Thrombophilie : exploration biologique

Thrombophilie : exploration biologique

M. Alhenc-Gelas, L. Darnige

La thrombophilie clinique est caractérisée par la survenue de thromboses essentiellement veineuses précoces ou récidivantes, ou de siège inhabituel, non ou mal expliquées par le contexte clinique. La throm- bophilie biologique est définie comme un état d’hypercoagulabilité qui augmente le risque de thrombose.

La détermination du potentiel thrombotique biologique d’un individu atteint de thrombophilie clinique influence la prise en charge thérapeutique. Il est déterminé à partir d’un

bilan de thrombose

qui doit comporter la recherche de tous les facteurs biologiques de risque

établis

génétiques (déficits en antithrombine, protéine C, protéine S, FV Leiden, mutation

20210G>A, dysfibrinogénémies) et acquis (anticorps du syndrome des antiphospholipides, polyglobulie, thrombocytémie). La recherche de la mutation V617F de JAK2, d’hémoglobinurie paroxystique nocturne et le dosage de l’homocystéine ne sont effectués que dans des formes cliniques particulières. Les recherches d’anomalies doivent être réalisées en tenant compte des recommandations des sociétés savantes, à la fois en ce qui concerne les individus à explorer, les aspects temporels et les aspects techniques (préanalytiques et analytiques).

©2017ElsevierMassonSAS.Tousdroitsréservés.

Mots-clés:Thrombophilie;Inhibiteursdelacoagulation;FVLeiden;F220210G>A;SAPL;JAK2; Homocystéine;HPN

Plan

■Introduction 1

■Facteursderisquegénétiques 1

Physiopathologie 1

Méthodesd’étude 4

■Facteursderisqueacquis 6

Syndromedesantiphospholipides 6

SyndromesmyéloprolifératifsetmutationV617FdeJAK2 7

Hémoglobinurieparoxystiquenocturne 7

■FacteurVIIIethomocystéine 8

FacteurVIII 8

Homocystéinémie 8

■Bilandethromboseenpratique 8

Indications 8

Bilandethrombose 8

Stratégied’exploration 9

Aspectstemporels 9

Introduction

La thrombophilie comporte deux aspects, biologique et cli- nique.Lathrombophiliecliniqueestcaractériséeparlasurvenue dethromboses(essentiellementveineuses[TV]:phlébitesinex- pliquéesdesmembresinférieurs,emboliespulmonaires,ouplus rarementde siègeinhabituel[cérébrale,mésentérique, membre supérieur, etc.]), précoces, récidivantes. La thrombophilie bio- logique est définie comme un état d’hypercoagulabilité qui augmentelerisquede thrombose.Lapathologie thrombotique

estmultifactorielle^[1].Lepotentielthrombotique(PT)d’unindi- viduestfonctionduterraingénétique.Lanotiond’unehistoire familialedethromboseestàprendreencomptecarlarecherche desfacteursderisque(FR)génétiquesconnusestnégativedans environ lamoitié desfamilles concernées.LePTd’unindividu évolueaucoursdutempsenfonctiondesonâge,decirconstances favorisantesoudéclenchantescliniquesoupharmacologiques,et del’apparitionéventuelledeFRbiologiquesacquis (Tableau1).

Chezunsujetsymptomatique,lesdécisionsthérapeutiquesvisant àéviterdesrécidivessontprisesentenantcompteduPTglobal.

LePTbiologiqueestdéterminéàpartird’un«bilandethrom- bose»quicomportelarecherchedetouslesFR«établis»dont laprésenceauneinfluencesurlerisquetellequ’elleinfluencela priseenchargethérapeutique.

Danslesformeshabituellesdethrombophilieclinique,lebilan comporte des recherches des anomalies constitutionnelles des inhibiteurs de la coagulation (antithrombine [AT], protéine C [PC],protéineS[PS]),desmutationsFVLeidenetF220210G>A et des dysfibrinogénémies héréditaires,et celles des anomalies acquises (anticorps [AC] du syndrome des antiphospholipides [SAPL],syndromesmyéloprolifératifs[SMP],polyglobulie[PV]et thrombocytémieessentielle[TE]).

Larecherchedequelquesautresanomaliesestréaliséedansdes formescliniquesexceptionnelles(cf.infra)^[2].

Facteurs de risque génétiques

Physiopathologie

Lesmutationsthrombogènesaffectentdesprotéinesquiontun rôleessentieldanslacascadedelacoagulation(Fig.1).

EMC-Biologiemédicale

1

Volume12>n^◦1>janvier2017

Tableau1.

Principauxpartenairesdurisquethrombotique.

Situationscliniques Facteursderisque

Génétiques Acquis

Âgeélevé DéficitenAT Polyglobulie,thrombocytémie

Antécédentsdethrombose DéficitenPC SAPL

Cancer DéficitenPS JAK2V617F^a

Obésité FVLeiden

Immobilisation F220210G>A

Chirurgie Dysfibrinogénémie

Grossesseetpost-partum

Voyagesenaviondeplusde5heures Traitementsparestrogènes

AT:antithrombine;PC:protéineC;PS:protéineS;F:facteur.

aThrombosessplanchniques.

FX

FXa FXa-FVa

FIXa-FVIIIa AT

AT

AT

AT FT

FIX

PS/PCa PC

FII

FXIIIa

Fibrine Fibrinogène

FXIII FIIa

FIXa FVIII

FV

FXIa FXI FVII

FT-FVIIa

Figure1. Cascadede lacoagulation,activationset inhibitions.AT : antithrombine;PCa:protéineCactivée;PS:protéineS;F:facteur.

FVLeiden,F220210G>A

LefacteurV(FV)auneactionprocoagulanteentantquecofac- teurdel’actiondufacteurXa(FXa)surlaprothrombine(FII)et uneactionanticoagulanteentantquecofacteurdelaPCactivée (PCa)vis-à-visdeladégradationdufacteurVIIIactivé(FVIIIa).La PCadégradeleFVactivé(FVa)parclivageauniveaudesarginines enposition506et306.Leclivageen506intervientenpremieret estprépondérantlorsqueleFVaetlaPCasontprésentsenfaible concentration,maisl’inactivationn’esttotalequ’aprèsclivageen 306.LeFVest codéparle gèneF5situésurle chromosome1.

LeFVLeidenestunfacteurVanormalquirésulted’unesubstitu- tionG>Aenposition1691dugène,induisantleremplacementde l’argininenormalementprésenteenposition506delaprotéine paruneglutamine.Cette mutationengendreune résistancedu FVaauclivageparlaPCa(RPCA),avecplusdeFVaetdethrom- bine(FIIa)pouvantperdurerdanslacirculation,etunpotentiel thrombogèneaccru^[3].LeFIIesteneffetleprécurseurcirculant inactifduFIIa,enzymequiaunrôleessentieldanslacascadede lacoagulationpuisqu’elleestresponsabledelatransformationdu fibrinogènesolubleencaillotdefibrine.LeFIIestcodéparlegène F2situésurlechromosome11.LamutationF220210G>Asesitue enavaldelaséquencecodante,danslarégion3 nontraduite.

Elleaugmentel’efficacitéduclivageetdelamaturationdesacides ribonucléiquesmessagers,etlasynthèsedufacteur.Cemécanisme pourraitexpliquerl’associationsignificativedelamutationàdes tauxplasmatiquesélevésdeFIIquiinfluencentlagénérationde FIIa^[4].

Déficitsen inhibiteursdelacoagulation

Ladécouvertedansdesfamillesthrombophiliquesdedéficitsen AT,PCouPSadémontrélerôlefondamentaldecesinhibiteurs entantquerégulateursdelacoagulation.

Physiologiedesinhibiteurs

Antithrombine. L’ATestuneprotéineplasmatiquecirculante (concentration moyenne 200 ␮g/ml), de synthèse exclusive- ment hépatocytaire. Elle appartient à la famille des serpines (sérine-protéasesinhibiteurs) etpossèdedeuxsites fonctionnels essentiels,lesited’interactionaveclessérine-protéasesciblessitué à l’extrémitéC-terminaledela molécule,etlesite deliaison à l’héparineouauxhéparansulfatesde laparoivasculaire àdis- tancedecelui-ci.Lesprotéasesciblessontinhibéesparformation de complexes 1/1 engageant leur site actif. L’héparine ou les héparansulfatessontdescofacteursdel’AT,quiagissentenaug- mentantla vitessed’inactivation (d’unfacteur d’environ2000 pourl’interactionAT-IIa).L’éliminationdescomplexessefaitpar l’intermédiaired’unrécepteurhépatique^[5].

