Filtration de dispersions de micelles de caséine : propriété du dépôt, interactions colloïdales et modélisation

THESE / AGROCAMPUS OUEST

Sous le label de l’Université Européenne de Bretagne pour obtenir le diplôme de :

DOCTEUR DE L'INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES AGRONOMIQUES, AGRO-ALIMENTAIRES, HORTICOLES ET DU PAYSAGE

Spécialité : Biologie et Agronomie Ecole Doctorale : VAS

présentée par : PENG QU

Filtration de dispersions de micelles de caséine : Propriétés du dépôt, Interactions colloïdales & Modélisation soutenue le 07 décembre 2012 devant la commission d’Examen

Composition du jury :

Thomas CROGUENNEC, Professeur Agrocampus Ouest, Président Pierre AIMAR, Directeur de recherche, LGC CNRS, Toulouse, Rapporteur

Sylvie MARCHESSEAU, Professeur, Université Montpellier 2, Rapporteur

Alain RIAUBLANC, Chargé de recherche, INRA Nantes, Examinateur

Anne PITKOWSKI, Chargée de recherche, Groupe Bel, Examinateur Paul MENUT, Maître de conférences, Montpellier SupAgro, Invité

Geneviève GESAN-GUIZIOU, Directrice de recherche, INRA Rennes, Directrice de thèse Antoine BOUCHOUX, Chargé de recherche, INRA Rennes, Co-directeur de thèse

N° ordre : 2012-26

N° Série : B-231

Remerciements  

J’aimerais remercier dans cette section toutes les personnes qui ont contribué, de manière générale, à l’élaboration de ce manuscrit et à me former en tant que chercheur.

Tout d’abord je remercie la Région Bretagne et l’INRA pour le financement de thèse. Merci également à Romain Jeantet qui m’a conseillé dans le choix de mon stage de fin d’études de Master 2, ce stage m’ayant conduit à ce sujet de thèse.

Je remercie Geneviève Gésan-Guiziou et Antoine Bouchoux pour m’avoir proposé ce sujet de thèse. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma reconnaissance. Je les remercie plus particulièrement pour leur disponibilité, la confiance et la liberté qu’ils m’ont octroyées tout au long de ce travail. J’espère que ce manuscrit, et le travail réalisé durant ces trois années de thèse, auront été à la hauteur de la confiance qui m’a été accordée.

Je tiens à remercier l’ensemble des membres de mon comité de thèse : Monsieur Patrice Bacchin, Madame Anne Pitkowski, Monsieur François Morgan et Monsieur François Mariette. Merci pour le suivi des travaux et les discussions scientifiques que nous avons eues ensemble. Vos propositions m’ont beaucoup aidé dans la conduite de cette thèse ainsi que pour le développement de mes compétences.

J’adresse mes remerciements à l’ensemble des membres du jury : Monsieur Thomas Croguennec pour avoir accepté de présider la commission d’examen, Monsieur Paul Menut, Monsieur Alain Riaublanc et Madame Anne Pitkowski pour avoir accepté de participer au jury de cette thèse et tout particulièrement Monsieur Pierre Aimar et Madame Sylvie Marchesseau qui ont accepté de juger ce travail et d’en être les rapporteurs.

Merci à Stéphane Pezennec, Saïd Bouhallab, Rachel Boutrou, Marieke Van Audenhaege et Gwenolé Gernigon pour leurs aides et propositions relatives à la préparation de ma soutenance.

Un grand merci à Mesdames Sylvie Lortal et Joëlle Léonil, de m’avoir accueilli au sein de

l’UMR STLO Science et Technologie du lait et de l’Oeuf. J’ai eu de la chance d’avoir pu

travailler dans un tel environnement. Je retiendrai, les moyens matériels mis à ma disposition

pour obtenir les meilleurs résultats possibles et bien sur les moyens humains. Merci à

l’ensemble du personnel du STLO, pour avoir mis au service de ce travail leurs multiples compétences et avoir su être toujours disponibles pour répondre à mes besoins.

Je tiens à exprimer mes remerciements à Fanny Guyomarch, Marie-Hélène Famelart, Valérie Gagnaire, Frédéric Gaucheron, Stéphane Pezennec et Saïd Bouhallab pour vos réponses à toutes mes questions scientifiques.

