I Remerciements
Ce travail a été réalisé avec le soutien du Ministère de l’Agriculture et de la Ruralité de la Région Wallonne dans le cadre d’un projet mené par « Le Centre Européen du Cheval de Mont le Soie ».
J’adresse mes remerciements
au Professeur Serteyn pour m’avoir donné la possibilité de travailler sur ce sujet passionnant,
au Professeur Serteyn et à Madame Deby qui ont bien voulu diriger mon travail, pour leurs conseils et leur confiance,
au Docteur C. Deby pour sa disponibilité lors des études en microscopie de fluorescence et des mesures en chromatographie,
au docteur Y. Henrotin et à son équipe pour m’avoir initiée à la culture des chondrocytes et avoir mis à ma disposition une partie de l’infrastructure nécessaire à la culture sous tension d’oxygène contrôlée, au Docteur A. Mouithys-Mickalad pour sa disponibilité lors des études en oxymétrie et en résonance paramagnétique électronique,
à toute l’équipe du Laboratoire de Biochimie de l’Oxygène du C.O.R.D.
à toute l’équipe du Pôle Équin.
Que tous veuillent bien trouver ici le témoignage de ma reconnaissance et de mes sincères remerciements pour l’accueil bienveillant qu’ils m’ont toujours réservé.
J’adresse mes remerciements tout particulièrement à Josiane Neuray pour son aide dans l’application de méthodologies nouvelles ou habituelles au laboratoire et à Daniel Jeuniaux pour l’initiation aux techniques secrètes de Mac Intosh et d’Adobe Photoshop.
Je remercie tout autant ceux qui ont participé, de près ou de loin, à la réalisation de ce mémoire, pour leur soutien et les discussions fructueuses, mais aussi pour le rire, l’amitié, « les mardis gras » et les dégustations de gâteaux tout simplement pour fêter des succès dans nos recherches au labo ; en bref, tout simplement pour tous les bons moments passés ensemble.
Last but not least, j’adresse un grand merci à mes parents et surtout à mon mari Sascha qui m’ont aidée et soutenue tout au long de ce travail.
II
Remerciements……….………..… I Table des matières……….……….... II Résumé……….………...… VII Summary……….………...… IX
1. Introduction générale………..……….………....… 1
2. Revue de la littérature………..… 2
2.1. La constitution d’une articulation synoviale……….…….…………..… 2
2.1.1. Aspect anatomique……….………...… 2
2.1.2. Aspect histologique et composants……….………..… 3
2.2. L’ostéo-arthropathie dégénérative équine……….……...……… 19
2.2.1. Généralités et évolution……….………...………….… 19
2.2.2. Classement des différents types d’OAD…….………..…… 20
2.2.3. Description des altérations……….………..…. 21
2.2.4. Les médiateurs impliqués dans l’OAD équine……….…..… 26
2.3. Notions sur le métabolisme de l’oxygène……….……….…..… 37
2.3.1. La réactivité de l’oxygène……….……… 37
2.3.2. Le rôle des ROS et les défenses anti-oxydantes……….…..… 38
2.3.3. Principales ROS et RNOS : brève description……….………. 39
2.3.4. Les principales enzymes productrices de ROS.…..……….. 42
2.3.5. Les mécanismes cellulaires de l’anoxie/ré-oxygénation..………….. 46
2.4. Les ROS dans l’articulation……….……… 50
2.4.1. L’anoxie/ré-oxygénation dans l’articulation……...….…………... 50
2.4.2. Nature et effets des ROS impliquées dans les maladies articulaires..……… 51
2.4.3. Le cas particulier du •NO..……….. 53
2.5. La culture des cellules de l’articulation : méthodes usuelles………….…….. 56
III
3. Approche clinique : l’ostéo-arthropathie dégénérative juvénile
chez le cheval ardennais……….…...…... 59
3.1. Résumé des travaux antérieurs ………..…….. 59
3.2. Étude anatomo-pathologique et histo-pathologique……….….….. 61
3.3. Description d’un cas d’OADJ au niveau du grasset……….…..….. 63
3.4. Discussion……….………….……….. 66
4. Objectifs des recherches…………...……….….…….. 67
5. Synthèse des expériences menées sur les chondrocytes articulaires et les synoviocytes équins en culture……….……….. 68
5.1. Matériel et Méthodes……...…………..……….….…….. 68
