Le cuivre influence le stress oxydatif et l'inflammation associés à la mucoviscidose et régule la barrière jonctionnelle bronchique saine via la protéine prion cellulaire (PrPC)

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Le cuivre influence le stress oxydatif et l’inflammation

associés à la mucoviscidose et régule la barrière

jonctionnelle bronchique saine via la protéine prion

cellulaire (PrPC)

Amal Kouadri

To cite this version:

Amal Kouadri. Le cuivre influence le stress oxydatif et l’inflammation associés à la mucoviscidose et régule la barrière jonctionnelle bronchique saine via la protéine prion cellulaire (PrPC). Biochimie, Biologie Moléculaire. Université Grenoble Alpes, 2017. Français. �NNT : 2017GREAV080�. �tel-01744341�

THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE LA COMMUNAUTE UNIVERSITE

GRENOBLE ALPES

Spécialité : CSV/CHIMIE BIOLOGIE Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Amal KOUADRI

Thèse dirigée par Le Dr. Mohamed BENHAROUGA

Préparée au sein du Laboratoire de Chimie et Biologie des

Métaux

Dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

Le cuivre influence le stress oxydatif et

l’inflammation associés à la

mucoviscidose et régule la barrière

jonctionnelle bronchique saine via la

protéine prion cellulaire (PrP

₎

Thèse soutenue publiquement le «15 décembre 2017», Devant le jury composé de :

Dr. Jean-Jacque FEIGE

DR-INSERM, Grenoble, Président

Dr. Lhousseine TOUQUI

DR-Pasteur, Paris, Rapporteur

Pr. Sophie THENET

DR-EPHE, Paris, Rapporteur

Dr. Christelle CORAUX

CR-INSERM, Reims, Examinateur

Dr. Nadia CHERRADI

CR-INSERM, Grenoble, Examinateur

Dr. Mohamed BENHAROUGA

Le cuivre influence le stress oxydatif et

l’inflammation associés à la mucoviscidose et

régule la barrière jonctionnelle bronchique saine

via la protéine prion cellulaire (PrP

c

₎

Université Grenoble Alpes

École doctorale Chimie et Sciences du vivant

Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (LCBM)

Équipe Biologie des Métaux (BioMet)

CEA Grenoble

Thèse de doctorat en Sciences de la Vie

Le cuivre influence le stress oxydatif et

l’inflammation associés à la mucoviscidose

et régule la barrière jonctionnelle

bronchique saine via la protéine prion

cellulaire (PrP

c

₎

Amal Kouadri

Encadrant Dr. Mohamed BENHAROUGA

Le cuivre influence le stress oxydatif et l’inflammation associés à la mucoviscidose et régule la barrière jonctionnelle bronchique saine via la protéine prion cellulaire (PrPc₎

Amal Kouadri © Automne 2017

Thèse de doctorat en Sciences de la Vie

Directeur de thèse : Dr. Mohamed BENHAROUGA

Université Grenoble Alpes

École doctorale Chimie et Sciences du vivant

Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (LCBM) Équipe Biologie des Métaux (BioMet)

CEA Grenoble 17 rue des martyrs

Remerciements

Je tiens à remercier tout d’abord Mme le Professeur Sophie THENET et Mr le Docteur Lhousseine TOUQUI de m’avoir fait l’honneur d’être les rapporteurs de mon manuscrit de doctorat. Je remercie également Mme le Docteur Nadia CHERRADI, Mme le Docteur Christelle CORAUX et Mr le Docteur Jean-Jacque FEIGE qui ont accepté de faire partie de mon jury.

Merci au Docteur Nadia Alfaidy et surtout au Docteur Mohamed Benharouga pour son encadrement durant ces 3 années, pour son aide et la confiance qu’il m’a témoignée en acceptant la direction scientifique de mes travaux.

Ce travail ayant pu être réalisé grâce au financement de l’association Vaincre La Mucoviscidose, je remercie également tous ces membres.

J’exprime aussi ma profonde gratitude au Docteur Stéphane Ménage de m’avoir accueilli au sein du Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux où a été réalisée cette thèse, et à l’ensemble des permanents de tout le laboratoire, Affond, BioCat, SolHyCat, MCT et aussi et surtout BioMet.

Merci à l’ensemble des personnes qui m’ont apporté leur soutien aussi bien technique que moral qui se reconnaîtront sans mal, merci d’exister, merci d’être vous, ne changez jamais, vous êtes parfait. Enfin ces remerciements ne seraient pas complet sans ces mots de deux personnages à la simplicité et à la profondeur étonnante qui m’ont marqué et me marquerons toujours.

„

— ∂3P_x2_{- to K}

The name of the Doctor

„

moment-là qu’on peut bien comprendre des trucs. Vous me prenez pour un con, non ? Ah ça y’est, j’viens de comprendre à quoi ça sert la canne. En fait ça sert à rien. . . Du coup ça nous renvoie à notre propre utilité : l’Homme face à l’Absurde !

—Perceval

Table des matières

Table des figures x

Abbréviations xii I Introduction 1 1 Le système respiratoire 2 1.1 Trachée . . . 3 1.2 Bronche et bronchioles . . . 4 1.3 Alvéoles . . . 5 2 Les épithéliums 7 2.1 Structure et fonction de l’épithélium bronchique . . . 7

2.2 Fonction de barrière . . . 8

2.2.1 Clairance muco-ciliaire (CM) . . . 8

2.2.2 Sécrétion de médiateurs protecteurs . . . 9

2.2.3 Intégrité de l’épithélium . . . 9 2.2.4 Jonctions serrées . . . 10 i Claudines et occludine . . . 10 ii JAM . . . 11 iii ZO-1 . . . 11 2.2.5 Desmosomes . . . 12 i Desmogléines et desmocollines . . . 12 ii Desmoplakine . . . 13

iii Plakoglobine (ou γ-caténine) . . . . 13

2.2.6 Jonction adhérente . . . 13 i Caténines . . . 14 i.1 α-caténine . . . 15 i.2 β-caténine . . . 15 i.3 γ-caténine . . . 15 i.4 Caténine p120 . . . 15 ii E-cadhérine . . . 15

2.3 Pathologies pulmonaires . . . 16 3 La mucoviscidose 17 3.1 Généralités . . . 17 3.2 La protéine CFTR . . . 18 3.2.1 Structure . . . 18 3.2.2 Fonction de la protéine CFTR . . . 20

3.2.3 Mutations au niveau du gène CFTR . . . 21

3.2.4 Approches thérapeutiques fondamentales . . . 23

3.3 Données cliniques . . . 24

4 L’inflammation 26 4.1 Généralités . . . 26

4.2 Les cellules de l’inflammation . . . 27

4.3 Étapes de l’inflammation . . . 28

4.3.1 Les cytokines . . . 29

i Cytokines de l’hématopoïèse . . . 30

ii Cytokines de la réponse immunitaire . . . 30

iii Cytokines de l’inflammation . . . 31

4.4 Cas de la mucoviscidose . . . 32

4.4.1 Présence du processus inflammatoire . . . 32

i Les neutrophiles . . . 33

ii Les macrophages . . . 33

iii Les cellules épithéliales . . . 34

4.4.2 L’inflammation précoce . . . 34

5 Le stress oxydatif 36 5.1 Production et fonctions des radicaux libres oxygénés (ROS) . . . 36

5.1.1 Production des ROS (Reactive Oxygen Species) . . . . 36

5.1.2 Fonctions des ROS . . . 38

5.2 Protection contre les ROS . . . 39

5.3 Stress oxydant et mucoviscidose . . . 40

5.3.1 Au niveau urinaire . . . 40

5.3.2 Compartiment intracellulaire . . . 41

i Au niveau cytoplasmique . . . 41

ii Au niveau mitochondrial . . . 42

iii Au niveau du réticulum endoplasmique (RE) . . . 44

iii.1 PERK . . . 44

iii.2 ATF6 . . . 44

iii.3 IRE-1 . . . 45

6 La protéine prion cellulaire 51

6.1 La découverte du Prion . . . 51

6.2 La protéine prion cellulaire (PrPc_{) . . . . 54}

6.2.1 Structure de la protéine PrPc _{. . . . 54}

6.2.2 Voie de synthèse, maturation et dégradation . . . 56

6.2.3 Rôles du Prion cellulaire . . . 58

i Prion et jonction cellulaire . . . 58

ii Activité cytoprotectrice du Prion . . . 58

iii Prion et inflammation . . . 60

iv Prion et cuivre . . . 61

II Objectifs 63 III Résultats 66 1 Homéostasie du cuivre et stress oxydant dans l’épithélium bronchique humain mucoviscidosique : rôle dans les réponses inflammatoires 67 1.1 Introduction . . . 67

1.2 Discussion et perspective . . . 104

2 Effet de la correction pharmacologique versus la correction génétique sur le profile inflammatoire des cellules épithéliales bronchiques homozygotes pour la mutation delF508 106 2.1 Introduction . . . 106

2.2 Discussion et perspective . . . 134

3 L’expression de la protéine cellulaire (PrPc_{) et son importance} fonction-nelle dans l’épithélium bronchique : rôle dans la protection de la barrière jonctionnelle contre le stress oxydatif. 137 3.1 Introduction . . . 137

3.2 Discussion et perspective . . . 180

IV Conclusions et Perspectives 182

V Annexes 188

Bibliographie 202

Table des figures

1.1 Schéma et histologie de l’appareil respiratoire (d’après [1]) . . . 3

1.2 Structure schématique et histologie de la trachée (d’après [2]) . . . 4

1.3 Coupe histologique d’une bronche (d’après [3]) . . . 5

1.4 (a) Schéma de la structure des alvéoles pulmonaires, (b) Structure al-véolaire d’un tissu pulmonaire (d’après [4]) . . . 6

2.1 Structure de l’épithélium bronchique (d’après [3]) . . . 8

2.2 Schéma et résumé des différentes jonctions cellulaires et leurs fonctions (d’après [15]) . . . 9

2.3 Schémas des principales molécules des jonctions serrées (d’après [17]) . 10

2.4 Tableau des claudines exprimées dans les bronches, les alvéoles et le mésothélium (d’après [21]) . . . 11

2.5 Schémas des principales molécules des desmosomes (d’après [15]) . . . 12

2.6 Schéma des principales molécules des jonctions adhérentes (d’après [32]) 14

3.1 Nombre de patients vus dans l’année et pourcentage d’adultes (d’après le registre français de la mucoviscidose) . . . 18

3.2 Évolution annuelle des principaux indicateurs (d’après le registre français de la mucoviscidose) . . . 18

3.3 Structure CFTR (A). Schémas de l’organisation des domaines de CFTR

(d’après [51]). (B) Structure moléculaire du CFTR humain.(d’après [52]) 20

3.4 Schémas de la conséquence d’un défaut de CFTR sur l’activité d’autres canaux ioniques dans (A) un épithélium sain et (B) dans un épithélium de type mucoviscidosique (d’après [63]) . . . 21

3.5 Liste des six différentes classes de mutation de CFTR et leurs consé-quences cellulaires (d’après [65]) . . . 22

3.6 Mécanismes d’action et cibles des modulateurs pharmacologiques de

CFTR disponibles pour les patients atteints de mucoviscidose ou en développement pré-clinique (d’après [71]) . . . 24

3.7 Organes atteints et problèmes de santé associés à la mucoviscidose (d’après [72]) . . . 25

4.1 Fonctions de différents types de cellules immunitaires (d’après [78]) . . 28

4.2 Schéma des différentes étapes de l’inflammation alvéolaire (d’après [88]) 29

4.3 Liste des cytokines, de leurs fonctions, de leurs cibles et de leurs sites de sécrétion (d’après [105]) . . . 32

5.1 Les principales espèces réactives de l’oxygène (d’après [160]) . . . 37

5.2 Mécanismes de production des radicaux libres par la réaction de Fenton et de Haber-Weiss (d’après [161]) . . . 38

5.3 Liste des principaux antioxydants (d’après [165]) . . . 39

5.4 Schéma des altérations mitochondriales et leurs conséquences dans la

mucoviscidose. (d’après [205]) . . . 43

5.5 Schémas générale de la réponse UPR (d’après [220]) . . . 46

5.6 Schéma simplifié de l’homéostasie du cuivre dans les cellules eucaryotes (d’après [251]) . . . 49

6.1 Liste des maladies à Prion humaines et animales (d’après [258]) . . . 51

6.2 Représentation schématique de la comparaison des structures de la PrPc

et PrPsc_{(d’après Atkinson CJ., Prion. 2016 ;10(1) :63-82) . . . . 53}

6.3 Schéma de la propagation de la PrPsc_{dans les cellules neuronales (d’après}

[274]) . . . 53

6.4 schémas de la structure primaire de la PrPc _{dans les cellules neuronales}

(d’après [285]) . . . 55

6.5 Schémas des différentes formes topologiques de la PrPc_{dans les cellules}

neuronales (d’après [285]) . . . 56

6.6 Schémas du trafic cellulaire de la PrPc _{dans les cellules neuronales}

(d’après [285]) . . . 57

6.7 Différentes voies de signalisation liées à la survie cellulaire dans lesquelles la protéine Prion à rôle déterminant. (d’après [319]) . . . 60

6.8 Représentation du devenir du Prion cellulaire et de sa liaison au cuivre (d’après [307]) . . . 61

0.1 Schéma récapitulatif partie I . . . 185

0.2 Schéma récapitulatif partie II . . . 187

Abbréviations

(Ctm)PrP ou C-transmembrane PrP

(Ntm)PrP N-transmembrane PrP

8-OHdG 8-hydroxy-2’-désoxyguanosine

ABC ATP Binding Cassette

ADN Acide DésoxyriboNucléique

AMPc Adénosine Monophosphate Cyclique

AP Activator Protein

AP-1 Activator Protein 1

ARM Armadilo

ATF6 Activating Transcription Factor 6

ATP Adénosine TriPhosphate

BPCO BronchoPneumopathie Chronique Obstructive

bZIP Basic Leucine Zipper

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

CM Clairance Mucociliaire

CSF Colony Stimulating Factor

eIF2 Eukaryotic Initiation Factor 2

ENaC Epithelil Na+ Channel

ERAD endoplasmique reticulum associated degradation

GK Guanylate Kinase GPI GlycosylPhosphatidylInisitol GPx Gluatathion peroxydase GRO Growth-regulated GSH Gluthation réduit GSSG Glutathion oxydé H2O2 Peroxyde d’hydrogène

IκBα nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha

IFN Interférons

IL Interleukin

IRE-1 Inositol Requiring Enzyme 1

JAM Junctional Adhesion Molecules

JNK c-Jun N-terminal Kinase

LBA Lavage Broncho Alvéolaire

MAGUK Membrane-Associated Guanylate Kinase

MAPK Motigen-Activated Protein Kinase

MCP-1 Monocyte Chemotactic Protein 1

MIP Macrophage Inflammatory Protein

MMP Matrix MetalloProteinase

MRE Metal Responsive Element

NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NBD Nucleotide Binding Domain

NETS Neutrophil Extracellular TrapS

NF-κB Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NGF Nerve Growth Factor

NK Natural Killer

NO oxyde nitrique

NOX NADPH oxydase

O2- Radical superoxyde

OH• _{Radical hydroxyle}

ORCC Outwardly Rectifying Chloride Channel

PDZ PSD95/dlg/ZO-1

PECAM Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule

PERK Potein RNA-like Endoplasmic Reticulum Kinase

PKA Protein Kinase A

PKC Protein Kinase C

PNN PolyNucléaires Neutrophiles

RE Réticulum Endoplasmique

RNS Reactive Nitrogen Species

ROMK Renal Outer Medullary Potassium Channel

ROS Reactive Oxygen Species

S1-P Site-1 Protease

S2-P Site-2 Protease

SH3 Src Homology 3

SLA Sclérose Latérale Amyotrophique

SOD SuperOxyde Dismutase

TGF Transforming Growth Factor

Th T helper

TJP Tight Junction Protein

TMD Transmembrane Domain

TNF Tumor Necrosis Factor

TRL Toll-like Receptor

UPR Unfolded Protein Response

Xbp X-box binding protein

I

Introduction

1

Le système respiratoire

La respiration est le berceau du rythme (Rainer Maria Rilke). En effet, nous avons besoin d’air pour vivre. L’air est composé à 78% d’azote, 21% d’oxygène et 1% de gaz rares, mais seul l’oxygène est indispensable à la vie. Pour fonctionner les cellules de l’organisme ont besoin d’énergie, cette énergie est le résultat d’une réaction chimique entre les glucides et l’oxygène contenu dans l’air. Cette réaction produit aussi du dioxyde de carbone que nous expulsons via le système respiratoire. L’arbre respiratoire (ou appareil respiratoire) est constitué des voies aériennes supérieures (nez, bouche, larynx), de la trachée et des poumons.