Merci à Madame Florence Rousseau pour son aide concernant les expériences de mesure de la taille des particules. Merci à Monsieur Christophe Genest et Laurent Fromont pour l’installation du pilot de filtration. Merci à Madame Nadine Leconte pour la préparation du solvant de l’UF utilisé dans cette thèse. Merci également à Madame Murielle Rabiller-Baudry pour son investissement sur les expériences de filtration à haute pression.

Je remercie Wenjiao Shao pour le travail excellent qu’elle a fait sur « la mesure des forces cohésives entre les micelles de caséine » pendant son stage, merci pour ses contributions à cette thèse et les bons moments que nous avons passés ensemble.

Un grand et sincère merci à Fabienne et Marieke, pour leur investissement professionnel et personnel et pour m’avoir encouragé tout au long de ces années de thèse.

Merci beaucoup à Madame Laurence Fauvel, Anne-Marie Renouard et Danielle Guilloux pour leurs aides quant aux démarches administratives, la réservation des matériels et la préparation des déplacements. Merci également à Madame Viviane Picard pour son aide dans la recherche d’articles.

Mes remerciements vont aussi à l’ensemble des jeunes chercheurs du STLO pour leur sympathie et amitié.

Je clos enfin ces remerciements en dédiant cette thèse de doctorat à mes parents et aux

quelques amis que j'ai eus la chance d'avoir à mes côtés, qui m'ont soutenu tout au long de ces

années de travail.

Résumé

Lors de l'ultra- ou microfiltration d'un lait écrémé, les micelles de caséine, espèces colloïdales poreuses et déformables, viennent s’accumuler à la surface des membranes et former ainsi des couches de matière concentrées. Dans certaines conditions, ces couches de matière peuvent passer de l'état liquide à l'état solide (gel). La présence de ce gel conduit à des altérations notables des performances de la filtration, aussi bien en termes de flux que de sélectivité. Afin de mieux maîtriser les opérations de filtration, il est nécessaire de mieux connaître les conditions qui conduisent à la formation de ces gels et les interactions impliquées. Il est également primordial de développer un modèle de filtration qui puisse aider les acteurs industriels à conduire leurs opérations de manière optimale et dans des conditions d'encrassement minimum. Nos résultats montrent dans un premier temps que la

"pression osmotique critique" nécessaire pour former du gel de micelles de caséine pendant la filtration est de l'ordre de 31-35 kPa. La formation de ce gel est conduite par les interactions cohésives localisées à la surface des micelles de caséine. Ces interactions cohésives peuvent être affectées par les conditions de compression (niveau, cinétique, durée) qui conduisent à la formation du gel. Dans un second temps, nous avons élaboré un modèle de filtration à partir de mesures directes et indirectes de pression osmotiques et de perméabilité de nos dispersions de micelles de caséine. Le modèle obtenu semble tout à fait robuste et peut prédire les performances d'une filtration frontale dans n'importe quelles conditions de flux ou de pression transmembranaire. Outre l'aspect appliqué des recherches menées dans ce travail, nous pensons que de nombreuses questions que nous y soulevons dépassent le simple cadre de la filtration d'un lait. Nous estimons en particulier que certaines des approches proposées sont tout à fait généralisables à l'étude de la filtration d'objets colloïdaux poreux et déformables de toutes origines: microgels ou agrégats colloïdaux protéiques par exemple.

Abstract

In the ultra- or microfiltration of skimmed milk, the casein micelles, porous and

deformable colloidal species that represent the major protein composition in the milk,

accumulate on the membrane surface and thus form layers of concentrated materials. Under

certain conditions, these layers can turn from the liquid state into the solid state (gel). The

presence of the gel leads to significant alterations of the filtration performances, both in terms

of flux and selectivity. In order to control the filtration operations, it is necessary to

understand the conditions that lead to the formation of these gels in the filtration. It is also

important to develop a filtration model that can help industry actors to conduct their

operations in an optimal manner and in conditions of minimum fouling. Ours results show

firstly that the "critical osmotic pressure" for the formation of the gels of casein micelles

during the filtration is around 31-35 kPa. The formation of the gels is due to the bonding

between the casein micelles through the cohesive interactions located on the surfaces of

micelles. These cohesive bonds can be affected by the condition (degree, rate, time) of the

compression used for forming the gels. Secondly we developed a filtration model based on the

direct and indirect measurements of osmotic pressure and permeability of our dispersions of

casein micelles. The resulting model seems quite reliable and can predict the performance of a

frontal filtration under any conditions of flux or applied pressure. Beside the aspect of

application of our model for the dairy industry, we believe that many questions that we

resolved in this work rise beyond the simple framework of the filtration of milk. In particular

we noted that some of the experimental or modeling approaches proposed in this work are

quite generalizable to study the filtration of porous and deformable colloidal objects from all

sources: protein microgels or colloidal aggregates for example.

