogenèse. Ces différents facteurs sont décrits ci-dessous.

1.3.1. La polarité apico-basale, l’orientation du fuseau mitotique et les divisions symétriques/asymétriques des progéniteurs neuraux

Comme nous l’avons vu précédemment, les progéniteurs neuraux du TN sont des cellules hautement polarisées selon un axe apico-basal (cf :1.2.1.). Chacun d’entre eux donne naissance à 2 nouveaux progéniteurs par division symétrique (ou renouvellement), ou à un progéniteur neural et à un neurone par division asymétrique (Figure 11A et 11B). Ces 2 types de divisons cellulaires sont étroitement liés à l’orientation des fuseaux. En effet, lorsque le fuseau mitotique est aligné avec la membrane plasmique, le sillon de division divise et réparti équitablement des déterminants cellulaires présents dans les cellules filles, c’est la division planaire (Figure 11C-D, panel de gauche). Lors de la neurogenèse, l’axe du fuseau mitotique est légèrement modifié et engendre une division asymétrique des déterminants cellulaire et donc du progéniteur, c’est la division oblique (Figure 11C-D, panel de droite).

La polarité apico-basale des progéniteurs est définit principalement par un « domaine apical » contenant des jonctions d’adhérences (cellule-cellule), des protéines de polarité (Par3, PAR6, et aPKC), des kinases (RhoA et Rac1) ainsi que les Rho GTPases ou encore des protéines associées aux centrosomes et au maintien des fuseaux mitotiques tels que CDK5rap2, Ndel1 ou encore la Dynéine. D’autres facteurs très importants dans la mise en place du fuseau mitotique et donc pour la balance division symétrique/asymétrique dépendent également du

« domaine apical ». En effet, les progéniteurs possèdent un cil primaire au sein du « domaine apical » (capteur de signaux extracellulaire provenant du liquide céphalorachidien), dont la dissolution avant l’entrée en mitose est indispensable pour la mise en place des centrosomes au niveau du fuseau mitotique. Chaque fuseau possède alors 2 centrosomes, constitué de 2 centrioles : un ancien de la cellule mère qui porte les protéines d’ancrage au fuseau mitotique et de ciliogenèse, et un nouveau de la cellule fille. L’altération des protéines liées au centrosome induit une altération de la prolifération au détriment de la neurogenèse. L’héritage asymétrique des centrosomes et du cil primaire influence donc la destinée cellulaire des progéniteurs (Figure 11D-E ; Revues : Paridaen et al., 2014 ; Laguesse et al., 2015).

Enfin, lors de la neurogenèse, la division asymétrique se caractérise, entre autre, par la répartition inégale de Par3 qui se fixe à Numb (inhibiteur de la voie Notch). Cette fixation induit alors l’activation de la voie Notch au sein de la cellule fille où Numb est exprimé en majorité c’est à dire dans la cellule destinée à rester un progéniteur. La seconde cellule fille

Figure 12: Fonction des facteurs proneuraux chez les invertébrés et les vertébrés. Les gènes proneuraux sont nécessaires et suffisants pour engager des cellules progénitrices vers la différenciation en un type neuronal particulier, notamment via la voie de signalisation Notch. Chez la drosophile, les gènes proneuraux sont d'abord exprimés dans des cellules ectodermiques quiescentes qui ont à la fois la faculté des donner des dérivés ectodermiques et neuronaux.

L'activité proneurale résulte dans la sélection des progéniteurs qui se sont engagés vers une destinée neuronale mais restent multipotentes puisqu’ils génèrent les progéniteurs des organes sensoriels donnant naissance à des neurones, des cellules gliales et d'autres types de cellules non-neuronales, et quelques neuroblastes du système nerveux central générant également des neurones et des cellules gliales. Les progéniteurs des systèmes nerveux central et périphérique ne commencent à se diviser une fois l'expression des gènes proneuraux diminuée. Chez les vertébrés, en revanche, les gènes proneuraux sont d'abord exprimées dans des cellules neuro-épithéliales qui possèdent déjà une destinée neuronale et sont capables de s’autorenouveller. L'activité proneurale engendre la génération et la délamination des progéniteurs limitées à une destinée neuronale ou gliale et qui ont un potentiel mitotique limité.