Le poumon vient juste après la trachée et constitue l’organe central de la respiration. Il est situé dans la cage thoracique au-dessus du diaphragme. Une double membrane séreuse, la plèvre pariétale, située contre la paroi thoracique, et la plèvre viscérale maintient le poumon contre la paroi thoracique.

Hors pathologies, l’homme possède deux poumons séparés l’un de l’autre par le médiastin. Le poumon dit droit est divisé en trois lobes et le gauche en deux. Chacun de ces lobes est relié à la trachée via une bronche souche qui se divise en bronches plus petites, puis en bronchioles à l’extrémité desquelles on retrouve les alvéoles regroupées par grappes. Les alvéoles constituent le lieu principal des échanges gazeux entre l’air qui les baigne et le sang de leurs capillaires

La proportion de cellules et l’épaisseur des épithéliums des voies respiratoires varient sous forme d’un gradient allant de cellules caliciformes et pluristratifiées vers des cellules cylindriques et uni-stratifiées. Cette transition se fait progressivement de la trachée aux alvéoles (Figure1.1).

Figure 1.1:Schéma et histologie de l’appareil respiratoire (d’après [1])

1.1

Trachée

La trachée fait suite au larynx. C’est un cylindre de 10 à 12 cm de long et de 1 à 2 cm de diamètre qui se termine par une bifurcation en deux bronches principales au niveau du médiastin. La paroi trachéale est formée de trois couches (Figures1.1 et

1.2) :

— la muqueuse de type respiratoire, comporte un épithélium pseudo-stratifié composé de cellules ciliées et de cellules caliciformes qui sécrètent le mucus. Le

chorion est riche en fibres élastique, en glandes mixtes, en tissu lymphoïde où la vascularisation est abondante et riche en nerfs. La muqueuse a pour rôle, entre autres, d’empêcher le collapsus de la paroi trachéale pendant la respiration. Elle est aussi chargée d’assurer le réchauffement, l’humidification et la filtration de l’air respiré ;

— la tunique fibrocartilagineuse est constituée d’anneaux cartilagineux dans sa partie antérieure et de bandes musculaires lisses en postérieur qui lui confèrent sa flexibilité ;

— l’adventice est un tissu conjonctif riche en vaisseaux et en nerfs.

Figure 1.2:Structure schématique et histologie de la trachée (d’après [2])

La trachée assure le passage de l’air durant tout le cycle de la respiration. Elle présente aussi, en relation avec son appareil mucociliaire, une fonction de drainage permettant l’élimination des particules inhalées vers le pharynx.

1.2

Bronche et bronchioles

Les bronches primaires (ou souches) se divisent en bronches lobaires puis en bronches segmentaires pour finir par les bronchioles. D’architecture semblable à la trachée,

quelques différences, comme la présence d’un réseau de fibres élastiques plus im-portant dans le chorion, qui fait office de séparation avec la sous-muqueuse laquelle contient moins de structures glandulaires et présente une discontinuité des anneaux cartilagineux.

Les bronchioles sont très fines (0,5 à 1mm de diamètre), divisées en trois types, chacune étant progressivement de plus en plus petite : les bronchioles lobaires, les bronchioles terminales et les bronchioles respiratoires. Il n’y a pas d’échange d’air dans les bronchioles lobaires et terminales ; en revanche, il y en a au niveau des bronchioles respiratoires. La fonction primaire des bronchioles est de conduire l’air des bronches aux alvéoles et de contrôler le débit d’air distribué dans le poumon par constriction ou dilatation. La structure des bronchioles est sensiblement différente des celles des bronches.

Les bronches sont entourées d’un anneau de cartilage qui les maintient ouvertes, alors que les bronchioles sont entourées d’un mur de muscle lisse permettant de dilater et de contracter les voies respiratoires. Elles contrôlent ainsi la livraison d’air aux alvéoles. La muqueuse des bronchioles est formée d’un épithélium simple cylindrique dépourvu de cellules caliciformes et pauvre en cellules ciliées. Le chorion est réduit à une fine lame élastique et la sous-muqueuse qui se confond avec l’adventice ne contient pas de glandes (Figures1.1et1.3).

Figure 1.3:Coupe histologique d’une bronche (d’après [3])

1.3

Alvéoles

À l’aboutissement de l’arbre bronchique, on retrouve les alvéoles regroupées en acinus pulmonaires. Un acinus est constitué de 5 à 6 alvéoles entourées d’un réseau de capillaires sanguins intimement lié à la fonction des alvéoles.

L’épithélium alvéolaire est constitué de pneumocytes de type I (membraneux) et de type II (granuleux). Alors que la proportion en pneumocytes I et II est sensiblement identique, les pneumocytes de type I, du fait de leurs structures fines (0,1 à 0,2µm d’épaisseur) et étalées, couvrent 95% de la surface alvéolaire. Ceci a pour conséquence de conférer à l’épithélium alvéolaire une caractéristique souple très étendue qui favorise les échanges gazeux, mais aussi très fragile qui le rend vulnérable aux attaques microbiennes et aux polluants.

La barrière alvéolo-capillaire, au travers de laquelle est assurée la fonction d’échanges gazeux, est formée de pneumocytes de type I des alvéoles et des cellules endothéliales des capillaires. Les pneumocytes de type II sont de forme cubique et présentent une microvillosité au niveau de leur pôle apical. Leur aspect granuleux est dû à leur cytoplasme riche en organites, dont un spécifique, les corps lamellaires, qui sécrète le surfactant pulmonaire. De plus, ils présentent un réticulum endoplasmique et un appareil de Golgi surdéveloppés, signe d’un métabolisme très actif. Le surfactant sécrété (et aussi recyclé) par les corps lamellaires des pneumocytes de type II a pour fonction de fluidifier le mucus, de faciliter les échanges gazeux et de diminuer la tension de surface des alvéoles afin qu’elles ne s’effondrent pas sur elles-mêmes pendant la respiration et qu’elles conservent leur élasticité (Figures1.1et1.4).

Figure 1.4:(a) Schéma de la structure des alvéoles pulmonaires, (b) Structure alvéolaire d’un tissu pulmonaire (d’après [4])

2

Les épithéliums

Dans les épithéliums, tissus très organisés, les cellules ne fonctionnent pas seules : elles sont regroupées en tissus conjonctif, musculaire, nerveux et épithélial. Les cellules épithéliales forment une barrière protectrice qui recouvre tous les tissus qui sont en contact avec le monde extérieur en séparant physiquement l’organisme de celui-ci. Plutôt que d’être une barrière statique et impénétrable, les épithéliums sont des structures dynamiques qui ajustent leurs proliférations, leurs différenciations et leurs morts cellulaire en réponse à des signaux intrinsèques et extrinsèques. Un épithélium est composé de cellules contiguës, reliées les unes aux autres par des jonctions. Les tissus épithéliaux recouvrent les organes comme la peau, les voies respiratoires et l’appareil reproducteur. Comme les structures des épithéliums sont différentes en fonction de leur localisation et de leur rôle dans l’organisme, dans la partie suivante ne seront détaillées que la structure et la fonction de l’épithélium bronchique.