Leslimitesdevaleursderéférencesonthabituellementexpri- méespourlesprotéinesdel’hémostaseenconsidérantunevaleur moyennenormale à100%.Chezl’adulte,l’ATplasmatiqueest normalementcompriseentre80et120%.Àlanaissance,l’ATest enmoyenneà50%etlesvaleursdel’adultesontatteintesvers l’âgede1an^[6].Lespersonnesâgéespourraientprésenterdestaux d’ATunpeuplusbas,demêmequelesfemmesenceintes^[7].

Protéine C, protéine S. La PC est une glycoprotéine vita- mine K dépendante de synthèse exclusivement hépatocytaire, circulante (2 ␮g/ml en moyenne dans le plasma). Elle est synthétiséesousformemonocaténaireinactiveet devientbica- ténaire avec une structure remaniée après activation. Les domaines fonctionnels essentiels sont le domaine des acides gamma-carboxy-glutamiques(GLA)àl’extrémitéN-terminale(la carboxylationestl’étapevitamineKdépendante),indispensables àlafixationdelaprotéinesurlessurfacesphospholipidiques(PL), le site declivage par le FIIa etle site catalytique à l’extrémité C-terminale^[8].

La PS est une glycoprotéine monocaténaire également vita- mine K dépendante et possédant de ce fait des analogies de structureimportanteaveclaPC(enparticulierledomaineGLA).

Àla différencedela PC,la PSn’est pasprécurseurmaiscofac- teurdeprotéase,etnepossèdedoncpas desitecatalytique en C-terminal,mais un domaine qui a des analogies de structure aveclasexhormonebindingglobuline.Lesrégionsimpliquéesdans lesinteractionsavecsespartenairesontétélocalisées.LaPSn’est pasexclusivementhépatocytaire;lacelluleendothélialeparticipe àsaproductionetlesplaquettesencontiennent.Saconcentra- tionplasmatiquemoyenneestdel’ordrede20␮g/ml.Ellecircule pour60%liéeauxchaînesbêtad’uneprotéineducomplément, laC4bBP,etpour40%sousformelibre(PSL).

LesystèmePC-PSestunsystèmeanticoagulantphysiologique majeur,toutparticulièrementauniveaudelamicrocirculationoù lasurfaceendothélialeesttrèsimportante.LaPCfixéeàunrécep- teurendothélialspécifique,l’endothelialPCreceptor,estactivéepar

Tableau2.

Prévalencedesanomaliesgénétiquesetrisquethromboembolique.

Facteurderisque Prévalence(%) Risquerelatif

Populationgénérale PatientsTV+ PremièreTV Récidive

DéficitATHz 0,02–0,05 1–2 20–50 2,5

DéficitPCHz 0,2–0,4 3 15 2,5

DéficitPSHz* 0,03–0,1 2 10 2,5

FVLeidenHz 5 20 3–5 1,5

F220210G>AHz 2 6 2–3 1,5

GroupesanguinnonO 55–57 75 2 2

Hz:hétérozygote;TV:thrombosesveineuses;AT:antithrombine;PC:protéineC;PS:protéineS;F:facteur.

le FIIafixé à unautre récepteurendothélial,la thrombomodu- line(TM).Defac¸onintéressante,auseinducomplexeFIIa-TM,le FIIaperdtotalementsescapacitésprocoagulantesetactivatrices plaquettaires.LaPSexerceunrôledecofacteurdelaPCaenaug- mentantl’affinitédelaPCapourlesPLdessurfacessurlesquelles ellesefixe.LaPCa,aidéeparlaPSlibre,dégradelesFVaetFVIIIa parclivage, cequi entraînela pertedeleurfonctionprocoagu- lante.EllepourraitégalementinhiberdirectementleFIXaetêtre cofacteur du tissuefactor pathway inhibitorpour l’inhibitiondu complexefacteurtissulaire-FVIIa-FXa^[9].

PourlaPC,leslimitesdesvaleursderéférencedel’adultesont 70et140%.Àlanaissance,laPCplasmatiqueestcompriseentre 17 et 53%. Lesvaleurs de l’adulte ne sont atteintes quevers l’âgede15ans^[10].Lagrossesse n’entraînepas demodification significative^[11].PourlaPS,ceslimitessontfonctiondusexeet del’âge.Lalimite inférieureestde 60%pourleshommes, de 55%pourlesfemmes ménopausées,de50%pourles femmes plusjeunes,maisleseuilderisquethrombotiqueaccru sesitue franchementplusbas,vers30à 40%^[12].Àla naissance,laPS est comprise entre 12 et 60 %, et les valeurs de l’adulte sont atteintesvers6mois^[10].Lagrossesseengendreunediminution de la PS dès le début du deuxième trimestre, dépendante des estrogènes^[11].

Pathologie

Déficitsacquis^[13–15]. DesdéficitsacquisenAT,PCouPSsont observésdanslecadredel’insuffisancehépatocellulaire(diminu- tiondesynthèse),dessyndromesdeconsommation(thromboses étenduesetcoagulationintravasculairedisséminée),dusyndrome néphrotique (parfuite urinaire mal compensée). La formation d’ACdirigéscontrecesprotéinesestunecausetrèsrarededéfi- cit acquis en PC ou PS. Pour la PS, au cours du syndrome inflammatoire,laconcentrationplasmatiquedeschaînesbêtade C4b-BPpeut modifierl’équilibreentrelesformesliéesinactives etlibres,avecsoitdesdéficitsacquis,soitdesaugmentationsde PSLsusceptiblesdemasquerdesdéficitsconstitutionnels.Desdéfi- cits acquis sont observés en cas d’hypovitaminose K d’origine pathologiqueouthérapeutique.LetraitementparantivitamineK (AVK)entraîneuneffondrementdesactivitésanticoagulantes,des baissesplusmodéréesdel’activitéamidolytiquedePC, etdela quantitédePCet PScirculantes(modificationdu métabolisme dela protéine).L’administrationorale d’estrogènesdiminueles taux d’AT et de PS, avec un effet plus ou moins net en fonc- tion du traitement. Les traitements curatifs par héparine non fractionnée(HNF)ouhéparinedebaspoidsmoléculaire(HBPM) à fort pourcentage de chaînes longues peuvent entraîner une diminution de la concentration d’AT de l’ordre de 20 %. Les traitementsparL-asparaginaseentraînent desdéficitsacquisen inhibiteurs.

Déficitsconstitutionnels. LesdéficitsconstitutionnelsenAT, PC,PSsontdesanomaliesàtransmissionautosomiquedominante à pénétrancevariable. Laplupart desdéficitsretrouvéschezles sujets symptomatiques sont des déficits quantitatifs (de typeI pourATetPC,ouI/IIIpourPS).Lesdéficitsqualitatifs(typeII) sontrares.

Lesgènesquicodentcesinhibiteurssontpourl’AT,SERPINC1 (septexons),situésurlechromosome1,pourlaPC,PROC(neuf exons,chromosome2)etpourlaPS,PROS1(15exons,chromo- some3).Lesbasesmoléculairesdesdéficitsontétébienétablies,

avecplusde300mutationsdélétèresidentifiéespourchaquegène (non-sens,fauxsensougrandsremaniementsgéniquesdansles déficits de type I et, sans surprise, plutôt des mutations faux sensaffectantdessitesfonctionnelsdanslesdéficitsdetypeII).

Degrandsremaniementsgéniquessontbeaucoupplusrarement retrouvésdanslesdéficitsenPCquedanslesdéficitsenATouPS.

Ilyapeudemutationsrécurrentes.Pourl’AT,ilexistetroistypes dedéficitsdetypeII:typeIIRS,quicorrespondàdesmutations quiaffectentlesiteactifd’inhibitiondesprotéases(reactivesite), typeIIHBS(heparinbindingsite)avecdesmutationsquiaffectent lesitedeliaisonàl’héparineettypeIIPEpouranomaliespléiotro- piques,grouped’anomaliesplushétérogènesdontcertainesont un retentissementsur la stabilité.Les déficitsqualitatifs enPC comportentdesdéficitsdetypeIIAC(avecanomaliedel’activité anticoagulante,sansanomaliedel’activationoudel’activitédu site protéasique)etde typeIIAM(anomaliesdel’activationou del’activitédelaPCaavecretentissementsurl’activitéamidoly- tique)^[16–18].

Dysfibrinogénémies

Lefibrinogèneestcomposédetroischaînespolypeptidiquesdif- férentes,␣,␤et␥,organiséesendimèresetcodéespartroisgènes, FGA,FGB,FGG,faisantpartied’un cluster localisé surle chro- mosome4.Quelquesanomaliesqualitativesconstitutionnellesdu fibrinogène,facteurderisquedethrombose,ontétérapportées, enrelationavecdes anomaliesdeformationoude stabilitédu caillot^[19].

