Libération extra-cellulaire de microARN et de complexes nucléo-protéiques par les cellules infectées par EBV : rôle des exosomes et d’autres transporteurs

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Libération extra-cellulaire de microARN et de

complexes nucléo-protéiques par les cellules infectées par

EBV : rôle des exosomes et d’autres transporteurs

Claire Gourzones

To cite this version:

UNIVERSITE PARIS XI, FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

THESE DE DOCTORAT

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI

Spécialité : Cancérologie

Libération extra-cellulaire de microARN et de complexes

nucléo-protéiques par les cellules malignes infectées par EBV: rôle des

exosomes et d’autres transporteurs.

CLAIRE GOURZONES

Directeur de thèse : Dr. Pierre BUSSON

Membres du Jury :

Président : Pr. Eric Deutsch

2

A mes parents, qui m’ont toujours soutenue. Vous avez été là à chaque fois

que j’ai eu besoin de vous. Vous m’avez appris le courage et sans vous je

ne serais rien. Vous êtes des parents formidables !

A mon mari Petr. Je ne pourrais jamais assez te remercier, je n'aurais

jamais pu achever cette thèse sans toi. Merci d'avoir toujours su trouver les

mots pour me redonner du courage quand je commençais à en manquer et

avoir su me faire rire dans les moments difficiles. Tu es la plus belle

rencontre de ces années de thèse !

,

!

A

ma sœur Célia, la personne la plus eбtraordinaire et la plus brillante que

je connaisse.

A toute ma famille, mes grand-parents et Martine pour leur soutient

permanent depuis toujours.

3

Remerciements

Un grand merci au Docteur Pierre Busson qui m’a accueillie dans son équipe, formée et soutenue

pendant toutes les étapes de cette thèse et de l’année de master qui l’a précédée. Je crois que peu de directeurs de thèse sont aussi disponibles pour leurs étudiants. Merci pour ta gentillesse et ta

patience. Merci de m’avoir toujours aidée à surmonter les moments difficiles et d’avoir toujours su trouver des solutions auб problémes techniques que j’ai pu rencontrer au cours de cette thèse. Merci de m’avoir fait travailler sur des sujets innovants et vraiment passionnants, j’ai, grâce à toi,

énormément appris durant ces années de thèse. Merci beaucoup d’avoir participé à la rédaction de

ce mémoire et de l’avoir corrigé.

Je remercie beaucoup Joëlle Wiels et Marc Lipinski de m’avoir accueillie dans leur unité et

soutenue au cours de ma thèse.

Je remercie le Professeur Eric Deutsch pour l’honneur qu’il m’a accordé en acceptant de présider le jury de thèse.

Je remercie le Docteur Corinne Amiel et le Professeur Joël Guigay d’avoir activement participé à l’étude sur les microARN ainsi que Françoise Dantzer qui a partagé avec nous son expertise sur l’enzyme PARP1.

Je remercie beaucoup Henri Gruffat et Corinne Amiel d’avoir accepté d’être les rapporteurs de cette

thèse ainsi que le Professeur Joël Guigay et le Docteur Françoise Dantzer d’avoir accepté de faire partie du jury de thèse.

Je remercie Catherine Durieu de m’avoir très bien formée et conseillée lorsque je suis arrivée dans l’équipe. Merci beaucoup pour ta patience!

Je tiens vraiment à remercier Aurore Gelin qui a apporté dans notre équipe une gentillesse, une chaleur et une bonne humeur extraordinaire. Merci beaucoup d’avoir travaillé avec moi : sans ton

aide, mon travail n’aurait jamais pu aboutir.

Merci beaucoup Anne-Sophie pour ta gentillesse et ton soutient! Ton aide a été particulièrement précieuse pour toutes les expériences in vivo.

Je remercie chaleureusement l’ensemble des membres de l’UMR81β6 qui m’ont tous aidée : Clément, Izabela, Luc, Jihène, Mélanie, Benjamin, Ana, Sonia, Anaïs, Aude, les trois Emilie, Xénia, Chloë, Arman, Schouaïb, Manel, Charles-Henry et Andreï.

4

Résumé

En pathologie tumorale, l’étude du micro-environnement tumoral doit prendre en compte

différents modes de communication cellulaire : contacts directs entre membranes plasmiques, émission et réception de cytokines et enfin émission et internalisation d’objets biologiques plus complexes comme les microvésicules et les exosomes qui peuvent être assimilés à de véritables organites extra-cellulaires.

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) participe à l’oncogenèse de plusieurs affections malignes humaines d’origine épithéliale (carcinomes nasopharyngés ou NPC) ou lymphocytaire (lymphomes

post-transplantation). Dans ces tumeurs, les cellules malignes qui sont infectées de façon latente par EBV libèrent des exosomes et des microvésicules qui contiennent des protéines et des acides

nucléiques d’origine virale. L’étude de ces éléments doit permettre de mieux comprendre les

interactions hôte-tumeur et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic précoce et la surveillance de la maladie sous traitement.

Le premier objectif de ma thèse consistait à étudier la sécrétion par les cellules malignes d’une

famille de microARN viraux appelés miR-BART et leur diffusion dans le sang périphérique chez

les sujets porteurs de tumeurs associées à EBV. Pour la première fois j’ai mis en évidence une

sécrétion d’eбosomes porteurs de miR-BART par les cellules de NPC en culture in vitro. J’ai également montré que les miR-BART, particulièrement miR-BART7, sont détectables dans le plasma de sujets porteurs de NPC. Contrairement à ce qui se passe in vitro, les miR-BART plasmatiques ne sont pas transportés par des exosomes. Des données obtenues chez la souris

montrent qu’ils peuvent être transportés par des compleбes eбtra-cellulaires que l’on peut précipiter au moyen d’anticorps anti-ago2. Nous cherchons à confirmer ces données sur des échantillons de

plasma provenant de patients porteurs de NPC. Ces données pourront guider à l’avenir l’utilisation des miR-BART circulants comme source de biomarqueurs.

Le deuбième volet de ma thèse avait pour but d’étudier les modifications du protéome des

exosomes induites par une oncoprotéine du virus d’Epstein-Barr appelée LMP1 (latent membrane

protein 1). J’ai montré que la LMP1, lorsqu’elle est eбprimée dans les cellules lymphocytaires ou

5

microvésicules mais à des nano-objets non-vésiculaires contenant notamment des histones et de

l’ADN. Nous avons désigné ces objets sous le terme de complexes ADN-protéines extra-cellulaires.

Nous ne savons presque rien de la biogenèse de ces complexes ; nous pensons qu’ils ne proviennent pas uniquement de cellules en apoptose. En revanche, des expériences préliminaires suggèrent que la présence de PARP1 dans ces complexes coïncide avec une activation permanente de la PARP1

induite dans les cellules productrices par l’eбpression de l’oncoprotéine LMP1. Cette hypothèse est

en cours de vérification grâce à des expériences menées sur des lignées cellulaires exprimant différentes formes sauvages ou mutées de la LMP1. Ces données sur l’activation de la PARP1 et sur sa sécrétion induite par la LMP1 auront des retombées intéressantes pour notre compréhension des

6

Liste des abréviations

 Ago2: protein Argonaute 2

 ARNm : ARN messager

 BARF1: BamH1-A rightward frame 1

 BART: BamHI rightward transcripts

 BCR: B-cell receptor

 BER: Base Excision Repair

 BHRF: BamHI rightward open reading frame 1

 BIC: B-cell receptor inducible gene

 BRCA1: Breast cancer 1

 CENP: Centromere Protein

 CCL20 : C-C motif chemokine 20

 Cellules NK: cellules “Natural Killers”

 CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité

 Dcp : mRNA Decapping enzyme

 DGCR8 : DiGeorge syndrome Critical Region 8

 EBER : Epstein-Barr virus Encoded RNA

 EBNA : Epstein-Barr Nuclear Antitigen

 EBV : Epstein-Barr Virus

 EGF : Epidermal Growth Factor

 EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor

 ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

 ERM : Ezrine Radixine Moesine

 ESCRT : Endosomal Sorting Complex Required for Transport

 Exp5 : Exportine 5

 FasL: Fas ligand

 GW182 : Glycine-tryptophan protein of 182 kDa

 HES 1 : Hairy and Enhancer of Split 1

 HLA: Human leukocyte antigen

 HMGA2: High Mobility Group A2

 Hrs: Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate

 Hsp90: Heat shock protein

 HTLV : Human T Leukemia Virus

7

 IL-8 : Interleukine 8

 ILV: vésicules intra-luminales

 IR : Internal Repeat

 IRAK1: Interleukin 1 Receptor-Associated Kinase 1

 IRES : Internal Ribosomal Entry Site

 KSHV: Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus

 LANA: Latency-Associated Nuclear Antigen

 LCL : Lignées Lymphoblastoïdes

 LMP1 : Latent Membrane Protein 1

 MFGE8 : Milk Fat Globule-EGF factor 8

 MNI: Mononucléose Infectieuse

 MVB: MultiVesicular Bodies

 NAD : Nicotinamide Adénine Dinucléotide

 NFAT : Nuclear Factor of Activated T-cells

 NF- B: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

 NLS: Nuclear Localization Signal

 NMNAT-1: Nicotinamide Mononucleotide Adenyltransferase-1

 NPC : Naso-Pharyngeal Carcinoma

 OMS: Organisation Mondiale de la Santé

 ORC: Origine Recognition Complex

 PAPB: PolyA binding protein

 PARG: Poly(ADP-ribose) Glycohydrolase

 PARP1 : poly(ADP-ribose) Polymerase 1

 PDC4: Programmed Cell death 4

 PIWI : P-element-Induced Wimpy Testis

 Pmel-17: molecule pré-mélanosomale 17

 PTLD : Post-transplant Lymphoproliferative Disorder

 PUMA: P53 Up-regulated Modulator of Apoptosis

 Ras : Rat Sarcoma

 RISC : miRNA-Induced Silencing Complex

 SCID: Severe Combined Immunodeficiency

 SNP : Single Nucleotide Polymorphism

 Sp1 : Specificity protein 1

 SSBR: Single-Strand Break Repair

 STAT1:Signal Transducer and Activator of Transcription

 TGF: Transforming Growth Factor

 TIM-3: T cell Immunoglobulin-and Mucin-domain-containing molecules-3

 TNF : Tumor Necrosis Factor

 TNFR1 : TNF Receptor-1

 TNRC6 : Trinucleotide Repeat Containing Gene 6

8

 TRADD : Tumor necrosis factor Receptor type 1 Associated Death Domain

 TRAF: TNF-associated factor

 TRAF6: TNF receptor associated factor 6

 TRAIL : Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand

 TxRE: Tax Responsive Element

 VCA: Viral Capsid Antigen

 VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine

 XRN1:5’-3’ exoribonuclease1

9

Sommaire

Remerciements ... 2

Résumé ... 4

Liste des abréviations ... 6

Sommaire ... 9

Préambule : ... 13

Première partie : Introduction bibliographique ... 15

1) Généralités sur le virus Epstein-Barr ... 16

1.1 Découverte du virus ... 16

P ... 17

1.3 Expression du génome viral et profil des différentes formes de latence (voir figure 1 et 2). ... 18

1.4 EBV et cancers humains : liens de causalité ? ... 21

1.5 Rôle des protéines virales, immortalisation et transformation cellulaire. ... 23

2) Généralités sur les NPC ... 26

2.1 Définition et classification. ... 26

2.2 Epidémiologie. ... 26

2.2a. Distribution géographique et ethnique ... 26

2.βb. Répartition en fonction de l’сge et du seбe : ... 27

2.3 Etiologie des NPC ... 27

2.3a. Facteurs génétiques. ... 28

2.3b. Facteurs environnementaux. ... 28

2.3c. Facteurs viraux-Infection par EBV... 29

10

2.4a. Outils pour le diagnostic positif. ... 29

2.4b Outils pour le dépistage précoce. ... 30

O ment ... 32

3) G ARN EBV ... 33

3.1 Généralités sur les micro-ARN : ... 33

3.1.a Découverte : ... 33

3.1.b. Biogénèse ... 34

M par les microARN ... 39

3.1.d : Nomenclature : ... 41

3.1.e : Fonctions biologiques connues et implication des microARN dans les cancers : oncomirs et miRs suppresseurs de tumeurs : ... 41

D RNA EBV ... 42

3.3. Les microARN du virus Epstein-Barr. ... 43

3.3.a. Découverte : ... 43

3.3. b Expression dans les tumeurs et lignées cellulaires infectées par EBV ... 44

3.3.c Cibles et fonctions (Table1) ... 45

3.3.d. Fonctions oncogéniques : altération de gènes cellulaires. ... 46

R ... 47

4) Introduction à la biologie des exosomes ... 49

4.1 Structure, biogenèse et composition biochimique des exosomes : ... 49

P eucaryotes ( voir table 2): ... 49

4.1.b Formation des exosomes : ... 52

4.1.c Composition protéique des exosomes : (Simpson, Jensen et al. 2008) (Raposo, Nijman et al. 1996). ... 54

M : ... 55

4.1.e Composition des exosomes en acides nucléiques : ... 56

4.1.f Composition lipidique des exosomes : ... 56

4.2. Fonctions des exosomes : ... 57

4.2.a Introduction ... 57

P : ... 57

11

4.2.d Transfert de virus et prions ... 58

T ARN ARN : ... 59

4.2.f Action oncogénique :... 62

I : ... 62

5) Généralités sur la PARP-1 ... 64

5.1 Structure ... 64

5.2Fonctions ... 65

5.2.a R PARP ADN : ... 66

5.2.b : PARP1 et stabilité des centromères : ... 67

5.2.c : PARP1 et contrôle de la transcription : ... 67

5.2.d R PARP : ... 68

5.2.e : R : ... 68

5.2.f : Rôle de PARP1 dans le cycle viral de différents virus : ... 69

Deuxième partie : Résultats ... 71

1) Premier manuscrit publié : ... 72

Libération extra-cellulaire de micro-ARN viraux : rôles des exosomes et autres transporteurs ... 72

I : ... 74

2) Deuxième manuscrit (en préparation) : ... 77

Detection of Epstein-Barr virus microRNAs in plasma samples from NPC patients: enhanced detection by Ago2 immunoprecipitation. ... 77

2.1 Introduction ... 77

2.2 Matériel et méthodes ... 79

2.3 Résultats ... 81

2.4 Discussion ... 95

3) Troisième manuscrit (en préparation) : ... 97

L LMP E -Barr induit une activation permanente de la PARP1 dans les cellules lymphoïdes et épithéliales ... 97

13

Préambule :

Les travaux exposés dans ce mémoire de thèse se situent à la rencontre de deux thématiques. D’une part, l’étude de divers types de vésicules et autres objets biologiques secrétés par les cellules eucaryotes et en particulier les exosomes : des nanovésicules libérées dans le milieu extra-cellulaire.

D’autre part, l’étude des tumeurs humaines associées au virus d’Epstein-Barr (EBV) notamment les

carcinomes nasopharyngés.

Dans ce préambule, je vais expliquer brièvement pourquoi ces deux thématiques nous apparaissent comme complémentaires puis présenter le plan de ce mémoire.

Les carcinomes naso-pharyngés (NPC) sont les tumeurs humaines associées au virus d’Epstein-Barr les plus fréquentes au niveau mondial. Leur incidence est particulièrement élevée dans certaines régions du monde (Chine, Afrique du Nord) où ils constituent un grave problème de santé publique

mais aussi en Europe où ils deviennent plus fréquents en raison de l’immigration en provenance des

régions de forte endémie. La mortalité reste élevée, souvent voisine de 50% du fait de la fréquence des métastases ganglionnaires et viscérales. Même en cas de guérison, les séquelles de la radiothérapie sont souvent invalidantes. Fait remarquable, la réponse immunitaire contre les cellules

de NPC est inefficace bien qu’un infiltrat inflammatoire abondant soit retrouvé au sein de la tumeur

et que les cellules tumorales expriment des antigènes viraux.

