Influence de la monensine sur l'ultrastructure et la composition biochimique des fractions parietales du Botrytis cinerea

Influence de la monensine sur la composition lipidique et protéique des culots membranaires chez Botrytis cinerea Pers. et Sclerotium rolfsii Sacc.

Yahya Koulali, Jean Louis Fonvieille, Abbes Es-Sgaouri et Robert Dargent

Résumé : Les membranes de jeunes hyphes en croissance de Botrytis cinerea et de Sclerotium rolfsii en présence ou en absence de monensine ont été isolées, et leur composition chimique a été déterminée. La monensine induit des variations de la proportion de différents constituants membranaires, se traduisant par une importante réduction des valeurs des rapports protéines/lipides et stérols/phospholipides. Ces modifications montrent que la monensine affecte le trafic vésiculaire et donc une biosynthèse et une croissance normales.

Mots clés : monensine, membranes, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii.

Abstract: Membranes of young hyphae of Botrytis cinerea and Sclerotium rolfsii in the presence or absence of monensin were isolated and their chemical content was determined. Monensin induced a reduction of protein/lipid and sterol/phospholipid ratios. These modifications show that monensin affects vesicular traffic and also both the normal biosynthesis and growth.

Key words: monensin, membranes, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii.

Koulali et al. 944

La monensine, ionophore carboxylique, se lie aux ions Na

, K

et à des protons pour former des complexes ion–ionophores solubles dans les constituants lipidiques de la membrane biologique (Pressman et Fahim 1982; Bergen et Bates 1984). Elle provoque un déséquilibre ionique de part et d’autre de la membrane de la cellule, de la vésicule ou d’un compartiment subcellulaire (Mollenhauer et al.

1990). Cet ionophore est très utilisé pour l’étude des phéno- mènes sécrétoires aussi bien chez les cellules animales que végétales (Tartakoff 1983; Chrispeels 1983; Boss et al. 1984;

Mollenhauer et al. 1990; Speranza et Calzoni 1992; Calzoni et al. 1993; Ciampolini et al. 1993; Hoffmann-Benning et al.

1994; Satiat-Jeunemaitre et al. 1994; Qiu et al. 1995), son

site d’action étant l’appareil de Golgi. Cependant aucune atten- tion n’est attribuée à l’étude des effets de la monensine sur la composition chimique des membranes, bien que celles-ci soient impliquées dans l’élaboration et le transport des cons- tituants de la paroi cellulaire. Elaborés au niveau du réticu- lum endoplasmique et des dictyosomes, et transportés par les vésicules, ces constituants sont libérés, après fusion de la membrane vésiculaire avec le plasmalemme, et déversés dans l’espace périplasmique servant ainsi à la construction de nouvelles parois.

Dans des travaux antérieurs, nous avons montré que le site d’action de la monensine chez les champignons filamen- teux est l’appareil de Golgi (Koulali 1992) et que cet iono- phore a une influence sur la composition chimique des parois (Koulali et al. 1992, 1996a, 1996b, 1998) et sur la sé- crétion et la structure des exopolysaccharides (Koulali et al.

1996a) chez des champignons appartenant à différents grou- pes taxonomiques. Dans le présent travail, pour mieux com- prendre l’impact de la monensine sur les phénomènes sécrétoires, nous rapportons les effets de cet effecteur sur la composition chimique des culots membranaires chez deux genres : le Botrytis cinerea Pers. et le Sclerotium rolfsii Sacc.

Matériel biologique

Les espèces utilisées, le Botrytis cinerea Pers. et le Sclerotium rolfsii Sacc., proviennent du Centraalbureau voor Schimmelcultu- res, Baarn, Pays-Bas (n

126.58 et 224.51 respectivement).

Reçu le 2 mars 1998. Révision reçue le 21 juillet 1998.

Accepté le 31 juillet 1998.

Y. Koulali. Laboratoire d’amélioration de la production végétale, Faculté des sciences et techniques, Université Hassan 1

, Km 3,5, route de Casablanca, B.P. 577, Settat, Maroc, et Laboratoire de mycologie végétale, Université Paul Sabatier, 118, route de Narbonne, 31062 Toulouse Cédex, France.

J.-L. Fonvieille et R. Dargent.

Laboratoire de mycologie végétale, Université Paul Sabatier, 118, route de Narbonne, 31062 Toulouse Cédex, France.

A. Es-Sgaouri. Laboratoire de biologie et physiologie végétales, Faculté des sciences I - Ain Chock, Université Hassan II, Km 8, route El Jadida, B.P. 5366 Maarif, Casablanca, Maroc.

1

Auteur à qui adresser toute correspondance.