SOMMAIRE 1

INTRODUCTION 9

CHAPITRE I. Synthèse Bibliographique 13

I.1 Le lait et les micelles de caséine: composition et caractéristiques 14

I.1.1 Lait 14

I.1.1.1 Globules gras I.1.1.2 Protéines de lactosérum I.1.1.3 Minéraux I.1.2 Micelles de caséine 17

I.1.2.1 Composition et caractéristiques générales I.1.2.2 Composition de surface I.1.2.3 Structure interne I.1.2.4 Physico-chimie et dynamique micellaire I.1.2.4.1 Acidification I.1.2.4.2 Alcalinisation I.1.2.4.3 Température I.1.2.4.4 Chlorure de Sodium (NaCl) I.1.2.4.5 Agent chélatant du calcium I.1.2.4.6 Urée I.2 La filtration membranaire 29

I.2.1 Généralités et modes de fonctionnement 29

I.2.1.1 Définition

I.2.1.2 Classification

I.2.1.3 Modes de fonctionnement

I.2.1.3.1 Frontal/tangentiel I.2.1.2.2 Pression transmembranaire / Flux constant(e)

I.2.2 Concepts fondamentaux 33

I.2.2.1 Loi de Darcy

I.2.2.2 Adsorption et blocage de pores

I.2.2.3 Polarisation de concentration

I.2.3 Filtration d'espèces colloïdales 35

I.2.3.1 Particularité

I.2.3.1.1 "Colloïdal flux paradox"

I.2.3.1.2 Conditions critiques et formation du dépôt

I.2.3.2 Modélisation

I.2.3.2.1 Généralités

I.2.3.2.2 Théorie

I.3 Filtration de micelles de caséines 43

I.3.1 Généralités 43

I.3.2 Conditions d'apparition du dépôt 44

I.3.3 Propriétés du dépôt 45

I.3.3.1 Structure

I.3.3.2 Résistance spécifique

I.3.3.3 Cohésion

I.3.4 Modélisation des performances de filtration 48 I.4 Objectifs spécifiques de la thèse et stratégies adoptées 51

CHAPITRE II. Matériels et Méthodes 55

II.1 Protéines et solvant 55

II.1.1 Poudre de PhosphoCaséinate Natif (PPCN) 55

II.1.2 Caséinate de sodium 56

II.1.3 Solvant : perméat d'ultrafiltration (UF) 56

II.2 Préparation des dispersions 57

II.2.1 Dispersion de micelles de caséine 57

II.2.2 Dispersion de caséinate de sodium 59

II.2.3 Dispersion de micelles réticulées 59

II.3 Mesures de pression osmotique (Chapitre V) 59

II.3.1 Osmomètre à membrane 60

II.3.2 Compression osmotique 61

II.4 Filtrations 63

II.4.1 Pilote de filtration 63

II.4.2 Protocole de filtration 1 : Etude des conditions critiques

d'apparition du dépôt et de ses propriétés (Chapitre III) 65 II.4.3 Protocole de filtration 2 : élaboration et validation du

modèle de filtration proposé (Chapitre V) 69

II.5 Mesures de cohésion/irréversibilité des gels 70

II.5.1 Principe 70

II.5.2 Fabrication d'un gel de micelles de caséine 70

II.5.2.1 Compression osmotique

II.5.2.2 Ultracentrifugation

II.5.3 Redispersion des gels 75

II.6 Mesures de perméabilité (Chapitre V) 76

II.7 Analyses 78

II.7.1 Dosage des protéines 78

II.7.1.1 Kjeldahl

II.7.1.2 Bradford

II.7.2 Dosage des minéraux 79

II.7.3 Extrait sec total (EST) 80

II.7.4 Turbidité 80

II.7.5 Mesures de taille 81

II.7.6 Electrophorèse SDS-Page 82

II.7.7 Masse volumique (Mv) 82

CHAPITRE III. Conditions critiques et propriétés du dépôt

irréversible de micelles de caséine pendant la filtration frontale 85

III.1 Introduction 88

III.2 Materials and methods 90

III.2.1 Dispersions 90

III.2.2 Filtration system 91

III.2.3 Filtration protocol 92

III.2.4 Membrane cleaning 95

III.3 Results and discussion 95

III.3.1 Formation of a deposit vs. caseins organization 95 III.3.2 Critical conditions for deposit formation 97 III.3.3 Sponge-like particles make sponge-like deposits 102