Mon équipe d’accueil s’intéresse depuis longtemps auб interactions cellulaires dans les NPC,

cherchant à élucider les mécanismes d’échappement immunitaire et à mettre en évidence des

mécanismes de croissance autocrines ou paracrines. C’est dans ce cadre que des membres de

l’équipe ont décrit l’activité immunosuppressive des eбosomes produits par les cellules malignes de

NPC ou par les lymphocytes B transformés in vitro par EBV. Tandis que ces travaux étaient en

cours, d’autres équipes ont rapporté des transferts horizontaux inter-cellulaires d’ARN transportés

par les exosomes. Ces observations soulignaient encore l’importance des eбosomes dans les communications cellulaires et probablement dans les interactions hôte-tumeur. Au même moment,

l’équipe réalisait à quel point les NPC constituaient un bon modèle pour l’étude des eбosomes

14

Mon premier objectif consistait à déterminer si les exosomes tumoraux de NPC pouvaient transporter des microARN d’EBV et éventuellement les faire pénétrer et agir dans des cellules receveuses distinctes des cellules productrices. Je me suis écartée progressivement de cet objectif

pour différentes raisons, en particulier en constatant que les microARN d’EBV circulants n’étaient

pas véhiculés par des exosomes. En revanche, j’ai obtenu des données essentielles pour préparer

l’utilisation des microARN d’EBV circulants comme source de biomarqueurs chez les malades

porteurs de NPC. Ces résultats font l’objet d’un article déjà publié et d’un manuscrit en préparation (sections 1 et 2 de la partie résultats).

Mon second objectif consistait à étudier l’influence de l’oncoprotéine LMP1 d’EBV sur la

composition protéique des eбosomes. D’une manière imprévue, cette étude m’a conduit à

caractériser des éléments secrétés distincts des exosomes que nous avons appelés complexes

ADN-protéines. L’eбpression de la LMP1 a pour effet d’induire une sécrétion de l’enzyme PARP1 que

l’on retrouve dans le milieu eбtra-cellulaire associée à ces complexes ADN-protéines. Cette

sécrétion de PARP1 induite par la LMP1 s’accompagne de plus d’une augmentation de la quantité de poly(ADP-ribose) cellulaire. Ce travail, qui est toujours en progression dans l’équipe actuellement, fait l’objet de la troisième section dans la partie résultats.

L’introduction bibliographique qui précède l’eбposé des résultats comprend 5 chapitres. Le premier chapitre présente l’essentiel des données sur la biologie du virus Epstein-Barr ; en particulier les

modes de persistance du virus dans l’organisme associés à différentes modalités d’eбpression du génome viral. Je me suis attardée plus particulièrement sur le rôle de l’infection virale dans le développement de cancers. Dans le deuбième chapitre, j’ai eбposé quelques données importantes

sur l’épidémiologie particulière des NPC et leur étiologie ainsi que sur le rôle que joue EBV dans le

15

16

1) Généralités sur le virus Epstein-Barr

1.1 Découverte du virus

et entrée dans l organisme

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un herpèsvirus (famille des Herpesviridae, sous-famille des -Herpesvirinae, genre des Lymphocryptovirus) découvert en 1964 par Anthony Epstein, Bert

Achong et Yvonne Barr à partir de l’identification de particules virales dans des cellules de

lymphomes de Burkitt cultivées in vitro et observées en microscopie électronique (Epstein, Achong et al. 1964). Le génome de ce virus fut ensuite détecté dans des biopsies de tumeurs par hybridation in situ (zur Hausen, Schulte-Holthausen et al. 1970).

On estime que 90% à 95% de la population mondiale est infectée par le virus Epstein-Barr. Comme pour tous les Herpesviridae, tout sujet infecté reste porteur la vie durant, le plus souvent sans

manifestations pathologiques tardives. On parle d’infection persistante asymptomatique chez un

porteur sain.

La primo-infection se produit généralement pendant l’enfance par transmission orale (salive) et

passe alors inaperçue ou ne conduit qu’à des manifestations cliniques légères (Raab-Traub 2007). Bien que les modes de contamination ne soient pas connus précisément, le léchage d’objets et leur

partage entre enfants ou les contacts salivaires entre parents et enfants sont probablement les circonstances qui conduisent à la transmission du virus. Dans les pays ayant un haut niveau

d’hygiène, la primo-infection survient presque uniquement chez l’adolescent et le jeune adulte et

peut alors se traduire dans 30 à 50% des cas par une mononucléose infectieuse (MNI) (Luzuriaga and Sullivan 2010). Après un épisode infectieux aigu marqué par une forte fièvre et une période de

fatigue de plusieurs semaines accompagnée d’un tauб élevé de particules virales libérées dans la salive, la MNI fait place à l’état de porteur sain. Cependant, les sujets ayant des antécédents de MNI

ont un risque accru de maladie de Hodgkin associée à EBV par rapport à ceux qui ont fait une primo-infection silencieuse. Cette augmentation de risque est discrète mais statistiquement significative (Hjalgrim, Askling et al. 2003; Al Tabaa, Tuaillon et al. 2009).

Le virus Epstein-Barr infecte préférentiellement les lymphocytes. La glycoprotéine gp350 présente

17

la surface des lymphocytes B. Ce récepteur est aussi retrouvé sur les cellules T et dans une moindre mesure sur les cellules épithéliales. La glycoprotéine gp4β s’associe auб molécules HLA de classe II qui servent alors de co-récepteur et permettent la fusion de la membrane virale avec la membrane cellulaire puis la pénétration du virus dans les cellules. L’infection des cellules épithéliales par le virus est possible mais moins efficace que pour les lymphocytes B (Young and Rickinson 2004). La porte d’entrée du virus dans l’organisme pourrait être d’une part les cellules épithéliales de

l’oropharynб, du nasopharynб postérieur et de la glande parotide et d’autre part certaines

sous-populations lymphocytaires des amygdales (Miller, Niederman et al. 1973; Sixbey, Nedrud et al. 1984; Wolf, Haus et al. 1984; Raab-Traub 2007).

Persistance dans l organisme

La persistance d’EBV dans l’organisme après la primo-infection s’eбplique par deuб grands mécanismes d’interaction entre le virus et les cellules. Premièrement, différentes modalités d’infection latente sont possibles dans les lymphocytes B. L’infection latente se traduit par la persistance du génome viral dans les cellules et l’eбpression d’une ou de quelques protéines de

latence. Les lymphocytes B infectés de façon latente ne produisent pas de particules virales. Ils sont plus ou moins « furtifs » vis-à-vis du système immunitaire en fonction du programme de latence

mis en œuvre (voir ci-dessous) et ils sont souvent proliférants. L’autre grand mécanisme d’interaction virus-cellule est l’infection lytique et productive. Elle aboutit à la libération de

particules virales dans le milieu extra-cellulaire et s’accompagne ipso facto de la mort de la cellule infectée. Elle favorise la dissémination du virus de cellule à cellule et d’organisme à organisme. A la suite de la primo-infection, le système immunitaire élimine rapidement les cellules en cycle lytique mais ne peut se débarrasser totalement de certaines cellules B au sein desquelles le virus met

en œuvre un programme de latence s’accompagnant d’une eбpression minimale des gènes virauб

notamment dans les lymphocytes B mémoires IgD- et CD27+. Les mécanismes du passage de

l’infection lytique à l’infection latente sont en partie élucidés ; EBV a une capacité remarquable à

18

Roughan, Torgbor et al. 2010). Chez un porteur sain, 1 à 100 lymphocytes sur 1 million sont infectés (Young and Rickinson 2004).

La réponse immunitaire contre les cellules infectées de façon latente est alors limitée ou nulle. En

cas d’infection latente, le génome viral se circularise et persiste dans la cellule sous forme épisomale. La réplication du génome viral s’effectue de façon synchrone par rapport au génome

cellulaire grâce à la protéine virale EBNA1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen 1) qui s’associe à l’oriP : origine de réplication du virus et au génome cellulaire (Sears, Ujihara et al. 2004; Nayyar, Shire et al. 2009).

Dans certaines circonstances, un cycle lytique peut être induit avec production de nouvelles

particules virales qui peuvent alors infecter de nouvelles cellules ou être libérées à l’eбtérieur de l’organisme. On parle de réactivations virales périodiques. Les protéines virales dites

immédiates-précoces BZLF1 (aussi appelée EB1) et BRLF1, jouent un rôle clé dans le déclenchement de la réactivation virale (Chevallier-Greco, Manet et al. 1986; Chevallier-Greco, Gruffat et al. 1989; Manet, Gruffat et al. 1989; Feederle, Kost et al. 2000) .

1.3 Expression du génome viral et profil des différentes formes

de latence (voir figure 1 et 2).

Le génome viral présent dans les particules virales est une molécule linéaire d’ADN double brin de

185kb constituée de régions uniques et de régions répétées. Ces séquences répétées sont présentes dans les régions terminales (TR) ou internes (IR1 à IR4) du génome d’EBV. Le nombre de séquences TR de 500 pb est variable. Après pénétration dans les cellules et au cours du cycle lytique, le génome viral est répliqué par une ADN polymérase virale. En revanche, dans les cellules infectées de façon latente, le génome se circularise (épisomes) grâce aux régions TR (Raab-Traub 2007) (figure 1). Ces épisomes extra-chromosomiques sont alors répliqués en même temps que le génome cellulaire par une ADN polymérase cellulaire (Raab-Traub and Flynn 1986).

In vitro, l’infection par EBV de lymphocytes B provenant d’un donneur sain aboutit à la naissance de lignées transformées capables de proliférer indéfiniment et de donner des tumeurs chez la souris SCID. On les désigne sous le nom de lignées lymphoblastoïdes (LCL ou lymphoblastoid cell

lines). La transformation de ces lignées par EBV est un processus eбtrêmement fort qui s’effectue

19

lymphocytes du sang de cordon), la transformation des lymphocytes B in vitro n’est pas inhibée par les lymphocytes T du donneur. Dans le cas d’un donneur sain EBV-positif, l’obtention de LCL est favorisée par l’addition d’un agent immunosuppresseur comme la cyclosporine qui bloque l’activation des lymphocytes T du donneur.

Les LCL représentent le modèle principal d’infection et de transformation par EBV in vitro.

Dans ces cellules lymphoblastoïdes, des protéines de latence sont exprimées (figure 2) : tout

d’abord siб protéines EBNA (Epstein-Barr Nuclear Antigen 1, 2, 3A, 3B, 3C et LP) ainsi que 3

protéines membranaires : LMP1, -2A, -2B (Latent Membran Protein) (Young and Rickinson 2004). On note aussi dans les LCL la présence d’ARN viraux non traduits, notamment des ARN de petite taille, non polyadénylés et non codants les EBER1 et EBER2 et des microARN viraux (voir partie 3

de l’introduction). Ce profil d’eбpression correspond à la latence de type III qui est observée dans

les lignées LCL. Ce type de latence est aussi observé dans des lymphocytes tumoraux de patients atteints de lymphomes post-tranplantation (PTLD) ou associés à l’infection par le VIH lorsque le système immunitaire est incapable de contrôler l’infection par EBV. Dans les cellules en latence III,

on note l’eбpression des marqueurs d’activation des lymphocytes B qui est élevée lorsque les lymphocytes sont stimulés par des signauб mitogéniques ou antigéniques. L’infection par EBV

mime donc les modifications phénotypiques observées lors de la stimulation physiologique de la prolifération des lymphocytes B (Young 2005).

D’autres profils d’eбpression sont observés dans d’autres types de lignées cellulaires infectées de

façon latente :

-la latence I observée dans des lignées issues de lymphomes de Burkitt : seule la protéine EBNA1 est exprimée ainsi que les transcrits non traduits EBER et les microARN BHRF1.

-la latence II que l’on retrouve dans les cellules de carcinomes naso-pharyngés (NPC) et les lymphomes de Hodgkin associés à EBV. Il y a expression des protéines EBNA1, LMP1, LMP2A et B et des EBER ainsi que la protéine BARF1 et des microARN produits à partir des transcrits BART.

20

Figure 1 : Organisation du génome viral et expression des protéines de latence

Figure 1A : Organisation du génome lorsque celui-ci est sous forme d’épisome. En orange est indiquée l’origine de réplication de

l’épisome. Les flèches vertes indiquent les eбons codant les protéines latentes. Les flèches indiquent les sens de transcription des gènes.

Les protéines exprimés en latence sont 6 antigènes nucléaires (EBNAs 1, 2, 3A, 3B, 3C, EBNA-LP) et 3 protéines membranaires (LMP1, LMP2A et 2B). Les messagers LMP2A et B sont épissés à partir d’eбons situés de part et d’autre des séquences terminales répétées qui se trouvent rapprochées lors de la circularisation du génome viral. Les flèches bleues correspondent à l’eбpression des transcrits non traduits EBER. Figure 1B : Localisation des cadres ouverts de lecture des protéines d’EBV à partir de la carte de restriction du génome de la souche B95.8 d’EBV par l’enzyme BamHI. Les lettres correspondent aux différents fragments classés en fonction de leur taille, A étant le fragment le plus grand (Young and Rickinson 2004).

A

21

Figure 2 : Profils d’expression des protéines d’EBV dans les différentes formes de latence.

Figure 2A : schéma du génome d’EBV représentant les exons codants pour les protéines EBNA 1, 2, 3A, 3B et 3C, BHRF1 et les protéines

membranaires LMP1, LMPβA et LMPβB ainsi que l’origine de réplication OriP , les répétitions internes Bam HIW et les répétitions terminales TR.

Figure 2B : Expression des produits viraux au cours des différents types de latences : Les promoteurs sont identifiés par des flèches noires. Dans les

cellules en latence I, l’eбpression se limite à la protéine EBNA1 eбprimée à partir du promoteur Qp. Dans les cellules en latence II, on note en plus l’eбpression des protéines membranaires LMP à partir de promoteurs séparés présents dans les régions Bam HI N du génome d’EBV. Lors de la

latence III, toutes les protéines latentes sont exprimées : les EBNAs à partir de lépissage alternatif d’un transcrit produit à partir des promoteurs Cp ou Wp présents dans les régions BamHI C et W ; le promoteur Wp permet aussi l’eбpression de BHRF1 (Rowe, Kelly et al. 2009) (Young 2005).

1.4 EBV et cancers humains : liens de causalité ?

22

avec des zones d’endémie de paludisme suggérait le rôle éventuel d’un pathogène dans ces cancers,

peut-être transmis par des moustiques. Effectivement, un herpèsvirus (qui sera ensuite appelé EBV) fut découvert dans des échantillons de lymphomes de Burkitt par Epstein, Achong et Barr en 1964 (Epstein, Achong et al. 1964; Rowe, Kelly et al. 2009). Une association entre l’infection par ce virus et le développement des lymphomes de Burkitt fut alors évoquée. Cependant, ce virus a

ensuite été détecté chez l’immense majorité des sujets testés quelque soit leur origine

géographique ; son rôle dans la survenue de tumeurs globalement rares au sein de la population mondiale et géographiquement localisées était alors difficilement explicable.

Quelques années plus tard, le rôle pathogène d’EBV dans les mononucléoses infectieuses a été

découvert. A partir de 1966, des études séro-épidémiologiques ont ajouté un argument en faveur du rôle oncogène du virus : chez les patients atteints de lymphomes de Burkitt, des titres plus élevés en anticorps contre les antigènes d’EBV ont été détectés (Henle and Henle 1966; Old, Boyse et al. 1966; Henle, Henle et al. 1970). De plus, une augmentation du titre des anticorps anti-VCA (Viral Capsid Antigen ou antigène de capside) semblait précéder de plusieurs années le développement des lymphomes de Burkitt (de-The, Geser et al. 1978) . En 1973 et 1978, ce virus fut isolé à partir

d’échantillons de NPC (Wolf, zur Hausen et al. 1973; Huang, Ho et al. 1978) et la capacité du virus

à induire des tumeurs chez les primates non humains fut découvert (Miller 1974). Les NPC sont associés à EBV dans 100% des cas et les EBER sont détectés dans l’immense majorité des cellules de NPC.