Techniques générales

Le B. cinerea a été cultivé sur le milieu de culture mis au point par Thomas (1972) dont la composition par litre est la suivante : 20 g glucose, 1,12 g

-asparagine monohydrate, 0,8 g CaH

(PO

)

·H

O, 1,5 g KH

PO

, 0,5 g MgSO

·7H

O, 0,02 g MnSO

·H

O, 0,02 g ZnSO

·H

O, 0,01 g CuSO

·5H

O, 0,04 g FeSO

·7H

O. Le pH est ajusté à 4,5. Le Sclerotium rolfsii a été cultivé sur le milieu de culture mis au point par Dupont (1983) dont la composition par litre est la suivante : 10 g glucose, 5 g Corn steep liquor, 1 g KH

PO

, 1,5 g MgSO

·7H

O, 0,4 g NaO

, 5 ppm thiamine. Le pH est ajusté à 4,5. Ces milieux liquides ont été mis dans des fioles de Roux à section trapézoïdale à raison de 100 mL par fiole puis stérilisés à l’autoclave à 110°C pendant 20 min. Les ensemencements ont été faits à partir d’une suspension mycélienne issue de précultures âgées de 6 jours, broyées stérile- ment à l’ultra turax pendant 30 s.

Préparation de la monensine

À partir d’une solution mère de monensine (Sigma) dissoute dans l’éthanol à 90°C (50 µ g/ µ L) nous avons effectué des dilutions de manière à obtenir la concentration de 10 µ g/mL. La monensine a été ajoutée aseptiquement au milieu de culture avant l’ensemencement.

Conditions de développement

Les cultures en condition statique ont été mises à incuber à 24°C et à l’obscurité.

Isolement et purification des membranes

Nous avons mis à profit pour cette étude les techniques mises au point au cours des travaux conduits antérieurement sur des espèces fongiques (Touze-Soulet et Dargent 1977; Fonvieille 1985;

El Mougith et al. 1988; Koulali et al. 1996b).

L’isolement est réalisé à partir de mycélium âgé de 4 jours.

Après filtration sous vide et lavage à l’eau distillée, le mycélium essoré est broyé dans du tampon Tris–HCl 0,05 M de pH 7,4 contenant du saccharose 0,25 M, de l’EDTA di-sodique 1 mM et du MgCl

0,1 mM. Deux antibiotiques sont ajoutés : le chloram- phénicol et la cycloheximide à raison de 200 mg/L chacun.

Après un broyage à l’ultra-turax pendant 1 à 2 min, la suspen- sion obtenue est homogénéisée dans un broyeur à bille de verre DYNO-MILL de type KDL refroidi par un courant d’eau : six broyages d’1 min, séparés par 1 min d’arrêt avec refroidissement continu, sont réalisés. Le broyat contenant les billes de verre est centrifugé 10 min à 3000 tours/min. Le surnageant S

est réservé et le culot est soumis à un nouveau broyage identique au précédent.

Les billes de verre sont éliminées par filtration sous vide sur un verre fritté de porosité 1. Le filtrat est centrifugé comme précé- demment et le surnageant S′

est réuni au précédent. Le culot contenant les parois est éliminé et les surnageants S

et S′

sont traités en vue de l’obtention des membranes. Les surnageants (S

+ S′

) sont centrifugés à 7000 tours/min pendant 20 min. Le culot contenant les mitochondries est éliminé et le surnageant est soumis à une nouvelle centrifugation identique à la précédente. Le surnageant obtenu est soumis à une nouvelle centrifugation à 30 000 tours/min dans un rotor angulaire (Beckman, modèle 50.2Ti) pendant 20 min. Le surnageant est éliminé et le culot ainsi obtenu est lavé deux à trois fois dans le tampon Tris–HCl 0,1 M sans sac- charose et sans antibiotiques. L’absence des mitochondries dans les culots membranaires a été vérifiée par la recherche de l’activité de la succinate déshydrogénase selon la méthode de Marriott (1975).

À la fin, les membranes sont récupérées par centrifugation à 30 000 tours/min et lyophilisées.

Techniques biochimiques

Les protéines ont été dosées par la méthode de Lowry modifiée par addition de déoxycholate selon Dunn et Maddy (1976).

L’identification et le dosage des acides aminés totaux provenant d’une hydrolyse à l’HCl 6 M pendant 15 h à l’étuve, à 100°C, ont été réalisés à l’auto-analyseur Beckman.

Les lipides ont été extraits selon la méthode de Bligh et Dyer (1959) modifiée par Weete et al. (1983). Les phospholipides ont été dosés selon la méthode de Bartlett rapportée par Kates (1975).