5.1.1. Les modèles de culture de cellules articulaires………...……….. 68
5.1.1.1. La culture des chondrocytes équins……….………….. 68
5.1.1.2. La culture des synoviocytes……….……….. 75
5.1.1.3. La co-culture des chondrocytes articulaires et des synoviocytes équins………....………….………….. 79
5.1.1.4. Techniques utilisées pour tous les types de culture……….…….. 82
5.1.2. Techniques microscopiques………....…………...…….………….. 83
5.1.2.1. Microscopie optique………....………….……….. 83
5.1.2.2. Microscopie électronique………....………….………….. 86
5.1.3. Techniques d’étude de la respiration cellulaire…....………..….………….. 87
5.1.3.1. Oxymétrie (mesure de la consommation d’oxygène) ….……….. 87
5.1.3.2. Mesure de l’activité de la cytochrome c oxydase…….………….. 89
5.1.4. Techniques d’étude du métabolisme oxydatif…....………….……….. 89
5.1.4.1. Mesure de l’éthylène par chromatographie en phase gazeuse.….. 89
5.1.4.2. Mesure de la production d’espèces radicalaires par la technique de résonance paramagnétique électronique (RPE).…...……….. 90
5.1.4.3. Mesure des nitrites/nitrates (dérivés du •NO).…...…………... 94
IV
5.1.4.4. Mesure de la nitrotyrosine..…...……….. 95
5.1.5. Mesure des marqueurs de l’activité métabolique……….. 95
5.1.6. Analyse statistique.…...……….. 98
5.2. Résultats et discussions...……….. 99
5.2.1. Modèles de culture des chondrocytes articulaires...……….. 99
5.2.1.1. Évolution de la culture en fonction du pourcentage d’O2……….. 99
5.2.1.2. Influence du pourcentage d’O2 et de la concentration en glucose sur l’évolution de la culture des chondrocytes équins……...…….. 113
5.2.1.3. Modèle de culture des chondrocytes équins en suspension.…….. 115
5.2.1.4. Étude morphologique………. 116
5.2.2. Modèle de culture des synoviocytes……….…………. 124
5.2.2.1. Caractérisation immunologique des synoviocytes……..………. 124
5.2.2.2. Évolution de la croissance cellulaire……..……….……. 125
5.2.2.3. Étude morphologique des synoviocytes…….……….……. 126
5.2.2.4. Discussion….………133
5.2.3. Modèle de co-culture chondrocytes/synoviocytes…….……….……. 135
5.2.3.1. Sélection des conditions de co-culture…….……….……. 135
5.2.3.2. Croissance des synoviocytes et des chondrocytes en co-culture.. 138
5.2.3.3. Discussion……….……… 139
5.2.4. Effets de l’anoxie/ré-oxygénation sur les chondrocytes équins …………... 141
5.2.4.1. Respiration cellulaire (fonction mitochondriale) des chondrocytes équins……….………..…………..141
5.2.4.2. Production d’espèces radicalaires……….………. 144
5.2.4.3. Effets métaboliques……….………..……. 145
5.2.4.4. Discussion………..……….………..……. 147
V
5.2.5. Production des RNOS par les synoviocytes.………. 150
5.2.5.1. Respiration cellulaire (fonction mitochondriale lors de l’A/R).…. 150 5.2.5.2. Mise en évidence d’une production d’espèces radicalaires par RPE-spin trapping lors de l’A/R.……….………..…. 152
5.2.5.3. Effet sur la production globale de ROS (mesure de l’éthylène par chromatographie en phase gazeuse).……….. 155
5.2.5.4. Discussion………..……….………..….…. 158
5.2.6. Interactions entre synoviocytes et chondrocytes dans un modèle de co-culture.…..……….……….…. 162
5.2.6.1. Effets de la co-culture sur la production de médiateurs inflammatoires…..………….…….………...………….. 162
5.2.6.2. Discussion………..……….………….…..……. 164
6. Discussion générale et perspectives………...………. 166
7. Bibliographie……….………. 173
8. Publications scientifiques……….………. 197
Revue de la littérature : Le rôle des synoviocytes dans l’articulation diarthrodiale enflammée soumise aux : Annales de Médecine Vétérinaire. Brève communication : Histology of two rice bodies isolated from the stifle of an adult draught horse stallion. publiée par : Journal of Veterinary Science. 2006, 7, 83-85.……….……… 233
Étude I : Viability of equine articular chondrocytes in alginate beads exposed to different oxygen tensions. publiée par : The Veterinary Journal. 2004, 168, 167-173..……….……..……… 237
Étude II : Oxygen consumption of equine articular chondrocytes : influence of applied oxygen tension and glucose concentration during culture. acceptée pour publication par : Cell Biology International, 2007..………….……… 245
Étude III : Influence of oxygen tension and glucose concentration on the light and electron microscopic appearance of equine articular chondrocytes cultured in alginate beads. soumise aux : Archives of Histology and Cytology. .……….……… 264
VI
Étude IV : Characterisation of primary equine synoviocytes and synoviocytes (continuous cell line HIG-82) in culture
soumise aux : Archives of Histology and Cytology....……….………..………… 274
Étude V : Synoviocytes, not chondrocytes release free radicals after cycles of anoxia/re- oxygenation.
publiée par : Biochemical and Biophysical Research Communications.
2005, 334, 669-673...………..………..………… 289
Annexes : ...………..………..…………..……… 295 Abréviations et formules chimiques
Liste des figures Liste des tableaux
VII Résumé
La pathogénie de l’ostéo-arthropathie dégénérative chez le cheval est l’objet de nombreuses recherches, notamment sur le rôle des espèces activées de l’azote et de l’oxygène (RNOS) dont les actions délétères sur l’articulation sont décrites, mais dont l’origine, les raisons et la cinétique de production restent peu connues : on implique souvent les chondrocytes et des phénomènes cycliques d’anoxie-ré-oxygénation (A/R). L’objectif du travail était d’étudier la production des RNOS par les cellules de l’articulation, chondrocytes ou synoviocytes équins, cultivés séparément ou en co-culture pour imiter les interactions existantes dans l’articulation où les chondrocytes matures sont nourris par diffusion à partir du liquide synovial à basse tension en O2, fourni par les synoviocytes. Pour induire leur activité oxydante, nous avions choisi de soumettre les cellules en culture à des cycles successifs d’A/R. Les cellules articulaires équines sont libérées de leur matrice par digestion enzymatique. Les chondrocytes sont mis en culture en billes d’alginate (culture en trois dimensions qui maintient le phénotype cellulaire) et les synoviocytes sont cultivés en monocouche. Les chondrocytes équins sont cultivés en milieu à 4,5 g/l de glucose, sous différentes conditions en O2 : 21 % (condition de culture habituelle), 5 % (condition proche de la situation in vivo) et 1 % (condition d’anoxie).
Le nombre des chondrocytes est resté pratiquement constant partout jusqu’au 10e jour de culture. Mais une identification (par coloration spécifique) montre une augmentation régulière au cours du temps du nombre des cellules apoptotiques à 21% d’O2 et une diminution à partir du 11e jour à 5 % et à 1% d’O2. À 1 % d’O2, il y a une chute du nombre de cellules vivantes jusqu’au 8e jour de culture, chute qui est compensée au 11e jour. 5 % d’O2 sont les conditions de culture les plus favorables au maintien du nombre de cellules et les chondrocytes résistent à l’anoxie pendant plus de dix jours de culture. Pour tester le rôle du glucose dans la résistance à l’anoxie, les chondrocytes sont cultivés avec des concentrations variables en glucose (0, 1 et 4,5 g/l de milieu), combinées aux tensions d’O2 de 1 %, 5 % et 21 %. L’excès de glucose (4,5 g/l) a un effet défavorable après 8 jours de culture. Les chondrocytes équins sont capables de résister plusieurs jours aux conditions les plus drastiques : 1 % d’O2 et absence de glucose. Les études en microscopie (optique et électronique) confirment une souffrance cellulaire à 21 % d’O2, accentuée à 4,5 g/l de glucose: accumulation de gouttelettes à contenu lipidique et mitochondries œdématiées. Elles montrent également la présence de lipides intracellulaires dans les chondrocytes sains, une source d’énergie possible permettant leur survie en anoxie.