III.4 Conclusion 106

CHAPITRE IV. Interactions cohésives impliquées dans

gélification des dispersions de micelles de caséine 109

PARTIE IV-I.Effets de la concentration, de la cinétique de gélification,

et du temps de contact entre les micelles 113

IV-I.1 Introduction 114

IV-I.2 Materials and method 116

IV-I.2.1 Casein micelles dispersion 116

IV-I.2.2 Making the gel 117

IV-I.2.3 Irreversibility test 119

IV-I.2.4 Analysis and calculations 120

IV-I.2.4.1 Protein content analysis by Bradford reaction

IV-I.2.4.2 Turbidity

IV-I.2.4.3 Determination of casein and water content in the gels from total

solid analysis

IV-I.2.4.4 Particle size

IV-I.3 Results 122

IV-I.3.1 Impact of the compression degree 122

IV-I.3.1.1 General features

IV-I.3.1.2 Redispersed casein fraction

IV-I.3.1.3 Nature of the redispersed objects IV-I.3.1.4 Hydration of the residual "gels"

IV-I.3.2 Impact of the compression routes on the redispersed casein fraction 127

IV-I.4. Discussion 129

IV-I.4.1 The proteolysis does not explain the results of redispersion 129 IV-I.4.2 Surface cohesion between casein micelles ensures the irreversibility of the

gels 131

IV-I.4.3 Sufficient compression is necessary for bonds formation 131 IV-I.4.4 High compression degree affects the stability of the gel 133 IV-I.4.5 Gradual or long time compression process makes more connections 133

IV-I.5 Conclusions 134

PARTIE IV-II. Nature des forces cohésives entre micelles en milieu

concentré 137

IV-II.1 Introduction 137

IV-II.2 Rappels méthodologiques 139

IV-II.2.1 Dispersion des Micelles Réticulées 139

IV-II.2.2 Formation des gels par l'ultracentrifugation 139

IV-II.2.3 Redispersion des gels 139

IV-II.3 Résultats et discussions 141

IV-II.3.1 Effet de la réticulation de la micelle 141

IV-II.3.2 Effet des minéraux 145

IV-II.3.2.1 Eau

IV-II.3.2.2 Chélatant (EDTA)

IV-II.3.3 Effet du pH 8.5 149

IV-II.3.4 Effet des interactions hydrogènes et hydrophobes 152 IV-II.3.4.1 Température

IV-II.3.4.2 Urée

IV-II.4 Conclusions 158

CHAPITRE V. Modèle de filtration 161

PARTIE V-I. Modélisation 163

IV-I.1 Introduction 164

V-I.2 Theory 168

V-I.2.1 Filtration model 168

V-I.2.2 Modeling the filtration performances from k(C) and Π (C) 169 V-I.2.3 Using the model in a reverse way: estimating k(C) knowing Π(C) and J(t) 171

V-I.3 Materials and methods 173

V-I.3.1 Dispersions 173

V-I.3.2 Osmotic pressure measurements 174

V-I.3.2.1 Osmotic stress

V-I.3.2.2 Membrane osmometry

V-I.3.3 Permeability measurements 176

V-I.3.3.1 From dead-end filtration runs V-I.3.3.2 From osmotic stress experiments

V-I.4 Results and discussion 179

V-I.4.1 Osmotic pressure, Π (C) 179

V-I.4.2 Permeability, k(C) 181

V-I.4.2.1 Before close-packing / Dilute regime V-I.4.2.1 After close-packing / Dense regime V-I.4.2.3 Empirical equation for k(C)

V-I.4.3 Resulting filtration model: analysis 186

V-I.5 Conclusions and Perspectives 191

PARTIE V-II. Résultats supplémentaires 195

V-II.1 Pression osmotique des micelles de caséine dans UF 196 V-II.2 Pression osmotique et perméabilité dans différentes conditions physico-

chimiques 200

V-II.2.1 Caséinate de sodium 201

V-II.2.2 Effet du NaCl 203

V-II.2.3 Effet du pH 5.6 206

V-II.2.4 Effet de la réticulation 209

Conclusions générales 213

Références 221

Annexes 241

INTRODUCTION

Les opérations de séparation par membrane (autrement appelées opérations de filtration) utilisent des membranes semi-perméables qui permettent le fractionnement de solutés et/ou de particules contenus dans un solvant. On les distingue selon le seuil de coupure de la membrane et la nature de la force motrice appliquée pour conduire la séparation (différence de pression, concentration, champ électrique, …). Les séparations par membrane utilisant une différence de pression sont les plus utilisées, et parmi elles on distingue quatre grandes opérations: osmose inverse, nanofiltration, ultrafiltration et microfiltration.