Fréquence.Risquethromboemboliqueassocié La prévalence dans les populations caucasiennesdes déficits héréditairesenAT,PC,PS,etdesmutationsthrombogènesdeF5 etF2,ainsiquelesrisquesrelatifsdeTVassociésàleurprésenceà l’étathétérozygote,sontrapportésdansleTableau2^[20].Lesdys- fibrinogénémiessonttrèsrares,retrouvéeschezmoinsde1%des sujetsquiprésententunethrombophilieclinique.

Ilexisteunegrandehétérogénéitédesconséquencescliniques desdéficitseninhibiteursexpliquéeparlecaractèreplusoumoins délétèredesmutationssous-jacentes.

LesdéficitsenATdetypeIIHBSsontdécritsdepuislongtemps commemoinsthrombogènesquelesdéficitsenATdetypeIou RS(risquefaibleàl’étathétérozygote).Cependant,desdonnéesde 2016montrentunehétérogénéitédurisqueauseindecegroupe, avecaumoinsunvariant(ATBudapestIII)entraînantunrisque thrombotiquesignificatifàl’étathétérozygote^[21].

Deplus,lephénotypeplasmatiquen’estpassystématiquement lerefletfidèledu risqueconditionnéparlamutation.L’activité cofacteurdel’héparinedel’ATestdel’ordrede50%,quecesoit chezleshétérozygotesporteursdevariantsHBSoudemutations detypeI,etellepeutêtrepeudiminuéechezlesporteursdecer- tainsvariantsdetypeIIPEouRS(quiengendrentunrisquefort).

PourlaPC,ilademêmeétémontréquedespatientshétérozygotes pourdesmutations«fortes»pouvaientavoiruneconcentration dePCpeuvoiremêmenondiminuée^[22].Unautreexempleestune mutationdePCresponsabled’undéficitqualitatifqui serévèle êtreunemutationgaindefonctionlorsquesesconséquencessont étudiéesdansuntestdegénérationdeFIIa^[23].PourlaPS,lesmuta- tionsdontlaprésenceconditionneunrisquethrombotiqueaccru

Tableau3.

Antithrombine,mesuredel’activitécofacteurdel’héparineetdétectiondevariants.

Type Mutation Activitécofacteurdel’héparine

AntiXa AntiIIa

IIRS Stockholm(p.G424D) D NouD

IIRS Denver(p.S426L) N D

IIRS Glasgow(p.R425H) Dmêmesiincubationlongue Dseulementsiincubationcourte

IIHBS Dseulementsiincubationcourte

D:diminuée;N:normale.

sontretrouvéeschezlessujetsquiprésententmoinsde30à40% dePSLcirculante.LamutationHeerlen(p.Ser501Pro),mutation faibleassociéeàune PSplasmatiquepeudiminuée,n’a,à l’état hétérozygote,pasd’effetsignificatifsurlerisquethrombotique.En cequiconcernelesdéficitsenPSdetypeII,lesquelquesmutations responsables dedéficits qualitatifs misesenévidence semblent avoirpeud’effet^[12].Lesstatutshomozygote,hétérozygotecompo- siteet doublehétérozygoteentraînent unrisque thrombotique supérieurà lasimplehétérozygotie.Cependant,la raretédeces statutsestunegêneàl’estimationdudegréderisque.D’aprèsla littérature,lerisquedepremièreTVassociéàladoublehétérozy- gotiepourFVLeidenetF220210A,ouàl’homozygotiepourFV Leiden,seraitdel’ordrede15à 20etlerisquederécidivetout auplusdel’ordrede2,5^[24].L’homozygotiepourledéficitenAT n’estrencontréequepourdesanomaliespeuthrombogènes(car elleestprobablementlétaleavantlanaissancepourlesmutations plusdélétères);pourPCetPS,l’homozygotiepourdesmutations avecabsencetotaledeprotéinecirculanteactivepeutentraînerdes manifestationsthrombotiquessévèresdèslanaissanceoumême inutero(nécrosescutanées,etc.)^[25].Letableaucliniqueobservé chezun hétérozygote compositepour desmutations peudélé- tèrespeutnepasêtredifférentduphénotypecliniqueassociéà unehétérozygotiesimplepourunemutationclairementdélétère.

Méthodes d’étude

FVLeiden,F220210G>A^[26]

Lesrecherchesdemutationsontencadréesparla législation.

Ellesnepeuventsefairequedansdeslaboratoiresagréésetavec le consentement éclairé signédu patient. Toutes les méthodes derecherchedemutationsponctuellespeuventêtreemployées.

Lestechniquesdepolymerasechainreactionentempsréel,lesplus utiliséesactuellement,permettentuneréalisationsimultanéedes étapesd’amplificationdel’acidedésoxyribonucléiqueetdedétec- tionde lamutation surleproduit amplifié;ellesutilisentune sondefluorescente qui permet la quantification etla caractéri- sation del’amplicon formé entemps réel.Elles permettentde déterminersans ambiguïté lestatut génétique (homozygoteou hétérozygote).LarecherchedelamutationF220210G>Anepeut sefairequepartestdebiologiemoléculaire.

Uneautreapprochedela présencedu FVLeidenestla réali- sationd’untestplasmatiquequimesurelaRPCA.Eneffet,leFV LeidenestlacausequasiexclusivedeRPCA associéeàla TV.Il existedenombreuxcoffretscommerciauxbaséssurladétermina- tiondetempsdecoagulation(TC)enprésenceetenl’absencede PCa.Cesontdestestsplasmatiques dedépistage,facilesàréali- serdansleslaboratoiresd’hémostase,maisquinepermettentni d’affirmerlaprésencedel’anomaliemoléculaire,nidedéterminer lestatutgénétique.Deplus,ilyadesrisquesdefauxrésultats,les testsplasmatiquespouvantêtresoumisàinterférences.Pources raisons,unrapportdelaHauteAutoritédesantéde2007propo- saitdeprivilégierlarecherchedelamutationquiadepuislorsété inscriteàlanomenclaturedesactesdebiologiemédicale.

Inhibiteursdelacoagulation

Ilfaututiliserenpremièreintentionlestechniquesdemesure sensibles à tous les typesde déficits (AT :mesure de l’activité cofacteurdel’héparine;PCetPS:mesuresd’activitépartestde coagulation).

Antithrombine

Les techniques utilisées doivent permettre de diagnostiquer touslestypesdedéficits.Troisméthodologiessontàemployer: endépistage,lamesuredel’activitécofacteurdel’héparinequiest laplussensibleàl’ensembledesdéficitsquelqu’ensoitletype, complétéedanslecadredutypageparlamesuredel’antigèneet del’activitéprogressive^[27].

Mesure de l’activité cofacteur de l’héparine. Cette tech- nique permet d’évaluer la capacité de l’AT à inhiber FIIa ou Xaajoutéenquantitéfixe etenexcès,enprésenced’héparine.

Laquantité résiduelle deprotéase est mesurée parson activité amidolytique sur substrat spécifique. Pour mesurer spécifique- ment l’AT, il faut impérativement un temps d’incubation du mélange plasma-protéase-héparine court, un excès d’héparine danslemilieuet,sil’onutiliseduFIIa,ildoitêtred’originebovine.

Letampondedilutionduplasmaaégalementsonimportance.

Laméthodeestthéoriquementapteàdépistertouslesdéficits.Il existedenombreuxréactifscommerciauxetdesadaptationspour l’automatisation.

Il convient d’être extrêmement vigilant lors du choix d’un coffret carles performances sont hétérogènes.La détectionde certainesmutationsdetypeIIRS(mutationStockholm,Denver, Glasgow,parexemple)oudetypeIIHBS,mutationsdontlapré- senceaugmentesignificativementlerisquedethrombose,àl’état hétérozygotepourlespremièresouàl’étathomozygotepourles deuxièmes,estparticulièrementdélicate(Tableau3)^[28,29].

Lesrésultatssontinterprétablesnormalementchezlespatients sous héparines. En ce qui concerne les anticoagulants oraux directs(AOD):si laprotéase cibleest leFIIa,l’activitéanti IIa despatientssousAODdetypeATnepeutpasêtreétudiée;chez lespatientstraitésparantiXadirects,lamesuren’estpaspossible silaprotéasecibleestduFXa.

Dosageimmunologique. L’ATestfacileàmesurerpartech- niqueimmunologique.EnEurope,quelqueslaboratoiresutilisent encore l’immunoélectrophorèse ou l’immunodiffusion radiale.

Laplupart utilisentdes techniquescommerciales enzyme-linked immunosorbentassay(Elisa),ouimmunoturbidimétriquesautoma- tisées,dontlescaractéristiquesanalytiquessontplusfavorables.

