méthode enzymatique de Sanger

(1)

S

Séquençage de l’ADN selon la équençage de l’ADN selon la méthode enzymatique de

méthode enzymatique de Sanger

Sanger

(2)

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

• Extraction.

• Clonage dans un vecteur.

• Multiplication.

Préparation de l’ADN à séquencer:

• Multiplication.

• Purification.

(cf, Cours de biologie moléculaire

)

(3)

1- Séparation des deux brins par thermodénaturation:

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

ADN double brin

+

Chauffage jusqu’ à la Tm, abaissement rapide de la température

ADN mono brin

(4)

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

Domaine déjà connu

Séquence d’ADN à déterminer:

Domaine à séquencer

(5)

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

2- Hybridation avec une amorce marquées (radioactive, fluorescente):

Amorce radioactive marquée au ³²P

(6)

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

3- Néosynthèse du brin complémentaire au brin à séquencer:

Par le jeu de la complémentarité stérique et chimique, le brin à séquencer sera complété par un brin néosynthétisé grâce à l’action de l’ADN polymérase.

Amorce radioactive marquée au ³²P

(7)

L’enzyme (l’ADN polymérase ADN dépendante) polymérise le brin complémentaire à partir du brin à

séquencer.

Pour se faire, elle utilise comme substrats les quatre nucléotides triphosphates :

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

Substrats nécessaires:

nucléotides triphosphates :

(8)

Conditions opératoires supplémentaires:

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

On ajoute un pseudo-substrat qui bloquera l’élongation de cette polymérisation.

Il s’agit de didésoxyribonucléotides qui sont des

nucléotides qui ne possèdent pas de groupement OH

en 3’ ce qui les empêche d’établir une liaison

nucléotidique.

(9)

Les didésoxyribonucléotides s’insèrent à la place de leurs homologues naturels ce qui bloque la synthèse du brin néoformé.

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

synthèse du brin néoformé.

(10)

ADN + Amorce radioactive + ADN polymérase + dATP , dCTP + dGTP + dTTP

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

Tube 2

Tube 1 Tube 3 Tube 4

+ ddATP + ddGTP + ddCTP + ddTTP

(11)

Important!

Le pseudo-substrat est ajouté en très faible quantité pour inhiber la synthèse d’une façon

aléatoire.

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

aléatoire.

Ainsi, statistiquement, on obtiendra toutes les

combinaisons de formation possibles pour les

fragments de brins complémentaires.

(12)

Exemple du tube 1 (sans l’intervention de l’inhibiteur) P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaineconnu- 3’OH

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce marquée-5’

³²

P

Fragment synthétisé

(13)

Exemple pour le tube 1 (ddATP) avec inhibition:

L’enzyme utilise de façon aléatoire le dATP ou le ddATP.

Ainsi la synthèse peut être bloquée:

P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

On obtient:

H3’-ddA-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddA-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddA-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

ici ici ici

(14)

Exemple pour le tube 1 (ddATP) Bilan des synthèses possibles:

32

P5’-G-T-C-ddA-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G- ddA-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G- ddA-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH(synthèse

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH(synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur le gel.

Ainsi on identifiera :

(15)

Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

Méthode enzymatique de Sanger

(16)

Exemple pour le tube 2 (ddGTP)

L’enzyme utilise de façon aléatoire le dGTP ou le ddGTP Ainsi la synthèse peut être bloquée:

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

H3’-ddG-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddG-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddG-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddG-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

H3’-ddG-amorce radioactive-5’³²P

ici ici ici ici ici

(17)

Exemple pour le tube 2 (ddGTP) Bilan des synthèses possibles:

32

P5’-ddG-3’H

32

P5’-G-T-C-A-ddG-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-ddG-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-ddG-3’H

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

P5’-G-T-C-A-G-G-T-ddG-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-ddG-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur le gel.

Ainsi on identifiera :

(18)

Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

Méthode enzymatique de Sanger

(19)

Bilan des deux tubes 1 (ddATP) et 2 (ddGTP)

Les deux électrophorèses sont faites en parallèle:

Méthode enzymatique de Sanger

(20)

Exemple pour le tube 3 (ddCTP)

L’enzyme utilise de façon aléatoire le dCTP ou le ddCTP.

Ainsi la synthèse peut être bloquée:

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

H3’-ddC-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddC-T-G-amorce radioactive-5’³²P

ici ici

(21)

Exemple pour le tube 3 (ddCTP) Bilan des synthèses possibles:

32

P5’-G-T-ddC-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-ddC-3’H

32

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur le gel.

Ainsi on identifiera :

(22)

Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers l’anode (+),

Méthode enzymatique de Sanger

(23)

Bilan des trois migrations : tubes 1 (ddATP), 2 (ddGTP) et 3 (ddCTP)

Les trois électrophorèses sont faites en parallèle:

Méthode enzymatique de Sanger

(24)

Exemple pour le tube 4 (ddTTP) L’enzyme utilise de façon aléatoire le dTTP ou le ddTTP.

Ainsi la synthèse peut être bloquée:

P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH

HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

H3’-ddT-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddT-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P

H3’-ddT-G-G-A-C-T-G-amorce radioactive-5’³²P H3’-ddT-G-amorce radioactive-5’³²P

ici ici ici ici

(25)

Exemple pour le tube 3 (ddTTP):

bilan des synthèses possibles

32P5’-G-ddT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-ddT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-ddT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-ddT-3’H

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-ddT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale) On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur le gel.

Ainsi on identifiera :

(26)

Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers l’anode (+)

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

Ce nucléotide n’est pas déterminable

(27)

Autoradiographie des quatre pistes de la PAGE

Méthode enzymatique de Sanger

(28)

Lecture de la PAGE

Méthode enzymatique de Sanger Méthode enzymatique de Sanger

La séquence du brin néoformé d’ADN se lie horizontalement de l’anode (correspondant au côté 5’P) vers la cathode

(correspondant au côté 3’OH):

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-X-3’OH 32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-X-3’OH Le brin à séquencer est donc:

P5’-X-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH