Interactome in vivo
overview
Romain Roncagalli
roncagalli@ciml.univ‐mrs.fr
Etude de la signalisation dans les cellules immunitaires primaires
Lymphocytes T, B, NK
La signalisation est dependente des récepteurs antigeniques
ZAP‐70 Lck
TCR
LAT
Y136 Y171 Y191 Y226
P PP
PLC-
Gads
SLP‐76 P
Grb2
Proliferation Activation
Secretion of cytokines Proximal signaling in T cells
Cellule T immature
thymus périphérie
Y136 Y171 Y191 Y226
P PP
PLC-
GadsSLP-76
Grb2P
Pas de cellules T
LAT est essentiel pour le développement des cellules T
Blocage dans le développement
Cellule T immature
thymus Périphérie (rate, ganglions)
LAT Y136F/Y136F
LAT est essentiel dans le maintien de l’homéostasie des cellules T
Y136F
Y171 Y191 Y226 P
PGads SLP-76
Grb2P
Éducation thymique altérée
Expansion anarchique Lymphoprolifération
Hypersécrétion cytokinienne Hyperimmunoglobulinémie IgE/G1
Splénomégalie lymphadénopathie
Aguado et al, Science 2002
La signalisation du TCR est défectueuse dans les cellules T LATY136F
Non stim CD3/CD28 +IL2
0 102 <B‐FITC‐A>103 104 105 0
50 100 150 200 250
# Cells 1.89
0 102 <B‐FITC‐A>103 104 105 0
200 400 600
# Cells 6.57
0 102 <B‐FITC‐A>103 104 105 0
100 200 300
# Cells 98.7
0 102 <B‐FITC‐A>103 104 105 0
100 200 300 400 500
# Cells 59.1
Prolifération LAT+/+
LATY136F
LAT
Y136 Y171 Y191 Y226
P PP
PLC‐
Gads SLP-76
Grb2P
SOS
Ras
MAPK
PiP2 IP3
DAG
Ca++
RasGRP1
ADAP NCK Vav
Division cellulaire Survie
Réorganisation du cytosquelette Sécrétion de cytokines
LAT: un nœud essentiel dans la signalisation des cellules T
Molecular phenotype Cellular phenotype
phenotypes emerge from perturbed molecular networks
Change in the cellular environment:
e.g. TCR activation Point mutation
Signalisation du TCR
Acuto et al Nat Rev Immunol2008)
identifying the maximum of interactions, (ou pourquoi utilisé la MS/MS et ne pas trouver uniquement ce que l’on cherche)
IP: LAT IB: P-Tyr
Stimulation - + - + - +
Silver stain LAT
Sepharose beads PA
1
2 BAIT
BAIT 1
2
Initiate a program that will allow to integrate all components of the TCR signaling events
Interactome protein X
Condition A Unstimulated WT protein
Condition B Stimulated
Mutant protein
Signalisation du TCR
Parameters to integrate:
TCR affinity
Time of stimulation Cell type
Costimulation
Autres parametres techniques à integrer:
Choix du Tag
Le type de stimulation (T°C, tubes, Flask…) Le « STOP » de la réaction
Le buffer de lyse utilisé
Concentration en sels du pulldown
Le choix du TAG !!!