2.1

Structure et fonction de l’épithélium

bronchique

L’épithélium bronchique est à l’interface entre le système respiratoire et l’air que l’on inspire. Il repose sur un tissu conjonctif constitué d’une membrane basale, d’une lamina propria et d’une sous-muqueuse, qui contient du muscle lisse, des glandes et du cartilage [5]. L’épithélium bronchique est composé de trois types de cellules qui forment ensemble une couche ciliée pseudo-stratifiée (Figures1.3et Figure2.1) :

— les cellules ciliées cylindriques dont la principale fonction est d’éliminer les particules grâce à leur capacité de clairance muco-ciliaire ;

— les cellules sécrétoires présentes sous plusieurs formes, représentent environ 20% de l’épithélium bronchique. Les cellules caliciformes sont les principaux producteurs de mucus des voies aériennes, dans lequel les particules inhalées, ainsi que les virus et les bactéries, peuvent être piégés [6]. Les cellules de Clara (ou pneumocytes de type II granulaire) produisent le surfactant. De plus, ces cellules peuvent participer à l’élimination des agents nocifs. Les cellules de Clara

sont prédominantes dans les bronchioles et les cellules caliciformes dans les voies aériennes plus larges ;

— les cellules basales sont considérées comme les cellules souches de l’épithélium bronchique.

Figure 2.1:Structure de l’épithélium bronchique (d’après [3])

2.2

Fonction de barrière

Les cellules de l’épithélium bronchique défendent les voies aériennes contre l’entrée de pathogènes. Cette défense repose à la fois sur l’intégrité de l’épithélium qui forme une barrière physique, sur la sécrétion du mucus et sur la fonction ciliaire dont l’action commune permet une clairance muco-ciliaire efficace contre différents agents extérieurs. Les cellules de l’épithélium bronchique sont aussi capables de synthétiser et de sécréter différents médiateurs dont le rôle principal est la défense de l’intégrité épithéliale.

2.2.1

Clairance muco-ciliaire (CM)

Les particules inhalées sont piégées dans le mucus puis éliminées des voies aériennes par la CM grâce aux battements coordonnés des cils. La CM est facilitée par la sécrétion

est régulée par divers facteurs tels que la bradykinine, l’histamine et les cytokines [7–10] .

2.2.2

Sécrétion de médiateurs protecteurs

Pour assurer la protection contre les pathogènes, l’épithélium bronchique sécrète un certain nombre de médiateurs comprenant des substances antibactériennes, des anti-protéases, des antioxydants (glutathion, superoxyde dismutase et catalase) et des médiateurs de l’inflammation tels que les interleukines [11–13].

2.2.3

Intégrité de l’épithélium

L’intégrité physique de l’épithélium est maintenue par plusieurs mécanismes d’adhé-rence [14]. Les jonctions serrées sont une structure étroite en forme de couronne entourant chaque cellule au pôle apical. Les desmosomes et les jonctions adhérentes sont impliquées dans le maintien d’une forte adhérence cellule-cellule. L’ensemble de ces jonctions forment une barrière physique, empêchant les «fuites» (Figure2.2). En plus de ces jonctions, il y a les jonctions GAP de communication et les hémidesmo-somes qui servent à l’ancrage des cellules épithéliales à la lame basale.

Figure 2.2:Schéma et résumé des différentes jonctions cellulaires et leurs fonctions (d’après [15])

2.2.4

Jonctions serrées

Au niveau des jonctions serrées, les cellules sont maintenues étroitement l’une contre l’autre par des groupes de protéines appelées claudines, chacune interagissant avec un groupe partenaire au niveau de la membrane plasmique opposée. Ces groupes sont organisés en réseaux dont le degré de densité est proportionnel à l’étanchéité de l’épithélium. Le but des jonctions serrées est d’agir comme une barrière imperméable et d’empêcher les liquides de s’échapper entre les cellules. À côté des claudines, on trouve l’occludine, protéine transmembranaire dont la fonction principale est encore très étudiée et les protéines JAM (Junctional Adhesion Molecules). Claudines, occludine et JAM s’associent aux protéines intracellulaires de la membrane périphérique appelées protéines ZO-1 (Zonula occludens 1) qui s’ancrent au cytosquelette d’actine [15, 16] (Figure2.3).

Figure 2.3:Schémas des principales molécules des jonctions serrées (d’après [17])

i Claudines et occludine

Protéines majeures des jonctions serrées, claudines et occludine possèdent deux domaines extracellulaires en forme de boucle qui interagissent avec les claudines et occludine de la cellule voisine, et quatre domaines transmembranaires dont les extrémités sont cytoplasmiques. La famille des claudines compte une vingtaine de membres, chacun spécifique d’un tissu et dont plusieurs, au moins deux différents,

avec des partenaires protéiques comme les ZO ce qui leur permet d’être reliées au cytosquelette d’actine. Les claudines 1, 3, 4, 5, 7, 8 et 18 sont exprimées dans les bronches et bronchioles humaines. Il existe des rapports divergents pour l’expression de la claudine 2 [18–21] (Figure2.4).

Figure 2.4:Tableau des claudines exprimées dans les bronches, les alvéoles et le mésothélium (d’après [21])

ii JAM

Protéines transmembranaires possédant deux boucles de type immunoglobulines extracellulaires les JAM présentent un domaine transmembranaire et une partie C-terminale intracellulaire. Il existe trois isoformes de JAM : JAM-A, -B et –C. Les JAM possèdent tous un domaine PDZ en C-terminale indispensable à la liaison avec les ZO [22].

iii ZO-1

La protéine Zonula occludens-1 (appelée aussi TJP-1 pour Tight Junction Protein-1) se lie aux extrémités cytoplasmiques des claudines, occludine et JAM. Elle interagit aussi avec la F-actine au niveau du cytosquelette. Elle appartient à la famille des protéines MAGUK (Membrane-Associated Guanylate Kinase) et est constituée de trois domaines distincts, PDZ (PSD95/dlg/ZO-1), SH3 (Src homology 3) et GK (Guanylate Kinase), ainsi que d’une région C-terminale plus ou moins longue, ZO-1 possédant la plus longue [23, 24].

2.2.5

Desmosomes

Les desmosomes forment des zones de contact ponctuelles entre les cellules épithé-liales adjacentes. C’est un complexe de protéines dont certaines s’étendent au travers de la membrane cellulaire tandis que d’autres ont pour fonction d’ancrer la jonction dans la cellule. Des protéines d’adhérence spécialisées, la desmogléine et la desmocol-line, toutes deux membres de la famille des cadhérines, se trouvent sur les membranes des deux cellules et interagissent dans l’espace entre les cellules. À l’intérieur de la cellule, les cadhérines s’attachent à une structure appelée plaque cytoplasmique qui contient en particulier de la plakoglobine et des desmoplakines. Ces dernières sont liées aux filaments intermédiaires qui participent à l’ancrage de la jonction. Les desmosomes fixent les cellules adjacentes ensemble, en veillant à ce que les cellules des organes et des tissus qui s’allongent, comme par exemple les poumons, restent connectées [15] (Figure2.5).

Figure 2.5:Schémas des principales molécules des desmosomes (d’après [15])

i Desmogléines et desmocollines

Les desmogléines et les desmocollines sont des cadhérines. Comme toutes les cadhé-rines elles portent des domaines de liaison au calcium (dont dépend leur fonctionne-ment). Ce sont des glycoprotéines transmembranaires qui possèdent une extrémité

N-terminale extracellulaire où se situent les sites de fixation au calcium et une extré-mité C-terminale cytoplasmique. Le calcium est nécessaire à la reconnaissance et à la liaison de cadhérines entre elles [25–27]. La particularité de la desmogléine et de la desmocolline est qu’elles sont capables de faire des liaisons avec des cadhérines diffé-rentes (liaisons hétérophiliques), elles sont par la suite ancrées sur une plakoglobine, puis une desmoplakine, et enfin au filament intermédiaire du cytosquelette [28].

ii Desmoplakine

La desmoplakine est une protéine importante du desmosome qui sert à maintenir l’intégrité structurale de la jonction. La desmoplakine existe sous deux isoformes la première connue sous le nom de « DPII » de 260,0kDa et la seconde appelée « DPI » de 332,0kDa, quasiment identiques à l’exception d’un domaine plus court dans la DPII. La desmoplakine ancre les filaments intermédiaires aux plaques desmosomales [28].

iii Plakoglobine (ou γ-caténine)

La plakoglobine également appelée γ-caténine, est un membre de la famille des caténines, homologue à la β-caténine puisqu’elle contient elle aussi un motif d’acides aminées répété distinctif appelé répétition Armadillo (ARM). La plakoglobine est un composant cytoplasmique des desmosomes et des jonctions adhérentes. Elle possède, en plus du domaine ARM, des domaines globulaires N-terminaux et C-terminaux de structures in- connues. Elle a été initialement identifiée comme composant des desmosomes, où elle peut se lier aux membres de la famille des cadhérines ainsi qu’aux cadhérines classiques telles que la E-cadhérine ; dans ce cas elle, est appelée

γ-caténine [29]. Comme la β-caténine elle serait impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire [30].