Les opérations d'ultra- et micro-filtration sont à l'heure actuelle largement utilisées en industrie laitière. Elles sont présentes au sein des chaines de transformation fromagère et prennent une place privilégiée dans les procédés conduisant à l’obtention de fractions protéiques aux fortes propriétés nutritionnelles et fonctionnelles (Maubois et Ollivier, 1997;

Brans et al., 2004). Cependant, ces opérations ont connu un développement si rapide que leur conduite est souvent mal maîtrisée voire problématique. Un enjeu majeur est donc de parvenir à mieux contrôler ces opérations de filtration; ceci dans le double objectif de maîtriser la qualité des produits qui en sont issus (composition, fonctionnalité) et de minimiser l'impact de ces opérations sur l'environnement (maîtrise des consommations énergétiques et réduction des rejets).

Comme il est illustré dans la Figure 1, lors de la filtration du lait écrémé, les micelles de caséine, espèces colloïdales "molles" par excellence, viennent s’accumuler à la surface des membranes et forment ainsi des couches de matière concentrées. Dans certaines conditions

"extrêmes" de filtration, ces couches de matière peuvent passer de l'état liquide (dispersion) à

l'état solide (gel). Le gel ainsi formé, qui est la conséquence d'interactions cohésives entre les caséines est irréversible parce qu'il ne disparaît pas quand la pression transmembranaire est relâchée. Il conduit ainsi à des altérations notables des performances de la filtration, aussi bien en termes de flux que de sélectivité (Le Berre et Daufin, 1996; Gésan-Guiziou et al., 1999;

Jimenez-Lopez et al., 2008).

Afin de mieux maîtriser les opérations de filtration en industrie laitière, il devient donc nécessaire de mieux connaître les conditions qui conduisent à la formation du gel de micelles de caséines. Il est aussi important de disposer d'un modèle de filtration qui permette de prédire la formation du gel et les performances de filtration.

Figure 1. Présentation schématique de l'accumulation des micelles de caséine sur la membrane pendant la filtration et les questions de recherches principales dans cette thèse.

Dans ce contexte et brièvement, l'objectif de cette thèse est de répondre aux questions suivantes, ou du moins d'y contribuer:

(i) Il est établi que les micelles de caséine peuvent former un dépôt irréversible pendant la filtration. En revanche, les conditions exactes de formation de ce dépôt, dans les conditions physico-chimiques du lait, sont encore mal connues. Quelles sont donc les conditions critiques d'apparition du gel de micelles (en particulier pression et concentration critiques)?

Est ce que la formation du gel/dépôt et ses propriétés en terme de porosité et résistance

hydraulique sont liées aux propriétés et à la structure spécifique de la micelle dans son

individualité? Si oui, peut-on formaliser ces liens et comprendre en quoi les propriétés de la micelle de caséine déterminent les propriétés du dépôt?

(ii) L'accumulation de micelles de caséine à la surface de la membrane conduit à un gel plus ou moins irréversible, indiquant des interactions cohésives mises en jeu dans la gélification.

Or, les conditions de filtration qui renforcent ou atténuent ces interactions sont peu étudiées.

Une meilleure connaissance de ces conditions permettrait pourtant de limiter, voire d'éviter la formation de ce dépôt irréversible. Quelles sont donc les conditions d'obtention du gel (temps de contact, niveau de compression/concentration, …) qui conduisent à la cohésion du dépôt de micelles? Peut-on casser les forces de cohésion mises en jeu, et si oui, dans quelles conditions? Et enfin, peut-on avoir une idée de la nature de ces forces de cohésion?

(iii) Certaines théories et approches ont été développées afin d'établir des modèles prédictifs pour les filtrations d'espèces colloïdales. Le modèle développé par Bacchin et al. (2002 a,b;

2006 a,b) par exemple permet de prédire quantitativement le flux de perméation, les profils de concentration et les conditions critiques de formation de dépôt de colloïdes (latex). Cependant la majorité des modèles proposés considère les colloïdes comme des sphères rigides, ce qui n'est pas adapté au cas des espèces molles et poreuses que sont les micelles de caséine. Les modèles existants, développés pour des colloïdes sphériques et rigides peuvent-ils être adaptés au cas d'objets mous et déformables? Si oui, quelle adaptation faut-il envisager, quels paramètres faut-il déterminer?