Le dosage des stérols libres des lipides totaux a été effectué selon la technique de Stadtman (1957) qui dose le cholestérol et l’ergostérol et celle de Carmack et al. (1976) qui est réalisée sur un précipité obtenu avec la digitonine. Les lipides neutres ont été sé- parés par chromatographie en couche mince sur gel de silice en uti- lisant comme solvant le mélange : hexane – éther éthylique – acide acétique (78:20:4, en volumes). La révélation se fait par pulvérisa- tion avec une solution de rhodamine B à 0,1% dans l’éthanol à 95°C, dilué au 1/10 dans une solution de phosphate monosodique 0,25 M (Wagner et al. 1961). Pour la chromatographie des lipides polaires, nous avons utilisé le solvant de développement suivant : chloroforme – méthanol – eau – acide acétique (65:25:4:1, en volu- mes). Comme révélateur, nous avons utilisé les vapeurs d’iode ou le réactif décrit par Dittmer et Lester (1964). Les proportions des différents lipides neutres ou des phospholipides sont déterminées après élution pendant 2 h des différentes bandes par une solution chloroforme–méthanol (2:1 v/v) additionnée de 0,5% d’acide acé- tique. La silice résiduelle est éliminée par centrifugation 10 min à 6000 tours/min.

Les acides gras ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse. L’extraction et la méthylation des acides gras contenus dans les échantillons de lipides totaux, neutres et polaires s’effectuent selon la méthode décrite par Mc Gee et Allen (1974), modifiée par Gerhardt et Gehrke (1977). L’appareil utilisé était un intersmat IGC 121 DSL avec détecteur à ionisation de flamme. Les analyses ont été effectuées en chromatographie isotherme à la tem- pérature de 185°C. La température de l’injecteur était de 200°C, celle du détecteur de 220°C. Les quantités d’acides gras ont été dé- terminées par rapport à la masse relative du témoin interne, l’acide heptadécanoïque (C17:0) absent dans notre matériel biologique.

La tolérance du B. cinerea et du Sclerotium rolfsii à la monensine a été déterminée auparavant (Koulali et al. 1992, 1996a, 1996b, 1998) et la concentration de 10 µg/mL, seule- ment fongistatique, représente la concentration minimale qui donne le maximum d’effet.

L’activité succino-deshydrogénasique est très faible ou nulle dans les culots membranaires du B. cinerea et du Sclerotium rolfsii témoins ou cultivés en présence de monensine, ce qui indique l’absence de contamination mitochondriale.

L’examen des résultats du tableau 1 montre que chez les

organismes témoins, le pourcentage des protéines varie entre

10% chez le Sclerotium rolfsii et 14% chez le B. cinerea. La

présence de la monensine dans le milieu de culture

n’entraîne pas chez le Sclerotium rolfsii de modifications si-

gnificatives, par contre chez le B. cinerea elle induit une di-

minution plus ou moins importante des teneurs en protéines

(16%). Après hydrolyse chlorhydrique des culots membra-

naires, pour 100 mg de membranes lyophilisées, 30 et

22 µmol d’acides aminés ont été dosés, respectivement, dans

les membranes témoins du B. cinerea et du Sclerotium

rolfsii. En présence de monensine, cette quantité subit

chez le B. cinerea une diminution par rapport au témoin,

confirmant ainsi les résultats mentionnés pour les protéines totales.

Dans les membranes témoins du B. cinerea les acides aminés dominants sont l’asparagine, la leucine et l’alanine, et chez le Sclerotium rolfsii ce sont la valine, l’alanine et la glutamine. En présence de monensine, les variations sont surtout d’ordre quantitatif. Chez le B. cinerea, nous notons l’augmentation des acides aminés soufrés (la cystéine pas- sant de 0,34 à 7,23% et la méthionine de 0,54 à 7,12%) alors que l’alanine et l’arginine subissent une diminution impor- tante (50% environ). Le Sclerotium rolfsii se distingue du B. cinerea par l’augmentation de la phénylalanine (2,88×), de la lysine (2,61×) et de l’arginine (35%) et la diminution de la proline (75%) et des acides aminés soufrés (la méthio- nine : 75% et la cystéine : 70%).

Chez les deux espèces étudiées, le pourcentage des lipides totaux des culots membranaires témoins oscille entre 25%

chez le Sclerotium rolfsii et 27% chez le B. cinerea (tableau 2).