Ànoterquedanscertainesméthodologieslaprésencedefacteur rhumatoïdepeutinduireunesurestimationdutauxd’AT.

Mesuredel’activitéprogressive. Cetteméthodediffèredela mesuredel’activitécofacteurdel’héparineparl’absenced’ajout d’héparinedanslemilieuréactionneletparuneincubationplus longueduplasmaàétudieraveclaprotéasecible.Cetestévalue lacapacitéfonctionnelledusited’inhibitiondesprotéases,mais ilneprendpaslafonctionnalitédusitedeliaisonàl’héparineen compte.IlpermetdedifférencierlestypesIIHBS(activitéprogres- sivenormale)destypesIIRS(activitéprogressivebasse).Ànoter queletempsd’incubationpluslongréduitlaspécificité;deplus, ilnepeutpasêtreréaliséchezunpatienttraitéparhéparine.

Bienquecetteméthodesoitindispensableautypage,iln’existe pas,ànotreconnaissance,d’adaptationcommercialesatisfaisante surleplandesperformancesanalytiques.

Résultats dans les différents typesde déficits(Tableau 4).

DanslesdéficitsdetypeI,lesrésultatssontclairementanormaux avecles troisméthodes.Dansles déficitsdetypeIIPE, lestaux sonttrès peudiminués(70–80 %),rendantle diagnosticparti- culièrement difficile. Dans les déficits de type IIHBS, l’activité cofacteurde l’héparineestseule anormale.Dansles déficitsde typeIIRS,l’activitécofacteurdel’héparineetl’activitéprogressive sonttoutesdeuxanormales.

Tableau4.

Déficitseninhibiteurs:méthodesd’étude.

Inhibiteur Méthodedemesure Résultatdiminuési AT Activitécofacteurhéparine I,IIHBS,IIRS,IIPE^a

Activitéprogressive I,IIRS,IIPE^a

Antigène I,(IIPE^a)

PC Activitéamidolytique I,IIAC,IIAM Activitéanticoagulante I,IIAC

Antigène I

PS Activité II

Antigène(PSlibre) I,III AT:antithrombine;PC:protéineC;PS:protéineS.

aPeudiminué.

ProtéineC

Ilexistedestechniquesd’étudedelaPCbaséessurtroisprin- cipesdifférents:lamesureparTC,quiestapteàdépistertousles typesdedéficitsetestdoncàutiliserenpremière intention,la mesuredel’activitéamidolytiquequiévaluelacapacitédelaPC àêtreactivéeetlafonctionnalitédusiteprotéasiquedelaPCa,et lamesuredel’antigène.

Mesuredel’activité. Lestechniquescommercialesonttoutes unepremièreétaped’activationdelaPCàl’aided’uneenzyme spécifiqueextraited’unvenindeserpent,leProtac^®.Ànoterque decefaitlavoiephysiologiqued’activationdelaPC(àl’aidedu complexeFIIa-TM)n’estpasexplorée.

Technique de coagulation. Dans ce cas, la deuxième étape consisteenlamesured’unTCaprèsajoutd’unplasmacommer- cialdéplété enPC, dans untest global de typeTCA,ou après déclenchement dela coagulationpar ajout devenin de vipère Russel(VVR)activateurduFX.L’activitécatalytiquedusitepro- téasiqueetlesinteractionsaveclesprotéinescibles,laPS,lesPLet lecalciumsontexplorées.Cestestsétudientdoncdenombreuses facettesfonctionnellesdelaprotéine,maisétanttrèsglobaux,ils sontles plussensibles auxinterférences:présence d’héparines (lesseuilsd’interférencesontsouventindiquésparlesfabricants), oudecertainsanticoagulantslupiques(LA)qui,enallongeantles TC,peuventmasquerdesdéficits;tauxélevésdeFVIIIouprésence duFVLeidenqui,enraccourcissantlesTC,peuventsimulerdes déficits.Lesdegrésd’interférencesontplusoumoinsimportants enfonctiondescoffrets,etilconvientdeprendreconnaissance des indications apportées par le fabricant et la littérature. Ces techniquesnedoiventpasêtreréaliséessousAOD;eneffet,lapré- senced’AODpeutentraînerdesallongementsdeTCsusceptibles demasquerdesdéficitssous-jacents^[30].

Techniqueamidolytique. Danscecas,ladeuxièmeétapeétudie lacapacitédelaPCaàcliverunsubstratchromogènespécifique.

Cetteméthodeposemoinsdeproblèmestechniquesquelaprécé- denteetpeudeproblèmesd’interférence,quelquesoitlecoffret commercialutilisé.

Dosage immunologique. Les faibles concentrations circu- lantesdePCimposentl’emploidetechniquesde typeElisaou enzyme-linkedfluorescenceassay(surVIDAS^®).

Résultats dans les différents types de déficit (Tableau 4).

DanslesdéficitsdetypeI,lestroisméthodesdonnentdesrésultats anormaux;danslesdéficitsdetypeIIAM,l’activitéestanormale, quellequesoitlatechniquedemesure,laconcentrationdelapro- téineestnormale.DanslesdéficitsdetypeIIAC,l’activitémesurée partestdecoagulationestseuleanormale.

ProtéineS

LaclassificationdesdéficitsenPSdiffèredecelledesdéficitsen PCouAT:ilexistedeuxtypesdedéficitsquantitatifs,detypeI avecPSLettotale(PST)conjointementdiminuées,etdetypeIII avecPSLdiminuéemaisPSTnormale.

Mesuredel’activité. L’activité dela PS se mesuredans un systèmeoùelleestcofacteurdel’effetprotéasiquedelaPCa.Les testscommercialisésmesurentl’allongementduTCinduitparla PSdansunmélangeduplasmaàtesteretd’unplasmacommercial dépourvudePS,enprésencedePCa(exogèneouproduitedansle mélangeàl’aideduProtac).Lacoagulationestétudiéedansuntest

detypeTPouTCA,ouaprèsactivationparduFXaajoutéoupro- duitparactivationendogèneduFXparleVVR.Lestauxélevésde FVIII,laprésenced’héparines,decertainsLAetduFVLeidensont descausespotentiellesdefauxdiagnostics.L’influenceestplusou moinsgrandeenfonctionducoffret.L’activitédelaPS,comme l’activitéanticoagulantedelaPCetpourlesmêmesraisons,ne peutpasêtreévaluéechezlessujetstraitésparAOD^[31].

Laqualitédesréactifscommerciauxdemesuredel’activitédela PCetdelaPSesthétérogène,incitantlesbiologistesàlavigilance.

Dosageimmunologique. LesdosagesdePSLetPSTpeuvent être réalisés à l’aidede techniquesElisaou immunoturbidimé- triques.EncequiconcernelesdosagesdePSL,laprotéinepeut êtrecaptéesurdesparticulesdelatexrecouvertesdeC4bBPou d’unAC monoclonalanti-PSL,etlareconnaissances’effectueà l’aided’unautreAC monoclonalanti-PSL. Quelquesmutations affectentdesépitopesdela PSreconnusparl’unoul’autredes AC,etentraînentlamiseenévidenced’untauxbasdePSalors quel’activitéestnormale.

Résultats des dosages dans les déficits constitutionnels (Tableau4). Encequiconcernelesdéficitsquantitatifs,lesdéfi- citsdetypeIetIIIcoexistentauseindesmêmesfamilleschezdes sujetsporteursdelamêmemutation;uneffetdel’âgeaétéévoqué pourexpliquercephénomène.Ledegréderisquedethrombose chezlessujetsporteursd’undéficitdetypeIIInesemblepasdif- férerdeceluiretrouvépourlesdéficitsdetypeI,etl’évaluationde laPSTn’adoncpasd’intérêtcarsonrésultatn’apasd’influence surleconseilthérapeutique.DanslesdéficitsdetypeII,l’activité estseuleanormale^[18].

Testsplasmatiques:qualité

L’exploitation des résultats obtenus dans des programmes d’évaluation externe de la qualité a donné lieuà des publica- tionsqui ontbien montréla nécessité d’uneoptimisation des techniquescommercialesdédiéesàl’étudedesinhibiteurs.

Différentespistesd’améliorationontétéproposées.Lanéces- sitépourlesutilisateursdecalibrerlesméthodesàl’aided’étalons commerciauxeux-mêmescalibrésparrapportauxstandardsinter- nationaux disponibles a été plusieursfois soulignée ^[32,33].Un travailduGroupefranc¸aisd’étudessurl’hémostaseetlathrom- bose(GEHT)apermisdemettreàdispositiondeslaboratoiresdes limitesacceptablesdecoefficientsdevariationdefidélitéintermé- diaireetdebiais.