VIII
Les synoviocytes équins en culture ont été caractérisés en microscopie (aspect, détection immmunologique de la protéine-produit du gène PGP 9,5) et par leur capacité de phagocytose.
Ils se multiplient de façon exponentielle à 10 % d’O2 (condition proche des conditions physiologiques) et peuvent être maintenus en culture de longue durée. À 21 % d’O2, ils se multiplient plus lentement. L’étude du métabolisme oxydant des chondrocytes et des synoviocytes équins, en conditions de culture normales et après A/R, est effectuée en mesurant leur consommation d’O2 par oxymétrie (réponse mitochondriale), leur production globale de RNOS (estimée par la mesure de l’éthylène, produit par l’attaque d’un substrat par les RNOS) et leur production d’espèces radicalaires [mesurée en résonance paramagnétique électronique (RPE) avec spin trapping]. Les chondrocytes équins consomment peu d’O2 (± 20 picomoles d’O2/min/10 6 cellules) indépendamment des conditions de culture avant oxymétrie et malgré un complexe terminal de la chaîne mitochondriale fonctionnel. Ils sont peu influencés par les cycles d’A/R et ne produisent ni de RNOS ni d’espèces radicalaires.
Les synoviocytes équins consomment plus d’O2 (± 1 nanomole d’O2/min/106 cellules) et trois cycles d’A/R induisent une chute de cette consommation et des signes de souffrance mitochondriale. Les synoviocytes sont capables de produire des RNOS et augmentent cette production sous l’effet d’une stimulation par agent pharmacologique (PMA) ou endogène (TNF-α). Cette production de RNOS est liée à l’activité d’enzymes à flavine comme la NOX.
La RPE montre une production d’espèces radicalaires après A/R, identifiées aux dérivés de l’anion superoxyde et d’une peroxydation lipidique dont l’origine est la mitochondrie, sans pouvoir exclure une participation des enzymes oxydantes cytosoliques (NOX ou xanthine oxydase). Les synoviocytes peuvent donc répondre par une activité oxydante à l’A/R.
Pour la co-culture, les meilleures conditions sont un rapport synoviocytes/chondrocytes 1/3, un milieu de culture mixte, 10 % d’O2, la condition d’adhérence pour les synoviocytes et la culture en billes d’alginate (placées en « inserts ») pour les chondrocytes. Après 48 h de co- culture dans ces conditions, 80 % des synoviocytes et 60 % des chondrocytes survivent. Les interactions entre les deux types cellulaires se traduisent par des variations importantes dans la production de certains médiateurs inflammatoires comme la PGE2.
Il ressort de ce travail que les synoviocytes répondent à l’A/R par une production de RNOS et en libérant des médiateurs inflammatoires et qu’ils pourraient jouer un rôle majeur dans l’OAD. Des études complémentaires sont nécessaires, surtout avec le modèle de co-culture.
IX Summary
The pathogenesis of degenerative osteoarthritis in the horse is an important matter of research, and becomes more focused on the role of the reactive oxygen and nitrogen species (RNOS).