En présence de monensine les variations sont fonction de l’espèce étudiée : chez le B. cinerea nous notons une augmentation des lipides totaux (3,60%) alors que chez le Sclerotium rolfsii, comme pour les protéines, la monensine n’induit pas de grandes modifications. C’est pourquoi, le rapport protéines/lipides reste pratiquement stable chez cette espèce (0,40), alors que chez le B. cinerea, il subit une dimi- nution de 19%.

Les phospholipides dans les culots membranaires ont une teneur allant de 17% chez le Sclerotium rolfsii à 20% chez le B. cinerea. La monensine exerce une action importante sur ces constituants lipidiques; leur augmentation considérable

étant notée chez les deux espèces étudiées (B. cinerea, 37%;

Sclerotium rolfsii, 33%). Après séparation par chromatographie monodimensionnelle en couche mince, les différents phos- pholipides sont dosés par estimation du phosphore après mi- néralisation. Chez les organismes témoins, les phospholipides principaux au niveau des culots membranaires sont la phos- phatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine (36 et 20%

respectivement chez le B. cinerea; 44 et 30% respectivement chez le Sclerotium rolfsii). Le B. cinerea se caractérise aussi par la teneur importante de la lysophosphatidyléthanolamine (16%). La présence de monensine dans les milieux de cul- ture entraîne, par rapport aux témoins, des variations d’ordre quantitatif. Chez le B. cinerea, nous remarquons une dimi- nution considérable de la lysophosphatidyléthanolamine, qui est à l’état de trace, de la phosphatidylcholine (47%) et de la phosphatidyléthanolamine (28%) et une augmentation des autres phospholipides (diphosphatidylglycérol ou cardio- lipides, 7,71×; acide phosphatidique, 4,36×; l’ensemble phosphatidylsérine + phosphatidylinositol, 66%). Chez le Sclerotium rolfsii, l’ionophore provoque une diminution de la phosphatidylcholine (47%) et de la phosphatidyléthanola- mine (10%), et une augmentation considérable de l’acide phosphatidique (3,89×), de l’ensemble phosphatidylsérine + phosphatidylinositol (78%) et des cardiolipides (54%).

Les stérols libres représentent, dans les culots membra- naires témoins, entre 9% chez le Sclerotium rolfsii et 12%

chez le B. cinerea. Dans les membranes, les phospholipides sont liés aux stérols, et de nombreux travaux ont montré l’importance du rapport stérols/phospholipides. Nous avons calculé ce rapport : il est égal à 0,52 chez le Sclerotium rolfsii Botrytis cinerea Sclerotium rolfsii

Témoin Monensine Témoin Monensine

Protéines

14,09±1,14 11,85±0,23 10,07±0,75 9,97±1,20

Acides aminés

Asparagine 12,37 11,77 8,19 10,54

Thréonine 7,34 8,12 5,18 5,15

Sérine 8,45 9,20 8,14 6,10

Glutamine 9,93 9,75 10,65 9,47

Proline 6,32 6,25 4,73 1,20

Glycine 7,04 7,12 8,70 9,23

Alanine 10,12 4,76 12,29 11,14

Valine 5,63 — 17,72 10,39

Cystéine 0,34 7,23 1,12 0,33

Méthionine 0,54 7,12 1,03 0,26

Isoleucine 4,78 5,18 4,15 5,67

Leucine 11,26 10,28 7,72 9,71

Tyrosine 1,97 2,45 1,13 1,05

Phénylalanine 4,44 4,13 2,14 6,18

Lysine 5,18 4,37 3,49 9,12

Histidine — — 1,35 1,40

Arginine 4,23 2,27 2,27 3,06

Total 30,38 26,03 22,23 22

a

Les résultats sont exprimés en pourcentage du poids des membranes lyophilisées. Ils représentent la moyenne de cinq dosages.

b

Les résultats sont exprimés en pourcentage de la somme des acides aminés, sauf pour le total qui est exprimé en micromoles pour 100 mg de membranes lyophilisées.

Tableau 1. Variation du contenu en protéines et des proportions des différents acides

aminés des culots membranaires sous l’influence de la monensine.

et 0,60 chez le B. cinerea. En présence de monensine, les stérols, chez les deux espèces, subissent une inhibition oscillant entre 6,50 chez le B. cinerea et 10,40% chez le Sclerotium rolfsii, ce qui entraîne la réduction des rapports stérols/phos- pholipides d’environ 32% chez les deux espèces.