Adapté d’après Bertrand et al., 2002

Figure 13: Classification des gènes proneuraux. Arbre phylogénétique des facteurs de transcription bHLH neuronaux de drosophile (bleu) et de souris (rouge). Ce dendrogramme a été créé à partir de l’alignement des régions bHLH des différentes protéines en utilisant X Clustal 2.0.12. Les autres noms (alias) sont donnés entre parenthèses.

D’après Lai et al., 2013

(Par3±) sort alors du cycle cellulaire et se différencie via l’inhibition de la voie Notch et l’expression de facteurs proneuraux (cf 1.3.3.1) tels que Neurogenine2 (Ngn2/Neurog2) (Figure 11D-F ; Revues : Paridaen et al., 2014 ; Laguesse et al., 2015).

1.3.2. La migration nucléaire intercinétique

La migration nucléaire intercinétique (cf :1.2.1.) permet l’organisation d’un neuroépithélium pseudostratifié au sein de la zone ventriculaire, c’est à dire de l’organisation d’un maximun de cellules en prolifération (progéniteurs neuraux) dans un espace réduit.

Toute perturbation de ces mouvements de migration nucléaire intercinétique induit des défauts de neurogenèse. Ces défauts seraient liés à des modifications d’activité de la voie Notch (cf 1.3.3.2.), un gradient d’activité existant à travers l’épaisseur du neuroépithélium (Del Bene et al., 2009). Cet effet est contrôlé par la polarité apico-basale et l’orientation du fuseau mitotique (cf 1.3.1).

1.3.3. L’inhibition latérale

L’équilibre prolifération/différenciation neuronale dépend de divers mécanismes impliquant des interactions intercellulaires et particulièrement de l’inhibition latérale nécessitant des signaux extrinsèques et intrinsèques tels que la voie de signalisation Notch, les régulateurs négatifs (SoxB1, Hes et Id) et positifs (les gènes proneuraux) de la différenciation cellulaire.

1.3.3.1. Les gènes proneuraux

Un gène est dit « proneural » lorsqu’il est nécessaire et suffisant pour engager les cellules progénitrices vers la différenciation en un type neuronal particulier. Les premiers gènes proneuraux ont été décrits chez la drosophile. Ils sont au nombre de 5, 4 gènes formant le complexe achaete-scute et le gène atonal. Ils codent pour des facteurs de transcription (FT) de type bHLH (basic Helix-Loop-Helix). Ces protéines forment des complexes hétérodimériques avec les protéines E (protéines bHLH ubiquitaires). La majorité de ces complexes sont des activateurs transcriptionnels. Chez la drosophile, les gènes proneuraux s’expriment au sein d’une cellule ectodermique quiescente qui à la capacité de donner des dérivés ectodermiques mais également neuronaux. La fonction proneurale de ces gènes se résume donc en la sélection de progéniteurs qui s’engageront vers une destinée neuronale tout en restant multipotentes (précurseurs des neurones, cellules gliales…). Ces gènes proneuraux possèdent des orthologues tel que les gènes Neurogénine (Ngn/Neurog), Ascl

Figure 15: Voie de signalisation Notch. Les protéines NOTCH sont synthétisées sous forme de précurseurs qui subiront divers clivages et seront transportés à la membrane plasmique où ils résident sous forme d’hétérodimères. L’interaction des récepteurs NOTCH avec leurs ligands, conduit à une cascade de clivages protéolytiques. Le premier clivage est médié par la TACE (facteur de nécrose tumorale-alpha-convering enzyme/métalloprotéinase), suivie d'un deuxième clivage par l'activité de la gamma-sécrétase PS (présénilines), qui libère le domaine cytoplasmique intracellulaire des récepteurs Notch (NICD). Ce domaine libéré entre dans le noyau et se lie au facteur de transcription (CSL), qui déplace les co-répresseurs (CoR) et recrute des co- activateurs (CoA), conduisant à l'activation de la transcription de gènes cibles en aval.