Their deleterious actions on the joint are already described, but their origin, the reasons for their creation and their kinetics of production remain unclear: chondrocytes and cyclic phenomena of anoxia/re-oxygenation (A/R) are often considered to be involved in RNOS production. The objective of this work was to study the production of RNOS by the joint cells, equine chondrocytes or synoviocytes, which are cultured separately or in co-culture to mimic the interactions in the joint: in vivo mature chondrocytes are fed at low O2 tension by diffusion from the synovial fluid, which is furnished by the synoviocytes. To induce their oxidant activity, the cultured cells are submitted to successive cycles of A/R. The articular equine cells are isolated from their matrix by enzymatic digestion. The chondrocytes are cultured in alginate beads (three dimensions culture, which conserves the cell phenotype), and synoviocytes are cultured in monolayer. At a first time, chondrocytes are cultured with culture medium containing 4.5 g/l glucose and under different oxygen tensions: 21 % (usual condition), 5 % (in vivo condition) and 1 % (anoxia condition). The cell number remains quite unchanged in all conditions until 10 days of culture. But a more specific analysis (by cell staining) shows a regular increase of the apoptotic cell number at 21 % O2 and a decrease from day 11 at 5 % and 1 % O2. At 1 % O2, there is a decrease in the number of living cells observable until day 8 of culture, but this decrease is partially compensated on day 11. 5 % O2
are the culture conditions permitting to obtain stable cell numbers, and astonishingly, chondrocytes support anoxia conditions for more than 10 days. To assess the role of glucose in the chondrocytes resistance to anoxia, the equine articular chondrocytes are cultured with variable glucose conditions (0, 1 and 4.5 g/l of culture medium), in combination with variable the O2 tensions of 1 %, 5 % and 21 %. The high glucose concentration (4.5 g/l) is reducing the viability of chondrocytes after 8 days of culture. The equine chondrocytes are able to live during several days of culture in the most severe conditions: 1 % O2 and in absence of glucose.
Microscopic (light and electron) studies confirm a cell suffering at 21 % O2, which is more pronounced at 4.5 g/l glucose: The most important findings were an excessive storage of lipid droplets and mitochondrial œdema. We also observe the presence of lipid droplets in normal chondrocytes (freshly isolated), which are a possible source of energetic substrate allowing
X
survival in anoxia. Equine synoviocytes are characterized by microscopy (morphology, immunological detection of the protein product of gene 9.5) and by their phagocytosis capacity. Synoviocytes grow in an exponential manner at 10 % O2 (near in vivo conditions) and can be cultured for long periods. At 21 % O2, the cell division is slower compared to 10 % O2. The oxidant metabolism of the equine chondrocytes and synoviocytes in normal culture conditions and after A/R is investigated by measuring their O2 consumption (mitochondrial function) by oxymetry, their global RNOS production by gas chromatography quantification of ethylene (the product of the oxidation of a substrate by RNOS), and their free radical production by electron spin resonance by means of spin trapping (ESR). The equine chondrocytes show a very low O2 consumption (± 20 picomoles d’O2/min/10 6 cells), independently from the culture conditions applied prior to oxymetry and despite a functional terminal complex of the mitochondrial respiration chain. Their O2 consumption is even not altered by three cycles of A/R. Chondrocytes do neither produce RNOS nor free radicals even after repetitive cycles of A/R. The equine synoviocytes consume a higher amount of O2 (± 1 nanomole dO2/min/106 cells), and three cycles of A/R induce a reduced consumption with signs of mitochondrial suffering. The synoviocytes are able to produce RNOS and increase their production after stimulation with a pharmacological agent (PMA) or endogenous agents as, for example, TNF-α. This RNOS production is linked to the activity of flavinic enzymes like NOX. The ESR study shows a production of free radicals after A/R, which are identified as derived from superoxide anion and lipid peroxidation, they originate from mitochondria, but we cannot exclude a role of cytosolic oxidant enzymes (NOX or xanthine oxidase). The synoviocytes thus do respond to A/R by an oxidant activity. For the co-culture, the best conditions are a synoviocytes/chondrocytes ratio of 1/3, and a mixed culture medium, 10 % O2, monolayer culture for synoviocytes and alginate bead culture for chondrocytes (put into « inserts »). After 48 h of co-culture in these conditions, 80 % of synoviocytes et 60 % of chondrocytes survive. The interactions between the two cell types lead to important variations in the production of some inflammatory mediators, such as PGE2.
From this work, it appears that the synoviocytes are stimulated by A/R to produce RNOS and to release inflammatory mediators, and that they can therefore play a major role in OAD.
Complementary studies especially with the co-culture model, are required to further assess the observed phenomena.