Les lipides neutres ont été séparés par chromatographie en couche mince sur gel de silice. Chez le B. cinerea, les trigly- cérides (33%), les diglycérides (26%) et les acides gras li- bres (23%) sont les plus abondants dans les membranes témoins. En présence de monensine, ces lipides neutres res- tent majoritaires, mais par rapport au témoin, les trigly- cérides subissent une augmentation considérable (78%) alors que les diglycérides et les acides gras libres subissent des di- minutions (50 et 19% respectivement). Chez le Sclerotium rolfsii, les lipides neutres majoritaires, en absence comme en présence de l’ionophore, sont les acides gras libres (58 et 74% respectivement) et la présence de la monensine pro- voque ainsi leur augmentation (28%). Les monoglycérides (17%) et les stérols estérifiés + acides gras estérifiés (5%) subissent des diminutions importantes en présence de cet ef- fecteur (76 et 65% respectivement).

Enfin, les acides gras ont été analysés par chromato- graphie en phase gazeuse en présence d’un témoin interne, l’acide heptadécanoïque (C17:0), absent chez les deux espèces étudiées. Les proportions des acides gras constitutifs des différents culots membranaires, ainsi que les taux d’insaturation sont résumés dans le tableau 3.

Dans les lipides totaux des culots membranaires témoins du B. cinerea les acides gras dominants sont l’acide palmi- tique (C16:0, 39%) et l’acide oléique (C18:1, 32%). Par contre chez le Sclerotium rolfsii, l’acide gras majoritaire est l’acide linoléïque (C18:2, 60%) suivi de l’acide palmitique (22%). En présence de monensine, la comparaison avec les témoins fait apparaître chez les deux espèces étudiées, à

quelques exceptions près, une diminution des acides gras sa- turés au profit des acides gras insaturés. C’est ainsi que, en ne tenant compte que des acides gras les mieux représentés, chez le B. cinerea, nous notons la diminution des acides pal- mitique (C16:0, 46%) et stéarique (C18:0, 64%) et l’aug- mentation des acides linoléïque (C18:2, 3×) et α-linolénique (C18:3, 6×) et chez le Sclerotium rolfsii, les acides palmi- tique (C16:0) et stéarique (C18:0) diminuent (37 et 29% res- pectivement) et l’acide linoléïque (C18:2) augmente (24%).

Le degré d’insaturation des lipides totaux des culots mem- branaires varient sous l’action de la monensine, subissant chez les deux espèces une augmentation considérable (3×).

La composition en acides gras des phospholipides et des lipides neutres, témoins, est identique à celle des lipides to- taux, exception faite de certains acides gras comme par exemple l’acide palmitoléique (C16:1) chez le B. cinerea qui subsiste à l’état de trace. Nous trouvons les mêmes acides gras majoritaires, mais les taux d’insaturation sont très fai- bles par rapport à ceux des lipides totaux. La présence de la monensine induit par rapport aux lipides totaux des varia- tions faibles. Elles vont toujours vers le sens d’une augmen- tation des acides gras insaturés, ce qui entraîne une augmentation des indices d’insaturation.

Dans le cadre de recherches sur la morphognèse des champignons filamenteux, nous avons utilisé la monensine comme effecteur chimique connu pour interférer avec les mécanismes de la croissance. Des travaux antérieurs ont montré que les champignons sont sensibles à la monensine (Liu 1982). L’ionophore a une influence sur la morphoge- nèse fongique (Poli et al. 1986; Sewall et al. 1986; Pancaldi et al. 1994) et inhibe la croissance et la biosynthèse des lipides Botrytis cinerea Sclerotium rolfsii

Constituants Témoin Monensine Témoin Monensine

Lipides totaux 27±1,30 27,98±1,20 25,13±1,07 24,87±1,35

Phospholipides 20,30±0,95 27,80±1,45 17,45±0,75 23,14±1,15

Phosphatidylcholine 36,46 19,30 43,90 23,14

Phosphatidyléthanolamine 19,58 14,15 29,87 27,01

Lysophosphatidylcholine 8,30 9,38 7,38 16,86

Phosphatidylsérine + phosphatidylinositol 12,55 20,78 10,50 18,64

Lysophosphatidyléthanolamine 16,14 — 2,64 2,14

Acide phosphatidique 5,18 22,59 1,64 5,68

Cardiolipides 1,79 13,80 4,25 6,53

Stérols 12,05±0,52 11,27±0,85 9,05±0,74 8,11±0,95

Lipides neutres

Monoglycérides 13,86 7,31 16,94 4,05

Diglycérides 26,36 13,05 5,93 5,17

Acides gras libres 23,20 18,81 57,65 73,50

Triglycérides 33,14 59,06 15,05 15,74

Stérols estérifiés + acides gras estérifiés 3,44 1,77 4,43 1,54

Protéines/lipides (%/%) 0,52 0,42 0,40 0,40

Stérols/phospholipides (%/%) 0,60 0,41 0,52 0,35

Nota : Les valeurs des lipides totaux sont exprimées en pourcentage du poids des membranes lyophilisées. Celles des phospholipides et des stérols sont exprimées en pourcentage du poids des lipides totaux. Elles représentent la moyenne de cinq dosages. Les autres valeurs sont exprimées en pourcentage du total de chaque classe lipidique.