Analysedesgènes

L’analysedesgènesSERPINC1,PROCetPROS1apermisd’établir lesbasesmoléculairesdesdéficits.L’approcheclassiquecomporte l’analysedesexons,desjonctionsintron-exonetdesrégionspro- motrices proximales par séquenc¸age direct, et la recherche de grandsremaniementsgéniques.Desapprochesparnewgeneration sequencingcommencentàêtredéveloppées.L’analysedesgènes, onéreuseetcomplexeàréaliseretàinterpréter,n’estpasuneana- lysederoutinemêmesicertainsplaidentdanscesens^[34].Elleaide audiagnosticdansdes casparticuliers(phénotype plasmatique d’interprétationdifficile,enquêtefamilialevisantàdéterminerle caractèrehéréditaired’uneanomalieimpossible).Ladétermina- tionchezlesparentsdelamutationàl’originedelanaissanced’un enfant homozygote gravement atteint offre la possibilité d’un diagnosticanténatalpourdesgrossessesultérieures.Cesanalyses nedoiventêtredemandéesqu’auxquelquescentresdisposantde l’expertise nécessaireà l’estimationdes conséquencescliniques potentiellesdesmutationsmisesenévidence.

Dysfibrinogénémies

Le dosage du fibrinogène par TC (valeurs de référence 1,5–3,5 g/l) associé à la mesure du temps de thrombine per- metledépistagedecestrèsraresanomalies.Enprésenced’une dysfibrinogénémie,horscontexteinflammatoire, lefibrinogène coagulableestleplussouventdiminué.Letempsdethrombine estallongé.

La caractérisation utilise des méthodes complémentaires, immunologiqueetd’étudedesfonctionsauseindesvoiesdela coagulationetdelafibrinolyse.L’analysedugènepeutpermettre d’identifierlamutationresponsable.Ilexistedesdysfibrinogéné- miesd’origineacquisedansleshépatopathies.

Tableau5.

Critèresdiagnostiquesactuelsdusyndrome desantiphospholipides. Le diagnosticestretenusiaumoinsuncritèrecliniqueetuncritèrebiolo- giquesontprésents.

Critèrescliniques Thromboses

≥1thromboseartérielle,veineuseoude petitsvaisseaux

Complicationsobstétricales

≥1mortfœtaleinexpliquéeaprèsla 10^esemainedegestation

≥1naissanceprématuréeavantla 34^esemaineenraisond’uneéclampsie, d’uneprééclampsiesévèreoud’une insuffisanceplacentaire

≥3faussescouchesspontanéesconsécutives avantla10^esemaine

Critèresbiologiques LA

LAdétectésurdeuxprélèvementsàau moins12semainesd’intervalleselonles recommandationsinternationales aCL(sérumouplasma)

aCLd’isotypeIgGet/ouIgM,àdestaux moyensàélevés(>40GPLouMPL, ou>99^epercentile)surdeuxprélèvementsà aumoins12semainesd’intervalle,détecté paruntestElisastandardisé

Anti-β2GPI(sérumouplasma) Anti-␤2GPId’isotypeIgGet/ouIgM, (taux>99^epercentile)surdeuxprélèvements àaumoins12semainesd’intervalle,détecté paruntestElisastandardisé

LA:anticoagulantslupiques;aCL:anticorpsanticardiolipine;Ig:immuno- globulines;Elisa:enzyme-linkedimmunosorbentassay.

Facteurs de risque acquis

L’apport des tests biologiques dans les pathologies acquises favorisant la thrombose est particulièrement important pour le SAPL pour lequel les thromboses peuvent survenir à tout niveau de l’arbre vasculaire. La mutation V617F de JAK2 et l’hémoglobinurieparoxystiquenocturne(HPN)sontàrechercher dansdescontextescliniquesparticuliers.

Syndrome des antiphospholipides

Caractéristiques

LeSAPLestuneentitéclinicobiologiquedéfiniepardesmani- festations thrombotiques artérielles et/ou veineuses, et/ou des complicationsobstétricalesavecprésence persistanted’auto-AC dits«antiphospholipides»(aPL):LAet/ouACanticardiolipine (aCL)et/ouanti-béta-2-glycoprotéineI(aB2GPI)^[35] (Tableau5).

LeSAPLpeutêtreassociéaulupusérythémateuxsystémique,ou primaire.

Lesrecherches deLA détectentdes AC qui ontla capacitéà prolongerdesTCin vitro.Dansle contextedu SAPL,lescibles des AC sont la B2GPI ou le FII, protéines qui se lient aux PL anioniques. Le risqued’évènements cliniques enrelation avec laprésencedecesACvariedansl’ordredécroissantsuivant:LA aveccibleaB2GPI,LAaveccibleFII,aB2GPI,aCL.Latripleposi- tivitépourLA,aCLetaB2GPI estassociéeà unrisqueclinique beaucoupplusfortqu’unepositivitésimplepourl’undecespara- mètres.LesaPLpathogènesàl’originedelatriplepositivitésont desauto-ACdirigéscontreunépitopedudomaineIdelaB2GPI.

Lesmécanismespathogènesfontparticiperdifférentstypescel- lulairesavec desperturbationsdu fonctionnementendothélial, plaquettaire,monocytaire,etdespolynucléairesneutrophiles^[36]. Laprésenced’aPLn’estpasspécifiqueduSAPL:detelsACpeuvent apparaîtreaucoursd’infections(mononucléoseinfectieuse,hépa- tites virales, parvovirus B19, cytomégalovirus, lèpre, virus de l’immunodéficiencehumaine),decancersetd’hémopathieslym- phoïdes(notammentcelless’accompagnantd’unpicmonoclonal d’immunoglobulines M [IgM] qui peut avoir une activité LA), demaladiesauto-immunes(polyarthriterhumatoïde,scléroseen

plaques,Gougerot-Sjögren)et de certains traitements(bêtablo- quants,quinidiniques,dérivésdelachlorpromazine,interféron), maislesaPLmisenévidencedanscessituationssontdesACnon pathogènesdirigéscontredesciblesdifférentesdecellesquisont reconnuesparlesaPLpathogènes.Parexemple,lesaPLinfectieux nereconnaissentpaslaB2GPI.LesaPLnonpathogènessontle plussouventtransitoires(exceptépourlesACinduitsparcertains traitements)etcettecaractéristiquepermetdelesdifférencierdes aPLpathogènes.C’estlaraisonpourlaquellelecontrôledelaper- manencedesAC(résultatspositifsaumoinsdeuxfoisàaumoins 3moisd’intervalle)faitpartiedudiagnosticbiologiquedeSAPL.

Deplus,lecaractèrepathogènedesACnepeutêtreenvisagéque s’ilssontmisenévidencemoinsdecinqansaprèslesévènements cliniques.

Diagnosticbiologique

L’hétérogénéitédesaPLetl’absencedetechniquecommerciale spécifique de mise en évidence des AC pathogènes entraînent d’importantesdifficultésdiagnostiques.Lestravauxdessociétés savantesconduitsdepuislesannées2000ontpermisderédiger desrecommandationsquiharmonisentetaméliorentprogressi- vementlediagnostic.

RecherchedeLA

PourlarecherchedeLA,lespremièresrecommandationsinter- nationalesontétépubliéessousl’égidedel’InternationalSociety onThrombosisandHaemostasis(ISTH)en1995,puismisesàjour en2009.LesrecommandationsplusrécentesduBritishCommit- teeforStandardsinHaematology(BCSH)(2012)etduClinicaland LaboratoryStandardsInstitute(CLSI)(2014)nechangentpasles grandsprincipesdediagnosticmaismodulentuncertainnombre depoints^[37,38].LarecherchedeLAcomporteclassiquementtrois étapes:dedépistage,demiseenévidenced’uneffetinhibiteuret deconfirmationducaractèrePLdépendantdel’inhibiteur.

Lorsquela recherchedeLAsefaitdanslecontexted’unTCA allongé,unequatrièmeétapeavecdosagedesfacteursVIII,IXetXI (surplusieursdilutions)estnécessairepourélimineruninhibiteur spécifiqued’unfacteur(parexemple,anti-FVIII).

Étape 1(dépistage). Letest dedépistage consiste à mettre enévidence un allongementde TC dépendantdes PL. Aucun testn’est en mesure de détecter la totalité des LA.Il est donc indispensablederéaliserenparallèleplusieurstestssensibleset explorantdesniveauxdifférentsdelacascadedelacoagulation.

