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Étude des fonctions cellulaires de SAMHD1, facteur de
restriction du VIH-1
Tania Louis
To cite this version:
Délivré par L’Université de Montpellier
Préparée au sein de l’école doctorale Sciences Chimiques
et Biologiques pour la Santé
Et de l’unité de recherche Institut de Génétique Humaine
Spécialité : Biologie
Présentée par Tania LOUIS
Soutenue le 8 juillet 2015 devant le jury composé de :
M. Monsef BENKIRANE, DR, CNRS Directeur de thèse
M. Uriel HAZAN, PU, CNRS/ENS Cachan Rapporteur
M. Olivier SCHWARTZ, DR, Institut Pasteur Rapporteur Mme Clarisse BERLIOZ-TORRENT, DR, INSERM Examinatrice
Mme Nathalie CHAZAL, MCU, CNRS/UM Examinatrice
Remerciements
Jen’aijamaisététrèsdouéepourlesremerciements,etaumomentd’écrireceuxͲcijepense surtout à toutes les personnes qui ont été là pour moi pendant ma thèse et que je vais malencontreusementoublier.D’avance,jem’enexcuse.
Jetienstoutd’abordàremercierMonsefBenkiranedem’avoiraccueilliedanssonéquipe,pour monstagedemaster2puispourmathèse.
Je remercie également les autres membres de mon jury, Clarisse BerliozͲTorrent, Nathalie Chazal,UrielHazanetOlivierSchwartz,quiontacceptéd’évaluermontravaildedoctorat. J’aibiensûrunepenséepourtouslesmembresactuelsetpassésdel’équipeBenkirane,avec quij’aiparfoispartagéplusqu’unbureauouunepaillasse.Parmitous,j’adresseunremerciement particulieràSabine,EstelleetChristelle.Vousavezétéàlafoisdesboufféesd’oxygèneetdessoutiens solidesquandj’enaieubesoin,j’espèreavoirpuvousrendrelapareille.Jecomptesurvouspourqu’on gardecontact! Jesouhaiteremercierl’ensembledespersonnelsdel’ancienneUniversitéMontpellier2qui ontcontribuéàfairedemonexpérienced’enseignementcequ’elleaété:ladécouverted’unepassion. Etjeremercieégalementmesétudiants,notammentceuxdugroupeAdelasérieA(deuxièmeannée de licence de biologie, année 2014Ͳ2015). Vous ne lirez probablement jamais ce message, mais l’ambiancedetravailavecvousétaitvraimentextraͲordinaire.
RÉSUMÉS
Résumés
Résumés
delathèse
Résuméfrançais:
L’étudedesinteractionsentreunpathogèneetsonhôte,bienqu’ayantgénéralementpour objectif de contrôler l’infection par le pathogène, permet parfois de découvrir des éléments fondamentaux sur le fonctionnement de l’hôte. J’ai choisi d’étudier les fonctions cellulaires d’une protéineinitialementidentifiéecommeunfacteurderestrictionduVIHͲ1.
SAMHD1(SAMdomainandHDdomainͲcontainingprotein1)estuneprotéineexpriméedans laplupartdestissushumains.Elleestcapabled’hydrolyserlesdéoxyribonucléotidestriphosphates (dNTP)cellulairesetpossèdeuneactiviténucléaseciblantdifférentsacidesnucléiquesdontlesARN simplebrininvitro.
Des mutations dans le gène SAMHD1 entraînent le développement d’une maladie autoͲimmune pouvant conduire à la mort précoce des nourrissons, ce qui suggère un rôle de la protéinecorrespondantedanslarégulationdelaréponseimmunitaire.IlaétémontréqueSAMHD1 estunfacteurderestrictioncapabled’empêcherl’infectiondecellulesnesedivisantpasparleVIHͲ1. LaprotéineviraleVpx,expriméeparleVIHͲ2,estcapabled’induireladégradationdeSAMHD1parle protéasomeetpermetderendrepermissiveslescellulesinitialementrésistantesàl’infectionparle VIH. SAMHD1estenréalitécapablederestreindrel’infectionpardesvirusaussidifférentsqueles rétrovirus et le virus de l’herpès simplex 1. Néanmoins, le mécanisme permettant à SAMHD1 de contrecarrer différents virus reste aujourd’hui sujet à controverse. Initialement considéré comme agissantendégradantlesdNTPcellulaires,SAMHD1sembleégalementcapablededégraderl’ARN génomiqueduVIHͲ1.
Si de nombreux travaux portent sur l’activité antivirale de SAMHD1, peu de données sont disponiblesconcernantlafonctioncellulairedecetteprotéine.OrSAMHD1estcapablederégulerla quantité de dNTP cellulaires et d’interagir avec certains acides nucléiques. Ces données font de SAMHD1unacteurpotentieldedifférentsprocessuscellulairesfondamentauxsensiblesàlaquantité intracellulairededNTP,notammentlaréplicationdugénomeoularéparationdesdommagesàl’ADN. J’aimontréaucoursdemondoctoratqueSAMHD1modulelecyclecellulaireetnotamment quelasurexpressiondecetteprotéineralentitlaproliférationcellulaire.J’aiégalementobservéquela surexpression de SAMHD1 augmente la sensibilité des cellules aux agents induisant des ruptures doublebrindel’ADN.Deplus,j’aidécouvertqu’encasderupturesdoublebrindel’ADNcellulaire, SAMHD1estrégulédefaçonspécifiqueparphosphorylationsursathréonine592etestrecrutéaux sitesdecassures. D’autrestravauxontconfirmél’importancedelarégulationdeSAMHD1aucoursducycle cellulaire,sasurexpressionetsaréductioninduisanttoutesdeuxunralentissementdelaprolifération cellulaire.Encomplémentdemesrésultats,quelquesétudessuggèrentqueSAMHD1joueunrôledans lemaintiendel’intégritédugénome,quipourraitêtredûàsoneffetsurlaréponseauxdommagesà l’ADN.Dansl’ensemble,cesrésultatsfontdeSAMHD1ungarantdel’homéostasiecellulaire. J’aideplusmontréquel’expressiondeSAMHD1estréduitechezenviron80%despatients souffrantdeleucémielymphoïdechronique.Lapertedecetteprotéineestdonccorréléeàl’apparition d’une maladie découlant de la perturbation du fonctionnement cellulaire. L’étude d’échantillons d’autrestypesdetumeursmontreque,dansdemoindresproportions,l’altérationdel’expressionde SAMHD1estunecaractéristiquegénéraledescancers.
MestravauxdedoctoratsoulignentainsilerôlefondamentaldeSAMHD1danslemaintiende l’intégritécellulaire.
EnglishAbstract: Understandinghostpathogeninteractionsrevealsnotonlyimportantinformationregarding thereplicationcycleofthepathogenbutitoftenleadstothediscoveryandbetterunderstandingof keybiologicalprocessesofthehost.TheaimofmyPhDwastodecipherthecellularfunctionsofthe HIVͲ1restrictionfactorSAMHD1.
SAMHD1 (SAM domain and HD domainͲcontaining protein 1) is expressed in most human tissues. This protein is able to hydrolyze cellular deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) and possessesanucleaseactivityprimarilyagainstsinglestrandedRNA. MutationsinSAMHD1havebeendescribedinpatientssufferingfromanautoͲimmunedisease causingprematuredeathofnewborns.ThisphenotypesuggestsaroleofSAMHD1inthecontrolof immuneresponse.Moreover,SAMHD1restrictsHIVͲ1innonͲcyclingcells.TheHIVͲ2accessoryprotein VpxinducesSAMHD1degradationbytheproteasome,conferringcellpermissivenesstoHIV. Infact,theantiviralactivityofSAMHD1hasbeenextendedtoothervirusesincludingHerpes SimplexVirus1andHepatitisBvirus.Nevertheless,themechanismbywhichSAMHD1restrictHIV replicationisdebated.ItwasinitiallythoughttoactbydepletingthedNTPpoolbutrecentstudies highlightedapotentialroleofSAMHD1nucleasefunctionindegradingHIVͲ1genomicRNA. ManystudiesaimingatunderstandingtheantiviralactivityofSAMHD1arebeingpursued, whereaslittleisknownaboutthecellularfunctionofthisprotein.ThefactthatSAMHD1isableto regulatethecellulardNTPpoolandtointeractwithnucleicacidssuggestsakeyroleofthisproteinin cellularprocesses,suchasDNAreplicationandrepair. DuringmyPhD,IshowedthatSAMHD1modulatesthecellcycle,astheoverexpressionofthis proteinslowsdowncellproliferation.IalsoobservedthatSAMHD1overexpressionincreasescellular sensitivitytodoublestrandDNAbreaksͲinducingagents.MoreoverIdiscoveredthat,afterdouble strandbreaksinduction,SAMHD1isspecificallyregulatedbyphosphorylationonitsthreonine592and recruitedatthedamagedsites.