Tableau 2. Composition lipidique globale des culots membranaires en présence et en absence de monensine.

(Weete et al. 1989; Fonvieille et al. 1991). Dans un précé- dent travail (Koulali et al. 1992, 1996a, 1996b, 1998), nous avons montré que la monensine modifie la composition globale des parois ainsi que la sécrétion et la structure des exopolysaccharides de champignons appartenant à différents groupes taxonomiques. Le changement de l’environnement lipidique des enzymes liées à la membrane plasmique, pourra lui aussi expliquer les variations dans la composition pariétale, comme cela a été supposé par Mpona-Minga et al.

(1989) alors qu’ils étudiaient l’action de l’amphotéricine B sur la biosynthèse des parois chez le Candida albicans. De plus, l’inhibition de la croissance fongique peut résulter d’une altération de la synthèse des stérols (Weete et al. 1989).

Les travaux portant sur la cytochalasine A (El Mougith 1986) ont montré que les modifications de la morphogenèse hyphale chez Mucor mucedo sont le résultats d’une dévia- tion du métabolisme lipidique. La monensine a une action sur la distribution des activités enzymatiques des fractions subcellulaires (Melroy et Jones 1986; Koulali et al. 1996a, 1996b). Enfin, chez l’Achlya bisexualis, nous avons montré que, le site d’action de la monensine est l’appareil de Golgi et que sa présence dans le milieu de culture a un impact né- gatif sur la composition et le fonctionnement des différents systèmes endomembranaires impliqués dans les processus sécrétoires, et donc dans les mécanismes de croissance (Koulali 1992; Koulali et al. 1996b).

En ce qui concerne les membranes « totales », les seuls travaux que nous connaissons sont relatifs à la composition lipidique de la fraction membranaire totale de Phytophthora capsici (Turelli et al. 1982), de Scopulariopsis brevicaulis (Fonvieille 1985) et de Candida albicans (Goyal et Khuller 1992), ce qui limite beaucoup les comparaisons qui pour-

raient être faites avec les résultats que nous obtenons, et qui en souligne leur originalité et donc leur intérêt.

On sait, d’après les nombreux travaux entrepris sur les membranes animales, végétales et celles de certains microor- ganismes, que leur nature est essentiellement lipo-protéique.

D’après Weete (1980), la quantité de lipides dans les membranes fongiques varie entre 30 et 50%. Les valeurs que nous avons trouvées pour nos deux espèces se situent près de leur limite inférieure (entre 25 et 28%). Chez le Scopulariopsis brevicaulis, Fonvieille (1985) trouve 19,66%

et chez le C. albicans (Goyal et Khuller 1992), le taux de li- pides dans la fraction microsomale de la forme mycélienne représente 18,5% du poids de la fraction, et celui de la forme levure, seulement 16,1%, valeurs légèrement inférieures aux nôtres. Les taux de protéines chez les témoins des deux espèces étudiées est compris entre 10 et 14%. Chez le Scopulariopsis brevicaulis, la teneur en protéine est de 21,68% (Fonvieille 1985).

Les teneurs en phospholipides totaux des culots mem- branaires de nos deux espèces (environ 20% des lipides totaux) sont très élevées par comparaison avec celles du Scopulariopsis brevicaulis (10,14%) (Fonvieille 1985) et du C. albicans (3,11% chez la forme levure et 4,14% chez la forme mycélienne) (Goyal et Khuller 1992). Les travaux de Mazliak (1971), d’Erwin (1973), de Mac Murray (1973) et de Thompson (1980) ont montré l’importance des phospholi- pides dans la biogenèse des membranes. Il ressort de ces études que deux phospholipides sont dominants : la phos- phatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine. Chez nos deux organismes, nous trouvons le même profil : l’ensemble phosphatidylcholine + phosphatidyléthanolamine représente 70,76% chez le Sclerotium rolfsii et 55,06% des phospholi-

C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C22:0 DI

Lipides totaux Botrytis cinerea

Témoin 0,84 0,34 38,61 0,44 12,08 32,35 13,92 1,40 — 1,87

Monensine 0,55 0,19 20,87 0,42 4,41 22,18 43,05 8,32 — 5,69

Sclerotium rolfsii

Témoin 0,48 1,89 21,78 0,10 8,81 6,87 59,42 — 0,66 2,64

Monensine 0,17 1,62 13,76 0,19 6,29 4,38 73,38 — 0,20 8,08

Lipides neutres Botrytis cinerea

Témoin 0,46 0,18 43,68 — 10,56 32,59 11,61 0,91 — 0,59

Monensine 1,02 0,22 34,92 0,06 7,81 28,64 24,95 2,39 — 0,86

Sclerotium rolfsii

Témoin — 1,58 33,71 — 7,47 3,91 45,22 — 8,09 0,96

Monensine 0,13 2,10 20,89 — 8,33 5 61,84 — 1,71 1,31

Phospholipides Botrytis cinerea

Témoin 0,42 0,36 49,38 — 14,18 27,09 7,66 0,91 — 0,46

Monensine 0,43 0,28 32,48 — 3,24 28,38 32,09 3,10 — 1,02

Sclerotium rolfsii

Témoin 0,80 0,58 39,02 0,43 11,04 4,91 43,22 — — 0,92

Monensine 0,12 2,10 24,36 1,35 5,28 5 59,77 — 2,02 1,28

Nota : Les résultats sont exprimés en pourcentage du total des acides gras. DI, degré d’insaturation : 1,0 (% monoènes/100) + 2,0 (% diènes/100) + 3,0 (% triènes/100) + 4,0 (% tétraènes/100) + 5,0 (% pentaènes/100); —, traces.

Tableau 3. Composition en acides gras des lipides des culots membranaires en présence et en absence de monensine.

pides totaux chez le B. cinerea. Chez le Scopulariopsis brevicaulis, il représente 80% des phospholipides totaux (Fonvieille 1985) et chez le C. albicans, il est compris entre 47% chez la forme levure et 52% chez la forme mycélienne (Goyal et Khuhller 1992).

En ce qui concerne les lipides neutres, leur teneur varie en fonction de l’espèce étudiée : chez le B. cinerea, les lipides neutres majeurs sont les triglycérides, les diglycérides et les acides gras libres; par contre chez le Sclerotium rolfsii, nous avons les acides gras libres et les monoglycérides. Ces résul- tats hétérogènes, peuvent s’expliquer par l’appartenance à des groupes taxonomiques différents. Chez le Scopulariopsis brevicaulis, les lipides neutres majoritaires sont les triglycé- rides (61,86%) et les diglycérides (19%) (Fonvieille 1985).

Dans les culots membranaires, les stérols représentent entre 9 et 12% des lipides totaux. Les stérols fongiques jouent un rôle essentiel associé aux phospholipides sur la perméabilité (Weete 1980) et la fluidité (Thompson 1980) membranaires. Chez les deux espèces étudiées, les rapports stérols/phospholipides sont compris entre 0,52 et 0,60% res- pectivement.

Enfin, l’analyse des acides gras montre que chez le B. cinerea, ce sont les acides palmitique (C16:0) et oléique (C18:1) qui sont les plus importants (39 et 32% respective- ment). Par contre, chez le Sclerotium rolfsii, l’acide gras ma- jeur est l’acide linoléïque (C18:2; 59%), ce qui se traduit par un degré d’insaturation élevé (2,64) chez cette espèce.

Turelli et al. (1982) montrent que le matériel membranaire de P. capsici, responsable du mildiou du piment, renferme un taux important d’acides gras saturés (acide palmi- tique (C16:0) et acide stéarique (C18:0)), l’acide gras insa- turé le plus abondant étant l’acide oléique (C18:1). Chez le Scopulariopsis brevicaulis, les acides gras les mieux repré- sentés sont les acides linoléïque (C18:2; 31,6%) et oléique (C18:1; 24,74%) suivi de l’acide palmitique (C16:0;

23,24%) (Fonvieille 1985). Chez le C. albicans (formes my- célienne et levure), l’acide gras dominant est l’acide palmi- tique (C16:0) représentant entre 40 et 50% selon la forme levure ou mycélienne (Goyal et Khuhller 1992).

Aucune attention n’a été donnée à l’action de la monen- sine sur les constituants membranaires, bien que différents rapports ont suggéré que la sécrétion lipidique soit altérée par la monensine dans les cellules. Miller-Prodraza et Fishman (1984), Saito et al. (1984), et Gundlach et al.

(1991) montrent que la monensine provoque l’accumulation cellulaire des glycosyl- et lactosylceramides. De leur coté, Van Meer et Van’t Hof (1993) montrent que la sécrétion des sphingolipides dans les cellules MDCK est altérée en pré- sence de la monensine. Shiao et Vance (1993) et Redman et al. (1997) constatent que la monensine n’affecte ni la syn- thèse de sphingomyéline ni son transport vers la surface cel- lulaire. Enfin, Inabayashi et al. (1995) montrent que la monensine modifie la conductance des phospholipides mem- branaires.