D’après Radtke et Raj, 2003

A B

Figure 14: Structure des récepteurs NOTCH et leurs ligands. (A) Chez la drosophile, on retrouve un seul récepteur Notch (dNotch) et 4 chez les vertébrés appelés NOTCH1 à NOTCH4. Le domaine extracellulaire de ces récepteurs possède 3 domaines « LIN repeat » riche en cystéine (vert clair), et un nombre variable de répétitions de type EGF (vert foncé). La partie cytoplasmique du récepteur contient un domaine RAM, deux signaux de localisation nucléaire (NLS), une répétition de domaines ankyrine (ANK repeat), et un domaine PEST (domaine de stabilisation de la protéine). dNotch, NOTCH1 et NOTCH 2 possèdent également un domaine TAD (transactivation). (B) Il existe 2 ligands dNotch nommé Delta (Dl) et Serrate (Ser). Il y en a 5 chez les vertébrés: deux homologues de Serrate: Jagged1, Jagged2 (JAG1-2) et trois homologues de Delta: Delta-like1 (DLL1), Delta-like3 (DLL3), et Delta-like4 (Dll4). Tous les ligands ont un domaine extracellulaire appelé DSL (Delta, Serrate, et LAG-2) impliqués dans la liaison au récepteur associés à des répétitions de type EGF. Ser et JAG1-2 abritent également un domaine riche en cystéine (CR).

D’après Radtke et Raj, 2003

NICD︎

(Mash/Xash,Cash), NeuroD ou encore les Olig chez les vertébrés. Comme chez la drosophile, ces FT de type bHLH forment des complexes hétérodimériques et sont impliqués dans la différenciation neuronale. Cependant ils s’expriment au sein d’un progéniteur neural prédéfinit capable de s’autorenouveler, qui ne peut donner naissance qu’à un neurone ou une cellule gliale (Bertrand et al., 2002 ; Lai et al., 2013 Figure 12 et 13). Une des cibles principales des gènes proneuraux est la voie de signalisation Notch, via l’activation de l’expression de ses ligands. Cette faculté est intimement liée au mécanisme d’inhibition latérale.

1.3.3.2. La voie Notch

La voie Notch est un système de communication entre 2 cellules juxtaposées (via le récepteur NOTCH) impliqué dans la régulation de nombreux processus de différenciation cellulaire tels que la neurogenèse ou la gliogenèse. Cette voie de signalisation est retrouvée chez la plupart des organismes pluricellulaires et est très conservée au cours de l’évolution.

Chez la drosophile, le gène dNotch code pour un récepteur transmembranaire appelé NOTCH, qui possède 2 ligands membranaires distincts : Delta (Dl) et Serrate (Ser). Chez les mammifères, on dénombre 4 gènes Notch, codant pour 4 récepteurs (Notch1-4) activés par 5 ligands également membranaires regroupés en 2 familles : les Delta-Like (DLL1, 3 et 4) et les Serrates like (Jagged 1 et 2). Malgré ces différences, la voie de signalisation Delta/Notch et le mécanisme d’inhibition latérale sont conservés (Bertrand et al., 2002 ; Radtke et Raj, 2003 ; Baladron et al., 2005 ; Figure 14A-B).

L’inhibition latérale est un mécanisme de rétrocontrôle qui permet, à partir d’une population cellulaire homogène, de produire deux populations différentes.

Dans la plaque neurale puis le tube neural des vertébrés, l’expression des gènes proneuraux est initiée dans une population homogène de cellules neurales qui sont équivalentes en terme d’expression des gènes proneuraux, des ligands et récepteurs Notch.

L’interaction entre un ligand Delta/Jagged et le récepteur Notch de cellules adjacentes induit une cascade d’événements intracellulaires aboutissant à l’inhibition temporaire de la différenciation. En effet, le ligand membranaire Delta/Jagged, présent à la surface d’une cellule, va tout d’abord entrer en contact avec les motifs extracellulaires EGF-like (Epithelial Growth Factor-like) des protéines Notch1 des cellules avoisinantes. Dès lors, la partie intracellulaire du récepteur de NOTCH (NICD) va subir un clivage protéolytique et s’associe avec une protéine cytoplasmique appelée RBP-J (Recombining Binding Protein suppressor of hairless), un homologue de Su(H) (suppressor of hairless) acteur majeure de la