Résumésdethèsevulgarisés
Résuméfrançais:
Préambule
Achaquerègleénoncéeenbiologiecorrespondaumoinsunviruscapabledelacontredire. Cetteobservationvadesrèglesgénéralestellesque«l’acidedésoxyribonucléique(ADN)estlesupport de l’information génétique (Alberts et al., 2008) » aux règles plus spécifiques, y compris celles concernantlesviruseuxͲmêmesetnotammentleurtaillemaximalequinecessed’êtreaugmentéepar ladécouvertedevirusdeplusenplusvolumineux(Ettenetal.,2010).Lesvirussontdetelsbriseursde dogmesbiologiquesqu’ilssuscitentdenombreusesdiscussionssurladéfinitionmêmedu«vivant» (Forterre,2012).
d’unethéoriederéférenceenbiologiemoléculaire.Cettedécouvertefondamentalead’ailleursvalu lePrixNobeldemédecineàsesauteursDavidBaltimoreetHowardMartinTeminen1975,prixpartagé avecRenatoDulbecco. 2/ImportancebiologiquedesrétroͲéléments Assezrapidementaprèsladécouvertedestranscriptasesinversesvirales,destracesd’activités comparablesontétédétectéesdanslesgénomesdeMammifèressouslaformederétrotransposons (Hollisetal.,1982;Nishiokaetal.,1980;Sharp,1983)etderétrovirusendogènes(LuedersandKuff, 1977).LesrétroͲélémentssontdéfiniscommedesélémentsmobilesdugénomedontladuplication nécessiteun intermédiairesousforme d’ARNservantdesupportàune transcriptaseinversepour permettrelasynthèsed’unecopieADNquiseraintégréedansunnouveaulocus(Figure2,partiede gauche).
ParmiceuxͲcisetrouventlesrétrovirusendogènes.Cesélémentsontunestructureidentique àcelledugénomedesrétrovirusmaisontgénéralementaccumulédesmutationsinactivantcertains deleursgènescequilesempêchedesemultipliercommelesrétrovirusdanslecadred’uneinfection. Certains rétrovirus endogènes, comme l’élément HERVͲK (Human Endogenous RetroVirus–K) chez l’Homme,sontnéanmoinscapablesdeconduireàlaproductiondeparticulesviralesmaiscesdernières nesontpasinfectieuses(Biedaetal.,2001).
Le second type de rétroͲéléments, les rétrotransposons, est subdivisé en deux grandes familles.LesrétrotransposonsàLTR(LongTerminalRepeats)ontunestructureprochedecelledu génomedesrétrovirusmaisnepossèdentpasdegèneEnvetnesontdoncpascapablesdepermettre la production de particules virales. Les rétrotransposons sans LTR ont une structure plus simple. Certains,commelesLINEs,codentleurpropretranscriptaseinversealorsqued’autres,commeles SINEs,sontdépendantsdelatranscriptaseinversed’autresrétroͲéléments(Tableau1).
élémentssontdirectementexcisésdugénomeetinsérésàunnouveaulocusparuneenzymedetype transposase(Tableau1).
Al’heureactuelle,onconsidèrequelegénomehumaincontient3%detransposons,8%de rétrovirusendogènesetderétrotransposonsàLTRetplusde34%derétrotransposonssansLTR,ce qui revient à dire que l’ensemble des éléments mobiles représente environ 45% du génome (Consortium, 2002). Si moins de 2% du génome humain contiennent des séquences codant des protéines,il estdésormaisbienconnuqueles98%restantsne sontpasdel’ADN«poubelle»et possèdentuncertainnombredefonctions(PalazzoandGregory,2014).Ainsi,l’impactdeséléments mobiles sur les génomes n’est pas seulement quantitatif, il est également fonctionnel. En effet, l’insertiond’élémentsmobilesdanslesgènescellulairesestsusceptibledemodifierleurexpression selondifférentsmécanismes(Albertsetal.,2008).Enapportantuncodonstopaumilieud’ungène, lesélémentstransposablespeuventempêcherl’expressiondelaprotéinecorrespondante.Ilspeuvent également perturber l’épissage des ARN messagers et conduire à des rétentions d’introns ou des pertesd’exonsquiaboutissentàlaproductiond’uneprotéinenouvelle(CordauxandBatzer,2009). Ainsi,enagissantdirectementsurlaséquencecodante,lesélémentsmobilesdugénomepeuvent conduireàdespertesoudesgainsdefonctiondesgènescellulaires.
B/Lesviruscommemoteursévolutifs
1/Lessyncytinesoulacréationd’uneClasse
L’intégration d’éléments viraux dans un génome cellulaire est susceptible de modifier son expressionetdecauserdespathologiesmaiselleconstitueégalementunmoteurévolutifimportant vial’apparitiondenouvellesprotéinespossédantdenouvellesfonctionspotentiellementprofitables pourl’hôte. L’exempleleplusmarquantdefonctionapportéeparl’intégrationdeséquencesviralesest vraisemblablementceluiayantconduitàl’apparitiondelaplacentationaucoursdel’évolutiondes Tétrapodes.En2000,deschercheursontobservéquelaprotéined’enveloppedurétrovirusendogène défectif HERVͲW est très fortement exprimée dans le placenta, notamment au niveau du syncytiotrophoblaste, une structure syncitiale ayant l’épaisseur d’une cellule unique qui forme la couche externe du placenta humain. Ils ont montré que cette protéine permet la fusion de la membraneplasmiquedescellulesquil’exprimentavecd’autrescellulesouavecdesliposomes(Miet al., 2000). Les propriétés fusogènes de cette protéine et son profil d’expression très particulier suggèrent qu’elle pourrait jouer un rôle dans la fusion des cytotrophoblastes pour former le syncytiotrophoblaste,c’estpourquoielleaétéappeléesyncytine(Mietal.,2000).
Il a par la suite été montré que l’expression de cette protéine d’origine rétrovirale était contrôlée par un facteur de transcription spécifique du placenta : GCMa (Yu et al., 2002). Cela s’expliqueparlefaitquelesited’intégrationdurétrovirusancestralestlocaliséenavaldedeuxsites defixationdeGCMa.Deplus,unedeuxièmesyncytineaparlasuiteétédécritechezl’Homme.Comme lapremière,elleestspécifiquementexpriméedansleplacenta,possèdedescapacitésfusogènes,et correspondaugèned’enveloppeencorefonctionneld’unrétrovirusendogène,HERVͲFRD(Blaiseet al.,2003).
Sur le plan évolutif, il est intéressant de noter que, contrairement à la plupart des gènes d’enveloppedesrétrovirusendogènes,l’étudedesséquencesdesgènesdessyncitines1et2nerévèle pasdepolymorphisme.Cetteconservationdeséquenceestlesigned’unesélectionpositiveforte, suggérantquelesprotéinescorrespondantesontunefonctionbiologiqueessentielle.Cependant,ces deux gènes n’ont été retrouvés que chez une partie des Mammifères : les Primates Simiens (de Parsevaletal.,2005).Néanmoins,d’autresdonnéesexpérimentalesontconduitàsupposerquedes événementsd’insertiondifférentsmaisdumêmetypesontégalementàl’originedel’apparitiondu placentachezlesautresMammifères.
Il s’avère en effet que des gènes comparables aux syncytines 1 et 2 des Primates ont été trouvéschezd’autresespèces.Ainsi,chezlasouris,deuxgènesd’enveloppeprésentssousformesde copies uniques et non apparentés aux rétrovirus endogènes murins connus codent des protéines expriméesdanslesyncytiotrophoblasteetpossédantdespropriétésfusogènes:lessyncytinesAetB (Dupressoiretal.,2005).Desorthologuesdecesdeuxgènesontétéidentifiéschezl’ensembledes Muridés mais pas chez les autres Rongeurs. Ils présentent des marqueurs de sélection positive suggérantleurimportancefonctionnelle.D’autrestravauxmenéssurdesmodèlesmurinsontpermis deréellementmettreenévidencelerôledesprotéinescorrespondantesdanslaformationduplacenta chezlasouris(Dupressoiretal.,2011,2009).
L’ensembledecesdécouvertesmontrequelarécupérationdegènesd’enveloppevirauxajoué unrôlefondamentaldansl’apparitionduplacentaetdoncdelaclassedesMammifères.Néanmoins uncertainnombredequestionsrestentencoresansréponse.
Tout d’abord, il parait surprenant que la protéine à l’origine de la capacité fusogène des cellules placentaires puisse avoir des origines indépendantes chez différents Mammifères. Cela suggèreraitquel’apparitionduplacentapuisseêtreuneformedeconvergenceévolutive,cequin’est pascohérentavecl’ensembledesdonnéesphylogénétiquesconcernantl’évolutiondesMammifères. L’hypothèse la plus probable est qu’une syncytine « originelle » ait été récupérée par l’ancêtre commun des Mammifères mais que les rétentions indépendantes d’autres syncytines au cours de l’évolutionaientconduitàsadisparitionprogressive,sibienqu’ellen’estplusfacilementidentifiable aujourd’hui(Dupressoiretal.,2012).Ladécouvertedetroisgènesdetypesyncytineàdesdegrés d’exaptation différents et témoignant de trois insertions différentes au cours du temps chez les Marsupiauxvadanslesensdecettehypothèse(Cornelisetal.,2015).
expliquéesparl’implicationdedifférentessyncytinesdansleurformation.Parexemple,chezl’Homme, lessyncytines1et2sontcoͲexpriméesdansuneenveloppesyncytiotrophoblastiqueuniquealorsque chez la souris les syncytines A et B sont exprimées séparément, dans deux enveloppes syncytiotrophoblastiquesdifférentes(Dupressoiretal.,2011,2012).
Enfin,lafonctionoriginelleayantconduitàlasélectiondessyncytinesaprèsleurinsertiondans legénomeviralestelleaussisujetteàdiscussion.Eneffet,ilestconnuquelesprotéinesd’enveloppe des rétrovirus peuvent également posséder une activité immunosuppressive (SchlechtͲLouf et al., 2010)etils’avèrequeledomaineresponsabledecetteactivitéestconservéchezl’ensembledes syncytinesidentifiéesàcejour.Celasoulèvelaquestionsuivante:estͲcequelessyncytinesontété sélectionnéespourleuractivitéfusogèneoupourleuractivitéimmunosuppressive(Dupressoiretal., 2012)?Eneffet,unedesparticularitésdelagestationestquel’organismedelamèredoitpouvoir tolérer l’organisme du fœtus, qui devrait être reconnu comme un corps étranger par le système immunitaire maternel. On peut ainsi considérer que du point de vue évolutif, l’apparition d’un mécanismed’immunosuppressionlocaleestessentielàl’apparitiondelagestationinutero,avant même la mise en place d’un organe comme le placenta. Le fait que la syncytine la plus ancienne observée chez les Marsupiaux, qui connaissent une période de gestation in utero en l’absence de placentadéveloppé,nesoitpasfusogènemaispossèdeundomaineimmunosuppresseurfonctionnel etconservévadanslesensdecettehypothèse(Cornelisetal.,2015).Lesprotéinesd’originesvirales, sélectionnées pour leurs fonctions immunosuppressives, auraient alors déterminé la structure du placentadesMammifèresparleurscapacitésfusogènes.
2/ReproductionsexuéeetdynamiqueduchatduCheshire
Destravauxmenéssurdesorganismesunicellulairesontamenédeschercheursàsupposer que le rôle des virus dans la reproduction dépasse largement la classe des Mammifères puisqu’ils pourraientêtreàl’originedelareproductionsexuée.
Cettehypothèsevientdel’étuded’uncoccolithophoridé,c’estͲàͲdired’unealgueunicellulaire pélagiqueentouréepardesplaquesdecalciteportantlenomdecoccolithes:Emilianiahuxleyi.Les coccolithophoridés jouent un rôle essentiel dans le cycle du carbone. En effet, ils piègent le CO2
atmosphérique dans leurs coccolithes qui, notamment lors de la mort de l’algue, finissent par se déposer sur les fonds marins où ils sédimentent pour donner de la craie. Le rôle potentiel de ces organismesdanslaréponseenvironnementaleàl’augmentationactuelledesgazàeffetdeserreest d’ailleursfortementdébattu(IglesiasͲRodriguezetal.,2008;Riebeselletal.,2000). Cescoccolithophoridéssontàl’origined’efflorescencesalgalesvisiblesdepuisl’espacecarleur protectiondecalciteestcapablederéfracterlalumièreetqu’ellespeuvents’étendresurplusieurs dizainesdemilliersdekilomètrescarrés.Emilianiahuxleyiestl’espècedecoccolithophoridélaplus abondantenumériquement,onlaretrouvedansunegrandepartiedeseauxduglobe.Unemeilleure connaissancedecemicroͲorganismeparticulierpourraitainsipermettred’améliorerlesmodèlesde perturbationducycleducarbone.
Comme beaucoup de microalgues, Emiliania huxleyi existe sous deux formes : une forme diploïdesereproduisantessentiellementparmitoseetuneformehaploïdepouvantsemultiplierpar mitoseouparfusiondedeuxcelluleshaploïdespourformerunecellulediploïde.Cesdeuxformessont extrêmement différentes du point de vue morphologique. La forme diploïde est non mobile et couvertedecoccolithophorestandisquelaformehaploïde,beaucouppluspetite,nepossèdepasde couchecalciquemaisestrenduemobileparlaprésencededeuxflagelles(Greenetal.,1996;Houdan etal.,2004).
marins(Schroederetal.,2002).LagrandeparticularitédecetterelationhôteͲpathogèneestqueces virusnesontcapablesd’infecterquelaformediploïded’Emilianiahuxleyi,laformehaploïdeétant totalementrésistanteàl’infection(Fradaetal.,2008).Deplus,ilsemblequ’enprésencedevirus,des celluleshaploïdesapparaissentdansunepopulationinitialementdiploïde.
Lesmécanismesmoléculairesgouvernantlepassageverslaformehaploïdesontinconnusà ce jour, mais la promotion de cette transition par la présence d’un agent viral et sa résistance à l’infectionsuggèrentunrôlepotentieldesvirusdanslarégulationvoirelamiseenplacedecetteforme haploïde.Or,cemécanismeestladéfinitionpremièredelareproductionsexuée,puisquecepassage parunecellulehaploïdepermet,lorsdelafusionentredeuxcelluleshaploïdesaumatérielgénétique différent,degénérerunecellulediploïdeaugénomenouveau.Silesavantagesetlesinconvénients évolutifsdelareproductionsexuéesontencorediscutés(LivelyandMorran,2014),sonmécanisme d’apparitionrestepourl’instantunmystèreetlesdonnéesconcernantEmilianiahuxleyisuggèrentque lesviruspourraientunefoisdeplusavoirjouéunrôleessentieldansl’évolutiondeleurshôtes.
Par ailleurs, l’étude des interactions entre Emiliania huxleyi et les virus susceptibles de l’infecteraconduitàlaconceptiond’unnouveaumodèled’interactionshôteͲpathogène.Eneffet,le modèlelepluscourammentutiliséestceluidelacourseàl’armement:lacellulemetenplaceun facteurantiviral,levirusévoluepourcontrecarrercefacteur,lacelluleévolueànouveaupourbloquer le virus malgré cette première résistance et ainsi de suite. Ce modèle porte également le nom d’hypothèsedelaReineRouge,paranalogieavecl’œuvredeLewisCarroll,carlesdeuxprotagonistes yévoluentenpermanencesansparveniràchamboulerl’équilibreinitial. OrcettedynamiqueévolutivenecorrespondpasàcequiestobservépourEmilianiahuxleyiet sespathogènes.Eneffet,ils’avèrequelegénomedecettealgueestextrêmementstablemalgréles extinctionsmassivesqu’ellesubitrégulièrement(MartínezMartínezetal.,2007).Celaaamenéles chercheursayantobservéladifférencedesusceptibilitédesformesdiploïdeethaploïdedel’algueaux infections à proposer un nouveau modèle, baptisé la théorie du chat du Cheshire, toujours en référenceàl’œuvredeLewisCarroll.Commecepersonnagedefiction,Emilianiahuxleyiestcapable, enpassantsousformehaploïde,deserendreinvisibleencasdedangerpourneredevenirdiploïde qu’unefoisledangerpassé(Fradaetal.,2008). CenouveaumodèledecoͲévolution,observédanslecasdel’infectiond’unhôteunicellulaire, estcertesdifficileàimaginerdanslecasd’unhôtepluricellulaire,maispeutconstituerunebasede réflexionpourcomprendred’autresdynamiquesd’interactionsentredescommunautésd’organismes, notammentlesinteractionsproieͲprédateur.
C
/Découvertesdemécanismescellulairesfondamentaux:l’exportnucléaire
1/IdentificationdeCrm1,unekaryophérinemajeure
LestravauxmenésdepuisontpermisdemieuxcaractériserlesfonctionsdeCrm1.Ainsi,cette protéineestdésormaisconsidéréecommeundespivotsdel’exportnucléaire.Eneffet,sid’autres virusqueleVIHsontcapablesdel’utiliserpourpermettrel’exportdeleursARN,notammentcertains papillomavirus (Onder et al., 2015), Crm1 est aussi essentielle à l’export de différents composés cellulaires. Ainsi, Crm1 est impliquée dans la biogenèse et l’export nucléaire des ribosomes des eucaryotes(ThomasandKutay,2003),desUsnARN(Fornerodetal.,1997)maiségalementdecertains ARNm(Brennanetal.,2000).Enplusdesafonctiondansl’exportnucléaire,Crm1aétéidentifiée commejouantunrôledecoordinationdedifférentsprocessusaucoursdelamitose,notammentla mise en place des microtubules kinétochoriens (Knauer et al., 2006), et jouerait un rôle dans la structuration de complexes nucléoplasmiques (Verheggen and Bertrand, 2012). L’ensemble des fonctions connues et supposées de Crm1 en fait un acteur majeur de la biologie nucléaire des eucaryotes (Hutten and Kehlenbach, 2007) et il est intéressant de noter que son inhibition est à l’originedel’améliorationcliniquedespatientsdansdesessaisthérapeutiquesdirigéscontredifférents typesdecancer(Kojimaetal.,2013;Wangetal.,2014b;Yangetal.,2014a). 2/IdentificationdeTAP,acteurclédel’exportdesARNmcellulaires L’exportdelaplupartdesARNmcellulairesestindépendantdeskaryophérinesetdelaGTPase Ran.Lesmécanismesmisenjeudanscettevoieparticulièred’exportnucléaireontégalementété caractérisés via l’étude de l’export nucléaire d’ARN viraux : ceux du virus MasonͲPfizer du singe (MPMV).
D/Quandlesvirusdeviennentdesoutils
1/Outilspourleschercheurs:exempledutraçagetransneuronal Lesvirussontcourammentutilisésenlaboratoire,àlafoiscommeobjetsd’étudeetcomme outilscarlespropriétésdecertainsviruspermettentderépondreàdesquestionsinabordablespar d’autresmoyens.En neurologie par exemple, une des problématiques clés est la compréhension de l’organisationdesréseauxneuronaux.Savoirquellespartiesdusystèmenerveuxcommuniquententre elles et de quelles façons permet de mieux comprendre les modalités exactes de transmission de signauxquel’onpeutvouloirsupprimerourestaurerpourtraiterdespathologies.Ilestdoncimportant depouvoirsuivrelesréseauxneuronauxàl’échellecellulaire.Orlesméthodesclassiquesdemarquage, indépendantes des virus, restent limitées. Selon la technique choisie, elles peuvent permettre de visualiser l’ensemble des neurones activés par un stimulus mais sans mettre en évidence les connections entre ces neurones, en activant potentiellement plusieurs réseaux sans pouvoir les distinguer et en ne révélant pas les neurones non activés au sein des réseaux concernés. Des techniques plus précises existent, reposant sur le marquage d’un neurone particulier et sur la transmissiondecemarquagedefaçonantérogradeourétrogradeauxneuronesconnectésavecle neuronemarqué.Cependantcestechniquesreposentsurdesagentsdemarquagequisontdilués lorsqu’ilsprogressentlelongdesréseauxneuronauxetladiminutionrapidedusignalpermetrarement devisualiserplusdedeuxneuronesconsécutifs(Loewy,1998).Lespremierstraçagestransneuronaux reposantsurl’utilisationdevirusneurotropesdetypeherpesviruschezleratetlasourisontdonc constituéuneréellerévolutionenneurologie(MartinandDolivo,1983;Ugolinietal.,1987).
En effet, l’utilisation de virus neurotropes pour visualiser les réseaux neuronaux (par immunofluorescence ou immunohistochimie) présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, contrairementauxautresmarqueurs,lesvirussontcapablesdesemultiplieretdoncd’autoͲamplifier lesignalqu’ilsconstituentaprèsinfectiond’unenouvellecellule.Ainsi,ildevientpossibledevisualiser le marquage de plusieurs neurones consécutifs, dont le nombre varie en fonction de la durée de l’infection avant sacrifice de l’animal. Par ailleurs, il a été montré que les virus utilisés dans les expériences de traçage transneuronal ne se transmettaient que via les connexions synaptiques (Enquist,2002;Ugolini,1995),cequipermetdevisualiserdesréseauxdeneuronesfonctionnellement connectés.
Deuxtypesdevirussontutiliséspourletraçagetransneuronal:desherpesvirus(dontlevirus de la pseudoͲrage) et des rhabdovirus. Cela vient essentiellement du fait que ces virus ont des tropismesdifférents:aprèsinfectionintranasalechezlasouris,levirusdelapseudoͲrageinfecteles systèmessympathique,parasympathiqueetsensorielmaispaslesystèmeolfactifalorsquelevirusde lastomatitevésiculairen’infectequelesystèmeolfactif(Sabin,1938).Parailleurs,silevirusdela pseudoͲrage a été privilégié pour l’étude des modèles murins car il n’est pas capable d’infecter l’homme, le virus l’herpès simplex 1 (HSVͲ1) et les rhabdovirus ont été utilisés pour l’étude des modèlesprimates.
ADNdoublebrindontlegénomefait150kb.Celaentraîneuncertainnombrededifférencesdans l’utilisation expérimentale de ces outils. Tout d’abord, les rhabdovirus ne possèdent qu’une seule protéined’enveloppe,RG(rabiesglycoprotein)cequilesrendtrèsspécifiquesd’untypecellulairevoire d’unezoneneuronaledonnée:levirusdelaragen’estainsicapabled’infecterlesneuronesqu’au niveaudesterminauxprésynaptiques(Lafon,2005).Enrevanchelesherpesvirusontplusieursgènes codantdesprotéinesd’enveloppecequileurpermetdeciblerunplusgrandnombrederécepteurs (McGeochetal.,1988). Enplusdecettespécificitédifférented’entréedanslacellulecible,ladifférencedetailleetde complexitéentrecesdeuxfamillesviralesfaitquelapathogenèsedesrhabdovirusestmieuxcomprise àl’échellecellulairequecelledesherpesvirus,maisquelegénomedecesderniersestplusfacilement modifiable.Eneffet,ledéveloppementdestechniquesdegéniegénétiqueapermisd’améliorerles virus utilisés dans le traçage transneuronal, en maîtrisant plus finement leur pathogénicité, en influençant leur direction de dissémination, en leur faisant exprimer des gènes rapporteurs mais surtoutenciblantplusprécisémentlescellulesinfectées.
Defait,laprincipalelimiteàl’utilisationdevirusneurotropesdansletraçagetransneuronal est le manque de maîtrise lors de l’infection du premier neurone dont on souhaite tracer les connexions. Si trop de neurones, proches physiquement, sont infectés simultanément, cela peut brouillerlesuividesréseauxcorrespondants.Degrandesavancéesontpuêtrefaitesencombinantla manipulationdesgénomesvirauxetlamanipulationdesgénomesdesmodèlesmurinsassociés.Dans le cas du virus de la pseudoͲrage, des souches virales ne se répliquant qu’en présence de la recombinaseCreontétégénérées.Utiliséessurdessourisn’exprimantCrequedanscertainstypes cellulaires ou dans certaines zones du cerveau, elles permettent un suivi plus précis des réseaux neuronaux(DeFalcoetal.,2001).L’organisationtrèscompactedugénomedesrhabdoviruscomplique sa modification, néanmoins une souche transgénique a été produite en remplaçant la protéine d’enveloppeoriginelleduvirusparuneautreprotéined’enveloppe,reconnaissantunrécepteurnon exprimépar lesMammifères.Utilisée encombinaisonavecdes souristransgéniquesexprimant ce récepteurdanscertainsneurones,cettesouchedevirusdelaragepermetégalementd’améliorerle traçagetransneuronal(Wickershametal.,2009). 2/Outilsthérapeutiques ĂͬWƌŽĚƵĐƚŝŽŶĚĞǀĞĐƚĞƵƌƐǀŝƌĂƵdž
utilisépourincorporerdel’ADNdansdescellulesmurines(Gradyetal.,1970)ouhumaines(Qasbaand Aposhian,1971).
Quelquesoitletypedevirusutilisé,leprincipedeproductiond’unvecteurviralesttoujours similaire (Figure 5). Des cellules productrices sont coͲtransfectées avec un plasmide contenant le transgènechoisietuneséquenced’encapsidation,unplasmidedit«helper»contenantlesgènes viraux nécessaires à la production des particules virales et éventuellement un troisième plasmide contenant le gène d’enveloppe virale qui permettra aux particules produites d’infecter le type cellulairevoulu.Letransgènepeutcontenirunouplusieursgènes,souslecontrôledepromoteurs choisispourencontrôler l’expression. Quelquesjoursaprèstransfection,lesurnageant deculture contenant les particules virales est récupéré et ces dernières sont éventuellement purifiées par ultracentrifugation avant d’être dosées puis congelées ou utilisées pour traiter les cellules cibles (SkubisͲZegadųoetal.,2013;Tiscorniaetal.,2006). DesparticulesviralespeuventêtreproduitesdecettemanièrepoursurͲexprimerdesgènes danslescellulescibles(enincorporantdirectementlesséquencesd’acidenucléiquecorrespondantes), poursousͲexprimerdesgènesdanslescellulescibles(enincorporantlesséquencesd’ARNinterférents ciblantlesARNmcorrespondants)oupourintroduireuniquementdesprotéinesdanslescellulescibles (vialeurinteractionaveclescomposantsdesvirionsutilisés).
deslignéesstablescontenantuntransgèneetl’exprimantdefaçonconstitutiveouinductibleselonle promoteurchoisi(Trono,2000). Parailleurs,lesvecteursvirauxjouentdeuxrôlesfondamentauxenthérapie:ilspeuventêtre utilisésdanslecadredethérapiesgéniquespourmodifierl’expressiondegènesparticuliersdansdes cellulesspécifiquesoucommevecteursvaccinauxpourpermettrelaprésentationd’antigènesd’agents infectieuxdansuncontextenonpathogène. ďͬƉƉůŝĐĂƚŝŽŶƐĚĞĚŝĨĨĠƌĞŶƚƐƚLJƉĞƐĚĞǀĞĐƚĞƵƌƐ Dépendammentdel’applicationfinale,ilimportedechoisirletypedevecteurleplusapproprié àsoncontexted’utilisation(Tableau2).Enlaboratoire,lebutdelatransductionestleplussouvent d’obteniruneexpressionàlongtermedutransgène.Pourcela,lesvecteurslesplusadaptéssontceux quipermettentl’insertiondutransgènedanslegénomecellulaire:lesvecteursdérivésdesrétrovirus etdeslentivirus.
In vivo, l’utilisation de ces vecteurs est délicate car ils sont susceptibles de perturber le fonctionnement de la cellule par mutagenèse insertionnelle et notamment de favoriser le développementdetumeursmaisceproblèmeneseposepaspourl’utilisationinvitro.Enrevanche,il estimportantdesavoirsilescellulescibléescontinuentàsediviserounon.Eneffet,laplupartdes vecteursrétrovirauxsontdépendantsdelamitoseetilestnécessaired’utiliserdesvecteurlentiviraux pourinséreruntransgènedanslegénomed’unecellulenesedivisantpas(Trono,2000).
Les vecteurs rétroviraux et lentiviraux n’étant capables d’infecter que certains types cellulaires,leurenveloppeestgénéralementremplacéeparcelleduVirusdelaStomatiteVésiculaire, laprotéineVSVg,quiestcapabledepermettrel’entréeduvirusdansn’importequeltypecellulaire (Burnsetal.,1993;Naldinietal.,1996).Onparlealorsdevecteurspseudotypés.L’autreavantagedes vecteursrétrovirauxetlentivirauxestqu’ilspermettentletransfertdeséquencesd’acidenucléique relativementlongues,pouvantallerjusqu’à10kb(Mátraietal.,2010). Enthérapiegénique,lesvecteurslesplusutiliséssontceuxdérivésdesadénovirus(22,5%des essaiscliniquesmondiaux,contre19,2%pourlesrétroviruset4,7%pourleslentivirus)(TheJournalof GeneMedicine).LesadénovirussontdesvirusàADNdoublebrinnonenveloppésdontlacapside icosaédriquemesureenviron90nmdediamètre.Leurgénomed’environ35kbestterminépardes séquencesrépétéesappeléesITR(InvertedTerminalRepetitions).Cevirusestunpathogènehumain bénin dont la majorité des infections sont asymptomatiques. Il est facile à produire in vitro et la protéineFibreàl’originedesontropismecellulaireestadaptableparinsertiondepeptides(Capasso et al., 2014). Les vecteurs adénoviraux permettent l’expression forte et transitoire des transgènes indépendammentduprocessusdedivisioncellulaire.
Les deux inconvénients majeurs des vecteurs adénoviraux sont leur forte propension à la recombinaisonlorsdeleurproductionetleurcaractèreimmunogène.Lapremièredecesobservations aconduitàlacréationdevecteursappelés«gutless»,littéralementvidésdel’ensembledesprotéines viralesoriginellesetnecontenantplusquelestransgènes,lesITRetlaséquenced’encapsidation.Cela rendhautementimprobableunerecombinaisonavecl’ensembledesgènesduplasmide«helper»qui Tailledu génome(kb) Immunogène Persistancedu
génomeviral Intégration
Dépendantdela mitose
Adénovirus 37 oui non non non
Aav 4,7 non oui rare non
Rétrovirus 10 non oui oui oui
Lentivirus 10 non oui oui non
II/
Compréhensiondesmécanismesdel’oncogenèse
A/
Evolutionpathologiquedescaractéristiquescellulaires
1/Définitionsetconceptsprincipaux
Le bon fonctionnement des organismes pluricellulaires repose entre autres sur le fait que chaquecelluleestréguléedefaçonàremplirunefonctionprécise.Cesrégulationsconcernentaussi bien la localisation, la prolifération, la différenciation que la mort de chacune des cellules de l’organisme.L’échappementauxmécanismesdecontrôlescorrespondantspeutentraînerdegraves pathologies.Lecancerestainsidûàdesperturbationspermettantàunecelluledeneplusrépondreà cesmécanismesdecontrôle.Cettecellulen’estalorsplussoumiseàsesrégulationsd’originemais répondauxpressionsévolutivesclassiquesindépendammentdurestedel’organisme.Sielles’adapte aux conditions dans lesquelles elle est maintenue, la cellule modifiée peut se multiplier de façon incontrôléeet,àlongterme,causeruncancer(Albertsetal.,2008;Gerlingeretal.,2014).
Cettedéfinitionducancercommel’apparitiond’unemassecellulaireproliférantsansrépondre aux mécanismes de contrôle de l’organisme permet de souligner qu’il existe en réalité autant de cancers que de patients. En effet, la nature du cancer dépend à la fois de la nature de la cellule initiatrice(typecellulaireetlocalisationdansl’organisme)etdelafaçondontelles’estaffranchiedes mécanismesdecontrôle(DiazͲCano,2015). Quelquesoitlecancer,lesétapesprécocesauniveaucellulairerestentlesmêmes(Figure6, haut).Pourlescomprendre,ilestnécessaired’avoirunevisionclairedesconditionsclassiquesde proliférationdescellulesauseindesorganismespluricellulaires.
Chez ces organismes, les cellules sont pour la plupart soumises à la limite de Hayflick, c’estͲàͲdirequ’ellesnepeuventsediviserqu’unnombrelimitédefois,autourde50pourlescellules humaines (Hayflick,1965).Cettelimiteestdueauraccourcissementprogressifdestélomères,des séquencesrépétéeslocaliséesauxextrémitésdeschromosomes,àchaquedivisioncellulaire(Harley etal.,1990).Lescellulessouchessontparmilesseulescellulesdel’organismeànepasêtresoumises à cette limitation du nombre de divisions car elles expriment une enzyme, la télomérase, qui est capable de rallonger les télomères (Batista, 2014; Greider, 1990). En plus de cette limitation intrinsèquedelaproliférationcellulaire,lescellulessainessontsoumisesàuneinhibitiondecontact. Autrementdit,lorsqu’auseind’untissulasurfacedechaquecelluleestintégralementencontactavec la surface d’autres cellules, les cellules ne se divisent plus (Abercrombie, 1967). La prolifération cellulaire n’est possible que lorsqu’elle est rendue nécessaire pour le renouvellement de cellules préalablementdétruites,pardeslésionsouparapoptose.
l’organisme, par ces cellules (Figure 6, bas). Ainsi, des altérations légères de certains organes perturbant leur fonctionnement sont considérées comme des lésions préͲtumorales. Elles sont généralement traitées de façon symptomatique et n’évoluent que rarement en véritables cancers (Albertsetal.,2008).Trèsvariablesselonlesorganesetlestissus,ceslésionspréͲtumoralesneseront pasdétailléesdansleprésentmanuscrit.