En présence de monensine, chez les deux espèces étu- diées, les modifications les plus importantes concernent la diminution des teneurs en stérols ainsi que l’augmentation des teneurs en phospholipides. Des résultats analogues ont été obtenus dans la membrane plasmique d’Achlya bisexua- lis (Koulali et al. 1996a, 1996b). Ces variations pourraient agir sur le fonctionnement des membranes compte tenu du

rôle de ces deux catégories lipidiques dans les phénomè- nes de perméabilité. La diminution des teneurs en protéi- nes est en accord avec les résultats trouvés par différents auteurs (Tartakoff et Vassalli 1978; Tartakoff 1983;

Heupke et Robinson 1985; Melroy et Jones 1986; Sticher et Jones 1988; Mollenhauer et al. 1990; Moore et al. 1991;

Speranza et Calzoni 1992; Satiat-Jeunemaitre et al. 1994;

Podila et al. 1995). Quant aux lipides qui subissent, chez le B. cinerea, une légère augmentation en présence de monen- sine, nous n’avons trouvé aucune information dans la littéra- ture pour expliquer ce résultat. Par contre, leur diminution dans le mycélium entier a été signalée chez l’A. bisexualis, Taphrina deformans et Neurospora crassa par Weete et al.

(1989) et chez l’A. bisexualis par Fonvieille et al. (1991).

Ces mêmes auteurs ont montré que cet effecteur provoque l’augmentation des phospholipides et la diminution des sté- rols totaux confirmant ainsi nos résultats sur les culots mem- branaires. Weete et al. (1989) suggère que l’arrêt de la croissance serait le résultat de l’inhibition de la biosynthèse des stérols qui provoquerait une interruption des fonctions golgiennes. Thompson (1986) et Hazel et Williams (1990) ont montré le rôle des variations de la composition lipidique des membranes dans l’adaptation des organismes aux condi- tions spécifiques de leur environnement.

La présence de monensine dans le milieu de culture en- traîne une augmentation des acides gras insaturés, entraînant ainsi l’augmentation du degré d’insaturation. Ces résultats confirment ceux trouvés par Weete et al. (1989) et Fonvieille et al. (1991) sur les lipides mycéliens. Bertho et al. (1991) travaillant sur des plantules de poireau rapportent que la monensine bloque le transfert des acides gras de longues chaînes vers les lipides de la membrane plasmique. Poon et al. (1981) ont montré que la variation de la composition en acides gras des phospholipides de la membrane plasmique des lymphocytes T affecte les activités de l’adénylate cyclase et de l’ATPase. Maresca et Cossins (1993) ont montré qu’il y a une relation étroite entre la composition en acides gras et la fluidité membranaire. Benyagoub et al. (1996) ont montré que les acides gras produits par Sporothrix flocculosa inhibent la croissance et modifient la composition lipidique chez trois champignons (Cladosporium cucumerinum, Fusarium oxysporum et Sporothrix flocculosa). L’action antifongique se traduit par une diminution des lipides totaux, une augmentation des acides gras insaturés, des acides gras libres, de l’acide phosphatidique et du rapport stérols/

phospholipides. Ces modifications de la composition lipi- dique conduisent à une augmentation de la fluidité membra- naire chez les champignons sensibles.

En conclusion, les résultats issus de ce travail, à notre connaissance, sont entièrement nouveaux. Ils apportent une claire contribution sur les modifications de la croissance chez les champignons filamenteux, en présence de la mo- nensine. Mais la rareté des travaux, utilisant la monensine, sur la cellule fongique, rend difficile toute interprétation.

Nous avons montré pour la première fois que cet ionophore induit des variations biochimiques des culots membranaires.

La séparation et la purification des différents systèmes

endomembranaires, chez les deux espèces doivent être entre-

prises. La difficulté d’un travail de cet ordre sur les espèces

fongiques filamenteuses réside dans le fait que les filaments

présentent une très grande hétérogénéité : sur quelques milli-

mètres de longueur, l’hyphe est constitué par une zone api- cale de croissance active riche en organites et une zone distale où débutent déjà des phénomènes de lyse, et où peu à peu la vacuole occupe une place importante dans le filament (Dargent 1977). Aussi, il est nécessaire de travailler sur un mycélium pris en début de phase exponentielle de crois- sance, mais ceci réduit considérablement la quantité de ma- tériel récoltée et disponible, surtout en présence de la monensine où la croissance est fortement inhibée (Koulali 1992; Koulali et al. 1992, 1996a).

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