2.2.6

Jonction adhérente

La jonction adhérente a plusieurs fonctions dont l’initiation et la stabilisation de l’adhésion cellule-cellule, la régulation du cytosquelette d’actine, la signalisation intracellulaire et la régulation de la transcription. Le cœur de la jonction adhérente est constitué d’interactions entre des glycoprotéines transmembranaires de la superfamille

des cadhérines, tels que l’E-cadhérine et des protéines d’ancrage trouvées à l’intérieur de la cellule membres de la famille des caténines comme l’α-caténine, la β-caténine, la caténine p120 et la γ-caténine. Ensemble, ces protéines contrôlent la formation, la maintenance et la fonction des jonctions adhérentes [15, 16, 31]. La jonction adhérente est constituée des protéines d’ancrage trouvées à l’intérieur de la cellule telles que l’α-caténine, la β-caténine, la caténine p120 et la γ-caténine. Ces protéines d’ancrage relient les microfilaments d’actine aux cadhérines, comme la E-cadhérine, protéine d’adhérence transmembranaire localisée en grande partie dans l’espace extra-cellulaire. Dans l’espace interjonctionnel, l’interaction entre deux cadhérines se fait grâce au calcium via leurs extrémités extra-cellulaires. Ces deux cadhérines utilisent leurs extrémités intracellulaires pour interagir avec les protéines de caténine localisées dans le cytoplasme des deux cellules adjacentes pour former le complexe cadhérine-caténine. Ce complexe se lie à l’α-actinine et à la vinculine qui relient le complexe cadhérine-caténine au microfilament d’actine de la cellule (Figure2.6)

Figure 2.6:Schéma des principales molécules des jonctions adhérentes (d’après [32])

i Caténines

La fonction primaire des caténines est de connecter les cadhérines aux filaments d’actine du cytosquelette dans les jonctions adhérentes, mais elles peuvent aussi, dans le cas de la β-caténine par exemple, jouer un rôle dans la signalisation cellulaire et la transcription. L’α-caténine, la caténine p120, la β-caténine et la γ-caténine sont toutes

membres de cette famille. Seules la β-caténine et la γ-caténine sont en interaction directe avec la partie cytoplasmique des cadhérines [27].

i.1 α-caténine L’α-caténine se lie avec une faible affinité aux filaments d’actine et au complexe E-cadhérine-β-caténine. Lorsque l’α-caténine n’est pas dans un complexe moléculaire avec la β-caténine, elle se dimérise pour réguler l’assemblage des fila-ments d’actine [33]. Mais des études récentes montrent qu’elle ne peut pas se lier simultanément à la β-caténine et au cytosquelette d’actine [34, 35].

i.2 β-caténine La β-caténine est une protéine impliquée dans la régulation de l’adhé-sion cellulaire et dans la transcription de certains gènes. Elle est par exemple un élément important dans la voie de signalisation Wnt. La β–caténine possède une structure homologue à la γ-caténine. Comme cette dernière, son cœur consiste en 12 répétitions (ARM), chacune d’environ 40 acides aminés, qui se plient ensemble en un domaine protéique rigide avec une forme allongée, ainsi qu’un domaine N- et C-terminal globulaire de structure inconnue. Elle est largement exprimée dans de nombreux tissus [16].

i.3 γ-caténine Voir 2.2.5 iii Plakoglobine page 13

i.4 Caténine p120 La caténine p120 est un membre de la sous-famille des protéines à domaine Armadillo. Contrairement aux caténines classiques (α-caténine, β-caténine et γ-caténine) qui ont fait l’objet d’études approfondies, la fonction biologique de p120 n’a émergé que récemment et son rôle reste toujours à identifier. Néanmoins, il est clair que p120 est une protéine des jonctions adhérentes grâce à son domaine d’interaction avec les cadhérines [36]. De plus elle stabiliserait la E-cadhérine en la protégeant de la dégradation protéique afin de maintenir sa localisation membranaire [37, 38].

ii E-cadhérine

Elle est la cadhérine classique de type I la plus étudiée et la protéine la plus importante des jonctions adhérentes. La E-cadhérine présente la même structure générale que la desmogléine et la desmocolline. Dans le cas de jonctions adhérentes, les cadhérines simples, comme la E-cadhérine, sont en interaction avec des caténines intracellulaires

(α-, β- et γ-caténine) qui servent d’intermédiaires de liaison avec les filaments d’actine du cytosquelette.

2.3

Pathologies pulmonaires

Malgré l’ensemble des éléments de protections disponibles dans l’épithélium bron-chique, décrits précédemment, il peut arriver que ce ne soit pas suffisant pour lutter contre les maladies. Les maladies pulmonaires ont essentiellement des causes in-fectieuses (bactéries, virus ou champignons pathogènes), la plus fréquente étant le pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) qui est aussi le plus dangereux. Parmi les pathologies pulmonaires fréquentes on trouve l’asthme, les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) caractérisées par un rétrécissement irréversible des bronches, les cancers et la mucoviscidose, maladie génétique caractérisée par une pro-duction importante d’un mucus épais qui entraîne d’important troubles respiratoires. On peut en citer beaucoup d’autres, mais c’est sur cette dernière pathologie que notre étude s’est concentrée.

3

La mucoviscidose

3.1

Généralités

La mucoviscidose est une maladie génétique, à transmission autosomique, récessive, et multiviscérale particulièrement fréquente dans la population caucasienne. La mu-coviscidose est causée par des mutations identifiées sur le gène CFTR (Cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator). Le gène CFTR est localisé sur le bras long

(appelé q) du chromosome 7 à la position 31.2 (7q31.2) [39] et code pour une glycoprotéine membranaire appelée CFTR exprimée au pôle apical de la majorité des cellules épithéliales.

C’est en 1938 à la suite d’autopsies d’enfants souffrant de malnutrition, que pour la première fois la distinction est établie entre la maladie cœliaque et la mucoviscidose définie à l’époque par le terme de « fibrose cystique du pancréas ». Elle est décrite comme une maladie caractérisée par une mauvaise absorption des graisses et des protéines, une stéatorrhée (quantité élevée de lipides dans les selles), un retard de croissance et des infections pulmonaires [40]. Ce n’est qu’en 1943 qu’elle est renommée « mucoviscidose » afin de rendre compte de l’état visqueux du mucus observé dans plusieurs organes autres que le pancréas [41]. En 1948, lors de la vague de chaleur à New York, un jeune pédiatre, Paul di Sant’Agnese, constate que beaucoup de nourrissons atteints de mucoviscidose présentaient une prostration due à la chaleur. Il émet l’hypothèse d’un problème de sudation et démontra par la suite la présence d’un excès d’ions sodium (Na+_{) et chlorure (Cl}-_{), dont les concentrations sont cinq}

fois plus élevées dans la sueur de patients atteints de mucoviscidose [42]. C’est grâce à cette découverte qu’est mis au point un peu plus tard le test de la sueur, toujours utilisé de nos jours pour diagnostiquer les patients atteints de mucoviscidose [43].

Selon le registre français de la mucoviscidose, on comptait un peu plus de 6000 patients recensés en 2014. Ce nombre, en constante progression depuis le début du recensement en 1992, compte pour la deuxième fois consécutive plus d’adultes que d’enfants, même si la population reste jeune avec un âge moyen d’environ 20 ans (Figures3.1et3.2).