Figure 16: Mécanisme d’inhibition latérale au cours de la neurogenèse. Représentation schématique de l’implication de la voie Notch dans le maintien de l’équilibre entre prolifération et différenciation neuronale par le mécanisme d’inhibition latérale. Durant la neurogenèse, les cellules du neuroépithélium expriment le récepteur NOTCH (jaunes et rouges) et un de ses ligands (Delta ou Jagged; verts) à des niveaux identiques. Par le mécanisme de l’inhibition latérale, une boucle de régulation se met en place entre les cellules voisines et provoque une augmentation de l’expression de Delta/Jagged par les gènes proneuraux et également une répression de l’expression des gènes proneuraux par l’activation de la voie Notch. En conséquence, une légère augmentation de l’activité des gènes proneuraux dans une cellule entraine la répression de l’expression des gènes proneuraux dans les cellules adjacentes. L’expression élevée des gènes proneuraux dans la cellule où elle est initiée (cellule de droite), induit un programme génétique conduisant la cellule vers sortie de cycle et la différenciation neuronale. En effet, les gènes proneuraux induisent l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la sortie de cycle (par exemple les CKIs) et la différenciation neuronale. Dans la cellule voisine (cellule de gauche), l’activation de la voie Notch induit la répression de l’activité proneurale et inhibe la différenciation neuronale.

D’après C. Francius, 2007

vont naître les futurs neurones primaires, les domaines proneuraux (triangle bleu). L’activation de la voie de signalisation Delta/Notch combinée à l’action des gènes neurogéniques situés en aval des gènes proneuraux permet la sélection spécifique des cellules destinées à se différencier en neurones primaires et empêcher les autres cellules de devenir des neurones. Cette restriction du nombre de futurs neurones (traits discontinus) est appelée l’inhibition latérale. (B) Hybridation in situ montrant des embryons de Xenopus laevis vue dorsal au stade neurula marqué par la sonde Epi-K, Sox2, xNgn1 ou N-Tubulin spécifique de l’ectoderme, du neurectoderme, des régions proneurales et des neurones primaires respectivement. (C) Modèle d’une cascade de régulation de la différenciation neurale précoce. Les facteurs de transcription

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

13 voie Notch chez la drosophile. Ce complexe est alors transloquédans le noyau où il entre en compétition avec les répresseurs transcriptionnels présents sur l’ADN (Figure 15). Cette compétition va permettre l’expression de gènes dits anti-neuraux plus particulièrement les gènes Hes1 et 5 (Bertrand et al., 2002; Guillemot, 2007).

Ces gènes, ainsi que ceux de la famille SoxB1 (Sox1, 2 et 3) présents dans tous les progéniteurs sans exception (Bylund et al., 2003; Graham et al., 2003; Pevny et Placzek, 2005) et les protéines Id (inhibitor of differenciation), sont capables de réprimer l’expression et l’activité des facteurs proneuraux. Ce réseau de protéines inhibe donc l’engagement des cellules dans leur phase de différenciation.

L’inhibition latérale Delta/Notch induit une boucle de régulation entre ces cellules et va induire une légère augmentation de l’expression de Delta définissant ainsi une cellule progénitrice. Cette dernière exprime fortement Delta à sa surface et va induire la voie Notch des cellules adjacentes qui exprimeront alors une faible quantité de ligand Delta. Ce déséquilibre induit donc, dans la cellule progénitrice, une levée de l’inhibition des gènes proneuraux qui vont alors promouvoir l’expression des inhibiteurs du cycle cellulaire et de gènes spécifiques des jeunes neurones postmitotiques tel que NeuroM. Ce progéniteur va ensuite poursuivre sa différenciation pour donner naissance à un neurone spécifique (Figure 16).

Chez le xénope, tous ces évènements sont très précoces. Au stade plaque neurale (st.13), les premières cellules à sortir de leur cycle de division et à entamer leur différenciation en neurones primaires sont déjà visibles. On les distingue par un marquage de la N-tubuline, permettant déjà la mise en évidence de 3 bandes de neurones primaires localisées de part et d’autres de la ligne médiane de l’embryon, précurseurs des neurones sensoriels, des INs et des MNs (Figure 17A, B et C).

1.3.4. Régulation du cycle cellulaire

Pour se différencier, une cellule doit donc sortir de son cycle cellulaire et entrer en quiescence. Pour comprendre ce phénomène, il faut tout d’abord comprendre les évènements de la division cellulaire.

1.3.4.1. Phases du cycle cellulaire, points de contrôle et complexes Cycline/CDK

Le cycle cellulaire constitue l’ensemble des phases que subit une cellule mère pour donner naissance à 2 cellules filles identiques ou non (Meijer, 2003). Il existe 4 phases

Synth èse

R T

S

G0

Réplication de l’ADN Phase de croissance 2

Préparation à la division

Phase de croissance 1 Préparation à la Réplication

Quiescence

Figure 18: Phases et points de contrôle du cycle cellulaire. Le cycle cellulaire se divise en deux grandes phases : l’interphase (G1,S,G2) et la mitose (M) au terme de laquelle une cellule mère donne naissance à (1) à deux cellules filles génétiquement identiques entre elles, qui recommencent à leur tour un cycle ou (2) à une cellule fille réalisant un nouveau cycle cellulaire et à une cellule fille destinée à se différencier qui entre en phase G0, phase de quiescence. Chaque phase du cycle est régulée par divers points de contrôle: le point R qui régit l’entrée en phase G0 ou l’entrée dans un nouveau cycle cellulaire, le point S et le point T qui permettent le contrôle de la viabilité de la réplication et de la composition de l’ADN et enfin le point A, où la cellule vérifie que les chromatides sœurs sont bien accrochées au fuseau mitotique afin de réaliser un mitose parfaite.

Adapté d’après Hardwick et al., 2015

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

14 principales dans le cycle cellulaire : la phase G1 (1^ère phase de croissance, préparation à la réplication), la phase S (phase de réplication de l’ADN) et la phase G2 (2^nd phase de croissance, préparation à la division) forment l’interphase et la phase M, la phase de la division cellulaire ou mitose. Ces phases sont réalisées dans cet ordre précis et inchangeable et chaque phase ne peut être initiée que si la précédente s’est parfaitement déroulée. Il existe une autre phase appelée phase G0 qui correspond à la phase de sortie du cycle cellulaire. Les cellules en phase G0 ne se divisent plus et sont appelées cellules quiescentes.

Chaque transition d’une phase à l’autre nécessite le franchissement de points de contrôle de la qualité du cycle appelés « CheckPoint ». Ainsi, il existe 4 points de contrôle.

Durant l’interphase, la cellule contrôle si sa croissance est correcte, si son ADN est répliqué correctement en une seule copie et si ce dernier n’a pas subit de lésions trop importantes, via le point R (Restriction CheckPoint) en phase G1, le point S (Replication CheckPoint) en phase S et le point T (DNA Damage CheckPoint) en phase G2. Durant la mitose, au moment de l’anaphase (point A), la cellule vérifie que les chromatides sœurs sont bien accrochées au fuseau mitotique de sorte qu’elles puissent être ségrégées en 2 pools identiques pour les 2 cellules filles (Figure 18).

Le déclenchement, l’avancée et la succession des diverses phases du cycle cellulaire nécessitent la formation, l’activation et l’inactivation séquentielle de divers régulateurs du cycle cellulaire. Ces derniers forment des complexes composés de cyclines et de protéines kinases cycline dépendante (CDK), spécifiques de chacune des phases (Figure 19), dont l’activité varie au cours du cycle. La formation et l’activité de ces complexes Cycline/CDK sont finement régulées par (1) l’alternance entre la synthèse au cours du cycle et la dégradation des cyclines dans le protéasome après ubiquitination, (2) par des modifications post-traductionnelles tels que les mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation des CDK par diverses kinases et phosphatases, et (3) par interaction physique avec des inhibiteurs de CDK, les CKI.

1.3.4.2. Régulateurs du cycle cellulaire et différenciation neuronale

Une cellule prend la décision de se diviser ou de se différencier très tôt en phase G1, avant le point R. Si le point R est passé, la cellule continue son cycle et se divise.

L’engagement dans la différenciation est quant à lui accompagné d’une sortie du cycle cellulaire et donc de l’entrée en phase G0. La modulation des régulateurs du cycle cellulaire contrôle la durée du cycle cellulaire qui est intimement liée à la différenciation neuronale. En effet, l’élongation de la phase G1 induite par la diminution de l’activité des CDK in vitro et in

Figure 19: Facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la différenciation neuronale. (A) Différents complexes Cyclines/CDK assurent la succession harmonieuse des différentes phases du cycle cellulaire et sont la cible de différents inhibiteurs, notamment les CKI (les Inhibiteurs de CDK), qui régissent la sortie du cycle cellulaire et l’entrée en phase G0 des cellules destinées à la différenciation neuronales. Les CKI sont répartis en 2 familles les INK et les KIP/CIP qui bloquent les complexes cycline/Cdk indispensables à l’avancée de la phase G1 et à l’entrée en phase S. Les CDK et les CKI régulent également l’expression de facteurs de transcription impliqués dans la neurogenèse tels que Ngn2/Sox2/Ascl1/

NeuroD. (B) Fluctuation de l’expression des facteurs de transcription Pax6 et Ngn2 au cours de la sortie du cycle et de la différenciation neuronale.