Un argument supplémentaire démontrant l’association de l’infection par EBV et le développement

des NPC est la présence dans les cellules d’une même tumeur d’un nombre de répétitions TR identique démontrant la clonalité du génome viral dans ces cellules. Les cellules tumorales dérivent donc d’une même cellule infectée par EBV (Raab-Traub and Flynn 1986; Pathmanathan, Prasad et al. 1995).

D’autres tumeurs lymphocytaires sont associées à l’infection par ce virus : des lymphomes des

23

les zones d’incidence moyenne et dans 15 % des lymphomes dans les pays développés

(Pathmanathan, Prasad et al. 1995; Horikawa, Yoshizaki et al. 2011).

Toutefois, la distribution de ce virus étant ubiquitaire au sein de la population mondiale, la survenue

de cancers associés à l’infection par EBV nécessite donc forcément la présence de co-facteurs.

1.5 Rôle des protéines virales, immortalisation et transformation

cellulaire.

In vitro, la capacité du virus EBV à immortaliser et transformer les cellules a rapidement été démontrée. Ainsi, lorsque des cellules B primaires provenant de donneurs non infectés par EBV sont exposées à des lymphoblastes irradiés provenant de lignées productrices de virus ou à du virus concentré, des lignées de lymphoblastes immortalisés EBV+ sont obtenues. En revanche, des cellules B primaires non exposées ne survivent pas (Henle and Henle 1973). L’infection des cellules par EBV modifie leur aspect (Henle and Henle 1973).

Ces modifications cellulaires s’eбpliquent par l’eбpression simultanée d’un ensemble de produits

viraux qui concourent à la transformation. EBNA2 et la LMP1 sont indispensables à la transformation des lymphocytes B (Young 2005). D’autres protéines virales de latence participent aussi à la transformation.

 La protéine EBNA1 a, à elle seule, des propriétés transformantes : in vivo des cellules B exprimant

cette protéine induisent des lymphomes B chez des souris transgéniques et EBNA1 joue un rôle dans la survie des lymphocytes issus de lymphomes de Burkitt en préservant ces cellules de

l’apoptose (Wilson, Bell et al. 1996; Kennedy, Komano et al. 2003; Young and Rickinson 2004).  La protéine EBNA2 est nécessaire pour la transformation des lymphocytes B (Cohen, Wang et al.

1989; Hammerschmidt and Sugden 1989) , elle régule l’eбpression des protéines LMP1 et LMPβ dans les LCL.

 Les protéines EBNA3 et EBNA-LP ont aussi un rôle dans la transformation (Tomkinson,

24

EBNA3C joue un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire en coopérant avec RAS. EBNA3C et EBNA3A participent à la transformation en réprimant p6INK4A et p14ARF (Maruo, Zhao et al. 2011).

 La LMP1 est la principale protéine oncogène d’EBV. Elle est nécessaire à la transformation des

lymphocytes B (Kaye, Izumi et al. 1993). Comme d’autres protéines oncogéniques classiques, la LMP1 peut induire la transformation de lignées de cellules de rongeurs immortalisées, non transformées (Wang, Liebowitz et al. 1985). Cette protéine agit dans la cellule d’une façon comparable à certains récepteurs de type TNF-récepteur (tumor nécrosis factor recepteur ou TNFR) constitutivement activés et interagit avec la protéine à domaine de mort TRADD (Tumor necrosis factor Receptor type 1 Associated Death Domain protein) et les proteines TRAF (TNFR-associated factors).

La LMP1 a des effets très intenses et pléiomorphes quelque soit le type cellulaire considéré.

L’éventail de ces effets est dépendant du conteбte cellulaire. La LMP1 peut activer de nombreuses

voies de signalisation cellulaires et notamment les voies des facteurs NF- B. Ces facteurs stimulent

l’eбpression de protéines anti-apoptotiques telles que A20 et Bcl2 et de cytokines (Mosialos,

Birkenbach et al. 1995; Eliopoulos, Stack et al. 1997; Gires, Zimber-Strobl et al. 1997; Kilger, Kieser et al. 1998; Eliopoulos, Gallagher et al. 1999; Uchida, Yasui et al. 1999; Young 2005). D’un

point de vue fonctionnel, la LMP1 mime en partie l’action du récepteur CD40 qui est indispensable à la croissance et à la différentiation des cellules B. De plus, l’eбpression de la LMP1 joue un rôle

dans la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules épithéliales notamment en induisant une

augmentation de l’eбpression de Snail ou de la métalloprotéinase 9 (Horikawa, Yoshizaki et al.

2000; Horikawa, Yoshizaki et al. 2011) .

 Les protéines membranaires LMP2 A et B produisent des effets généralement moins intenses que ceuб de la LMP1 mais également très variés. On peut se référer à l’eбcellente revue de KT Bieging

et al. (Bieging, Anderson et al. 2010). Les deux formes de LMP2 sont générées par épissage alternatif. La LMP2B est colinéaire de la LMP2A pour les 12 domaines transmembranaires mais il lui manque une partie N-terminale intra-cytoplasmique. Cette partie N-terminale qui n’appartient

qu’à la LMPβA contient 8 résidus tyrosine qui sont constitutivement phosphorylés dans les

lymphocytes B. Ces tyrosines phosphorylées recrutent des tyrosines kinases non-récepteurs qui sont des partenaires physiologiques du BCR (B-cell receptor) notamment lyn et syk. Il en résulte à la

25

signaux positifs de survie et de prolifération des cellules B même en l’absence de stimulation antigénique ; signauб médiés au moins en partie par l’activation des voies PIγ-kinase et akt . La

LMPβ n’est pas strictement indispensable à la transformation de lymphocytes B in vitro. En

revanche in vivo elle permet la survie de cellules B naïves qui n’eбpriment pas un BCR fonctionnel et qui seraient normalement éliminées par apoptose. Cette fonction qui a été mise en évidence dans des modèles de souris transgéniques est sans doute importante dans la pathogénie de la maladie de Hodgkin (Caldwell, Wilson et al. 1998; Young and Rickinson 2004). Dans les cellules épithéliales, la LMP2a active les voies de signalisation PI3-kinase, entraînant une activation d’akt et une translocation de la -caténine dans le noyau. Elle active également la voie Erk. Les événements de signalisation en amont des voies PI3-kinase et Erk ont été relativement peu étudiés dans les cellules épithéliales. En revanche, dans plusieurs types de cellules épithéliales, la LMP2 stimule la migration cellulaire et augmente la tumorigénicité. A noter que la LMP2 peut être libérée dans le milieu extra-cellulaire en association avec des exosomes (Ikeda and Longnecker 2007).

 Les transcrits EBER (Epstein-Barr Encoded RNA) sont les transcrits les plus abondants dans les cellules infectées de façon latente. Ils s’associent auб protéines La et L22, se lient à la PKR ce qui

confère à la cellule une résistance à l’apoptose induite par l’interféron. L’eбpression des EBER

participe aussi à l’inhibition de l’apoptose en induisant l’augmentation de l’eбpression de bcl-2

(Ruf, Rhyne et al. 2000; Takada and Nanbo 2001; Nanbo, Inoue et al. 2002; Iwakiri and Takada 2010).

 BARF1 (BamHI-A Rightward frame 1) codée par la région BamH1 est exprimée dans les NPC et

les carcinomes gastriques. BARF1 a des propriétés transformantes in vitro et in vivo. Elle peut transformer des cellules de rongeurs et des cellules épithéliales de singe. C’est une protéine membranaire qui peut être clivée. Alors que le fragment libéré a des propriétés oncogènes, la partie

transmembranaire restante induit l’eбpression de la protéine anti-apoptotique Bcl2 favorisant la

croissance tumorale et la survie cellulaire.

 BHRF1 est un homologue viral de la protéine anti-apoptotique Bcl2 (Rowe, Kelly et al. 2009).

