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Texte intégral

(1)ROBO4 dans les cellules métastatiques du cancer du sein : identification et caractérisation fonctionnelle d’isoformes protéiques François Le Pape. To cite this version: François Le Pape. ROBO4 dans les cellules métastatiques du cancer du sein : identification et caractérisation fonctionnelle d’isoformes protéiques. Cancer. Université de Lyon, 2017. Français. �NNT : 2017LYSE1269�. �tel-01823832�. HAL Id: tel-01823832 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01823832 Submitted on 26 Jun 2018. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) N°d’ordre NNT : 2017LYSE1269. THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON Opérée au sein de. L’Université Claude Bernard Lyon 1 Ecole Doctorale ED 340 BIOLOGIE MOLECULAIRE INTEGRATIVE ET CELLULAIRE Spécialité de doctorat : Sciences de la vie Discipline : Cancérologie. Soutenue publiquement le 5 décembre 2017, par :. François LE PAPE. ROBO4 dans les cellules métastatiques du cancer du sein : Identification et caractérisation fonctionnelle d’isoformes protéiques Directrice de thèse : Dr. DIAZ Chantal Devant le jury composé du : Pr. VALCOURT Ulrich. Université Claude Bernard Lyon1. Président du jury. Dr. BLIN Claudine. Université de Nice Sophia Antipolis. Rapporteur. Pr. HEYMANN Dominique. Université de Nantes. Rapporteur. Pr. BERNET Agnès. Université Claude Bernard Lyon 1. Examinatrice. Dr. CLEZARDIN Philippe. Université Claude Bernard Lyon 1. Directeur de l’UMR 1033.

(3) UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 Président de l’Université. M. le Professeur Frédéric FLEURY. Président du Conseil Académique. M. le Professeur Hamda BEN HADID. Vice-président du Conseil d’Administration. M. le Professeur Didier REVEL. Vice-président du Conseil Formation et Vie Universitaire. M. le Professeur Philippe CHEVALIER. Vice-président de la Commission Recherche. M. Fabrice VALLÉE. Directrice Générale des Services. Mme Dominique MARCHAND. COMPOSANTES SANTE Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard. Directeur : M. le Professeur G.RODE. Faculté de Médecine et de Maïeutique Lyon Sud – Charles Mérieux. Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS. Faculté d’Odontologie. Directeur : Mme la Professeure C. VINCIGUERRA. Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques. Directeur : M. X. PERROT. Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine. Directeur : Mme la Professeure A-M. SCHOTT. COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE Faculté des Sciences et Technologies. Directeur : M. F. DE MARCHI. Département Biologie. Directeur : M. le Professeur F. THEVENARD. Département Chimie Biochimie. Directeur : Mme C. FELIX. Département GEP. Directeur : M. Hassan HAMMOURI. Département Informatique. Directeur : M. le Professeur S. AKKOUCHE. Département Mathématiques. Directeur : M. le Professeur G. TOMANOV. Département Mécanique. Directeur : M. le Professeur H. BEN HADID. Département Physique. Directeur : M. le Professeur J-C PLENET. UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives. Directeur : M. Y.VANPOULLE. Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon. Directeur : M. B. GUIDERDONI. Polytech Lyon. Directeur : M. le Professeur E.PERRIN. Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique. Directeur : M. G. PIGNAULT. Institut Universitaire de Technologie de Lyon 1. Directeur : M. le Professeur C. VITON. Ecole Supérieure du Professorat et de l’Education. Directeur : M. le Professeur A. MOUGNIOTTE. Institut de Science Financière et d'Assurances. Directeur : M. N. LEBOISNE. . . .

(4) Remerciements Mes premiers remerciements s’adresse à ma directrice de thèse, le Dr. DIAZ Chantal. Merci pour la confiance que tu m’as accordée. Tes conseils et ton optimisme sans faille m’ont permis de gérer au mieux cette thèse. Je remercie également le Dr. CLEZARDIN Philippe pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser cette thèse sous les meilleures conditions. J’adresse mes sincères remerciements au Dr. BLIN Claudine ainsi qu’au Pr. HEYMANN Dominique pour avoir accepté de consacrer un temps précieux à la lecture de mon manuscrit ainsi que pour leurs critiques constructives à son sujet. Je remercie également le Pr. BERNET Agnès pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse ainsi qu’au Pr. VALCOURT Ulrich, pour avoir accepté de présider mon jury ainsi que pour ses nombreux conseils lors de mes comités de suivi de thèse. Mes remerciements s’adressent également au Pr. MALAVAL Luc pour l’intérêt et les conseils prodigués durant le suivi de mon travail. Je tiens à remercier Lise Clément-demange avec qui j’ai partagé ce projet et maintenant une amitié. Merci pour ta patience, ta pédagogie et ton soutien. Tu as incontestablement participé à mon évolution scientifique dans le laboratoire. Je remercie ma stagiaire maladroite Margaux Bernard qui va reprendre le flambeau ! Elle a tout cassé dans le labo, sauf mon moral… merci pour ton soutien. Je tiens également à remercier Martine Croset, tu as été un pilier pour moi dans ce laboratoire tant humainement que scientifiquement. Je n’oublierai jamais toute l’aide que tu as pu m’apporter. Je remercie Geoffrey Vargas de m’avoir supporté moi et mon mauvais caractère aussi longtemps (6ans), soutenu et encouragé dans les moments difficiles (surtout sur la fin de la rédaction de thèse) et d’avoir partagé les hauts et les bas du quotidien, ses blagues et sa bonne humeur. Je remercie toutes les personnes de l’unité U1033 avec qui j’ai partagé ces quelques années. Christine pour ta gentillesse et ton efficacité….et pour le nombre incalculable de café que tu as pu préparer. Lamia et Sandra pour votre bonne humeur, votre. . .

(5) disponibilité et votre soutien. Sofia pour les nombreux conseils et les moments partagés mais aussi Paola, Sacha et Léa pour nos nombreuses discussions. Je remercie Edith, Caroline, Irma et Olivier pour leur aide et conseils et je n’oublie pas l’ensemble du 6ème étage qui a largement participé à l’ambiance du laboratoire. Je tiens à remercier la Team de l’hôpital notamment Evelyne, merci pour ton aide ton soutien et ton expertise en gel deux dimensions, Marjorie, Olivier et jean Charles qui ont su partager leur bonne humeur. Je remercie également les deux rhumatologues qui ont fait un séjour dans l’unité. Merci Elodie pour toutes ces discussions, conseils et soutien à une époque où je faisais encore du sport… Merci Marie-Eva pour ton amitié, ta disponibilité et tous ces footings que nous avons partagés. Je remercie également les personnes avec qui j’ai partagé mes débuts dans le laboratoire, Sophie et Raphael le couple du laboratoire mariés et parents, Manon qui en terme de blague n’était pas en reste mais également Johnny, Mathilde, Casina, Debashish, Marie-Claude et de manière générale toutes les personnes de l’unité avec qui j’ai pu échanger et discuter. Je remercie également mes amis, sans qui ces trois années n’auraient pas été les mêmes. Margaux, Florian, Sarah, Christophe et Marlène…Merci pour tous les moments que nous avons partagés et que nous partagerons encore autour d’un bon repas (avec la petite Adèle)….sur des pistes de ski, ou dans un bar…et « peut être » un jour chez moi. Guillaume et Jeremy, merci pour votre soutien, votre aide ainsi que pour ces nombreuses soirées où vous m’avez grassement nourri même quand j’arrivais les mains vides. Camille, c’est avec toi que j’ai commencé cette aventure à l’université et même si tu es loin nous l’avons terminée ensemble….merci pour ton soutien….ta bonne humeur et tes blagues dont je ne me lasserai jamais. Manon, merci pour ton soutien et tous ces moments que nous avons partagés….depuis le lycée.. . .

(6) Anthony, merci d’avoir toujours été présent, pour nos discussions et pour tous les moments que nous avons partagés depuis que nous sommes gamins… A mes parents qui m’ont poussé à passer le bac… merci pour vos sacrifices, à mes frères et sœurs (ils sont nombreux) pour votre soutien constant. A ma tante Mireille et ma petite filleule Céléna, merci d’avoir toujours cru en moi, pour votre soutien et pour les nombres incalculables de « bonnes bouffes » que nous avons partagées ensemble. Vous êtes des piliers dans ma vie, je ne vous remercierais jamais assez pour ça. A ma tante Annie, mon cousin, ma cousine merci pour votre constance, votre bienveillance et votre soutien indéfectible. A ma Grand-mère, cette thèse je te la dois. Merci d’avoir été là au moment où j’en avais le plus besoin, de m’avoir soutenu, guidé et d’avoir toujours cru en moi… tu as amorcé la vie que je mène actuellement et je t’en serai éternellement reconnaissant.. Pour finir, je remercie toutes les personnes que j’ai croisées qui m’ont aidé personnellement. ou. professionnellement. malencontreusement, oublier de citer.. . . à. avancer. et. que. j’ai. pu,.

(7) Résumé ROBO4 dans les cellules métastatiques du cancer du sein : Identification et caractérisation fonctionnelle d’isoformes protéiques Les métastases osseuses sont des complications fréquentes de nombreux cancers tels que le cancer du poumon, de la prostate et du sein. Chez la femme, 70% des patientes présentant un cancer du sein avancé développent des métastases qualifiées d’ostéolytiques. Le développement de ce type de métastases entraine la destruction massive de l’os causant chez les patientes des fractures pathologiques. Les traitements actuellement dispensés en clinique tels que les bisphosphonates et le dénosumab (anti-RANKL) ne sont pas curatifs mais seulement palliatifs. Pour cette raison, notre laboratoire s’intéresse particulièrement aux évènements moléculaires et cellulaires précoces aboutissant à l’émergence de métastases osseuses. Les récepteurs Roundabout (ROBO) ont été initialement décrits comme des régulateurs cruciaux de la migration neuronale et vasculaire lors du développement. ROBO4 est le dernier récepteur décrit et diverge des autres récepteurs ROBO, notamment par son expression spécifique et limitée aux cellules endothéliales et hématopoïétiques. Toutefois, lors d’une analyse transcriptomique comparative, le récepteur ROBO4 a été retrouvé surexprimé dans la lignée tumorale ostéotropique MDA-B02. Les récentes expériences, réalisées par notre équipe, visant à inhiber l’activité du récepteur ROBO4, nous ont permis de considérer ce récepteur comme un médiateur de l’ancrage à l’os des cellules tumorales MDA-B02. En effet, L’utilisation d’un anticorps anti-ROBO4 réduit considérablement l'adhérence des cellules MDA-B02 sur les cellules ostéoblastiques MC3T3-E1 in vitro et l’ancrage à l’os in vivo. La sur-expression de ROBO4 dans le modèle cellulaire de cancer du sein murin 4T1 nous a conduit à mettre en évidence l’existence de deux formes de la protéine ROBO4 possédant des propriétés métastatiques potentiellement antagonistes : (i) une forme glycosylée détectée exclusivement dans les cellules endothéliales et (ii) une forme alternative non glycosylée « agressive » présente en forte quantité dans les cellules tumorales MDA-B02. L’identification de ces variants protéiques du récepteur ROBO4 aux propriétés fonctionnelles et structurales différentes nous a permis d’envisager de nouvelles pistes dans le décryptage des fonctions de ROBO4 dans le processus tumoral et pourrait conduire à la mise au point de thérapies innovantes pour empêcher la formation de métastases dans la moelle osseuse.. . .

(8) Abstract ROBO4 in metastatic breast cancer cells: Identification and functional characterization of protein isoforms Bone metastases are frequent complications of many cancers such as lung, prostate and breast cancer. In women, 70% of patients with advanced breast cancer develop metastases known as osteolytic. The development of this type of metastasis leads to the mass destruction of bone causing pathological fractures in patients. Current clinical treatments such as bisphosphonates and denosumab (anti-RANKL) only slow down the progression of the disease. For this reason, our laboratory is particularly interested in early molecular and cellular events leading to the emergence of bone metastases. Roundabout receptors (ROBO) were initially described as crucial regulators of neuronal and vascular migration during development. ROBO4 is the last receptor described and diverges from other ROBO receptors, in particular by its specific expression limited to endothelial and hematopoietic cells. However, in a comparative transcriptomic analysis, the ROBO4 receptor was found to be overexpressed in the MDA-B02 osteotropic tumor cell line. Recent experiments carried out by our team, aiming at inhibiting the activity of the ROBO4 receptor, allowed us to consider the ROBO4 receptor as a mediator of MDA-B02 tumor cells anchorage to the bone. Indeed, the use of an anti-ROBO4 antibody considerably reduces the adhesion of the MDA-B02 cells to the MC3T3-E1 osteoblastic cells in vitro and the anchoring to the bone in vivo. The overexpression of ROBO4 in the 4T1 murine breast cancer cell model led us to highlight the existence of two forms of ROBO4 protein with potentially antagonistic metastatic properties: (i) a glycosylated form detected exclusively in endothelial cells and (ii) an "aggressive" nonglycosylated alternative form present in large amounts in MDA-B02 tumor cells. The identification of these protein variants of the ROBO4 receptor with different functional and structural properties has allowed us to consider new oportunities of decrypting the functions of ROBO4 in the tumor process and could lead to the development of innovative therapies to prevent formation of metastases in the bone marrow. . .

(9) Sommaire Remerciements ......................................................................................................................... 3 Résumé ...................................................................................................................................... 6 Abstract ..................................................................................................................................... 7 Sommaire .................................................................................................................................. 8 Liste des tableaux .................................................................................................................. 12 Liste des illustrations ............................................................................................................ 13 Liste des abréviations............................................................................................................ 15. A. Préface .......................................................................................................................... 18 B. Etat de l’art................................................................................................................. 22 I. Biologie du tissu osseux .......................................................................................... 23 1.. GENERALITES ........................................................................................................... 23. 2.. ARCHITECTURE MACROSCOPIQUE .................................................................. 23. 3.. ARCHITECTURE MICROSCOPIQUE .................................................................... 24. 4.. 3.1.. Composantes organiques ................................................................................... 24. 3.2.. Composantes minérales...................................................................................... 24. COMPOSITION CELLULAIRE DU TISSU OSSEUX ............................................ 25 4.1.. 4.1.1.. Différenciation des ostéoclastes ................................................................. 25. 4.1.2.. Dégradation de la matrice osseuse ............................................................ 26. 4.2.. 6.. . Les ostéoblastes.................................................................................................... 27. 4.2.1.. Différenciation des ostéoblastes ................................................................. 27. 4.2.2.. Production de la matrice osseuse ............................................................... 29. 4.3. 5.. Les ostéoclastes .................................................................................................... 25. Les ostéocytes....................................................................................................... 30. NICHES HEMATOPOÏETIQUES ............................................................................ 30 5.1.. Les cellules souches hématopoïétiques ............................................................ 30. 5.2.. Concept de «niche hématopoïétique» .............................................................. 32. 5.3.. Niche endostéale ................................................................................................. 33. 5.4.. Niche vasculaire et périvasculaire .................................................................... 34. MECANISME DU REMODELAGE OSSEUX ........................................................ 35.

(10) 6.1.. Processus général ................................................................................................ 35. 6.2.. Régulation du remodelage osseux .................................................................... 36. 6.2.1.. Facteurs systémiques ................................................................................... 37. 6.2.2.. Facteurs locaux ............................................................................................. 38. 6.2.3.. Système RANK/RANKL/OPG ................................................................. 39. 6.2.4.. Régulation médiée par des molécules de guidage axonal ..................... 39. II. Métastases osseuses du cancer du sein ........................................................... 40 1.. CANCER DU SEIN .................................................................................................... 40. 2.. PROCESSUS METASTATIQUE ............................................................................... 41. 3.. 4.. 5.. 2.1.. Transition épithélio-mésenchymateuse et invasion locale (EMT) ............... 42. 2.2.. Intravasation : Cellules tumorales circulantes (CTCs) ................................... 43. 2.3.. Extravasation et invasion : Cellules tumorales disséminées (DTCs) ........... 44. DISSEMINATION METASTATIQUE OSSEUSE................................................... 45 3.1.. Niche pré-métastatique ...................................................................................... 46. 3.2.. Migration des cellules tumorales vers le tissu osseux ................................... 47. 3.3.. Nidation des cellules tumorales dans la moelle osseuse ............................... 48. 3.4.. ostéomimétisme et dormance ............................................................................ 49. FORMATION DES METASTASES OSTEOLYTIQUES ........................................ 51 4.1.. Activation de la résorption osseuse .................................................................. 53. 4.2.. Inhibition de la formation osseuse .................................................................... 55. 4.3.. Contribution du tissu osseux ............................................................................. 56. TRAITEMENTS DES METASTASES OSSEUSES .................................................. 58 5.1.. Thérapies actuelles .............................................................................................. 58. 5.2.. Thérapies émergentes ......................................................................................... 59. 5.2.1.. Traitement ciblant les ostéoclastes ............................................................. 59. 5.2.2.. Traitement ciblant les ostéoblastes ............................................................ 60. 5.2.3.. Traitement ciblant l’environnement osseux ............................................. 61. III. Les récepteurs de guidage axonal Roundabout ........................................ 62 1.. LES RECEPTEURS ROBO ET LES LIGANDS SLIT .............................................. 64 1.1.. Structure ............................................................................................................... 64. 1.2.. Interaction ligand/récepteur ............................................................................. 65. 1.2.1. . Liaison SLIT/ROBO ..................................................................................... 65.

(11) 2.. 1.2.2.. Dimérisation des récepteurs ROBO ........................................................... 66. 1.2.3.. Cas particulier du récepteur ROBO4 ......................................................... 66. REGULATION DES PROTEINES ROBO ET SLIT ................................................ 67 2.1.. 2.1.1.. Méthylation des promoteurs ...................................................................... 67. 2.1.2.. Régulation par les miRNA .......................................................................... 68. 2.2.. Régions promotrices .................................................................................... 69. 2.2.2.. Epissage alternatif ........................................................................................ 70. Modification post-traductionnelle .................................................................... 71. 2.3.1.. Clivage ........................................................................................................... 71. 2.3.2.. Glycosylation ................................................................................................ 73. 2.3.3.. Déubiquitinylation par USP33 ................................................................... 73. FONCTION ET SIGNALISATION DES RECEPTEURS ROBO .......................... 74 3.1.. Contrôle de la migration axonale ...................................................................... 74. 3.2.. Contrôle de la migration vasculaire ................................................................. 76. 3.2.1.. Migration des cellules endothéliales ......................................................... 77. 3.2.2.. Inhibition de l’angiogenèse et stabilisation de la vasculature ............... 77. 3.3. 4.. Régulation transcriptionnelle ............................................................................ 69. 2.2.1. 2.3.. 3.. Régulation épigénétique..................................................................................... 67. Physiologie des cellules souches hématopoïétiques ...................................... 79. LES RECEPTEURS ROBO DANS LA PROGRESSION TUMORALE ................ 80 4.1.. Dérégulation génétique ...................................................................................... 80. 4.2.. Implication dans la tumorigenèse et la formation de métastases ................ 81. 4.2.1.. Prolifération et survie des cellules tumorales .......................................... 81. 4.2.2.. Transition épithélio-mésenchymateuse .................................................... 82. 4.2.3.. Migration et chimiotactisme ....................................................................... 84. 4.2.4.. Angiogenèse tumorale ................................................................................. 85. C. Travail expérimental .......................................................................................... 88 I. Introduction et hypothèse de travail ................................................................. 89 II. Matériels et méthodes ............................................................................................. 93. . 1.. BIOLOGIE MOLECULAIRE ..................................................................................... 93. 2.. BIOLOGIE CELLULAIRE ......................................................................................... 97. .

(12) 3.. EXPERIMENTATION ANIMALE ......................................................................... 100. III. Résultats .................................................................................................................... 101 1.. SUR-EXPRESSION DU GENE ROBO4 HUMAIN DANS LE MODELE MURIN. DE METASTASES OSSEUSES 4T1 ............................................................................... 101 1.1.. Construction des outils ..................................................................................... 101. 1.2.. La sur-expression de ROBO4 dans les lignées murines de carcinome. mammaire aboutit à l’accumulation d’une forme protéique de masse moléculaire élevée ............................................................................................................................. 102 1.3.. Le récepteur ROBO4 est une protéine glycosylée ........................................ 104. 1.4.. Détection des formes protéiques glycosylée et non glycosylée de ROBO4. dans les cellules endothéliales, hématopoïétiques et tumorales .......................... 106 1.5.. La forme protéique glycosylée de ROBO4 réduit la migration et l’invasion. des cellules 4T1 mais n’affecte pas leur propriétés tumorales in vivo ................. 108 2.. STRATEGIE DE MUTAGENESE DIRIGEE POUR OBTENIR LA FORME NON. GLYCOSYLEE DU RECEPTEUR ROBO4 DANS LES CELLULES TUMORALES 111 2.1.. Construction des outils ..................................................................................... 112. 2.2.. La Mutagenèse dirigée des sites de glycosylation du récepteur ROBO4. n’aboutit pas à la synthèse d’une forme équivalente à celle détectée dans les cellules MDA-B02 ........................................................................................................ 113 2.3.. La protéine endogène détectée par l’anticorps Ac1 dans les cellules. tumorales est le produit du gène ROBO4 ................................................................ 116 3.. IDENTIFICATION DES TRANSCRITS DES CELLULES HUVEC ET MDA-B02 .................................................................................................................................... 117 3.1.. Mise en évidence de transcrits alternatifs du récepteur ROBO4 ................ 119. 3.2.. Les transcrits alternatifs de ROBO4 sont produits par les cellules. endothéliales HUVEC et les cellules ostéotropique MDA-B02 ............................ 121 3.3.. La protéine ROBO4 endogène détectée dans les cellules tumorales est une. forme plus légère et non glycosylée ......................................................................... 123. IV. Discussion et perspectives ................................................................................ 126 Publications et communications scientifiques ................................................................ 137 Références bibliographiques .............................................................................................. 138. . .

(13) Liste des tableaux TABLEAU 1. STATUT HORMONAL ET FREQUENCE DES SITES METASTATIQUES CHEZ LES PATIENTES AVEC UN CANCER DU SEIN INVASIF. ................................... 40 TABLEAU 2. LISTE DES COUPLES D’AMORCES UTILISES POUR LES EXPERIENCES DE RTQPCR ....................................................................................................................................... 93 TABLEAU 3. LISTE DES COUPLES D'AMORCES UTILISES POUR LES EXPERIENCES DE MUTAGENESE DIRIGEE. ......................................................................................................... 95 TABLEAU 4. LISTE DES COUPLES D'AMORCES UTILISES POUR LES EXPERIENCES DE CLONAGE MOLECULAIRE .................................................................................................... 97 TABLEAU 5. LISTE DES LIGNEES CELLULAIRES CULTIVEES .............................................. 98. . .

(14) Liste des illustrations FIGURE 1. STRUCTURE D'UN OS LONG. ...................................................................... 23 FIGURE 2. OSTEOCLASTOGENESE ................................................................................ 26 FIGURE 3. RESORPTION DE LA MATRICE OSSEUSE. ............................................... 27 FIGURE 4. OSTEOBLASTOGENESE................................................................................. 28 FIGURE 5. MINERALISATION OSSEUSE. ...................................................................... 30 FIGURE 6. ROLE DES RECEPTEURS ROBO4 ET CXCR4 DANS L'ANCRAGE DES CELLULES SOUCHES HEMATOPOÏETIQUES. ..................................................... 32 FIGURE 7. NICHES HEMATOPOÏETIQUES. .................................................................. 33 FIGURE 8. LES ETAPES DU REMODELAGE OSSEUX. ................................................ 36 FIGURE 9. REGULATION DU REMODELAGE OSSEUX. ............................................ 38 FIGURE 10. PRINCIPALES ETAPES DE LA CASCADE METASTATIQUE DU CANCER DU SEIN. ...................................................................................................... 42 FIGURE 11. LES ETAPES DE LA COLONISATION OSSEUSE PAR LES CELLULES TUMORALES. ................................................................................................................ 51 FIGURE 12. VISUALISATION DE L'OS EN CONDITIONS PHYSIOLOGIQUES ET METASTATIQUES EN RADIOGRAPHIE ET EN HISTOLOGIE. ......................... 52 FIGURE 13. CERCLE VICIEUX DES METASTASES OSSEUSES OSTEOLYTIQUES.53 FIGURE 14. ROLE DE LA TRIADE RANK/RANKL/OPG DANS LA FORMATION DES METASTASES OSSEUSES. .................................................................................. 54 FIGURE 15. LES ETAPES ET MOLECULES CLES DU PROCESSUS DES METASTASES OSSEUSES ........................................................................................... 57 FIGURE 16. LES RECEPTEURS DE GUIDAGE AXONAL. ........................................... 63 FIGURE 17. PHENOTYPE DES AXONES COMMISSURAUX CHEZ LA DROSOPHILE SAUVAGE OU MUTEE POUR LES GENES ROBO ET SLIT. ..... 63 FIGURE 18. STRUCTURE DES PROTEINES SLIT ET ROBO. ....................................... 65 FIGURE 19. REGULATION DES PROTEINES ROBO PAR LE MIRNA-218. ............. 68 FIGURE 20. SEQUENCE PROMOTRICE DU GENE ROBO4. ....................................... 70 FIGURE 21. CLIVAGE DE ROBO1. ................................................................................... 72 FIGURE 22. REGULATION DE LA MIGRATION CELLULAIRE PAR LA VOIE DE SIGNALISATION SLIT/ROBO................................................................................... 75 FIGURE 23.REGULATION PAR LE RECEPTEUR ROBO4 DE LA MIGRATION VASCULAIRE INDUITE PAR LA VOIE DU VEGF. ............................................... 79 FIGURE 24. ROLE DE LA VOIE SLIT/ROBO DANS LA TRANSITION EPITHELIOMESENCHYMATEUSE................................................................................................ 83 FIGURE 25. INHIBITION DE L'ANGIOGENESE TUMORALE PAR LA VOIE SLIT2/ROBO4. ............................................................................................................... 87 FIGURE 26. ROLE DU RECEPTEUR ROBO4 DANS LES ETAPES PRECOCES DE LA FORMATION DES METASTASES OSSEUSES. ....................................................... 92 FIGURE 27. VECTEUR D'EXPRESSION RETROVIRAL PLPCX-HROBO4. ............. 102 . .

(15) FIGURE 28. ANALYSE DE L'ACCUMULATION DES TRANSCRITS ET DETECTION DE LA PROTEINE ROBO4 DANS LES LIGNEES MURINES DE CANCER DU SEIN TRANSDUITES. ....................................................................... 104 FIGURE 29. CARACTERISATION DE LA GLYCOSYLATION DU RECEPTEUR ROBO4........................................................................................................................... 105 FIGURE 30. DETECTION DES FORMES GLYCOSYLEE ET NON GLYCOSYLEE DANS LES CELLULES ENDOTHELIALES, LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOÏETIQUES ET LES CELLULES TUMORALES DE CARCINOMES MAMMAIRES HUMAIN. .......................................................................................... 107 FIGURE 31. EFFET DE LA FORME GLYCOSYLEE DU RECEPTEUR ROBO4 SUR LA MIGRATION ET L'INVASION DES CELLULES CANCEREUSES 4T1...... 108 FIGURE 32. EFFET DE LA FORME PROTEIQUE GLYCOSYLEE DU RECEPTEUR ROBO4 SUR LA CROISSANCE ORTHOTOPIQUE ET SUR LA FORMATION DES METASTASES PULMONAIRES ET OSSEUSES DES CELLULES TUMORALES 4T1. ...................................................................................................... 110 FIGURE 33. LES SITES PUTATIFS DE N-GLYCOSYLATION DU RECEPTEUR ROBO4........................................................................................................................... 111 FIGURE 34. VECTEUR D'EXPRESSION PLPCX-HROBO4 DEPOURVU DES SITES DE GLYCOSYLATION. .............................................................................................. 112 FIGURE 35. ANALYSE DE LA SYNTHESE DE LA PROTEINE ROBO4 MUTEE POUR SES QUATRE SITES DE GLYCOSYLATION DANS LES CELLULES HUMAINES HELA. ................................................................................................... 114 FIGURE 36. CO-TRAITEMENT PAR LA TUNICAMYCINE ET PAR DES INHIBITEURS DU PROTEASOME DES CELLULES TUMORALES MDA-MB231 SUR-EXPRIMANT ROBO4. ................................................................................ 115 FIGURE 37. INVALIDATION GENETIQUE DU GENE ROBO4 PAR CRISPR/CAS9. ........................................................................................................................................ 116 FIGURE 38. PRINCIPE DE LA 5' RACE PCR. ................................................................ 118 FIGURE 39. IDENTIFICATION DES EXTREMITES 5' DES ARN MESSAGERS DE ROBO4 PROVENANT DES CELLULES ENDOTHELIALES ET DES CELLULES TUMORALES OSTEOTROPIQUES MDA-B02 ....................................................... 119 FIGURE 40. IDENTIFICATION DES PARTIES N-TERMINALE DES DIFFERENTS VARIANTS PROTEIQUES DE ROBO4 .................................................................... 120 FIGURE 41. DETECTION DES TRANSCRITS ALTERNATIFS DE ROBO4 PAR RTQPCR ............................................................................................................................. 122 FIGURE 42. FORMES PROTEIQUES PRODUITES PAR LES TRANSCRITS ALTERNATIFS DE ROBO4. ...................................................................................... 125. . .

(16) Liste des abréviations 3’UTR : 3’ Untranslated region 5’UTR : 5’ Untranslated region. A Abl : Abelson ADAMTS1 : ADAM Metallopeptidase with Thrombospondin Type 1 Motif Akt : Protein Kinase B ALP : Alkalin Phosphatase ARF6 : ADP-Ribosylation Factor 6. B BCL-2 : B-Cell Lymphoma 2 BCL-XL : B-Cell Lymphoma Extra Large BMP : Bone Morphogenetic Protein BMU : Basic Multicellular Units BRC : Bone Remodeling Compartment. C CAR : CXCL12-abundant reticular CASR : Calcium Sensing Receptor CC : Cytoplasmic Conserved CCL2 : C-C Motif Ligand 2 CDC42 : Cell Division Control Protein 42 Homolog CSF1R : Colony Stimulating Factor 1 Receptor CSH : Cellule Souche Hématopoïétique CSM : Cellule Souche Mésenchymateuse CTC : Cellule Tumorale Circulante CTGF : Connective Tissue Growth Factor CTR : Calcitonine Receptor CXCL12 : CXC-type Chemokine Ligand 12 CXCR4 : CXC-type Receptor 4. D DCC : Deleted In Colorectal Cancer DKK-1 : Dickkopf-1 DTC : Cellule Tumorale Disséminée. E EMT : Ephitelial to Mesenchymal Transition ER : Estrogen Receptor ETS : E26 Transformation-Specific. . .

(17) F FAK : Focal Adhesion Kinase FGF-23 : Fibroblast Growth Factor 23 Fra-1 : Fos Related Antigen 1. G GAPB : GA-Binding Protein GAS6 : Growth Arrest-Specific 6 G-CSF : Granulocyte Colony Stimulating Factor GDP : Guanosine Diphosphate GEF-Sos : Guanosine exchange factor Son-Of-Sevenless GTP : Guanosine Triphosphate. H HCAEC : Human Coronary Artery Endothelial Cell HCASmC : Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells HEK-293 : Human Embryonic Kidney HeLa : Henrietta Lacks HER2 : Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 HPMEC : Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell HUAEC : Human Umbilical Artery Endothelial Cell HUVEC : Human Umbilical vein Endothelial Cell. I IGF : Insuline-like Growth Factor IL : Interleukine. K kDa : Kilo-Dalton KI : Knock-In KO : Knock-Out. L LOX : Lysyl oxydase LPA : Lysophosphatidic Acid. M M-CSF : Monocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor MENA : Mammalian Enabled MET : Mesenchymal to Ephitelial Transition MMP : Matrix Metalloprotease Myo9B : Myosin IXB. . .

(18) N NG2 : Neural-Glial antigen 2 NHDF : Normal Human Dermal Fibroblasts. O OPG : Ostéoprotégérine OPN : Ostéopontine OSX : Osterix. P PAK : P21-Activated Protein Kinase PDGF : Platelet Derived Growth Factor PHOSPHO1 : Phosphate, Orphan 1 Pi : Phosphate Inorganique PIGF : Placental Growth Factor PR : Progesterone Receptor PRRx1 : Paired-Related Homeobox 1 PDTC : Ammonium Pyrrolidinedithiocarbamate PTH : Parathyroid Hormone PTHrP : Parathyroid Hormone-Related Protein. R RAC1 : Ras-related C3 Botulinum Toxin Substrate 1 RACE : Rapid Amplification of cDNA Ends RANK : Receptor Activator of NFκB RANKL : Receptor Activator of NFκB Ligand ROBO : Roundabout RUNX2 : Runt-Related Transcription Factor 2. S SCF : Stem Cell Factor SOST : Sclerostin SRGAP : SLIT-ROBO Rho GTPase Activating Protein. T TGF-β : Transforming Growth Factor β TNF-α : Tumor Necrosis Factor α TRAP : Tartrate-Resistant Acid Phosphatase TSP1 : Thrombospondine 1 UNC : Un-Coordinated VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR2 : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 WASP : Wiskott-Aldrich Syndrome Protein ZEB 1 : Zinc-finger E-box-Binding 1 ZO-1 : Zona Occludin 1 . . .

(19) . A. Préface . . .

(20) Dans les pays économiquement développés, le cancer est la première cause de mortalité chez l'homme et la seconde chez la femme après les maladies cardiovasculaires. En France métropolitaine, 385 000 nouveaux cas de cancers ont été estimés en 2015. Parmi eux, les cancers de la prostate chez l’homme et du sein chez la femme sont ceux les plus fréquemment diagnostiqués. Plusieurs thérapies ciblées sont aujourd'hui utilisées pour lutter contre le cancer du sein. Néanmoins, la majeure partie des décès dus aux tumeurs malignes solides est la conséquence de l’apparition et de la croissance de métastases pour lesquelles les traitements proposés sont beaucoup moins efficaces. C’est pour cette raison que la compréhension des étapes biologiques, menant les cellules d’une tumeur primitive à une localisation secondaire, est un des enjeux majeurs en cancérologie. Le tissu osseux est l’un des organes les plus souvent ciblés par les cellules métastatiques du cancer du sein, mais aussi du poumon et de la prostate. La survenue des métastases osseuses est à l’origine de troubles squelettiques, tels que des fractures pathologiques et des compressions médullaires, qui grèvent le pronostic vital des patientes. Avec 50 000 à 70 000 personnes concernées par an en France, les métastases osseuses constituent un véritable problème de santé publique. Le tissu osseux est un microenvironnement dynamique et complexe. La présence de cellules spécialisées permet le remodelage de l’os à travers sa dégradation. (ostéoclastes). et. sa. formation. (ostéoblastes).. Un. équilibre. physiologique finement régulé existe entre les processus de résorption et de formation. Ainsi, le dérèglement de l’une de ces deux activités conduit à des anomalies osseuses telles que l’ostéoporose (perte de masse osseuse) ou l’ostéopétrose (gain de masse osseuse). Les cellules tumorales de cancer du sein qui métastasent à l’os modulent le microenvironnement osseux via la sécrétion de facteurs initialement impliqués dans la régulation du remodelage osseux. Dans le cas des métastases ostéolytiques, les facteurs produits par les cellules tumorales stimulent l’activité des ostéoclastes et inhibent celle des ostéoblastes aboutissant à la destruction massive de la matrice osseuse. Ce constat moléculaire a permis l’élaboration de thérapies visant à limiter l’activité des. . .

(21) ostéoclastes par traitement des patientes avec des bisphosphonates ou du dénosumab. Toutefois, ces traitements sont uniquement donnés à visée palliative et n’améliorent pas la survie des patientes. C’est pourquoi il est nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de ces lésions osseuses afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, une analyse transcriptomique différentielle des cellules de cancer du sein de la lignée MDA-MB-231 et de la lignée MDA-B02 (dérivée des cellules MDA-MB-231 et métastasant spécifiquement vers l’os) a été entreprise au laboratoire. afin. d’identifier. les. déterminants. moléculaires. impliqués. dans. l’ostéotropisme des cellules de cette lignée. Cette étude a révélé une sur-expression du gène codant le récepteur de guidage axonal ROBO4 dans les cellules MDA-B02. Ce récepteur est un facteur important de la migration vasculaire développementale et pathologique. De plus, dans l’environnement osseux, ROBO4 est spécifiquement exprimé par les cellules souches hématopoïétiques et participe à leur tropisme et leur ancrage dans les niches osseuses. Cette fonction de ROBO4 est particulièrement intéressante car il a été démontré que les cellules tumorales s’établissent dans la moelle osseuse via des mécanismes moléculaires similaires à ceux employés par les cellules souches hématopoïétiques. Ainsi notre hypothèse majeure est que ROBO4, lorsqu’il est produit par les cellules tumorales, permettrait la colonisation et l’ancrage sur le site osseux. Les expériences précédentes réalisées au laboratoire vont dans ce sens puisqu’ils montrent que ROBO4 est un médiateur important dans l’ancrage des cellules tumorales dans l’environnement osseux. En effet, dans le modèle ostéotropique MDA-B02, l’inhibition de la synthèse du récepteur ROBO4 par génétique inverse ou bien son inactivation par l’utilisation d’un anticorps ne permet plus la colonisation du microenvironnement osseux par les cellules métastatiques. Mon projet de thèse se place dans la continuité des travaux réalisés au laboratoire et a pour objectif initial d’étudier plus précisément le rôle du récepteur ROBO4 dans les différentes étapes de la formation des métastases osseuses, c’est-àdire de la migration ciblée des cellules tumorales vers l’os jusqu'à leur développement dans l’environnement osseux. En effet, les mécanismes permettant aux cellules tumorales d’envahir la moelle osseuse ne sont pas complétement. . .

(22) élucidés et demeurent un enjeu majeur dans le contexte physiopathologique des métastases osseuses. Pour répondre à cette question, une stratégie de sur-expression à été développée afin d’identifier si un niveau élevé de ROBO4 humain dans des cellules de carcinomes mammaires pouvait moduler i) Les capacités migratoires et invasives de ces cellules in vitro ii) La capacité des cellules tumorales à croître dans la glande mammaire, s’échapper de la tumeur primaire et coloniser l’os dans un modèle murin in vivo. Pour vérifier ce dernier aspect, la lignée syngénique 4T1 a été choisie notamment parce qu’elle récapitule, une fois injectée dans la glande mammaire, l’ensemble des étapes du processus métastatique du cancer du sein. De manière inattendue, lors de la sur-expression du récepteur ROBO4, une forme glycosylée du récepteur, qui ne correspond pas à la forme synthétisée pas les cellules tumorales, a été produite. A partir de ce résultat, l’objectif fut double : i) Caractériser fonctionnellement la forme glycosylée du récepteur ROBO4 ii) Identifier l’origine de la forme endogène produite par les cellules tumorales afin de la produire dans notre modèle. Pour étudier ce dernier point, des approches de mutagenèse dirigée des sites de glycosylation ainsi que des expériences de RACE PCR permettant d’identifier les régions non-traduites des messagers ont été effectuées. Après avoir replacé ce travail dans son contexte bibliographique en présentant l’état des connaissances actuelles sur la biologie de l’os, les métastases osseuses et les récepteurs de guidage axonal Roundabout, les objectifs du travail de thèse, les résultats obtenus et les perspectives qui en découlent seront présentés. . . .

(23) . B. Etat de l’art . . .

(24) I. Biologie du tissu osseux 1. GENERALITES L’os est un tissu conjonctif minéralisé, décrit comme un organe dynamique et vivant qui assure au sein de l’organisme des fonctions vitales. La plus intuitive est la fonction architecturale car le squelette agit comme une charpente permettant le soutien et la protection des organes et des tissus mous et, associé aux muscles et aux ligaments, il rend possible le mouvement du corps humain. Biologiquement, l’os est une réserve de minéraux comme le calcium et le phosphate mais aussi d’hormones protéiques telles que l’ostéocalcine lui conférant le double rôle d’organe métabolique et endocrine. Enfin, en étant le siège de l’hématopoïèse, il permet la production des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes dans la moelle osseuse. 2. ARCHITECTURE MACROSCOPIQUE. Ephiphyse proximale. Cartilage articulaire Os spongieux. Métaphyse Os compact. Os trabéculaire. Cavité médullaire. Diaphyse Moelle osseuse. Canal de Havers Ostéon. Endoste Périoste. Lamelles concentriques. Métaphyse. Périoste Canal de Volkman. Ephiphyse distale Os trabécu laire. Ostéocytes. Os cort. Figure 1. Structure d'un os long.. . . . ical.

(25) Pour les os longs, on dénombre trois parties externes distinctes. La diaphyse correspond à la partie centrale de l’os. Les épiphyses sont situées aux extrémités distales et proximales des os longs. Enfin, les métaphyses sont des régions intermédiaires situées entre la diaphyse et l’épiphyse [1] (Figure 1). 3. ARCHITECTURE MICROSCOPIQUE Si l’on observe plus précisément la composition osseuse, deux structures prédominent : l’os cortical et l’os trabéculaire. L’os cortical compact représente 80% du squelette et constitue la diaphyse des os longs. Il est composé d’unités de bases appelées ostéons. L’os trabéculaire, représentant 20% du squelette adulte est constitué d’un réseau tridimensionnel de travées osseuses riches en tissus hématopoïétiques et adipeux. Sa résistance est faible, mais l’os trabéculaire représente une surface d’échange considérable jouant un rôle majeur dans la fonction métabolique de l’os [1] (Figure 1). 3.1. Composantes organiques Quel que soit son type, trabéculaire ou cortical, le tissu osseux est constitué d’une matrice protéique représentée presque totalement par le collagène de type I (90%), une glycoprotéine fibreuse et rigide responsable de la résistance de l’os [2]. Les protéines non collagéniques sont quantitativement minoritaires mais assurent des fonctions toutes aussi importantes que le collagène. La majorité des protéines non collagéniques sont d’origine osseuse et sont principalement produites par les ostéoblastes [3]. L’os est également un réservoir important de facteurs de croissance. L’IGF (Insulin-like Growth Factor), le PDGF (Platelet Derived Growth Factor), les BMP (Bone Morphogenetic proteins), le TGF-β (Transforming Growth Factor β) et les interleukines sont les plus représentés [3]. 3.2. Composantes minérales La phase minérale est composée presque dans son intégralité de cristaux d’hydroxyapatite de calcium de formule générale Ca10 (Po4)6(OH) 2, mais également. . .

(26) d’autres éléments en quantité significative comme le magnésium, le sodium ou encore le potassium [2]. 4. COMPOSITION CELLULAIRE DU TISSU OSSEUX L’os contient une grande variété de types cellulaires qui participent à ses fonctions biologiques. Parmi eux, les ostéoclastes qui sont responsables de la dégradation osseuse, les ostéoblastes qui sont responsables de la formation osseuse et les ostéocytes qui participent à la régulation du remodelage osseux. 4.1. Les ostéoclastes Les ostéoclastes sont des cellules géantes multinucléées qui ont la propriété unique de dégrader la matrice osseuse. Ces cellules spécialisées sont la différenciation finale de progéniteurs hématopoïétiques. 4.1.1. Différenciation des ostéoclastes La différenciation des CSH (Cellule Souche Hématopoïétique) en ostéoclastes matures nécessite leur engagement dans le lignage monocyte/macrophage. Il est rendu possible par l’action temporelle de différents facteurs produits par les ostéoblastes et les cellules stromales. Cet engagement est premièrement assuré par le facteur de transcription PU.1 qui permet la sur-expression par les CSH du récepteur au M-CSF (Monocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor) nommé c-fms [4]. La fixation du M-CSF sur son récepteur active l’expression par les précurseurs hématopoïétiques du récepteur RANK (Receptor Activator of NFκB) [5]. Le RANKL (Receptor Activator of NFκB Ligand) produit par l’environnement stromal mais aussi immunitaire (lymphocytes) agit en association avec le M-CSF et permet alors la différenciation des précurseurs monocytaires en ostéoclastes matures [6]. En parallèle, les ostéoblastes synthétisent l’OPG (ostéoprotégérine), un récepteur leurre du RANKL, qui régule finement la résorption osseuse par l’inhibition de l’ostéoclastogenèse [7] (Figure 2).. . .

(27) Précurseurs Hématopoïétiques. Précurseurs Monocytaire. C-FMS RANK. C-FMS Pré-ostéoclaste. PU.1+. C-FMS RANK M-CFS. OPG RANKL Ostéoblaste Ostéoclaste. Matrice osseuse. TRAP Cathepsin K H+ ATPase. Figure 2. Ostéoclastogenèse. Sous l’action du facteur de transcription PU.1, les précurseurs hématopoïétiques expriment le récepteur c-fms. L’action du M-CSF sur son récepteur permet la différentiation des cellules souches hématopoïétiques en précurseurs monocytaires et l’expression du récepteur RANK à leur surface. L’action simultanée du M-CSF et du RANKL produit par les ostéoblastes assure la formation d’ostéoclastes matures multinucléés capables de synthétiser l’enzyme TRAP et la cathepsin K.. 4.1.2. Dégradation de la matrice osseuse Dès lors qu’ils sont actifs, les ostéoclastes migrent en direction de la matrice et fusionnent pour former des cellules multinucléées et polarisées. Un réarrangement du cytosquelette d’actine et l’intervention de protéines membranaires, comme l’intégrine αvβ3, et de la matrice extracellulaire telles que le collagène de type I et l’OPN (Ostéopontine), permettent l’adhérence des ostéoclastes sur la surface osseuse. Cette fixation entraîne la formation d’un compartiment étanche entre la surface de l’os et la membrane basale [8]. La dissolution minérale résulte de l’acidification du milieu par le relargage d’ions hydrogènes tandis que la dégradation de la matrice organique est assurée par des enzymes protéolytiques comme la cathépsine K, le TRAP (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase) et MMP9 (Matrix Metalloprotease) [9], [10]. Leur action simultanée crée une fosse osseuse nommée lacune de Howship. (Figure 3).. . .

(28) Ostéoclaste. Ca2+. Lysosomes Ca2+. H+ Bordure en brosse. Cathépsine K MMP9 TRAP. H+ ATPase Ca2+. H+. Anneau d’actine (zone de scellement). Lacune de Howship. Matrice osseuse. Figure 3. Résorption de la matrice osseuse. Lors de la dégradation osseuse, les ostéoclastes présents sur la surface osseuse sont polarisés et présentent des structures membranaires typiques. Une zone de scellement, composée d’un anneau d’actine associé à des intégrines, va permettre l’adhérence de l’ostéoclaste et l’isolement de la surface à résorber. La bordure en brosse libère des ions H+ et des enzymes protéolytiques qui vont permettre la dégradation minérale et organique de l’os.. 4.2. Les ostéoblastes Les ostéoblastes sont des cellules spécialisées dans la production de la matrice osseuse minéralisée qui participent aussi à la régulation du remodelage osseux. Cette population cellulaire représente 4 à 6 % des cellules résidentes de la moelle osseuse. Les ostéoblastes sont des cellules polarisées, de forme cuboïdale qui se retrouvent principalement le long de la surface osseuse. 4.2.1. Différenciation des ostéoblastes Les ostéoblastes sont issus des CSM (Cellule Souche Mésenchymateuse) qui durant leur différenciation génèrent un panel hétérogène de cellules comprenant les pré-ostéoblastes, les ostéoblastes immatures et les ostéoblastes matures capables de produire de la matrice osseuse. La transition entre ces différents stades est régulée par l’action de deux facteurs de transcription : RUNX2 (Runt-Related Transcription Factor 2) et OSX (Osterix). La délétion homozygote des gènes codant ces deux protéines aboutit à une absence d’ostéoblaste chez la souris [11], [12]. RUNX2 permet. . .

(29) la différenciation des CSM en pré-ostéoblastes au détriment des lignées chondrocytaires et adipocytaires. Il permet également l’expression des gènes de la chaîne α1 du collagène de type I, de l’OPN et de l’ostéocalcine [13]. OSX est exprimé à des stades plus tardifs et agit en aval de RUNX2. OSX permet la différenciation des pré-ostéoblastes en ostéoblastes matures capable de synthétiser du collagène de type I et de l’ALP (Alkalin Phosphatase) [12] (Figure 4). La voie Wnt/β-caténine ainsi que les BMP (Bone Morphogenetic Protein) sont des acteurs fondamentaux dans le contrôle de l’ostéoblastogenèse en agissant notamment sur l’expression de RUNX2 [14] [15]. Inversement, les facteurs SOST (sclerostin) et DKK-1 (dickkopf-1) sont des antagonistes de la voie Wnt/β-caténine et régulent négativement la différentiation et l’activité des ostéoblastes [16]. . Précurseurs mésenchymateux. Chondrocytes Adipocytes myocytes. Pré-ostéoblastes Ostéoblastes immatures. RUNX2+. Ostéopontine Sialoprotéine osseuse. RUNX2+ OSX+. BMP -caténine. OSX+. Cellules bordantes. Ostéoblastes. RANKL Collagène de type I ALP. ostéocytes. Figure 4. Ostéoblastogenèse. La voie Wnt/β-caténine stimule l’expression du facteur de transcription RUNX2 qui va permettre la différenciation des précurseurs mésenchymateux en pré-ostéoblastes au détriment des lignées chondrocytaires et adipocytaires. OSX permet la différenciation des pré-ostéoblastes en ostéoblastes matures capables de synthétiser la matrice osseuse et de minéraliser cette dernière. Les ostéoblastes peuvent se retrouver piégés dans la matrice osseuse. Ils se différencient alors en ostéocytes ou dans d’autres conditions en cellules bordantes.. . .

(30) 4.2.2. Production de la matrice osseuse Dans l’os, les ostéoblastes synthétisent la matrice organique et assurent sa minéralisation par la production de cristaux d’hydroxyapatite. Durant la formation de la matrice organique, les ostéoblastes secrètent du collagène de type I et des protéines non collagéniques. Parmi elles se trouvent : - des glycoprotéines représentées par l’ALP et l’ostéonectine qui interviennent dans la minéralisation de l’os. - des glycoprotéines contenant des séquences consensus de liaison aux intégrines (séquences RGD pour Arg-Gly-Asp) comme la sialoprotéine osseuse et l’OPN. Elles interviennent dans l’interaction cellules/matrice. -. des. protéoglycanes. tels. que. la. décorine,. possédant. une. chaîne. glycosaminoglycane. Cette particularité biochimique leur permet de fixer et réguler la formation et l’organisation des fibres de collagène. - des Gla-protéines comme l’ostéocalcine qui présentent une forte affinité pour le calcium. La production d’hydroxyapatite s’effectue suite à l’association du Pi (Phosphate Inorganique) et du calcium. Deux mécanismes propres aux ostéoblastes permettent de produire du Pi. Le premier est intracellulaire et fait intervenir la protéine PHOSPHO1 (Phosphate, Orphan 1) qui, à partir de phosphoéthanolamine, et de la phosphocholine va permettre la production de Pi [17]. Le Pi produit s’accumule et s’associe aux ions calcium dans une vésicule matricielle qui, à terme, va se rompre et libérer des cristaux d’hydroxyapatite. Le second mécanisme est extracellulaire et complémentaire du précédent. Il fait intervenir l’ALP qui transforme le pyro-phosphate inorganique présent dans la milieu extracellulaire en Pi [18]. Cette production enrichit les cristaux nouvellement formés qui se déposent alors sur les fibres de collagène et calcifient la matrice (Figure 5).. . .

(31) Ostéoblaste. Composées phosphoorganiques PHOSPHO1. Pi. + Ca2+. ALP. PPi. Pi. + Ca2+ Matrice osseuse. Figure 5. Minéralisation osseuse.. . 4.3.Les ostéocytes Les ostéocytes sont une catégorie particulière de cellules puisqu’il s’agit en réalité d’ostéoblastes emmurés dans la matrice osseuse. En effet, à la fin d’un cycle de formation, les ostéoblastes peuvent se différencier en cellules bordantes, en ostéocytes ou bien entrer en apoptose [19] (Figure 4). Lors de la différenciation en ostéocytes, l’expression des marqueurs ostéoblastiques comme l’ALP et l’ostéocalcine diminuent pour laisser place à des marqueurs ostéocytaires spécifiques tels que SOST [20]. Les ostéocytes sont considérés comme des régulateurs puissants du remodelage osseux car ils sont en mesure de stimuler l’ostéoclastogenèse par l’apport de RANKL mais aussi d’inhiber la différenciation ostéoblastique par la production de SOST [21], [22]. 5. NICHES HEMATOPOÏETIQUES 5.1. Les cellules souches hématopoïétiques Voilà maintenant de nombreuses années que des expériences d’irradiation de moelle osseuse ont permis de mettre en évidence la capacité des CSH à coloniser l’environnement osseux et assurer la production de l’intégralité des cellules. . .