Adapté d’après Hardwick et al., 2015 et Bel-Vialar et al., 2007

Pax6

Pax6

NeuroD

Pax6

Ngn2

NeuroD

B

Sox2

Neurogenèse Gliogenèse Stabilisation

CDK

Phosphorylation

Ascl1 Myt1 NeuroD Cyclines

Ngn2 p15, p16, p18, p19

INK (inhibiteurs de CDK)

P21, p27, p57 CIP/KIP (inhibiteurs de CDK)

CyclineE/CDK2 CyclineA/

CDK2 CyclineA/

CDK1

CyclineB/

CDK1

CyclineD/CDK4-6

I. INTRODUCTION 1. Développement du système nerveux des vertébrés

15 vivo est nécessaire et suffisante pour induire la différenciation neuronale. Inversement, une phase G1 raccourcie par la surexpression des complexes CyclineD/CDK4-6 ou CyclineA/CDK2, inhibe la différenciation neuronale. Enfin, la surexpression du CKI, p27^Xic1 est également responsable de l’élongation de la phase G1 qui engendre alors la différenciation neuronale (Revue : Hindley and Philpott, 2012 ; Hardwick et al., 2015).

Les CKI sont divisés en 2 familles : les INK4 composés des protéines p15^INK4a, p16^INK4b, p18^INK4c et p19^INK4d et les CIP/KIP incluant les protéines p21^Cip1, p27^Kip1/Xic1 et p57^Kip1. Les CKI induisent la sortie du cycle cellulaire en inhibant les complexes Cycline/CDK impliqués dans la phase G1 (CyclineD/CDK4-6) et le point R (CyclineE- A/CDK2) (Figure 19A). En effet, les INK4 bloquent la formation des complexes en se fixant avec les CDK4-6 tandis que les CIP/KIP interagissent avec leurs complexes Cycline/CDK cibles et inhibent leur activité (Revue : Hindley and Philpott, 2012 ; Hardwick et al., 2015).

Chez le xénope, la surexpression de p27^Xic1 est nécessaire et suffisante pour induire la différenciation neuronale (Vernon et al., 2003).

1.3.4.3. Facteurs de transcription et dynamique du cycle cellulaire

La capacité des CKI et des CDK à induire et inhiber respectivement la différenciation neuronale peut également passer par un mécanisme cycle-cellulaire indépendant, via la régulation de facteurs de transcription. En effet, p57^Kip2 régule l’activité transcriptionnelle des gènes Ascl1 et NeuroD et contrôle ainsi la neurogenèse et la gliogenèse (Tury et al., 2011).

p27^Xic1, quant à lui, régule l’expression du gène Sox2 en se liant sur son promoteur (Li et al., 2012) et contrôle l’activité du facteur proneural Ngn2 en le stabilisant dans l’embryon de xénope et le cerveau des mammifères (Vernon et al., 2003 ; Nguyen et al., 2006).

Inversement, les CDK sont capables de phosphoryler la protéine NGN2. L’état de phosphorylation de NGN2, qui dépend de la durée de son exposition aux CDK, limite son interaction à l’ADN, bloque la transcription de ses gènes cibles NeuroD, Myt1 et donc la différenciation neuronale (Ali et al., 2011). Le même processus est observé pour ASCL1 (Ali et al., 2014). Les facteurs proneuraux servent donc en quelque sorte de rhéostat pour sentir le niveau d’activité des CDK (Figure 19A).

Les gènes proneuraux interviennent également dans la sortie du cycle et la différenciation neuronale en contrôlant l’expression de divers régulateurs du cycle cellulaire.

Ainsi, Ascl1, Ngn1 et NeuroD activent l’expression de p27^Kip1. Ascl1 régule également le cycle cellulaire en induisant l’expression des gènes Cdk2 et E2F1. Ngn2 quant à lui, induit indirectement les cyclines régulatrices de la transition G1/S (Hardwick et al., 2015). D’autres