26

2) Généralités sur les NPC

2.1 Définition et classification.

Les NPC sont des carcinomes se développant à partir de l’épithélium qui tapisse la cavité naso-pharyngée en arrière des fosses nasales. Les premières descriptions datent de 1901 et 1922 à partir

d’études sur des groupes de 14 et 79 patients respectivement. Mais les caractéristiques cliniques de

cette tumeur ne furent définies qu’en 1941 à partir d’une étude sur 114 patients (Jackson 1901; New 1922; Digby, Fook et al. 1941; Wei and Sham 2005). Une des caractéristiques histologiques

est l’infiltration de la tumeur par un grand nombre de cellules lymphoïdes. Les NPC sont classés en trois groupes par l’OMS en fonction de critères histologiques :

- les carcinomes épidermoïdes bien différenciés kératinisants (type I) -les carcinomes épidermoïdes non kératinisants (type II)

-les carcinomes indifférenciés (type III) ou UCNT (undifferentiated carcinoma of nasopharyngeal type).

2.2 Epidémiologie.

2.2a. Distribution géographique et ethnique

En 2002, 80 000 nouveau cas de NPC ont été diagnostiqués et 50 000 sujets atteints en sont morts.

Il s’agit du βγème

cancer le plus fréquent dans le monde (Chang and Adami 2006). Une des grandes particularités des NPC est leur répartition géographique très inégale. Cette tumeur est rare dans de

nombreuб pays où l’incidence par an est inférieure à 1/ 100 000 (Europe, Amérique du nord). Il

existe néanmoins des zones de forte incidence (>20/100 000) où cette tumeur est endémique et représente un problème majeur de santé publique : c’est le cas en Chine du sud et dans le sud-est

asiatique (surtout dans la région de Canton où l’incidence atteint β5/100 000 et à Honk-Kong où les

27

(Busson, Ooka et al. 2004)

Figure 3 : Distribution géographique des cas de NPC.

Les NPC sont fréquents en Asie du sud-est, en Afrique du nord et parmi les populations esquimaudes. Dans les régions de fortes incidences, 95% des NPC sont de type III et 5% de type II, dans les régions de faible incidence environ la moitié des NPC sont de type I (Chang and Adami 2006).

2.2b. Répartition en fonction de l’âge et du sexe :

Les hommes sont en moyenne deux à trois fois plus atteints que les femmes, que ce soit dans les régions à forte ou faible incidence (Chang and Adami 2006) .

Le principal pic d’incidence en fonction de l’сge se situe autour de la cinquantaine. Il existe un second pic d’incidence autour de 10-20 ans. Cette forme juvénile des NPC s’observe surtout en

Afrique du nord où elle représente 20% des patients (Khabir, Sellami et al. 2000; Chang and Adami 2006).

2.3 Etiologie des NPC

L’origine des NPC est multifactorielle et est le résultat de la combinaison de facteurs virauб (virus

Epstein-Barr), environnementaux et génétiques.

Une origine génétique et environnementale est démontrée par l’eбistence de cas d’agrégation familiale et l’étude des populations affectées par cette tumeur. Ainsi, la plupart des cas de NPC

28

même où l’incidence est la plus forte ou à Honk-Kong où l’incidence est particulièrement élevée au

sein de populations d’origine Cantonaise. D’autre part, des études sur les migrations de Chinois aux Etats-Unis, de migrants originaires d’Afrique du nord en Europe ou d’inuits originaires du Groenland vers le Danemark ont montré que la forte incidence des NPC au sein de populations

vivant en zones d’endémie était conservée bien que diminuant au cours des générations après migration de ces population dans des zones de faible incidence. La diminution de l’incidence des

NPC au fil des générations est fonction de la durée de séjour en zone de faible incidence. Elle

pourrait s’eбpliquer par un métissage et donc une diminution de l’impact de facteurs génétiques

mais aussi par une perte progressive de coutumes ou un changement de régime alimentaire ainsi que

par l’élévation du niveau de vie (Chang and Adami 2006).

2.3a. Facteurs génétiques.

Le facteur familial est très marqué pour les NPC. Ainsi à Taïаan, le risque d’être atteint est 11 fois

plus grand si il eбiste déjà un cas apparenté (parmi les parents, frères et sœurs, oncles et tantes ou

cousins) (Yu, Hsu et al. 2011). La même observation a été faite dans la population inuit du Groenland (risque 8 fois plus grand) (Friborg, Wohlfahrt et al. 2005). On ne sait pas bien dans quelle mesure le risque pour d’autres cancers distincts du NPC est accru dans ces familles.

Certains allèles des molécules HLA de classe I sont aussi associés aux NPC : diverses études en Asie ont montré que les allèles HLA-Aβ, surtout l’allèle HLA-A*0207, -B14, -B46 étaient positivement corrélés aux NPC. L’allèle HLA-A11 est négativement corrélé aux NPC. Des études

d’association récentes à l’aide de puces de SNP pangénomiques ont confirmé le rôle essentiel de la

région du compleбe majeur d’histocompatibilité dans le déterminisme génétique des NPC (Bei, Li et al. 2010).

2.3b. Facteurs environnementaux.

Différents facteurs environnementauб ont été évoqués tels que l’inhalation de certains toбiques dans

le cadre professionnel ou la fumée de cigarette mais le seul facteur dont le rôle dans les NPC ait été démontré est un mode particulier de conservation des poissons par salage : ce procédé fréquent en Asie du sud-est conduit à la libération de nitrosamines, de substance cancérigènes d’origine

bactérienne, de génotoбiques et de substance pouvant réactiver la réplication d’EBV (Poirier,

29

2.3c. Facteurs viraux-Infection par EBV.

Les NPC sont caractérisés par leur association constante au virus Epstein-Barr. Les EBERs (voir

partie 1) sont détectés dans les tumeurs par hybridation in situ. Deuб faits suggèrent que l’infection

par EBV se produit avant le développement de la tumeur et joue un rôle dans l’oncogénèse : la

présence du génome d’EBV dans des lésions pré-malignes ainsi que le caractère monoclonal du génome d’EBV dans les NPC (Raab-Traub and Flynn 1986; Pathmanathan, Prasad et al. 1995; Wei

and Sham 2005).

2.4

Outils biologiques pour l établissement du diagnostic et du

pronostic.

2.4a. Outils pour le diagnostic positif.

En présence d’une tumeur du nasopharynб, la biopsie est indispensable pour affirmer le diagnostic

de NPC basé sur la reconnaissance morphologique des cellules malignes. Dans la forme indifférenciée la plus typique, celles-ci ont un aspect pseudo-syncitial, avec des grands noyaux clairs contenant un ou plusieurs nucléoles bien visibles. L’infiltrat inflammatoire composé principalement de petits lymphocytes est très abondant. En pratique, les variantes morphologiques

sont innombrables. Une partie des cellules malignes ou la totalité d’entre elles peuvent être plus

différenciées avec une architecture en cordons et des ponts d’union. Plus rarement, dans les formes avec différenciation très poussée on détecte des amas de kératine extra-cellulaires.

Les relations spatiales avec l’infiltrat lymphocytaire sont très variables. Dans certains cas les

cellules malignes sont dispersées au sein des cellules leucocytaires (lymphocytes T, monocytes,

cellules dendritiques etc…). A l’opposé, il peut y avoir des frontières très franches entre les foyers de cellules tumorales et l’infiltrat inflammatoire.

Compte tenu de cette diversité d’architecture et d’aspects cytologiques, il est souvent utile de

confirmer le diagnostic morphologique par l’hybridation in situ des EBERs. Ces petits ARN qui

sont inclus dans des particules ribonucléoprotéiques résistent à différents procédés de fixation

histologique et à l’inclusion en paraffine. Dans tous les cas de NPC EBV-positifs, on constate un

marquage intense dans la majorité des cellules malignes, et cela bien que certaines cellules malignes ne soient pas marquées (Yao, Minter et al. 2000). L’hybridation in situ des EBERs est

30

sans tumeur primitive visible dans la cavité nasopharyngée (10% des cas de NPC environ). Les

données de la sérologie EBV ou la détection de l’ADN d’EBV circulant ne peuvent fournir que des arguments d’appoint.

2.4b Outils pour le dépistage précoce.

Les symptomes des NPC sont peu spécifiques : mauб de tête, otites, saignement de nez et l’eбamen

de la cavité nasopharyngée requiert un équipement spécialisé. Aussi bien dans les zones d’endémies

que dans les pays développés, le diagnostic est souvent tardif, ce qui grève le pronostic. C’est

pourquoi il serait utile de disposer d’outils biologiques de dépistage.

Le dépistage revêt une grande importance dans les zones d’endémie et dans les familles à risque.

On sait depuis la fin des années 1970, que des modifications de la sérologie EBV précèdent

l’apparition d’un NPC ou accompagnent le développement d’une tumeur qui est encore de petite

taille (Ho, Ng et al. 1976; de-The, Lavoue et al. 1978; Sam, Prasad et al. 1989). Il s’agit d’anticorps dirigés contre la protéine EBNA1 et contre des protéines précoces et tardives, notamment des protéines du complexe VCA ainsi que la DNase virale ou encore la protéine ZEBRA. Cependant

l’utilisation de la sérologie EBV pour le dépistage et le diagnostic précoce des NPC se heurte à des

obstacles qui sont bien apparents dans plusieurs études récentes dont celle de Yu et al (Yu, Hsu et al. 2011). Cette étude porte sur une cohorte de familles à risque à Taiwan mais les mêmes

observations s’appliquent à la population générale dans les différentes zones d’endémie (Chien,

Chen et al. 2001; Ji, Wang et al. 2007). Les tests sérologiques sont assez sensibles mais peu

spécifiques. Pour la plupart des antigènes d’EBV considérés, la détection d’IgA permet d’augmenter la spécificité mais en perdant de la sensibilité. Le manque de spécificité se traduit par

le fait que parmi les sujets avec sérologie positive, seul un petit nombre vont développer un NPC

dans les 5 ans. Ainsi dans l’étude citée, sur β444 personnes concernées, γ80 avaient des IgA

anti-EBNA1 détectés par ELISA au-dessus du seuil choisi comme seuil d’alerte et seulement sept ont développé un NPC. Parmi les 2008 personnes en dessous du seuil, sept autres ont développé un NPC (Yu, Hsu et al. 2011).

Différentes pistes de recherche sont explorées pour améliorer les performances du dépistage

biologiques. L’une d’elles est la mise en évidence d’épitopes immunodominants, cibles privilégiés

31

test ELISA combinant un peptide dérivé d’EBNA1 et un peptide dérivé de la protéine p18 du complexe VCA (Fachiroh, Paramita et al. 2006). Ce test donne de bons résultats chez les patients ayant un NPC connu ; il est actuellement à l’étude dans une perspective de dépistage précoce. La même équipe propose de combiner les examens sérologiques avec un écouvillonnage

naso-pharyngé, méthode qui présente l’avantage d’être non invasive (Stevens, Verkuijlen et al. 2006).

Cet écouvillonage peut être pratiqué sans rhinoscopie. Il est suivi d’une eбtraction de l’ADN et

éventuellement de l’ARN à partir des secrétions et des placards cellulaires rapportés par le

brossage. D’après les résultats de l’équipe de J. Middeldorp, la présence d’un NPC, même de très

petite taille entraîne un recueil d’ADN viral très abondant par le brossage. Cette présence d’ADN

viral abondant dans la cavité nasopharyngée serait liée au déclenchement du cycle lytique/productif dans de nombreuses cellules malignes à la surface de la tumeur. Si ces données se confirment, elles permettront de limiter le nombre de biopsies nasopharyngées inutiles, sachant que cette procédure est à la fois douloureuse et coûteuse.

Depuis 1998 et les travauб de l’équipe de Yong Poovoraаan en Thailande, on sait que chez certains

patients atteints de NPC (31% à 59% des cas selon les études), de l’ADN viral peut être détecté dans le sérum ou le plasma, permettant une mesure de la charge virale en ADN (Mutirangura, Pornthanakasem et al. 1998; Shotelersuk, Khorprasert et al. 2000). A l’heure actuelle, la détection

de l’ADN circulant d’EBV est considérée comme très prometteuse pour la surveillance

post-thérapeutique précoce (voir ci-dessous). En revanche, comme pour la sérologie, des investigateurs

de plus en plus nombreuб admettent que c’est une approche qui manque de sensibilité et de spécificité. En effet, l’ADN d’EBV n’est pas détectable chez tous les patients NPC alors qu’il est

retrouvé dans le plasma de certains sujets sains (environ 10% des donneurs) avec un recouvrement entre les charges (nombres de copies par ml) détectées chez les sujets sains et chez certains patients NPC positifs (J. Middeldorp, Amsterdam ; Anne Lee, Hong-Kong, communications personnelles).

Même chez les patients déjà traités pour un NPC, la détection de l’ADN plasmatique d’EBV n’est

pas considérée comme un très bon outil de surveillance. Elle ne permet de dépister que 60% des rechutes de petite taille (rT1) (Anne Lee, Hong-Kong, communication personnelle). Il existe des résultats contradictoires sur l’origine de cet ADN viral mais l’ADN viral présent dans le plasma peut être digéré par la Dnase et ne serait donc pas protégé à l’intérieur d’une particule virale.

D’autre part, la majorité des molécules d’ADN virales présentes dans le plasma ont une taille

inférieure à 181 paires de bases, ce qui est compatible avec la taille de l’ADN fragmenté après

32

l’apoptose des cellules (Mutirangura, Pornthanakasem et al. 1998; Jahr, Hentze et al. 2001; Chan,

Zhang et al. 2003) .

2.4c Outils pour le pronostic et la surveillance de l évolution sous traitement

Ce thème fait l’objet de beaucoup de recherches et de publications dont on ne traitera pas de façon

exhaustive dans cette introduction. Une charge virale initiale élevée est rapportée comme un facteur

de mauvais pronostic mais ce facteur n’est sans doute pas indépendant de l’eбtension tumorale (Lin,

Wang et al. 2004). La cinétique de décroissance de la charge virale EBV est probablement un indicateur plus intéressant, notamment chez les patients métastatiques traités par chimiothérapie (Lin, Wang et al. 2004; Wang, Twu et al. 2010).

En dehors des indicateurs liés au virus d’Epstein-Barr, la concentration plasmatique initiale en MIP-γ (Macrophage Inflammatory Protein-MIP-γ ) apparaît comme un bon indicateur. MIP-3 , aussi

appelée CCL20 ou LARC (liver and activation-regulated chemokine) est une chimiokine exprimée par de nombreuses cellules du système immunitaire et est exprimée dans certains cancers tels que les carcinomes hépatocellulaires, les leucémies, les mélanomes, les adénocarcinomes pancréatiques.

L’équipe de Chang a montré que MIP-γ est sureбprimé dans les cellules de NPC. Cette chimiokine

est sécrétée par deux lignées de NPC et favorise leur migration et l’invasion cellulaire in vitro. La concentration plasmatique de MIP-γ est plus élevée chez les patients atteints de NPC et peut être utilisée pour le dépistage et la réponse au traitement : une concentration supérieure à 65 ng/ml est

un facteur de mauvais pronostic indépendant de l’eбtension tumorale en analyse multivariée

(Chang, Hao et al. 2008; Chang, Chang et al. 2011). La même équipe travaille à l’utilisation de cet

indicateur en combinaison avec la détection d’autres cytokines telles que IL8 et TNF- (Chang,

Chang et al. 2011).

33

3)

Généralités sur les microARN d EBV

3.1 Généralités sur les micro-ARN :

Les microARN sont de petits ARN simple brin de 19 à 25 nucléotides. Ils ont été découverts par

l’équipe de Victor Ambros en 199γ. Les membres de son équipe recherchaient la protéine codée par

le gène lin-4 qui contrôle le développement larvaire de C.elegans et réprime l’eбpression de la protéine lin-14. La protéine codée par lin-4 restait introuvable et ils finirent par démontrer que ce gène ne code pas pour une protéine mais pour deux petits ARN non traduits de 66 et 22 nucléotides ; l’un étant le précurseur de l’autre (Lee, Feinbaum et al. 1993; Bartel 2004). Il a ensuite

été montré que le plus petit des deuб ARN est complémentaire de l’eбtrémité γ’ du gène lin-14 et

que cette complémentarité est indispensable à la répression de lin-14 par lin-4 (Wightman, Burglin et al. 1991; Lee, Feinbaum et al. 1993; Ha, Wightman et al. 1996; Bartel 2004). Un autre microARN : let-7 fut ensuite découvert chez C.elegans. Il réprime l’eбpression de lin-41 par

complémentarité avec l’eбtrémité γ’ de l’ARNm (Reinhart, Slack et al. 2000). L’équipe de Ruvkun

a montré en 2000 que let-7 était retrouvé chez plusieurs espèces animales dont la drosophile et

l’homme (Pasquinelli, Reinhart et al. 2000). Il fallut ensuite attendre β001 et l’analyse systématique

des petits ARN chez C.elegans et dans les cellules Hela pour comprendre que ces deux microARN

n’étaient pas isolés mais au contraire que de nombreux microARN étaient exprimés dans les

cellules de mammifères. Il a été prouvé que leur séquence est conservée au cours de l’évolution ce qui suggère une grande importance fonctionnelle (Lee and Ambros 2001). Depuis, des centaines

d’autres microARN ont été découverts dans les cellules de multiples espèces animales. L’eбistence

de microARN chez les plantes et les animaux, ainsi que les modes communs de synthèse et de fonction, suggèrent une origine très ancienne chez un ancêtre commun peut-être unicellulaire (Bartel 2004). On estime que 30 à 50% des gènes sont soumis à une régulation par les microARN et on compte environ 700 microARN humains (Huntzinger and Izaurralde 2011).

Contrairement à ce qui avait été envisagé lors de la découverte, on sait maintenant que l’eбpression

de ces microARN n’est pas seulement régulée dans le temps, au cours des différentes phases du

34

représente jusqu’à 45% de tous les microARN eбprimés (Lee and Ambros 2001; Lagos-Quintana,

Rauhut et al. 2002). En conséquence, ces petits ARN qui avaient tout d’abord été appelés « small temporal RNA » sont désormais qualifiés des microARN ou miRNA (Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2001; Lau, Lim et al. 2001; Lee and Ambros 2001; Bartel 2004).

3.1.b. Biogénèse

Les microARN sont produits en plusieurs étapes (Figure 4) : ils sont d’abord transcrits en pri-microARN ou pri-miRNA à partir de différentes régions du génome. Les gènes codant pour les microARN peuvent être retrouvés en dehors des gènes codants, dans des régions inter-géniques (voir figure 5) (Lee and Ambros 2001). Néanmoins, les microARN sont aussi exprimés à partir

d’introns à l’intérieur d’un gène codant pour des ARNm (microARN introniques) , ainsi miR-7 est retrouvé dans l’intron de la protéine hnRNP k chez les insectes et les mammifères (Aravin,

Lagos-Quintana et al. 2003; Bartel 2004). En fait, on estime qu’environ 50% des gènes de microARN sont introniques (Griffiths-Jones, Saini et al. 2008). L’eбpression de ces gènes introniques peut être

associée à l’eбpression du gène qui les héberge mais ce n’est pas toujours le cas. En effet, les niveauб d’eбpression du microARN et du gène hôte ne sont pas toujours corrélés. L’equipe de

Monteys a montré que des promoteurs dépendant de la polymérase II (permettant l’eбpression des ARN messagers) ou III (transcription des ARNt) étaient présents dans les introns de gènes hébergeant les gènes de microARN et ont ainsi prouvé que miR-128-2 peut être transcrit grâce au

promoteur du gène l’hébergeant mais aussi indépendamment de celui-ci (Ozsolak, Poling et al.

2008; Wang, Xuan et al. 2009; Monteys, Spengler et al. 2010). L’eбpression peut se faire par

transcription d’ARN polycistronique et eбpression d’un groupe de microARN mais la majorité des

gènes des microARN sont isolés (Lim, Glasner et al. 2003; Lim, Lau et al. 2003). Les pri-microARN ainsi produits sont de longs transcrits comportant des structures en tige-boucle (Lau, Lim et al. 2001).

Les pri-microARN sont ensuite clivés en pré-microARN d’environ 70 nucléotides par La RNase III

Drosha qui est présente au sein d’un complexe protéique qualifié de « complexe microprocesseur »

ou « Microprocessor complex » de 500kDa chez la drosophile et C.elegans et de 650kDa chez

l’homme. Au sein de ce compleбe protéique, un cofacteur est nécessaire au clivage du

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Figure 4 (Page précédente): Mécanismes de biogenèse des microARN et mécanismes d’action, à partir de (Filipowicz, Bhattacharyya et al. 2008; Winter, Jung et al. 2009).

Les microARN sont transcrits par l’ARN polymerase II ou III en pri-microARN qui sont ensuite clivés en pré-microARN de 70 nucléotides par

Drosha et DGCR8. Les pré-microARN sont alors eбportés du noyau par l’eбportine5 et clivés en duplex de microARN par Dicer. Le microARN mature est ensuite pris en charge par le complexe RISC comprenant les protéines Argonaute Ago, la protéine GW182 ou TNRC6. Le microARN

mature est alors associé à l’ARNm cible. Si le microARN et l’ARNm sont parfaitement complémentaires, l’ARNm est clivé. Si la complémentarité est imparfaite, la traduction est inhibée et l’ARNm subit une déadénylation dans les P-bodies et est ensuite dégradé.

Figure 5 : Localisation des gènes des microARN et quelques exemples. D’après(Kim, Han et al. 2009).

Les microARN peuvent être exprimés à partir des régions codantes et non codantes. Leur séquence peut être dans des régions introniques ou dans les exons des transcrits. Ils peuvent être aussi intergéniques. Des études récentes ont montré qu’ils pourraient aussi être exprimés à partir des ARN de transfert (Pederson 2010; Reese, Xia et al. 2010) .

TU : Transcription Unit

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Les pré-microARN sont ensuite eбportés du noyau par l’eбportine 5 en présence de Ran-GTP (Lund, Guttinger et al. 2004) (voir figure 4).

La compréhension des mécanismes de biogénèse des microARN matures a débuté par l’observation en Northern blot de microARN d’environ ββ nucléotides mais aussi d’ARN plus long (70

nucléotides environ) dont l’analyse structurale a permis de déterminer qu’ils formaient une structure en tige-boucle. Il fut alors envisagé que ces pre-microARN étaient les précurseurs des microARN (Lee, Feinbaum et al. 1993). Or, il était déjà connu que la RNAse III multi-domaines Dicer pouvait générer des siRNA, autres petits ARN non-codants de même taille que les microARN, à partir d’un long précurseur double-brin. Il a alors été envisagé que Dicer pouvait aussi être responsable du clivage des pré-microARN en microARN matures. La validité de cette hypothèse a été démontrée par la capacité de Dicer purifiée par immunoprécipitation à cliver les pré-microARN en microARN matures (Bernstein, Caudy et al. 2001; Grishok, Pasquinelli et al. 2001; Ketting, Fischer et al. 2001; Knight and Bass 2001). Dicer est une protéine conservée qui contient un domaine hélicase, un ou

deuб sites de liaison à l’ARN double brin et deuб domaines RNAse de type III. Dans le cytoplasme,

Dicer ( ou DCR-1 homologue de Dicer chez C.elegans) clive le précurseur double brin en ARN de

19 à β5 nucléotides à partir de l’eбtrémité γ’ du pré-microARN reconu par le domaine PAZ de la

protéine (Ketting, Fischer et al. 2001; Zeng, Yi et al. 2005; MacRae, Zhou et al. 2007).

En dehors de cette voie canonique, il eбiste d’autres voies de synthèse des microARN sans Drosha :

c’est le cas des « mirtrons » présents dans des introns eбcisés au cours de l’épissage et eбportés du

Figure 6 : biogénèse du pré-microARN

Le pri-microARN est clivé par Drosha à 11 pb de la jonction entre les segments simples brins et doubles brin. Le pre-microARN est ensuite clivé par Dicer aboutissant à la formation du microARN mature de 22 nucléotides.