BAIT TAG
N ou C‐term
Taille du Tag (encombrement sterique) Affinité pour la purification
Spécificité pour la purification Stringence de l’élution
Kinase/Phosphatase Adaptor
Transcription factor Enzymes…
- + - + - +
NP-40 0.5% LM 0.2%
50 35 100 75
Anti-CD3+CD4
150
NP-40 1% LM 2%
IP: LAT IB: P-Tyr
Short exposure Long exposure
Currently chosen for MS experiment n-dodecyl--lauryl maltoside
Optimization of detergent conditions for affinity purification of signaling complexes in primary T cells
L’arrêt de la stimulation
Changement de T°
Centrifugation
Lyse des les cellules
Interactome des cellules T
Génération de souris Knock-in
protein StrepTag
GSG linker Last exon
BAIT TAG
Protéines impliquées dans la signalisation du TCR
Pourquoi ? niveau d’expression physiologique de la proteine appat d’interet étudier les interactions dans des cellules primaires
pouvoir modifier le système directement sur la souris
Signalisation du TCR
BAITs
CD28
Card11 (CARMA1) ptpn6 (SHP1) Plcg1 Rasgrp1 LAT
LATpour (LAT136) Fyb (ADAP) Lat2 (NTAL) Pag1 grb2 Nck1
Inpp5d (SHIP‐1) Zap70
SLP‐76 Vav‐1 c‐CBL LCK
Identification de l’interactome des protéines intervenant dans la signalisation du TCR
BAIT
Extraction des protéines Souris knock‐in
Purification des Cellules T CD4+
Strep‐Tag
résine
Strep‐tactin
Complexe BAIT+
protéines interactrices
résine
purification
élution biotine
Identification des protéines du complexe Spectrométrie de masse
SLP‐76
Src homology 2 (SH2) domain‐
containing leukocyte protein of 76 kDa
Un exemple:
SKAP
Normal development and functions of T cells
from SLP-76 ST mice
résine Strep‐tactin
Complexe BAIT+
protéines interactrices
résine
purification
élution biotine
Identification des protéines du complexe
Spectrométrie de masse
Expression and pulldown of SLP-76 ST protein
Visual Cytoscape
SKAP
Detect MS1 peptides
Track MS1 peptides across LC-MS runs
Combine MS1 with MS2 identifications
Extract MS1 peptide profiles
m/z = 1520 Da z = 2
Tr = 45 min.
Protein XY SQ: KGCLAL
A label free approach to determine peptide
abundances
Themis
time Stimulation
time Stimulation
Temporal control in the formation of signalosome complexes following T cell activation
Weak interaction
Strong interaction
‐0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
0 50 100 150 200 250 300 350
Clusters based on the kinetic of interaction with SLP76
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
0 50 100 150 200 250 300 350
‐0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
0 50 100 150 200 250 300 350
SLP‐76
Group 1 Group 2 Group 3
Combiner des interactomes de plusieurs BAITs, et integrer la cinetique de stimulation
Quantifier le degres d’interaction
Quantifier de manière absolue ou relative le nombre de molecules qui interagissent entre elles
Autres interêts du modele in vivo
Comprendre les mecanismes « fins » de l’activation de cellules T
TCR transgenique
X
Souris KI SLP‐76ST/ST
Identifier des differences de signalisation dans des populations particulières
Souris KI Foxp3+ EGFP
X
Souris KI SLP‐76ST/ST
EGFP
CD4
Definir les genes associés à un facteur de transcription in vivo
Souris KI StrepTag
Transcriptional role of cyclin D1 in development revealed by a genetic‐proteomic screen.
Nature. 2010 Jan 21;463(7279):374‐8.
Perturber le systeme
modele de maladie
X
Souris KI SLP‐76ST/ST
Souris KO/KI
X
Souris KI SLP‐76ST/ST
WT LAT KO/mutant predicted
LAT KO/mutant Observed
Etudier et comparer les interactomes de differents types cellulaires
Grb2
Proteine ubiquitaire
Cellules immunitaires Fibroblastes
Neurones
Bernard & Marie Malissen
o Claude Grégoire o Sandrine Henri o Rachel Joly o Yinming Liang o Hervé Luche o Camille Malosse o Aurélie Malzac o Diana Ordonez o Kavita Reginald oSamira Tamoutounour o Dorothea Terhorst oAmandine Sansoni
oLaurence Ardouin-Bataille
Acknowledgments
IMSB, ETH Zürich Ruedi Aebersold Matthias Gstaiger Simon Hauri
IPBS, Toulouse
Bernard Monsarrat Karima Chaoui
Anne Gonzalez‐de‐Peredo MaP, Marseille
Luc Camoin
Stephane Audebert Emilie Baudelet
iRTSV CEA, Grenoble Jerome Garin
Yohann Couté Anne‐Marie Hesse