Les lésions préͲtumorales peuvent évoluer pour devenir des tumeurs. Les tumeurs, ou néoplasmes, sont des ensembles de cellules proliférant de façon anormale et ne partageant pas l’organisation du tissu environnant. Ces tumeurs sont dites bénignes si elles ne possèdent pas de capacitéinvasive.Ellespeuventalorsêtretraitéesparablationchirurgicaleoutraitementlocal.En revanche,ellessontditesmaligneslorsqu’ellessontcapablesd’envahirletissuenvironnantvoiredes pointsdistantsdel’organismevialacirculationsanguine.Cettedisséminationpeutcauserl’apparition detumeurssecondaires,ditesmétastatiques,quirendentlecancerd’autantplusdifficileàtraiteret aggraventlepronosticvitaldespatients(Albertsetal.,2008).
Quelsquesoientletypecellulaireetletissuconcernés,lecancerestenréalitéuncontinuum d’étatscellulairesettissulairesdegravitécroissante.Selonlescas,laprogressionverslesétatslesplus graves peut prendre quelques semaines ou plusieurs années, voire ne jamais avoir lieu. Ainsi, la caractérisation d’un cancer, notamment lors d’un diagnostic, nécessite d’évaluer sa probabilité d’évolution. 2/Delacellulesaineàlacellulecancéreuse Ăͬ>ĞĐĂŶĐĞƌ͕ƵŶĞĂĐĐƵŵƵůĂƚŝŽŶĚĞĚLJƐĨŽŶĐƚŝŽŶŶĞŵĞŶƚƐ L’aggravationprogressivedescomportementscellulairesetdeslésionsverslecancerdécoule du fait que cette maladie est causée par l’accumulation au fil du temps de différents dysfonctionnements.Cesdysfonctionnementsontpouroriginedesmodificationsdel’expressiondes gènesdanslescellulesinitiatricesdelamaladie.CellesͲcipeuventêtreduesàdesmutationsmodifiant directementlaséquencecodanted’ungèneenentraînantdesgainsoudespertesdefonctions,àdes mutationsdesséquencesrégulatricesmodifiantlaquantitédeprotéineproduiteàpartird’ungène donnémaisaussiàdeschangementsdel’étatépigénétique(JonesandBaylin,2002)d’ungèneou d’uneséquencerégulatrice.
Ces changements dans l’expression des gènes, qu’ils soient dus à des mutations ou à des modifications de l’état épigénétique de séquences données, induisent une évolution du comportement des cellules concernées. L’accumulation différentielle de perturbations dans les cellulescancéreusesestcoupléeàunprocessusdesélectionnaturelleàl’échellecellulaire(Figure7). Lescelluleslesplusaptesàsemultiplieretlespluscapablesd’échapperauxmécanismesdecontrôle del’organismevontêtreprogressivementsélectionnéesetcontribueràl’aggravationdelamaladie (Gerlingeretal.,2014). AuͲdelàdecettecorrélationentreaccumulationdemutationsetaggravationduphénotype, différentesdonnéesmontrentquelecancerrésulted’uneséried’événementsetnond’ununique dysfonctionnementoriginel. Toutd’abord,l’ADNpolymérasecatalysantlaréplicationdel’ADNaucoursducyclecellulaire possèdeuntauxd’erreurfaiblemaisnonnul,del’ordredede10Ͳ6mutationspargènepardivision cellulairechezl’Homme.Sachantqu’environ1016divisionscellulairesontlieuaucoursdelavied’un
al.,2008).Mêmeenconsidérantquelaplupartdecesmutationsseraientsilencieusesoun’induiraient pasuncomportementdetypecancéreuxdelacelluleconcernée,lescancersseraientextrêmement fréquentss’ilspouvaientêtrecausésparuneseulemutationdansungènedonné. Deplus,siuneseulemutationpouvaittransformerunecellulesaineencellulecancéreuse,la probabilitédedévelopperuncancerneseraitpasdépendantedel’âge.Eneffet,enl’absenced’agents mutagènes,laprobabilitéqu’unemutationapparaissedansungènedonnénevariepasaucoursdela vied’unindividu.Unenfantetunepersonneâgéeauraientdonclamêmeprobabilitéd’avoiruncancer. Or, dans les faits, l’incidence des cancers augmente avec l’âge (Balducci and Ershler, 2005). Cette observation a conduit les scientifiques à supposer que le cancer découlait d’une accumulation de mutationsavantmêmel’identificationdesgènesconcernés.
Al’heureactuelle,uncertainnombredegènesimpliquésdansledéveloppementducancer ontétécaractérisés.Ilestdoncpossibled’étudierleurséquencedanslescellulescancéreuses.Ce séquençage a permis de montrer que des mutations dans plusieurs gènes clés sont effectivement présentesdanslescellulespathologiques(Albertsetal.,2008;GrayandCollins,2000).Parailleurs,des expériences réalisées chez la souris ont confirmé qu’une seule mutation ne suffit pas à causer un cancer. En effet, des souris transgéniques portant une mutation impliquée dans le cancer ne développent des tumeurs qu’après un certain temps et uniquement à partir de certaines cellules (Albertsetal.,2008;vanMiltenburgandJonkers,2012).Cecimontrequed’autresévénementsenplus delamutationoriginellesontnécessairesàlaprogressiondelamaladie.
ďͬĂƌĂĐƚĠƌŝƐƚŝƋƵĞƐĚĞƐĐĞůůƵůĞƐĐĂŶĐĠƌĞƵƐĞƐĞƚŚĠƚĠƌŽŐĠŶĠŝƚĠƚƵŵŽƌĂůĞ
Quel que soit le type de cancer, les cellules cancéreuses partagent un certain nombre de caractéristiquesconnuescommeles«marquesdefabrique»ducancer(«Hallmarksofcancer»).La progression des connaissances sur les mécanismes d’établissement de cette pathologie et le comportement des cellules qui la causent va de pair avec une augmentation du nombre de ces caractéristiques. Lorsdeleurpremièredescription,cescaractéristiquesétaientaunombredesix(Hanahanand Weinberg,2000): Ͳ Lacapacitéillimitéederéplication Ͳ L’indépendancevisͲàͲvisdessignauxdecroissance Ͳ Larésistanceauxinhibiteursdecroissance Ͳ L’échappementàlamortcellulaireprogramméeparapoptose Ͳ Lacapacitéd’invasionetdemétastase Ͳ L’inductiondel’angiogenèse Lestroispremièrescaractéristiquesseretrouventchezlescellulestransforméesetchezlescellules cancéreuses alorsquelestroisdernièressontspécifiques descellules cancéreuses.Cespropriétés peuventêtredéfiniesauniveaumoléculaire,auniveaucellulaireetauniveaudelatumeur(Figure8, haut).
Depuis cette première description, d’autres caractéristiques partagées par les cellules cancéreusesontétéidentifiées(HanahanandWeinberg,2011)(Figure8,bas).Ils’agitnotammentde:
Ͳ LarésistancevisͲàͲvisdusystèmeimmunitaire Ͳ Lastimulationparl’inflammation
Ͳ L’instabilitégénétique
L’acquisition progressive ou parallèle de ces caractéristiques par des cellules initialement sainesconduitàleurévolutionverslecancer.Ilestcependantimportantdepréciserquetoutesces propriétés ne sont pas partagées par l’ensemble des cellules tumorales. En effet, si la tumeur est initialement causée par la prolifération anormale d’une cellule mutée et a donc une constitution originelleclonale,cetteclonalitédisparaitrapidement.
Lesmécanismesprécisconduisantàl’apparitiondedifférentstypesdecellulesauseindela tumeursontencoremalconnus,etlestypesdecellulesenquestionsontprogressivementcaractérisés (Meacham and Morrison, 2013). Néanmoins il est clair que l’instabilité génétique des cellules cancéreusesfavorisel’apparitiondemutationsdifférentesdanschacunedescellulestumorales.Les cellulespeuventalorsévoluerdefaçonsdifférentesauseindelatumeur(Gerlingeretal.,2014).
Parmilesdifférentescellulescancéreuses,lescellulessouchescancéreusessontaujourd’hui intensivement étudiées. Contrairement aux autres cellules cancéreuses, les cellules souches cancéreusessedivisentrelativementlentementmaispourraientêtreàl’originedirectedecertains cancers.Ellesseraientégalementparticulièrementimportantespourlaformationdesmétastaseset pourraientêtreàl’origined’ungrandnombrederécidivesaprèstraitement,leurfaibletauxdedivision
Figure8:récapitulatifdescaractéristiquesducancer,d’aprèsHanahanetWeinberg(Hanahanand
les rendant résistantes à la plupart des agents antiͲcancéreux (Islam et al., 2015; Meacham and Morrison,2013).
Enfin, il ne faut pas oublier que les tumeurs ne sont pas constituées que de cellules cancéreuses.Ellescontiennentaussidescellulessaines,ditesstromales,tellesquedesfibroblastes, descellulesendothélialesoudesleucocytes.Cescellulesnepartagentpaslescaractéristiquesdes cellulescancéreusesmaisellesfavorisentlemaintienetlacroissancedelatumeurenluiapportant différents facteurs (oxygène transporté via le sang, sécrétion d’enzymes altérant la matrice extracellulaire…)(Bhomeetal.,2015;PietrasandÖstman,2010).
B/
Commentidentifierlesgènesimpliquésdansl’oncogenèse?
1/Oncogènesetsuppresseursdetumeurs Lesgènesdontlaperturbationfavoriseledéveloppementdecancerspeuventêtreclassésen deuxcatégoriesprincipales:lesoncogènesetlessuppresseursdetumeurs(Albertsetal.,2008;Klein, 1988).Les oncogènes sont des gènes favorisant l’apparition des cancers (Figure 9, haut). Ils sont présentsdanslegénomesousformedeprotoͲoncogènes.Leurcaractèrepathologiqueestdûàune activationconstitutivedelaprotéinequ’ilscodent.CelleͲcipeutêtrecauséepardesmodifications qualitatives (mutations)ouquantitatives(duplication,surexpression…) dugèneoudeses produits (ARNm et protéine) aboutissant à un gain de fonction. L’activation d’un oncogène cellulaire est Figure9:schémadestroisgrandescatégoriesdemutationsfavorisantledéveloppementducancer.Lesdeux
dominante,lamodificationd’unseuldesdeuxallèlescellulairessuffisantàfavoriserledéveloppement cancéreux(Murrayetal.,1981).
Les suppresseurs de tumeurs, comme leur nom l’indique, ont pour fonction de limiter l’oncogenèse(Figure9,milieu).Ilssontnormalementexprimésdanslescellulesetc’estcettefoisͲci leurpertequiestàl’originedel’apparitiondescancers.Cettepertepeutêtredueàdesmutations ponctuelles inactivant le gène ou déstabilisant la protéine, mais aussi à des modifications épigénétiquesempêchantl’expressiondugèneouàdesévénementsderecombinaisonconduisantà lapertetotaledugène.Cespertesdefonctionsontgénéralementrécessivesetlessuppresseursde tumeurs ne perdent leur activité que lorsque les deux allèles du gène ont été altérés (Figure 10) (Levine,1993).
A ces deux classes de gènes impliqués dans l’oncogenèse peut être ajoutée une troisième catégorie,celledesgènesdemaintenance(Figure9,bas).L’actiondecesgènessurledéveloppement ducancerestplusindirectequepourlesprécédentsmaisrestenéanmoinsessentielle.Eneffet,cette catégorieregroupel’ensembledesgènesimpliquésdanslemaintiendelastabilitédugénome.Lorsque ceuxͲcisontaltérés,cequiestfréquemmentlecasdanslescellulescancéreuses,laprobabilitéde mutationaugmente.Cumuléeàl’augmentationdelavitessedeproliférationdescellules,c’estͲàͲdire delafréquencederéplicationdeleurgénome,celleͲcifavoriseledérèglementdesoncogènesetdes gènessuppresseursdetumeurs,doncledéveloppementducancer(FishelandKolodner,1995;Foxet al.,2013).
cancerencomparantsimplementlegénomed’unecellulecancéreuseavecceluid’unecellulesainedu mêmepatient:lesdifférencessonttropnombreuses.Deplusl’expressiondesgènesimpliquésdans l’oncogenèsepeutêtrealtéréeviadesmodificationsépigénétiquesnondétectablesparséquençage (JonesandBaylin,2002).Desanalysesdeséquençageportantsurunplusgrandnombredepatients oudesméthodesdifférentessontdoncnécessaires. Enfin,ilfautsoulignerqueletermede«gène»employépourparlerdesgènesimpliquésdans lecancerestenréalitéunabusdelangage.Ilseraitplusappropriédeparlerde«séquences»d’ADN. En effet, certains microARNs sont impliqués dans l’oncogenèse, en tant qu’oncogènes ou que suppresseursdetumeurs(Suzukietal.,2012).
2/Apportsdel’étudedescancersfamiliauxethéréditaires
Bien que relativement rares, les cancers familiaux et héréditaires ont permis d’identifier plusieursgènesimpliquésdansl’oncogenèse.Eneffet,aprèscaractérisationdanslecasparticulierd’un cancerfamilialdonné,plusieursgènessesontensuiteavérésimpliquésdansledéveloppementde nombreuxcancerssporadiques. Ainsil’étuded’uncancerdelarétine,lerétinoblastome,apermisd’identifierlegèneRbͲ1 commeétantunsuppresseurdetumeur.Lerétinoblastomeestuncancerrareayantlaparticularité d’êtrecauséparunnombretrèsréduitdemutationsettouchantgénéralementlesenfantsdemoins de cinq ans. Ce cancer peut être transmis de façon héréditaire ou se développement de façon sporadique. Dans la forme héréditaire, plusieurs tumeurs simultanées sont souvent observées, touchant généralement les deux yeux alors que la forme sporadique conduit à l’apparition d’une tumeuruniquedansunseulœil(Cowelletal.,1988).
Lesrétrovirusontlacapacitéderétrotranscrireleurgénomed’uneformeARNàuneforme ADN et de conduire à l’intégration de cet ADN viral au sein de l’ADN cellulaire. Ce mécanisme d’insertionestsusceptibledeperturberlefonctionnementdescellulesconcernées,toutcommecelui desélémentsmobilesdugénome,qu’ilssoientd’originerétroviraleounon.C’estainsiquel’étudedes rétrovirusaviairesaucoursduvingtièmesiècleaétéàl’originedelacaractérisationdeplusieursgènes cellulaires impliqués dans la régulation de la tumorigenèse. La démarche expérimentale étant comparable,unseulexempleseradéveloppéici:celuidelacaractérisationduprotoͲoncogènemyc. L’idéeselonlaquellelesviruspeuventêtreassociésaudéveloppementdecancersremonteà plusd’unsiècle.Ainsi,dès1908,EllermanetBangontétabliunliendecausalitéentrel’infectionde pouletsparlevirusdelaleucémieaviaire(VLA)etledéveloppementdeleucémies(Ellermannand Bang, 1909). La fréquence d’association était relativement faible puisque seuls 5% des animaux infectésparlevirusprésentaientdesleucémiessixmoispostͲinfection.
Enparallèle,Rous,quitravaillaitsurd’autrestumeursaviaires,amontréquecellesͲcin’étaient transmissiblesqu’entredesanimauxdelamêmeraceetquecettetransmissionétaitindépendantede la présence de cellules tumorales dans l’inoculat (Rous, 1911). Cela l’a mené à formuler deux hypothèses:cessarcomespouvaientêtrecauséspardesagentsinfectieuxouparmoléculessécrétées parlescellulestumorales.Ils’estrapidementavéréqu’unvirusétaitàl’originedudéveloppementde cessarcomes(RousandMurphy,1912),quiaétébaptisévirusdusarcomedeRous. Cesdeuxexemplesontjouéunrôlefondamentaldansl’acceptationdurôledecertainsvirus dansleprocessusdetumorigenèse.Lesrétrovirusoncogènesaviairesétudiésàl’époquepouvaient êtreclassésdansdeuxcatégories:certainsavaientunfortpouvoircancérigène(laquasiͲtotalitédes animauxinfectésdéveloppaientdestumeurs)alorsqued’autres,commeleVLA,n’induisaientdes cancersquechezunepartiedesanimauxinfectés. Ilafalluattendrequelquesdécenniesetledéveloppementd’outilsmoléculaires,notamment leséquençage,pourcomprendrel’originedecettedifférencedepathogénicité.Lesvirusàfortpouvoir cancérigène,parmilesquelslasoucheMC29duvirusdelamyélocytomatoseaviaire,sontretrouvés dans l’ensemble des cellules tumorales des animaux infectés mais sont absents des cellules non tumorales. L’étude du génome du rétrovirus MC29 a permis de montrer que celuiͲci, pourtant considérécommedéfectifcarincapabledesemultiplierenl’absencedecoͲinfectionparunautre rétrovirus,possédaitungènecapabled’induirelatransformationdescellulesinfectéesencellules tumoralesquelquesoitsonsited’insertiondanslegénome(Lautenbergeretal.,1981).Cetoncogène viralaétébaptisévͲmyc(Figure11,partiedegauche).
Figure11:schémarécapitulantlesdeuxprincipauxtypesd’oncogenèsemédiésparlesrétrovirusetimpliquant l’expressiond’unoncogène.Agauchelecasd’unvirusoncogènerapide,dittransducteur,dontlemodèleclassiqueest celuiduvirusdusarcomedeRous,àdroitelecasd’unvirusoncogènelent,ditcisͲactivateur,dontlemodèleclassique estlevirusdelaleucémieaviaire.1:infectiondelacellulecibleetentréedel’ARNviral.2:transcriptioninversepour formerl’ADNviral.3:insertiondel’ADNviraldansl’ADNcellulaire.3’:insertiondel’ADNviraldansl’ADNcellulaireen amontdulocuscͲmyc.4:transcriptiondel’oncogèneviralvͲmycsouslecontrôledupromoteurLTRviral. 4’:transcriptiondel’oncogènecellulairecͲmycsouslecontrôledupromoteurLTRviral.5:exportnucléairedel’ARNm myc.6:traductiondelaprotéinemycetinductiondel’oncogenèse. Pourlapremièrefois,lepotentieloncogéniqued’ungènecellulaireaétéidentifiéetilaété démontréqu’unvirusoncogènepouvaitagirenmodifiantl’activitéd’unprotoͲoncogènecellulaire.Les deux mécanismes décrits ciͲdessus (oncogenèse par l’expression d’un oncogène viral ou par la surexpressiond’unoncogènecellulaire)ontdepuisétéidentifiésdansdenombreuxcasdecancer induitpardesrétrovirus.
Leseulrétrovirusoncogènen’appartenant niàla catégoriedesvirustransducteursniàla catégoriedesviruscisͲactivateursestlevirusHTLVͲ1(virusTͲlymphotropiquehumain).Cevirusestle premiervirusdontlecaractèreoncogèneaétéformellementcaractériséchezl’hommeetilagitpar transͲactivationdemultiplesgènescellulairesfavorisantledéveloppementdeleucémies(Zaneand Jeang,2014).
C/Processuscellulairesperturbéslorsdel’oncogenèse
Comme rappelé précédemment, de nombreux processus cellulaires sont perturbés lors de l’oncogenèse. Dans cette partie, seuls ceux qui sont bien connus et sont impliqués dans le développementdesleucémiesserontdétaillés.Onnereviendranotammentpassurlamodificationde la sensibilité aux activateurs et inhibiteurs de croissance, la capacité d’invasion et de métastase, l’angiogenèse,leschangementsmétaboliquesetledétournementdelaréponseimmunitaire.
1/Résistanceàl’apoptose
Al’échelledel’organismeetdestissus,plusieursmécanismespermettententempsnormal d’éliminer les cellules présentant des dysfonctionnements. Parmi ces mécanismes, l’apoptose présenteladoublecaractéristiqued’êtregénétiquementprogramméeauseindechaquecelluleetde ne pas déclencher de réaction inflammatoire. L’apoptose joue un rôle essentiel au cours du développement embryonnaire et de la vie de l’organisme. Elle est par exemple impliquée dans la morphogenèsedesdoigtsetlerenouvellementdedifférentstissus,dontl’épithéliumintestinal.Le mécanisme d’apoptose est également déclenché lorsqu’une cellule subit des dommages à l’ADN importants (Flusberg and Sorger, 2015). Il permet donc d’éviter le maintien dans l’organisme de cellulesporteusesdemutationetsusceptiblededériverversunphénotypecancéreux.L’ensembledes cancers effectivement observés découle donc de cellules ayant acquis la capacité d’échapper à l’apoptose.
L’apoptosed’unecellulepeutêtreinduitepardeuxvoiesdesignalisationdifférentes.Lavoie extrinsèque dépend d’un signal extracellulaire tandis que la voie intrinsèque est déclenchée spontanément par la cellule elleͲmême. Ces deux voies convergent vers l’activation des caspases proͲapoptotiques(Albertsetal.,2008).Cesprotéasessontprésentesdanslecytoplasmesousforme deprécurseursinactifs,lesproͲcaspases,quisontactivésparclivageetdimérisation(Parrishetal., 2013).L’activationdecescaspasesparlesvoiesextrinsèqueetintrinsèquedel’apoptoseinduitle clivage de différentes protéines cellulaires et l’activation d’une nucléase capable de cliver l’ADN internucléosomique, l’apoptose étant associée à un clivage de l’ADN cellulaire (Widųak, 2000). L’ensembledecesmécanismesrégulésdedégradationaboutitàlamortcellulaireparapoptose(Figure 12).
Lavoieextrinsèquedel’apoptose(Figure13)estdéclenchéeparlareconnaissanced’unsignal extracellulaire par un récepteur membranaire couplé à un domaine de mort (DD). Ce signal extracellulairepeutͲêtrelocaliséàlasurfaced’uneautrecellule(ligandFas)oucirculant(TNFDetE).
L’interaction du récepteur avec le ligand extracellulaire va induire sa trimérisation, permettant l’interactiondesesDDintracellulairesaveclesDDdeprotéinesadaptatricestellesqueFADD(protéine associéeàFasavecDomainesdemort).Cesprotéinesadaptatricesrecrutentetactiventlacaspase8 qui déclenche ensuite une cascade d’activation des autres caspases conduisant à l’apoptose (Verbruggeetal.,2010).
protéineAIF(FacteurInduisantl’Apoptose)libéréeparlamitochondrieesttransportéedanslenoyau oùellefavoriseleclivageetlacompactiondel’ADN(AdrainandMartin,2001;Albertsetal.,2008;Cory andAdams,2002).
AuͲdelà de leur convergence vers l’activation des caspases, la voie extrinsèque et la voie intrinsèquedel’apoptosesontconnectéesvialaprotéineBid.Eneffet,Bidestactivéeparlacaspase 8lorsdelavoieextrinsèqueetactivelesprotéinesBaxetBakdelavoieintrinsèque.Ellefavorisele relargage de facteurs proͲapoptotiques depuis la mitochondrie et donc la voie intrinsèque de l’apoptose(Korsmeyeretal.,2000).
Dans certains cancers, la résistance à l’apoptose est due à la surexpression de facteurs antiͲapoptotiquecommeBclͲ2(Leeketal.,1994;Luetal.,1993).Maisdanslamajoritédescas,des mutationssontretrouvéesdanslesgènescodantdesfacteursclésdel’apoptose.
Cette protéine est présente à des niveaux très faibles dans les cellules saines car elle est dégradéeenparallèledesasynthèse.Elleeststabiliséelorsquelacelluleestconfrontéeàdifférents stresstelsquelesdommagesàl’ADN,l’hypoxie,unmanquedenucléotide,lestressoxydatifouencore l’expressiond’oncogènes.Cetteaugmentationduniveaudep53cellulaireinduitdifférentesréponses austress,dontl’apoptose(ChipukandGreen,2006).L’inactivationdugènecorrespondantdansdes cellulestransforméesconstituedoncuneavancéedrastiqueverslephénotypecancéreuxetp53est considérécommeunsuppresseurdetumeurmajeur. 2/Pertedecontrôleducyclecellulaireetaugmentationdelaprolifération Laproliférationd’unecellulesaineestfinementréguléepardifférentssignauxextracellulaires quipermettentdecontrôlerlenombredecellulesauseindechaquetissu.Lescellulescancéreuses sontàlafoisaffranchiesdecesmécanismesderégulationetdansunétatd’activationpermanentde leurproliférationcellulaire.Autrementdit,indépendammentdessignauxextérieurs,lesprocessusde croissancecellulaire,réplicationdugénomeetdivisioncellulairesontglobalementactivésdansles cellulescancéreuses,toutenrestantcoordonnésentreeux. Desmutationsdansdesdizainesdegènespeuventêtreàl’originedelanonsensibilitédes cellulescancéreusesauxsignauxextérieursdecontrôledelaprolifération(HanahanandWeinberg, 2000).Eneffet,cessignauxactiventdifférentesvoiesdesignalisationetchacuned’entreellepeutêtre interrompueparlasuppressiond’undesesintermédiairesprotéiques.Ledétaildesdifférentesvoies designalisationetdesintermédiairespourlesquelsdesmutationsontétéobservéesneserapasrepris ici.