L’ISTHaproposéen2009deréaliserdeuxtests,letestauVVRdilué (dRVVT)etuntempsdecéphalineavecactivateur(TCA)réaliséà l’aided’unréactifsensibleauxLA,ledépistageétantpositifsiau moinsundesdeuxtestsestanormal.

LeVVRactivelacoagulationauniveaudufacteurX,enprésence dePL.LedRVVTestdoncinsensibleauxanomaliesdesfacteurs VIII,IX,XIetXII.LasensibilitéduTCAvarieconsidérablementen fonctiondesréactifs,deleurteneurenPLetdutyped’activateur (silice,acideellagique,kaolin,etc.).LesréactifsdeTCAlesplus sensiblesontunefaibleconcentrationenPLetutilisentlasilice commeactivateur.Letempsdecéphalinekaolinestàproscrire.

Lesrecommandationsdu CLSI2014proposentdenepaséli- miner systématiquement l’emploi de tests supplémentaires de principedifférent(parexemple,tempsdethromboplastinediluée) comptetenudel’hétérogénéitédesAC.

Étape 2 (mise en évidence d’une activité inhibitrice). Il s’agitdedémontrerlapersistanced’unrésultatanormallorsdela répétitiondutestdedépistagesurunmélangeàpartieségalesde plasmadupatient(PP)etdeplasmanormal(PN);lePNpeutêtre unpoolpréparélocalementouunPNcommercialcertifiépour larecherchedeLA.Cesplasmasdoiventavoirétépréparésdans des conditions qui assurent l’absencede plaquettes résiduelles (<10G/l)(dontlaprésenceréduitlasensibilitédestests).Unrésul- tatanormalneprésumepasdelanaturedel’inhibiteur(LAouAC spécifique).

Étape 3, confirmation (démonstration du caractère phos- pholipidedépendantdel’inhibiteur). LecaractèrePLdépen- dantestdémontréparlacorrectiondel’allongementdutestde dépistageenprésenced’unexcèsdePLsaturantl’aPLprésent.Les PLapportésdoiventêtreenbicouchesouenphasehexagonale,

etl’utilisationd’extraitsplaquettairesestàproscrirecarnonstan- dardisable.Descoffretscommerciauxpermettentlaréalisationdes testsdedépistageetdeconfirmationavecunmêmeréactifàdeux concentrationsdePL.Leurréalisationsimultanéepeutpermettre ladétectiondeLAfaiblesquipassentinaperc¸usdanslastratégie habituelle.

Discussionconcernantlaplacedestestsdemélange. Laréa- lisationd’untestsurmélangeréduitlasensibilitévis-à-visdesLA faiblespareffetdedilution.LeCLSI2014adèslorsproposédene pasleréaliserlorsquelerésultatdutestdeconfirmationestdans leslimitesdesvaleursderéférence.

Expressiondesrésultats. Pourlestestsdedépistage,lesrésul- tatssontexprimésenratiodesTCobtenuspourPPetPN.

Pourlestestssurmélange,unmoded’expressionfréquemment utilisé pour le TCAest l’indiced’anticoagulant circulant (IAC, anciennementappeléindexdeRosner)calculéselonlaformule suivante:100×[TCAmélange–TCAPN]/TCAPP.

Pour les tests de confirmation, le résultat peut être exprimé en pourcentage de correction : [(dépistage – confirmation)/

dépistage]×100ou,plussimplement,enratio(dépistage/confir- mation).

Deplus,l’ISTHetleBCSHrecommandentd’exprimerlesrésul- tatsdestestsdedépistageetdeconfirmationenratiosnormalisés parrapportauxrésultatsobtenuspourlePNétudiédanslamême sériede mesure.Le CLSI 2014 discutel’intérêtpotentiel d’une normalisationparrapportautempsnormalmoyenduPN.

Seuils de positivité. Selon les recommandations 2009 de l’ISTH,ilconvientd’utilisercommeseuildepositivitéle99^eper- centile(moyenne+2,3DS devaleursdistribuéesnormalement), seuilétablilocalementpourchaqueréactifàpartirdeplasmasd’au moins40sujetssainsadultes.LeCLSI2014proposeunelimiteau 97,5^epercentile(moyenne+2DS).

Pour le TCA, un IACsupérieur ou égalà 15signe de fac¸on certainelaprésenced’unanticoagulantcirculant.

Recherchesousanticoagulant. Larecherchesousanticoagu- lantestdéconseilléedanstouteslesrecommandations,maiselles apportenttoutdemêmedesindications.

AntivitaminesK. Selonl’ISTH,sil’internationalnormalizedratio (INR)estinférieurà1,5,larecherchedeLApeutêtreeffectuéesur PPpur.Sil’INRsesitueentre1,50et3,lestestsdoiventêtreréalisés surmélangePP+PN(avecunesensibilitéréduite),etaucuntest nedoitêtreeffectuésil’INRestsupérieurà3.PourleBCSHetle CLSI,lestestspeuventêtreeffectuésmêmesil’INRestsupérieur à3.

Héparines.L’ISTH et le CLSI alertent sur les difficultés d’interprétation sous HNF alors que le BCSH indique que la recherchedeLAnedoitpasêtreeffectuéechezlespatientsrece- vantdesdosesthérapeutiques.Enpratique,lesTCAnedoivent pasêtreréalisés.PourledRVVT,laplupartdesréactifscommer- ciauxcontiennentunneutralisateurd’héparine efficacejusqu’à 0,8-1UI/mld’HNF.PourlesHBPM,sileseuild’interférencen’est pasindiquéparlefabricant,ilconvientdel’évalueraulaboratoire.

Deplus,ilfautpréleverleplusàdistancepossibledel’injection.

Anticoagulantsorauxdirects. LarecherchedeLAaveclestests habituelsn’estpasréalisablesousAODenraisondurisquedefaux positifs.

Recherched’ACLetAB2GPI

Lescritères biologiquesdudiagnosticdeSAPLcomportentla recherchedesIgG etdesIgM.LaplacedelarecherchedesIgM est débattue : la recherche d’IgG pourrait être suffisante pour l’estimationdurisquedethrombose;desformespurementobsté- tricalesdeSAPLpourraientêtreenrelationaveclaprésenced’IgM isolée.

Ilexisteunegrandevariétédetechniques(Elisa,etplusrécem- mentessaisenphasesolide)derecherchedesACLetAB2GPIdont les principeset/oules performancesnesontpastoutessatisfai- santes.Lesrecommandationsrécentesdel’ISTHdevraientaiderà améliorerlaqualitédestests^[39].

Encequiconcernelechoixdesméthodes:pourlesACL,ilest impératifdechoisiruntestquidépistelesACB2GPIdépendants etpourlesAB2GPIuntestdont lacibleestlaB2GPIhumaine, ainsiquedesméthodesdontlesperformancescliniquesontété établies.

Lesperformancesanalytiquesdesméthodesemployéesdoivent être bien entendu connues du laboratoire (limite de linéarité, fidélité intermédiaire, etc.) ; des contrôles internes de qualité (négatif,positifetàla limitedepositivitédelaméthode,indé- pendantsdescoffrets)doiventêtreprisencomptedanschaque série de tests, et la participation à une évaluation externe de la qualité est nécessaire. Les laboratoires doivent utiliser des méthodesdont lescoefficientsdevariation defidélitéintermé- diairesontinférieursà20%pourlesElisamanuelsetinférieursà 10%pourlestechniquesautomatisées.Leséchantillonsdoivent êtretestés endoubleentechniquemanuelle.L’imprécisiondes techniques doit être prise encompte pourl’interprétation des résultatsautour duseuil depositivité.Lescauses d’interférence (facteur rhumatoïde, hypergammaglobulinémie, hémoglobine, bilirubine,triglycérides)doiventêtreconnuesetconsidérées.

Lesrésultatsdesrecherchesd’ACL,calibréescontrelesstandards de Harris,sontrendus enunités GPL(IgG) ou MPL(IgM). Les résultatsdesrecherchesd’A2BGPIsontrendusenunitésarbitraires diverses.Ledéveloppementdecalibrantsinternationauxapparaît absolumentnécessaire.

Les ACde titremodéré etfortsontseuls inclus danslescri- tèresdiagnostiques,cequicorrespondàunseuildepositivitéde 40UGPL/mlouau99^epercentiled’unepopulationdevolontaires sainspourACLetau99^e percentilepourAB2GPI.Cesseuilsau 99^e percentile sont trèsdifficiles à évaluerpour un laboratoire etlesdernièresrecommandationsrendentpossiblel’emploides seuilsdepositivitéindiquésparlesfabricants,maisaprèsvérifi- cationdeleurvaliditéd’aprèsdesrésultatsdemesuresréalisées localementsuraumoins20sujetssains.