Ces questions sont traitées successivement dans les trois principaux chapitres de ce manuscrit; lui-même constitué de cinq chapitres au total.

De manière à présenter le contexte et bien positionner ce travail, le premier chapitre s'attache à une étude bibliographique qui porte sur cette thèse.

Le second chapitre du manuscrit décrit les principales techniques et protocoles expérimentaux utilisés.

Les trois chapitres suivants présentent les résultats de travail, visant à répondre aux questions

évoquées précédemment.

CHAPITRE I. Synthèse Bibliographique

Ce chapitre s'attache à positionner le travail de cette thèse par une étude bibliographique ciblée. Il consiste en 4 parties :

La première partie présente les composants généraux du lait en se focalisant sur les caractéristiques des micelles de caséine, leur structure, et leur dynamique lorsqu'elles sont soumises à différentes conditions physico-chimiques.

La deuxième partie présente les généralités et les concepts fondamentaux de la filtration membranaire. Etant donné les propriétés colloïdales des micelles de caséine, l'étude bibliographique est orientée sur la filtration des colloïdes, ses particularités et les approches de modélisation développées. L'objectif est de nous inspirer des principes et des approches méthodologiques existantes pour mieux comprendre et modéliser la filtration de micelles de caséines.

La troisième partie s'attache à résumer les travaux déjà menés sur la filtration de micelles de caséine.

L'ensemble de ces éléments, permet dans une dernière partie, de dégager les lacunes des travaux existants et ainsi de positionner notre travail et dégager les stratégies à suivre pour conduire nos expériences.

I.1 Le lait et les micelles de caséine: composition et caractéristiques

I.1.1 Lait

Le lait de vache est un fluide complexe contenant tous les nutriments nécessaires au développement du jeune mammifère. D'un point de vue biochimique, le lait est à la fois une émulsion de matière grasse sous forme de globules gras, une suspension des protéines, avec les micelles de caséine et les protéines du lactosérum, et une solution riche en minéraux et lactose. La composition globale du lait de vache est donnée dans le Tableau I.1. Le pH du lait, à température ambiante, se situe entre 6.4-6.8.

Tableau I.1: Composition du lait de vache (Walstra et al., 1999) Concentration (g/L) Taille

Eau 871

Globules gras 40 0.1-15 µm, moyenne 3.4 µm

Micelles de caséine 26 50-500 nm, moyenne 120 nm

Protéines solubles 7 3-6 nm

α-Lactalbumine

1.2 14 kD

β-Lactoglobuline

3.2 18 kD

Albumine sérique 0.4 66 kD

Protéose-peptone 0.8 4-40 kD

Immunoglobulines 0.8 150-900 kD

Lactoferrine 0.1 86 kD

Transferrine 0.1 76 kD

Autres 0.4

Lactose 46 0.35 kD

Minéraux 7

Vitamines, molécules

organiques, urée, etc. 3.2

I.1.1.1 Globules gras

Les globules gras couvrent une population de particules de tailles comprises entre 0.1 et

15 µ m. Ils sont composés principalement de triglycérides (Walstra, 1975; Ruiz-Sala et al.,

1996; Walstra et al., 2006). Les globules gras peuvent être séparés du lait entier par centrifugation (écrémage), le lait dépourvu de globules gras est un "lait écrémé" (0.05-0.1 g/L de lait). Il est techniquement possible de séparer les globules gras du lait entier par la microfiltration (Alfa-Laval, 1976) mais cette méthode est pratiquement peu utilisée. Dans la plupart des cas, les opérations de filtration sont appliquées à du lait écrémé parce que d'une part, la présence de globules gras pénalise les performances des opérations de filtration et que d'autre part, l'opération d'écrémage par centrifugation est une opération largement maîtrisée et utilisée pour la standardisation en matière grasse du lait entrant en usine. Les globules gras étant rarement impliqués dans les pertes de performances des opérations de filtration de lait, cette étude se focalise exclusivement sur la filtration de lait écrémé.