(32) sanguines par le biais des précurseurs myéloïdes et lymphoïdes. Même si les CSH ne représentent qu’une faible proportion des cellules de la moelle osseuse (0,005% à 0,01%) [23], leurs propriétés de quiescence, d’auto-renouvellement et de prolifération durant le processus de différenciation fait de l’hématopoïèse un mécanisme extrêmement efficace. Cette efficacité implique une régulation stricte par de nombreux facteurs intrinsèques et extrinsèques. Ensemble, ils participent à la migration ainsi qu’à la rétention des CSH dans l’os et déterminent également la levée de la dormance pour activer la prolifération et la différenciation en cellules matures fonctionnelles [24]. La régulation physiologique des CSH dépend de l’expression de facteurs provenant de l’environnement osseux. Le couple SCF (Stem Cell Factor) et son récepteur c-Kit interviennent dans la prolifération et l’auto-renouvellement des CSH. L’invalidation génétique de ces deux gènes, chez la souris, réduit la capacité des CSH à produire des progéniteurs et maintenir un pool de cellules primitives [25], [26]. La chimiokine CXCL12 (CXC-type Chemokine Ligand 12) est déterminante dans la régulation de l’hématopoïèse puisque sa fixation sur l’un de ses récepteurs physiologiques CXCR4 (CXC-type Receptor 4) favorise la migration, l’ancrage et la quiescence des CSH. La déplétion de CXCL12 chez la souris ne permet plus la colonisation de l’os par les CSH [27] tandis que l’inactivation de CXCR4 aboutit à une prolifération excessive [28]. Le ciblage de l’axe CXCL12/CXCR4 par un inhibiteur pharmacologique spécifique, l’AMD3100, confirme l’implication de ce couple dans l’ancrage des CSH dans l’os [29] (Figure 6). Le récepteur de guidage axonal ROBO4 (Roundabout 4) serait également impliqué dans la physiologie des CSH. En effet, le gène ROBO4 est exprimé par les CSH les plus primitives mais également par les cellules endothéliales des vaisseaux sinusoïdes [30], [31]. ROBO4 régulerait les CSH à deux niveaux. D’une part, produit par les CSH, il permettrait, en coopération avec CXCR4, l’ancrage des CSH dans l’os [32]. D’autre part, sa présence membranaire serait essentiel pour la trans-migration endothéliale des CSH de la circulation sanguine vers l’os [31] (Figure 6).. . .

(33) Sinusoïde. ROBO4 1 ROBO4. CXCR4. 3. SLIT2 CXCL12. 2. Figure 6. Rôle des récepteurs ROBO4 et CXCR4 dans l'ancrage des cellules souches hématopoïétiques. 1 : Les CSH qui produisent le récepteur CXCR4 migrent vers la moelle osseuse en réponse au CXCL12 sécrété par le microenvironnement osseux. Le récepteur ROBO4 produit par les cellules endothéliales des vaisseaux sinusoïdes favorise l’extravasation des CSH du sang vers la moelle osseuse. 2 : Dans l’environnement osseux ROBO4 participe en coopération avec CXCR4 à l’ancrage des CSH dans l’os. 3 : L’inhibition de CXCR4 et ROBO4 mobilise rapidement les CSH de l’os vers le sang. (Modifié d’après : Smith-Berdan et al., 2011). 5.2. Concept de «niche hématopoïétique» L’hypothèse d’un microenvironnement spécialisé capable de réguler la survie, la quiescence, l’auto-renouvellement et la différenciation des CSH a été proposée il y a de nombreuses années par Schofield [33]. Depuis, cette thématique connaît un essor considérable et des faisceaux d’arguments semblent converger sur l’existence de niches distinctes : la niche endostéale ou encore ostéoblastique, la niche vasculaire et plus récemment la niche mésenchymateuse ou périvasculaire. L’amélioration des techniques d’imagerie et la découverte de nouveaux marqueurs cellulaires et génétiques montrent que ce système ne serait pas aussi cloisonné mais qu’il s’agirait plutôt d’un processus physiologique continu dans lequel le réseau vasculaire. . .

(34) endostéal et centromédullaire ainsi que les cellules mésenchymateuses associées seraient les principaux acteurs [34] (Figure 7).. Cellule de Schwann. Ostéoblaste. TGF- OPN CXL12. Artérioles NG2+. Matrice osseuse. CAR/ Leptine+ TGF-. Ca2+. mégacaryocyte. Sinusoïde. CXCL12 SCF. Cellules Endothéliales. Ostéoclaste. Figure 7. Niches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques résident à proximité des vaisseaux sinusoïdes et des artérioles retrouvés dans l’endoste. Les facteurs CXCL12 et SCF produits par les cellules périvasculaires et les cellules endothéliales favorisent le maintien des CSH. D’autres populations cellulaires participent à la régulation des CSH par la sécrétion de facteurs qui favorisent la colonisation (Ca2+) et la quiescence (TGF-β). (Modifié d’après Boulais and Frenette., 2015).. 5.3.Niche endostéale L’endoste constitue l’interface entre l’os et la moelle osseuse. C’est une région tapissée de cellules de la lignée ostéoblastique à différents stades de différenciation, d’ostéoclastes et de fibroblastes. Seulement, leur implication directe dans le maintien des CSH reste vivement controversée [34], [35], [36]. En effet, les données d’imagerie récentes montrent que la faible proportion de CSH retrouvées dans la région endostéale se trouve à proximité des vaisseaux sanguins [37], [38]. Il ne serait donc pas certain que les cellules endostéales, comme les ostéoblastes participent, par le biais d’un contact cellules/cellules, au maintien des CSH. Néanmoins, des facteurs sécrétés par les ostéoblastes, comme CXCL12, l’angiopoïétine [39] et l’OPN [40], [41], . .

(35) influencent l’ancrage et la quiescence des CSH. De plus, la resorption osseuse médiée par les ostéoclastes enrichit l’endoste en Ca2+, en protéase et en facteur de croissance provenant de la matrice osseuse qui participent à la régulation des CSH dans la niche osseuse [42]. 5.4. Niche vasculaire et périvasculaire L’identification de marqueurs cellulaires [43] et génétiques [38] de plus en plus spécifiques a considérablement amélioré les techniques de détection des CSH les plus primitives au sein de la moelle osseuse et a permis de montrer que la majorité d’entre elles résideraient à proximités des capillaires sinusoïdes et des artérioles endostéales [37], [44]. Le système vasculaire osseux semble être un élément important dans l’homéostasie des CSH et la composition des niches. La perte de l’intégrité vasculaire induite, dans des modèles murins, par la déplétion du récepteur VEGFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) ou bien du récepteur ROBO4 altère la colonisation des CSH lors d’une greffe myéoloablative [31], [45]. De plus, Les cellules endothéliales sinusoïdes et artériolaires sont une source de CXCL12 et de SCF qui favorisent l’ancrage et le maintien des CSH [26]. Les capillaires sanguins sont étroitement associés à des sous-populations de CSM. Une des particularités de ces cellules est qu’elles produisent en forte quantité les deux facteurs cruciaux pour le maintien des CSH dans cet environnement: CXCL12 et SCF. Les cellules périvasculaires CAR (CXCL12-abundant reticular) ainsi que les cellules positives pour la leptine (LEPR+) en sont les sources principales et leur déplétion conditionnelle induit une déplétion en CSH [46], [47]. Des péricytes positifs pour le marqueur NG2 (Neural-Glial antigen 2) exclusivement associés aux artérioles semblent quant à eux promouvoir la quiescence des CSH [44]. La déplétion des cellules périvasculaires NG2+ relocalise les CSH dans les niches sinusoïdales, lesquelles stimulent leur prolifération. Ces données supportent l’hypothèse selon laquelle les CSH prolifératives résideraient à proximité des vaisseaux sinusoïdes tandis que les CSH quiescentes seraient davantage associées aux artérioles proches de l’endoste (Figure 7).. . .