Figure 3.1:Nombre de patients vus dans l’année et pourcentage d’adultes (d’après le registre français de la mucoviscidose)

Figure 3.2:Évolution annuelle des principaux indicateurs (d’après le registre français de la mucoviscidose)

3.2

La protéine CFTR

3.2.1

Structure

des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) et plus précisément à la sous-famille ABCC (ABCC7). La famille des protéines transporteurs ABC est extrêmement vaste ; on les retrouve dans l’ensemble du vivant aussi bien chez les eucaryotes que les procaryotes [44]. Ces protéines lient et hydrolysent l’ATP, étape nécessaire à leur activation, permettant ainsi d’assurer des échanges unidirectionnels d’éléments divers (ions, substrats, macromolécules. . . ) au travers des membranes cellulaires [45]. Les

transporteurs ABC sont constitués de quatre domaines :

— deux domaines cytoplasmiques de liaison/hydrolyse des nucléotides : NBD (Nucleotide Binding Domains). Les NBD possèdent trois motifs très conservés, les motifs Walker A et B de fixation de l’ATP et un motif dit « signature » LSGGQ, spécifique des transporteurs ABC, situé entre les motifs de Walker A et B [46]. Le passage des éléments à travers la membrane cellulaire se fait généralement grâce à l’énergie résultant de l’hydrolyse de l’ATP [47] ;

— deux domaines transmembranaires : TMD (TransMembrane Domain) (TMD1 et TMD2) constitués chacun de six segments transmembranaires, (TM : transmem-brane) allant de TM1 à TM6 pour TMD1 et de TM7 à TM12 pour TMD2, dont la nature dépend de l’élément transporté.

CFTR contient aussi trois domaines intracellulaires : deux domaines NBD (NBD1 et NBD2) et un domaine régulateur (R) reliant le NBD 1 au TMD2 et possédant de nombreux sites de phosphorylation [48] (Figure 3.3) . Le domaine R est codé par un exon unique, le 13ème_{exon spécifique à la protéine CFTR. Afin de permettre}

l’ouverture du canal CFTR par le MgATP, la phosphorylation du domaine R par les protéines kinases A et C (PKA, PKC) est une étape primordiale. On retrouve aussi, au niveau de la 4ème _{boucle extracellulaire reliant les segments TM7 et TM8 deux sites}

de N-glycosylation au niveau des asparagines 894 et 900 (N894 et N900). La grande majorité de la protéine (environ 80 %) est cytoplasmique, y compris ses domaines N et C terminaux, le reste étant soit transmembranaire (16 %) soit extracellulaire (4 %) [49, 50].

Figure 3.3:Structure CFTR (A). Schémas de l’organisation des domaines de CFTR (d’après [51]). (B) Structure moléculaire du CFTR humain.(d’après [52])

3.2.2

Fonction de la protéine CFTR

La protéine CFTR forme un canal anionique permettant la diffusion passive des ions Cl

-indépendamment du voltage cellulaire, mais dépendant de l’AMPc (phosphorylation

via PKA et PKC), et de la fixation et l’hydrolyse de l’ATP [53, 54]. Le mécanisme

de sélectivité anionique est lié aux segments transmembranaires TM1 et TM6 [55, 56]. La séquence de sélectivité du canal CFTR est : Br-_(Bromure)>Cl-_(Chlorure)>I

-(Iodure)>F-_{(Fluorure). Cette perméabilité au ions Cl}-_{plus importante que celle des}

ions I-_{permet de discriminer CFTR des autres canaux Cl}-_[57].

Malgré une sélectivité plus grande pour les anions, CFTR semble être perméable au tripeptide glutathion (GSH) qui est l’antioxydant le plus abondamment retrouvé dans les cellules pulmonaires [58]. CFTR est une protéine régulatrice de l’activité d’autres canaux ioniques. Ainsi, il a été montré que la présence de CFTR est indispensable à l’activation du canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) par les PKA [48]. De plus, CFTR régule négativement le canal sodique ENaC (Epithelial Na+

Channel) [48]. L’absence de l’activité canal Cl-_{associée à CFTR a pour conséquence}

une hyper-absorption de Na+_{, ce qui participe à la déshydratation du mucus [59]. En}

outre, CFTR régule négativement l’activité des canaux potassiques ROMK (Renal Outer

Medullary Potassium Channel) [60]. Il a également été démontré que la protéine CFTR

régule positivement l’activité de certaines aquaporines qui participent activement à l’hydratation du mucus [61, 62] (Figure3.4).

Figure 3.4:Schémas de la conséquence d’un défaut de CFTR sur l’activité d’autres canaux ioniques dans (A) un épithélium sain et (B) dans un épithélium de type mucovis-cidosique (d’après [63])

En conclusion, l’expression apicale de CFTR au niveau des cellules épithéliales des conduits bronchiques, digestifs et reproducteurs ainsi que son rôle important, direct ou indirect, dans la régulation du transport ionique et hydrique permettent la production d’un fin mucus qui participe au bon fonctionnement des voies aériennes, ainsi que des systèmes digestif et reproducteur.

3.2.3

Mutations au niveau du gène CFTR

Aujourd’hui, plus de 2000 mutations ont été identifiées sur le gène CFTR. Les plus fréquentes sont les mutations faux-sens (48,7 %), suivies par les mutations dues aux modifications du cadre de lecture causées par une petite insertion ou délétion (19,5 %), puis les mutations altérant des codons essentiels pour l’épissage (15,7 %) et enfin des mutations non-sens (12,9 %) [http ://www.genet.sickkids.on.ca]. En fonction du comportement cellulaire de CFTR, ces mutations ont été classées en six classes [64]. Les trois dernières classes sont associées à un phénotype mucoviscidosique modéré, les trois premières quant à elles, sont beaucoup plus sévères (Figure3.5).

Figure 3.5:Liste des six différentes classes de mutation de CFTR et leurs conséquences cellulaires (d’après [65])

— Les mutations de classe I conduisent à un défaut de production de la protéine CFTR qui est complètement absente, ce sont les deuxièmes mutations les plus fréquentes.

— Les mutations de classe II conduisent à un défaut de maturation de CFTR, ce qui a pour conséquence d’affecter l’adressage de la protéine du réticulum endoplas-mique (RE) vers l’appareil de Golgi. Ceci est dû à une mauvaise glycosylation et à un mauvais repliement (changement dans la structure tertiaire) de la protéine CFTR. Bien qu’elle soit partiellement fonctionnelle, CFTR est alors reconnue et dégradée par le système de dégradation ubiquitine/protéasome [64]. La mutation delF508, qui correspond à la délétion d’un résidu phénylalanine à la position 508 de la protéine CFTR, est de loin la plus fréquente (environ 70%). On la retrouve particulièrement dans la population caucasienne [66].

— Dans le cadre des mutations de classe III et IV, la protéine CFTR est normalement traduite et adressée à la membrane apicale, mais elle n’est pas fonctionnelle. Dans le cas des mutations de classe III, on observe un défaut de régulation de CFTR dû à une diminution de la phosphorylation du domaine R. Pour les mutations de classe IV on observe une altération de la conduction du canal qui peut se traduire par des modifications de la sélectivité ou une diminution du flux ionique.

— Les mutations de classe V résultent d’une altération de la stabilité de l’ARN messager conduisant à la diminution du nombre de copies de CFTR et donc du nombre de protéines CFTR adressées à la membrane apicale.

— Les mutations de classe VI sont à l’origine de l’altération de la stabilité de la protéine CFTR mature au niveau de la membrane apicale.

3.2.4

Approches thérapeutiques fondamentales

Depuis la découverte de CFTR, de nombreux progrès en termes de soins médicaux ont été réalisés. Bien que l’espérance de vie soit d’environ une cinquantaine d’années en moyenne pour les patients, la mucoviscidose reste une maladie incurable. Il existe deux approches thérapeutiques fondamentales. La première consiste en des traitements multiples destinés à soulager les symptômes de la maladie en ciblant les problèmes pulmonaires (infection, mucus). Cependant, ces traitements n’ont qu’une approche symptomatique. La seconde consiste à cibler les causes premières de la maladie, c’est-à-dire à refaire fonctionner la protéine CFTR défectueuse en la remplaçant par thérapie génique ou à l’aide de moyens pharmacologiques. Comme décrit précédemment, le dysfonctionnement de la protéine CFTR serait à l’origine de la maladie, il semble donc logique de penser qu’une correction de son activité soit la clé de la guérison pour les patients. En effet, la restauration de la sécrétion chlorure est l’enjeu majeur du développement de thérapeutiques pharmacologiques de la mucoviscidose [67]. À ce jour, il est possible d’agir grâce à des composants pharmacologiques sur CFTR en ciblant son système de régulation ou directement sur le canal par l’intermédiaire d’activateurs ou de potentiateurs directs ou indirects [68–70] (Figure3.6).

Figure 3.6:Mécanismes d’action et cibles des modulateurs pharmacologiques de CFTR dis-ponibles pour les patients atteints de mucoviscidose ou en développement pré-clinique (d’après [71])

3.3

Données cliniques

Globalement, la fonction de CFTR est de réguler le transport des ions et les mouve-ments d’eau au travers de la barrière épithéliale des cellules qui produisent du mucus, de la sueur ou de la salive. Sans altération, CFTR assure la sécrétion passive des ions Cl-_{à travers la membrane apicale. Ce mouvement anionique est important dans le}

contrôle des mouvements d’eau dans les tissus épithéliaux, élément nécessaire pour la production d’un fin mucus qui va protège les voies aériennes, le système digestif et reproducteur, ainsi que d’autres organes et tissus.

Dans la mucoviscidose,les atteintes pulmonaires sont les plus graves car elles se

révèlent fatales dans la plupart des cas. Succinctement, le gène CFTR défectueux est à l’origine d’une absorption de l’eau contenue dans le mucus qui protège les voies respiratoires. Cette couche fine devenue visqueuse empêche les cellules ciliaires de battre et donc les mécanismes d’évacuation du mucus de fonctionner correctement.

bactéries trouvent un environnement favorable à leur prolifération.Les atteintes pan-créatiques, elles, ont pour conséquence une difficulté d’assimilation des nutriments,

puisque le pancréas, très abîmé de naissance et encombré par un épaississement du mucus, empêche la bonne libération des enzymes essentielles à une bonne digestion.

Le foie et le système digestif, également atteints, peuvent présenter une cirrhose

biliaire pour le premier et une constipation et obstruction intestinale pour le second.

Un retard de la puberté et une infertilité peuvent aussi toucher certains patients

(Figure3.7).

Figure 3.7:Organes atteints et problèmes de santé associés à la mucoviscidose (d’après [72])

On peut observer une large diversité d’expression clinique d’un patient à l’autre, que ce soit pour l’âge d’apparition des premiers symptômes ou la sévérité de l’évolution de la maladie, mais un déclin des fonctions pulmonaires caractérisé par une infection progressive des voies respiratoires ainsi qu’une inflammation reste la cause principale de la morbidité et de la mortalité associées à la mucoviscidose.

4

L’inflammation

4.1

Généralités

La réaction inflammatoire ou inflammation est définie comme la réponse locale à toutes sortes d’agressions des tissus vascularisés et vivants. Habituellement bénéfique pour l’organisme, ce processus a pour but de réparer les lésions et d’éliminer l’agent pathogène, mais peut conduire dans certains cas à une inflammation néfaste pour l’organisme en raison de l’agressivité ou de la persistance de cet agent. D’autres causes, comme des anomalies dans la régulation du processus inflammatoire ou lorsque la quantité ou la qualité des éléments intervenant dans l’inflammation sont altérées, peuvent aussi conduire à une inflammation néfaste. C’est le cas de la mucoviscidose, maladie caractérisée par des atteintes pulmonaires progressives graves qui sont la cause principale de morbidité et de mortalité chez les patients. Il existe de multiples causes à l’origine de l’inflammation, comme les agressions de type physique (trau-matisme, chaleur/froid, radiations) ou chimique (agents caustiques, toxines, venins), l’infection par des micro-organismes comme les bactéries, virus, parasites et cham-pignons ou une agression dys-immunitaire (anomalie de la réponse immunitaire, allergies. . . ) qui sont capable de déclencher une inflammation.

Dans tous les cas, l’agent pathogène peut être soit endogène soit exogène. Plusieurs causes peuvent être responsables du déclenchement de l’inflammation et, pour un même agent pathogène, on assiste à des réactions inflammatoires différentes selon l’hôte et l’état de ses défenses immunitaires. Les acteurs de l’inflammation qui l’entre-tiennent ou la modifient sont divers et variés. Parmi ces acteurs, il y a les médiateurs pro et anti-inflammatoires. Même si les réactions inflammatoires peuvent être diffé-rentes d’un patient à l’autre, l’inflammation présente des mécanismes communs dont les étapes varient en fonction de l’organe et de l’agent pathogène responsables. La réaction inflammatoire comporte plusieurs étapes successives.

4.2

Les cellules de l’inflammation

Appartenant au système immunitaire certaines de ces cellules sont particulièrement agressives et tuent (par phagocytose) tous les éléments reconnus comme étrangers et les virus afin de les éliminer. Les cellules résidentes des tissus comprennent les phagocytes mononuclés résidents (cellules dendritiques et macrophages) ainsi que les mastocytes [73]. Si cette première ligne de défense est franchie, l’organisme réagit en organisant une contre-attaque cellulaire capable de tuer l’élément étranger. Ce moyen de défense entre en action très rapidement après le début de l’infection. Les cellules sont activées par le contact avec les éléments étrangers. En réponse, elles libèrent des médiateurs de l’inflammation notamment des cytokines pro-inflammatoires et de l’histamine, un vasodilatateur qui va favoriser le recrutement des cellules qui circulent

via le sang dans l’ensemble de l’organisme tels que les lymphocytes T et B, les cellules

NK (Natural Killer), les monocytes qui se différencient en macrophages en gagnant le tissu où ils seront qualifiés de résidents [73].

Les granulocytes sont les leucocytes les plus nombreux dans la circulation périphérique. La famille des granulocytes regroupe les polynucléaires basophiles, éosinophiles et neutrophiles. Entre les divers types de granulocytes d’importantes différences fonctionnelles existent. Ces cellules ont en commun un noyau multilobé, la présence dans leur cytoplasme de nombreuses granules et le fait que leur activité biologique s’exerce au niveau des tissus [74] (Figure4.1). Les fonctions des neutrophiles sont la défense de l’hôte, la phagocytose et la destruction de pathogènes invasifs [75]. En réponse à une infection, les neutrophiles génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) via la NADPH oxydase et secrètent pour protéger l’organisme des protéines granulaires anti-microbiennes comprenant entre autres l’élastase, la collagénase, les cathepsines et la myéloperoxidase. De l’ADN peut être libéré par les neutrophiles pour former des NETS (neutrophil extracellular traps) qui vont piègent les bactéries afin de les éliminer [76, 77]. Si cette réponse n’est pas contrôlée, des lésions tissulaires excessives et graves peuvent en résulter. Ces lésions représentent la majorité des atteintes pulmonaires observées chez les patients atteints de mucoviscidose.

Figure 4.1:Fonctions de différents types de cellules immunitaires (d’après [78])

4.3

Étapes de l’inflammation

Les cellules de tous les tissus sont capables de produire des neuromédiateurs et no-tamment la substance P [79], un neuropeptide de 11 acides aminés qui peut favoriser la libération par les mastocytes de divers médiateurs (dégranulation), tels que, entre autres, des protéases (cathepsines. . . ) [80] , des cytokines (Tumor Necrosis Factor (TNF), Interleukine (IL)-6. . . ) et des médiateurs de la vasodilatation comme les pros-taglandines (PG) et l’histamine [81–83]. Parallèlement, un phénomène d’accolement à la paroi des vaisseaux sanguins (margination) des leucocytes (cellules NK (Natural

Killer), monocytes et lymphocytes) a lieu grâce à l’expression d’adhésines. La

pro-duction de deux peptides du système complément C3a et C5a entraîne aussi une dégranulation et une activation des mastocytes [84]. Après activation, les mastocytes produisent des cytokines qui, en dehors de leurs effets locaux, peuvent rejoindre la circulation sanguine et exercer leurs effets à distance [85]. Les leucocytes, suite à leur margination, migrent dans les espaces extravasculaires, attirés par divers facteurs chimiotactiques et le TGFβ (Transforming Growth Factor β) : c’est la diapédèse. Ce processus permet aux monocytes d’achever leurs différenciations en macrophages [86]. Ces cellules, comme les polynucléaires neutrophiles produisent, particulière-ment lors de la phagocytose, des radicaux libres dont les effets cytocides locaux sont importants. Les macrophages ainsi que les polynucléaires neutrophiles produisent aussi de nombreuses hydrolases qui, entre autres, dégradent les constituants de la

Figure 4.2:Schéma des différentes étapes de l’inflammation alvéolaire (d’après [88])

Lorsque les inducteurs de la réaction inflammatoire ont disparu et que les produits résultant de la dégradation des tissus ont été éliminés, la cicatrisation peut avoir lieu. Celle-ci est caractérisée par une prolifération des fibroblastes, la synthèse du collagène et des protéoglycanes [89].