I.1.1.2 Protéines de lactosérum

Les protéines du lactosérum ou aussi dites "protéines solubles" (monomères ou oligomère de petite taille) constituent ~20% de la masse totale des protéines dans le lait. Les 80% restant sont des caséines considérées comme "non-solubles" car associées sous forme de "gros"

objets colloïdaux d'environ 100 nm que sont les micelles de caséine. Les protéines solubles sont des molécules de petite taille, entre 3-6 nm, qui ont des intérêts d'usages divers selon leurs propriétés physico-chimiques et leurs fonctionnalités (Cayot et Lorient, 1997; de Wit, 1998). Elles peuvent être utilisées comme émulsifiant, agent moussant, gélifiant ou agent de conservation dans le domaine agroalimentaire. La lactoferrine et l' α-lactalbumine ont aussi des applications pharmaceutiques.

I.1.1.3 Minéraux

Les minéraux représentent une fraction mineure du lait (moins de 7% de la matière sèche,

Tableau I.2), mais ont un rôle majeur aussi bien sur les plans nutritionnel (essentiellement

pour la croissance du jeune), technologique (participation à une grande diversité de textures

fromagères) et physico-chimique (participation à l'organisation des micelles de caséines). Les

minéraux se répartissent entre la phase aqueuse (dispersante) et l'intérieur des micelles de

caséine (autrement appelée phase micellaire ou colloïdale) (Figure I.1). Cette répartition est

régie par les paramètres physico-chimiques, tels que le pH, la température, la force ionique,

l'ajout de séquestrant de calcium (ex citrate). La distribution à pH 6.7 et température ambiante

est présentée dans le tableau I.2. Les ions monovalents (principalement Cl

^-

, K

⁺

et Na

⁺

) sont

essentiellement présents dans la phase aqueuse, alors que les phosphates, Ca

²⁺

et Mg

²⁺

sont pour une grande partie associés à la micelle. Les comportements, complexes, des minéraux dans le lait sont très bien résumés dans l'article de Gaucheron (2005), et les équilibres du calcium et du phosphate entre phase dispersante et colloïdale sont expliqués en détails dans le paragraphe I.1.2.4 relatif à la dynamique micellaire.

Tableau I.2: Composition en minéraux d'un lait de vache d'après Gaucheron (2005)

Minéraux Concentration (mmol/kg)

Concentration (mg/kg)

Quantité associée à la micelle (%)

Calcium 26-32 1043-1283 69%

Magnésium 4-6 97-146 35%

Inorganique phosphate 19-23 1805-2185 46%

Phosphore 30-32 930-992 46%

Citrate 7-11 1323-2079 11%

Sodium 17-28 391-644 0

Potassium 31-43 1212-1681 0

Chlorures 22-34 772-1207 0

Figure I.1: Les équilibres minéraux entre phase aqueuse et phase micellaire dans le lait (Gaucheron, 2005). Les concentrations des minéraux sont indiquées en mM, à pH 6.7 et température ambiante.

Comme il est montré dans la figure I.1, les minéraux sont en équilibre entre phase aqueuse

et les micelles dans le lait. Cet équilibre est dynamique avec son environnement. Par exemple,

l'ajout de calcium (CaCl

2

) dans le lait entraîne l'ionisation de H

2

PO

42-

et Citrate

^3-

et la

formation de CaHPO

4

et CitrateCa

^-

(sens 2b et 5b), ce qui induit un déplacement de l'équilibre des minéraux de la phase aqueuse vers la micelle (tous les sens "b").

I.1.2 Micelles de caséine

I.1.2.1 Composition et caractéristiques générales

Les micelles de caséine sont des structures supramoléculaires, assimilées à des colloïdes en suspension dans le lait. Leur distribution de taille est très hétérogène et varie de 50 nm à 500 nm, avec un diamètre moyen d’environ 120 nm (de Kruif, 1998; Dalgleish et al., 2004). Les principales caractéristiques des micelles de caséine sont reportées dans le tableau I.3.