Contrairement àla recherche deLA,lesrecherchesd’AC par techniqueimmunologiquepeuventêtreréaliséessousanticoagu- lant.LetitredesACdiminuechezlafemmeenceinteaudernier trimestreetilnefautpasrechercherlesACLjusteaprèslasurve- nued’unecomplicationobstétricalequipeutinduireuneprésence transitoireconséquenceetnoncausedelacomplication.

Interprétationdesrésultats

Lesrésultatsdoiventêtreaccompagnésd’uneconclusionindi- quantencasdepremierrésultatpositifdel’unoul’autretestla nécessitédevérifierlapersistancedel’anomalieaprès12semaines avantd’envisagerunéventuelcaractèrepathogène.

Syndromes myéloprolifératifs et mutation V617F de JAK2

LestroisSMPclassiquessanschromosomePhiladelphie(TE,PV, myélofibroseprimitive)sontassociésàdesthromboses.CesSMP sontlescauseslesplusfréquentesdeTVsplanchniques.Lapro- téineJAK2estuneprotéinedetypetyrosinekinaseimpliquéedans plusieursvoiesdesignalisationresponsablesdelasurvieetdela proliférationcellulaire,dontcelledescelluleshématopoïétiques.

UnemutationsomatiquedeJAK2(V617F)estprésentedans96% descasdePVetenviron60%descasdeTEetdemyélofibrose primitiveavecunrisquedethrombosequipourraitêtrefonction dupourcentaged’allèlemutant.Sonimplicationestexpliquéepar lacapacitédelaprotéinemutéeàinduireladifférentiationetla proliférationdesprécurseurshématopoïétiquessansintervention defacteursdecroissance.

Lamutation V617FdeJAK2,enl’absencedeSMPpatent,est une causede TVsplanchnique. Larecherche de l’anomalie est doncrecommandéedanscecontextecliniqueparticulier^[40].

Elledoitêtreréaliséeàl’aidedetechniquesspécifiquesetdont lasensibilitépermetladétectiond’unpourcentagefaibled’allèle muté(1-3%)^[41].

Hémoglobinurie paroxystique nocturne

L’HPN est une maladie clonale acquise des cellules souches hématopoïétiquescaractériséeparuneanémiehémolytiquecor- pusculaire,une aplasiemédullaire etparla survenuefréquente dethromboses.Lamaladiepeuttouchertouslesâges,maiselle affecteenparticulierlesjeunesadultes.Desthrombosesdesvais- seauxdemoyenetgroscalibres(veineshépatiques,abdominales,

cérébralesetdermiques)touchent40%despatients.Ellessont parfois la seule manifestation de la pathologie. La maladieest causéepardesmutationssomatiquesdugènePIG-Asituésurle chromosomeX,codantuneprotéinenécessaireàlabiosynthèse duglycosylphosphatidylinositol (GPI).Lamutation a lieudans uneouplusieurscellules hématopoïétiquesetentraîneundéfi- cit(totaloupartiel)detouteslesprotéines(enparticulierCD55 etCD59)qui s’attachentnormalementàla surfacedela mem- branecellulairegrâceàlamolécule«ancre»GPI.Lediagnostic reposesurlamiseenévidence,parcytométrieenflux,d’undéfi- citenprotéinesGPI-dépendantesdanslesglobulesrougesetles granulocytes.

Dans le contexte de thromboses inexpliquées, il est recom- mandéderechercheruneHPNencasdelocalisationinhabituelle (splanchniques,cérébrales,dermiques)^[42].

Facteur VIII et homocystéine

LeFVIII etl’homocystéine sontdes facteursmodulateurs du risquethrombotique,maisleurétudesystématiquen’estpasàce jourrecommandée.

Facteur VIII

LeFVIIIestuneprotéinequicirculedansleplasmamajoritai- rementliéaufacteurWillebrand(FW).LeFVIIIactivé(FVIIIa), dissociéduFW,estlecofacteurducomplexetenasedelacascade delacoagulation.LaconcentrationplasmatiquedeFVIIIdépend decelleduFW,del’originegéographique,dugroupesanguin(taux plusélevédeFWetFVIIIchezlessujetsdegroupesanguinnonO) etd’autresfacteursgénétiquesnonencoreidentifiés.Lesvaleurs deréférencesontchezl’adultecomprisesentre70et150%pour lessujets nonO, etentre50et150%pourles O.Lesfluctua- tionsdutauxdeFVIIIsontextrêmementfréquentes;parmiles causesd’augmentation,onpeut citerl’âge,la grossesse,le syn- dromeinflammatoire,lesyndromed’insulinorésistance.Lessujets degroupenonOontunrisquedeTVplusélevéquelesO(risque relatif:2–3).Deplus,ilexisteuneassociationsignificative,indé- pendanteduFW,entretauxdeFVIIIélevéàdistancedesépisodes aigusinflammatoireset TV(premiersévènementset récidives), probablementenrelationavecuneaugmentationdelacapacité àgénérerduFIIa.L’activitéduFVIIIestmesuréeleplussouvent pardestechniqueschronométriquesquiévaluentledegrédecor- rectionduTCAd’unplasmacommercialdépourvudeFVIIIparle plasmadupatient.Unecaused’interférenceestlaprésencedeLA; danscecas,unedilutionplusimportanteduplasmapermet,dans lamajoritédescas,d’éliminersoninfluence.Ledosagesystéma- tiquen’estpasrecommandédanslecadredubilandethrombose carleseuilderisquederécidiven’estpasclairementétablietpour desraisonstechniques(caractéristiquesanalytiquesdesméthodes peusatisfaisantesdanslazoned’intérêt)^[43].

Homocystéinémie

L’homocystéine estun métabolitede laméthioninequi pro- vientdesprotéinesdel’alimentationetdesprotéinescorporelles.

Lecycle de la méthioninecontribue à la réparation cellulaire.

Lerecyclagedel’homocystéinedépenddesvitaminesB6,B12,et desfolates,etdubonfonctionnementdelaMTHFR(méthylène tétrahydrofolatereductase).Lecatabolismedel’homocystéineest dépendant de la cystathionine bétasynthase. Les hyperhomo- cystéinémies modérées(25–100 ␮M/l)ou faibles(16–24 ␮M/l), relativementfréquentes,sontsouventd’origineacquise(insuffi- sancerénale,déficitsnutritionnelsenvitaminesB6,B12etfolates, originemédicamenteuse, etc.). Ces formes sont associées à un risque relatif de maladie cardiovasculaire et de TV de l’ordre de 2 à 3. Le retour à la normalité du taux d’homocystéine nes’accompagnepas d’une diminutiondu risque, raison pour laquelleledosaged’homocystéinesystématiquen’estpasrecom- mandédanslecadredubilandethrombose.Lepolymorphisme 677C>T de la MTHFR peut contribuer à expliquer les formes modéréeslorsqu’il est présentà l’étathomozygote(10 %dela

populationgénérale),encasdecarencevitaminique,maisiln’est pasparlui-mêmeFRdethrombosesetnedoitpasêtrerecherché d’emblée.

Leshyperhomocystéinémiessévères(>100␮M/l),rares, sont causées par d’autres mutations ; leur symptomatologie est complexe, avec la plupart du temps bien d’autres manifesta- tions cliniques que des thromboses ^[44]. Cependant, le dosage d’homocystéineasaplacepourlesdépisterencasdesymptoma- tologieatypiquecommedes thrombosesneurologiques.Il peut êtreréaliséà l’aidedetechniqueschromatographiques,électro- phorétiquesouimmunologiques.

Bilan de thrombose en pratique

Indications

Les recommandations des sociétés savantes ont défini des critères de sélection des patients présentant une pathologie thrombemboliqueàexplorerdetellesortequelesseulssujetsétu- diéssoient ceux chezqui le bilan estsusceptibled’orienter les attitudesthérapeutiquedepréventionprimaireetsecondaire^[45]. Les sujets à explorer sont ceux qui ont présenté des TV documentées(Doppler,scintigraphie),ou chezquiexistentdes séquellesobjectivesetquipourunepremière TVprésententau moinsunedescaractéristiquessuivantes:

• desurvenueprécoce:avant60ansdanslesrecommandations franc¸aisespubliéesen2009,avant40à50ansdanslalittérature plusrécente;

• desurvenuespontanéeoumalexpliquéeparlecontexte;

• de siège inhabituel (mésentérique, cérébrale, splanchnique, rénale,membresupérieur,etc.).

Sontdeplusàconsidérer:associationTV–avortementsàrépé- titionoupathologieobstétricalesévèreavecischémieplacentaire, comptetenudescaractéristiquescliniquesduSAPL;thromboses artériellesen l’absence de FRcardiovasculaires car detels évé- nements peuvent (quoique rarement) survenir chez des sujets porteursdedéficitsconstitutionnelseninhibiteursdelacoagu- lation;histoirefamilialedethromboses.