Parmi les médiateurs clés impliqués dans l’inflammation on trouve les cytokines. Ce sont des messagers chimiques de la communication intercellulaire qui jouent de multiples rôles importants dans les processus inflammatoires.

4.3.1

Les cytokines

Les cytokines constituent une famille d’une trentaine de membres regroupés en trois domaines d’activité : les cytokines de l’hématopoïèse, les cytokines de la réponse

immunitaire et les cytokines de l’inflammation. Cependant, les cytokines peuvent avoir des activités multiples qui les font appartenir en même temps à plusieurs domaines.

i Cytokines de l’hématopoïèse

Elles sont responsables de la prolifération et de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse. Elles contrôlent la production de chacune des variétés des cellules sanguines (globules rouges, monocytes, lymphocytes, pla-quettes. . . ). Parmi ces cytokines, il y a les colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF) [90].

ii Cytokines de la réponse immunitaire

Le développement de la réponse immunitaire est très directement sous la dépendance de plusieurs cytokines. Il y a deux principales familles de cytokines immunitaires [91, 92] :

— les cytokines dites de « type 1 », dont l’un des premiers membres identifiés est l’IL-2 produite principalement par les lymphocytes Th1 (T helper 1). L’IL-2 est la seule cytokine dont l’action est exclusivement lymphocytaire. Ceci est dû au fait que seuls les lymphocytes expriment son récepteur [93]. L’IL-15 possède des homologies structurelles et fonctionnelles avec l’IL-2. Cependant, l’IL-15 est essentiellement produite par les monocytes/macrophages [94]. Les interférons (IFN) sont importants pour la communication intercellulaire et sont considérés comme de véritables cytokines [95]. L’IL-12 est produite par les monocytes/macrophages activés. Son rôle est une activité synergique avec l’IL-2 pour induire la sécrétion de l’IFNγ par les lymphocytes NK. L’IL-2, l’IFNγ et l’IL-12 induisent la sécrétion d’autres cytokines, dites pro-inflammatoires [96] ; — les cytokines dites de « type 2 », parmi lesquelles l’IL-4 produite par les lym-phocytes Th2, les leucocytes basophiles et les mastocytes. Elle possède un large spectre d’activités biologiques et est essentielle à la production d’immunoglobu-line de type E. Elle inhibe la synthèse des cytokines de l’inflammation (IL-1, TNF, IL-6 et cytokines chimiotactiques) et stimule leurs inhibiteurs physiologiques [97, 98].

C’est une cytokine qui a donc des effets anti-inflammatoires. L’IL-13 partage de nombreuses activités avec l’IL-4, dont la synthèse de l’immunoglobuline E

et l’effet anti-inflammatoire [97]. L’IL-10 figure parmi les cytokines Th2 et pré-sente des effets anti-inflammatoires puissants en agissant sur la production des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires produites par les macrophages comme l’IL-1, TNF et IL-6 [99]. L’IL-10 est aussi capable d’inhiber la production d’IL-1 et des TNF en agissant sur leurs inhibiteurs respectifs [100].

iii Cytokines de l’inflammation

L’activation macrophagique comporte toute une série d’événements cellulaires comme la synthèse de radicaux libres et de monoxyde d’azote et la synthèse de toute une série de protéines parmi lesquelles les protéases et bien sûr les cytokines. Les deux cytokines les plus produites par les macrophages sont l’IL-1 et le TNF. Beaucoup d’autres cytokines sont produites par les macrophages comme l’IL-6 et les chimiokines (cytokine à activité chimiotactique) [99]. Les chimiokines sont des petites cytokines divisées en deux sous-groupes d’une dizaine de membres chacun : les sous-groupes CXC et CC. Celles appartenant au sous-groupe CXC, dont le prototype est l’IL-8, sont chimiotactiques pour les polynucléaires et non pour les macrophages [101].

Les chimiokines du sous-groupe CC, dont le prototype est le MCP-1 (Monocyte

Chemo-tactic Protein 1 ou CCL2), sont à l’inverse chimiotactiques pour les monocytes et les

macrophages et non pour les polynucléaires [102]. La sécrétion de ces deux types de chimiokines par les cellules endothéliales attire les polynucléaires et les macrophages sur le site de l’inflammation. L’IL-6 est une cytokine extrêmement importante au cours de l’inflammation, elle est secrétée par les macrophages et surtout par les cellules vasculaires à proximité du site de l’inflammation. Elle stimule la synthèse hépatique de protéines [103, 104] (Figure4.3).

Figure 4.3:Liste des cytokines, de leurs fonctions, de leurs cibles et de leurs sites de sécrétion (d’après [105])

4.4

Cas de la mucoviscidose

4.4.1

Présence du processus inflammatoire

Au cours des 30 dernières années, de nombreuses études ont permis de mettre en lumière les mécanismes moléculaires et cellulaires du processus inflammatoire associé à la mucoviscidose. Cependant, le lien entre l’infection et l’inflammation, d’un côté, et l’activité CFTR et l’inflammation, de l’autre côté, reste très énigmatique et controversé [106–110]. Une des caractéristiques physiopathologiques de la mucoviscidose est l’inflammation pulmonaire chronique dominée par l’influx de granulocytes, notam-ment des neutrophiles, au niveau des voies aériennes qui se traduit par la libération excessive d’élastases et d’autres protéinases induisant une dégradation progressive du tissu pulmonaire [111, 112]. Au niveau cellulaire, les réactions inflammatoires ont été caractérisées au niveau des macrophages, neutrophiles et de l’épithélium pulmonaire. Chaque type cellulaire remplit une fonction qui lui est propre, et, parmi ceux-ci, le

défense de l’hôte contre le pathogène, il contribue à sa destruction via la libération de médiateurs de l’inflammation et la production de ROS.

i Les neutrophiles

En hypoxique, condition caractéristique d’un mucus mucoviscidosique, la demi-vie des neutrophiles est augmentée. Cette longévité permet à ces cellules d’exercer leurs effets pro-inflammatoires au niveau pulmonaire de manière chronique [113]. De plus, il a été montré que CFTR est exprimé dans les neutrophiles. Cette expression est importante pour leur fonction de phagocytose et d’exocytose granulaire [114]. De plus, d’autres études ont montré que les neutrophiles mucoviscidosiques présentent des variations dans les concentrations cytoplasiques de certains ions. Ainsi, il a été observé une augmentation des ions chlorures et sodium et une diminution des ions magnésium [115]. Ces changements de concentrations semblent être partiellement restaurés par Ivacaftor, un potentiateur de CFTR utilisé dans le traitement de la mucoviscidose asso-ciée à la mutation G551D [115]. Dans la mucoviscidose, les neutrophiles présentent aussi un défaut dans le contrôle de la réponse inflammatoire associé à une incapacité à phagocyter et à débarrasser les poumons des bactéries [111]. Plusieurs études ont aussi montré la présence d’une multitude de différences entre les neutrophiles issus de patients atteints de mucoviscidose et ceux d’individus sains. Particulièrement, il a été observé une augmentation de la production de ROS [116], de la dé-granulation [117], de l’activité protéolytique ainsi qu’une augmentation de la libération d’élastases [118, 119], de métalloprotéinases matricielle (MMP) [118, 120, 121] et de l’apoptose [122, 123]. De plus, on observe une diminution dans l’activité anti-microbienne [124] et une dérégulation dans la production de cytokines [125].

ii Les macrophages

Dans la mucoviscidose, plusieurs défauts fonctionnels ont été observés au niveau des macrophages [126]. Ils présentent une diminution de leur capacité de clairance des cellules apoptotiques [123, 127–129], de la production de cytokines [130–133] et une diminution de la capacité de phagocytose [132–137]. Les macrophages montrent aussi une dérégulation du mécanisme de leur recrutement et de leur fonction phagocytaire bien avant leur stimulation par l’infection [138].