En cas de thromboses récidivantes inexpliquées, un bilan s’impose,surtoutsilasurvenuedupremierépisodeaétéprécoce.

Chez les sujets asymptomatiques d’unefamille thrombophi- lique, c’est-à-dire comportant au moins deux apparentés au premierdegrésymptomatiques(enfants,parents,fratrie),lesatti- tudesproposéessontlessuivantes:

• silessujetssymptomatiquesdela familleontétéexploréset qu’aucuneanomaliegénétiquethrombogènen’apuêtreiden- tifiéechezeux,iln’ya paslieude réaliserdestests.Lorsque l’exploration dessujets symptomatiques n’a pas été réalisée, celledesasymptomatiquesn’estgénéralementpaspréconisée horscontexteparticulier. Danslesdeuxcas, leconseilthéra- peutiquetientcomptedel’existenced’unehistoirefamiliale;

• siuneanomaliegénétiquethrombogèneaétémiseenévidence danslafamille,l’intérêtdelarecherchedecelle-ciestàdiscuter, entenantcomptedudegrédethrombogénicitédel’anomalie, de l’âgedes sujets, et des contextes cliniques thrombogènes auxquelsils risquentou nond’être confrontés(parexemple, grossesse,contraceptionorale).

Bilan de thrombose

Aspectspréanalytiques

Nombre de protéines de la coagulation sont fragiles ; les recherches de LA sont extrêmement influencées par la pré- sencedeplaquettesrésiduellesquiréduitlasensibilitédestests.

Pour les tests plasmatiques, le prélèvement et son traitement doiventdonc être effectués en respectant scrupuleusement les recommandationsétabliesparlessociétéssavantes(GEHT,CLSI) pourl’hémostase concernant la nature du tube, les critères de non-conformité(remplissagedestubes,hémolyse),ledélaidetrai- tement,lesconditionsdedoublecentrifugation,decongélationet dedécongélationéventuelledesplasmasàétudier.L’aspecticté- riqueoulipémiqued’un plasmadoitêtre prisencompte dans l’interprétationdesrésultats.

Lesrecherches d’ACLet d’AB2GPI peuvent être réalisées sur sérumousurplasmacitraté,comptetenudufaiblefacteurdedilu- tioninduitparlaprésenceducitratedansletubedeprélèvement.

Stratégie d’exploration

Lebilandedépistageréaliséchezlesujetsymptomatiquedoit permettred’estimersonPT.Ildoitdonccomporterlesexamens suivants:

• hémogramme(recherchedePV,TE);

• dosagedu fibrinogènepartechniquechronométrique,temps dethrombine(recherchede dysfibrinogénémieetévaluation dudegréd’inflammation);

• mesuredel’activitédesinhibiteursdelacoagulation(AT:acti- vitécofacteurdel’héparine;PC:activitéanticoagulante;PS: activitécofacteurdelaPC);

• rechercheduFVLeidenetdelamutationF220210G>A;

• recherche de LA (deux techniques, parfois plus), d’ACL et d’AB2GPI.

Laplacedeladéterminationdugroupesanguinetdudosage duFVIIIn’estpas,en2016,clairementétablie.

Untauxdeprothrombineestévaluépours’assurerdelaqualité duprélèvementetcommecontrôledelafonctionhépatique.La connaissancedutauxdeFVIIpeutêtreuneaideàl’interprétation d’uneactivitédePCabaissée(duréedeviesimilairedecesdeux protéines).

Lorsquelesrésultatsdubilanci-dessussontnégatifs,dansdes formes cliniquesparticulières (cf.supra),onpeut être amenéà rechercherlamutationJAK2V617F,uneHPN,unehyperhomo- cystéinémiesévère.

Certainestechniquesplasmatiquessontdifficiles àstandardi- ser, le rôle du biologiste dans l’interprétation des résultats est fondamental,etunerelationétroiteentreclinicienetbiologiste estindispensablepourunepriseenchargeoptimaledespatients thrombophiliques.Pourtoutescesraisons,ilestsouhaitablede neréalisercesbilansdethrombosequedansdescentresexperts quimaîtrisenttouslesaspectstechniquesetcliniquesdegestion delathrombophilie.

Aspects temporels

Dans l’idéal, le bilan de dépistage est à réaliser à distance desépisodesthrombotiques,despériodesaiguësd’inflammation et d’infection,destraitementsanticoagulantset desgrossesses, touscescontextesétantsusceptiblesd’induiredesperturbations acquises transitoires.L’évaluation du PT biologiquedu patient peutalorsêtreréaliséeàpartird’uneseuleprisedesang.

Pourdespatientschezqui,pourdesraisonscliniques,ledépis- tagedevraitêtrefaitsousanticoagulants,lesrappelssuivantssont nécessaires:

• lestraitementsn’ontaucuneinfluencesurlestestsdebiologie moléculaireetsurlesrecherchesd’ACpartechniqueimmuno- logique;

• certainstraitementshépariniquesontuneinfluencesignifica- tivesurl’ATetonnepeutpasutiliserleTCApourdétecterles LA;

• sousAVK,lesmesuresd’activitédePCetPSparTCnedoivent pasêtreréalisées(carellessonteffondréesetininterprétables),et lesmesuresd’activitéamidolytiqueetd’antigènedePCetdePS sontd’interprétationdifficile(diminutionsplusmodestes,en relationavecdesmodificationsdumétabolismedesprotéines).

Autotal,onnepeutaffirmerlanormalitédecesprotéinessous AVKetdescontrôlesàdistancedutraitementsontindispen- sables.Aprèsarrêt,laPCaretrouvésonétatbasalenseptjours environetlaPSentroissemaines.Lesconditionstechniques particulières à employerpour réaliser le dRVVT réduisent la sensibilitédutest;

• sousAOD,iln’estpas possibled’étudierPCetPSparTC,de rechercher unLAetpourl’AT ilfautchoisir latechniquede dépistageenfonctiondumédicament(antiIIaouantiXa).

Lorsqu’ilexistesurlepremierbilanuneanomalied’untestplas- matique,enl’absencedecaused’anomalieacquise,uncontrôleà distancedupremierexamendoitêtreréalisé.Pourlesinhibiteurs

delacoagulation,encasdepersistancedel’anomalie,letypage estréaliséàl’aidedestechniquesdécrites(cf.supra).

Pour les APL, un délai de plus de trois mois entreles deux prélèvementsdoitêtrerespecté.

La démonstration du caractère héréditaire d’un déficit en inhibiteur nécessite la réalisation d’une enquête familiale. Les anomalies permanentes sont seules prises en compte dans les décisionsthérapeutiques.

Pour lesmutationsthrombogènesdeFVetFII,deuxdétermi- nationssontsouhaitablestoutaumoinsencasdeprésencedela mutation.

“ ^{Points essentiels}

• Larecherchedethrombophiliebiologiquenedoitêtre effectuéequechezdessujetsprésentantunethrombophi- lieclinique.

• Lebilanbiologiqueréaliséchezunsujetsymptomatique estdestinéàévaluerlePTbiologiqueglobal;ildoitdonc comporterla recherche detousles FR établis(acquiset constitutionnels).

• Ildoitêtreréaliséselonlesrecommandationsdessocié- téssavantes.

Déclarationd’intérêts:M.Alhenc-Gelasdéclarenepasavoirdeliensd’intérêts enrelationaveccetaticle.

L.Darnige:interventionsponctuelles,rédactiondechapitresd’ouvragepour Stago.

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Pour en savoir plus

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www.has-sante.fr/portail/jcms/c474523/en/synthese-recherche-mutations- fv-leiden-et-fii-20210

www.portailvasculaire.fr/espace-sfmv/fichesLMV

www.ecat.nl/wp-content/uploads/2015/01/The-Clotting-Times-Issue-8- 2014.pdf

www.ecat.nl/wp-content/uploads/2013/02/The-Clotting-Times-Issue-6- December-2012.pdf

M.Alhenc-Gelas,Praticienhospitalier(martine.alhenc-gelas@aphp.fr).

L.Darnige,Praticienhospitalier.

Serviced’hématologiebiologique,HôpitaleuropéenGeorges-Pompidou,AP–HP,20-40,rueLeblanc,75908Pariscedex15,France.

Touteréférenceàcetarticledoitporterlamention:Alhenc-GelasM,DarnigeL.Thrombophilie:explorationbiologique.EMC-Biologiemédicale2017;12(1):1- 10[Article90-20-0220-A].

Disponiblessurwww.em-consulte.com

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