Tableau I.3: Les caractéristiques principales de la micelle de caséine à l'état natif (Gaucheron, 2005; Fox et Brodkorb, 2008)

Caractéristique Valeur

Diamètre 120 nm (50-500 nm)

Surface 8 × 10

^-10

cm

²

Volume 2.1 × 10

^-15

cm

³

Densité (hydraté) 1.0632 cm

^-3

Teneur en eau 63 %

Hydratation 3.7 g H

2

O / g protéine

Voluminosité 4.4 mL / g

Masse moléculaire (hydratée) ~1.3 × 10

⁹

Da Masse moléculaire (déshydratée) ~5 × 10

⁸

Da Nombre de chaines peptidiques ~5 × 10

³

Nombre de particules par mL de lait 10

¹⁴

-10

¹⁶

Surface micellaire par mL de lait 5 × 10

⁴

cm

³

Masse de minéraux ~ 0.8 g / kg micelles

Les micelles résultent de l’association de quatre types de caséines, α

s1

, α

s2

, β et κ, dans une

proportion moyenne de 3:1:3:1 respectivement. Elles contiennent 8% en masse de minéraux,

constitués essentiellement de phosphate et de calcium (McMahon et Brown, 1984) et sont

fortement hydratées, avec un taux d’hydratation de 3.7 g d’eau par g de protéines, ce qui

correspond à un volume spécifique ou voluminosité de 4.4 mL par g de protéines (Bloomfield and Mead, 1975; de Kruif, 1998).

La forte hydratation de la micelle, ainsi que sa masse volumique peu supérieure à celle de la phase solvante (qui limite les phénomènes de décantation), et son potentiel de surface élevé (qui assure des répulsions entre entités) confèrent une grande stabilité à cet objet en milieu aqueux. Sa structure, détaillée ci-dessous, confère également à la micelle des propriétés de déformabilité et compressibilité, qui conduisent à considérer cet objet comme une micro- éponge ou un microgel (Bouchoux et al., 2010).

I.1.2.2 Composition de surface

Si la composition interne des micelles a fait, et fait toujours, l'objet de nombreux débats et controverses, la composition de surface de ces objets fait l'objet d'un certain consensus. Il est maintenant communément admis que les caséines- κ sont situées majoritairement à la surface des micelles de caséine, leur partie hydrophile C-terminale s'étendant dans la phase aqueuse du lait à la manière des brosses d'un polyélectrolyte. Ce sont ces brosses qui stabilisent les micelles par des phénomènes de répulsions électrostatiques et stériques (De Kruif et Zhulina, 1996; De Kruif, 1998; 1999; Holt et Horne, 1996; Moitzi et al, 2010). L’épaisseur de cette couche de brosse de caséines-κ est estimée à environ 7 nm (De Kruif et Zhulina, 1996, Tuinier et De Kruif, 2002). Il semblerait que la quantité de caséines-κ ne soit pas suffisante pour couvrir entièrement la surface de la micelle de manière homogène, les caséines autres que la caséine-κ (caseines-α

s1

,-α

s2

, et β) seraient alors également situées à la surface et donc exposées à la phase aqueuse (Dalgleish et al., 2004; Dupont et al., 2012).

Figure 1.2 : Image d'une micelle de caséine sous "Scanning Electron Microscopy (SEM)"

(Dalgleish et al., 2004)

A noter que la surface de la micelle de caséine n'est pas parfaitement lisse, une certaine hétérogénéité ayant été observée par différentes techniques de microscopie (Kalab et al., 1982; Dalgleish et al., 2004; Ouanezar et al., 2012). Ceci indique que les composants dans la micelle ne sont pas organisés de façon homogène, et qu'il existe une variation spatiale en densité des masses au sein de la micelle.

I.1.2.3 Structure interne

Depuis une quarantaine, de nombreux travaux ont été réalisés et plusieurs modèles de structure de micelle ont été proposés pour tenter d'expliquer l'organisation des constituants de la micelle et leurs comportements face aux modifications essentiellement physico-chimiques.

Différentes méthodes ont été utilisées pour étudier la structure de la micelle: les méthodes physico-chimiques, plus anciennes, ont laissé la place aux techniques physiques comme la microscopie électronique (Dalgleish et al., 2004; Martin et al., 2006; McMahon et Oommen, 2008), la diffusion de lumière ou plus récemment encore la diffusion de rayon X (SAXS) et de neutrons (SANS) (Pignon et al., 2004; Marchin et al., 2007; Horne et al, 2006; Shukla et al., 2009; Moitzi et al., 2011). La structure interne de la micelle est toujours un débat d'actualité.

Plusieurs modèles ont été proposés comme des modèles à sous-micelles (Schmidt, 1980;

Walstra, 1999; Horne, 2003), des modèles homogènes ouverts (Holt, 1992; Marchin et al., 2007; McMahon et Oommen, 2008; Shukla et al., 2009; de Kruif, 2012 ) ou le modèle d'éponge (Bouchoux et al., 2010). Tous ces modèles considèrent que la micelle est constituée d'une matrice protéique dans laquelle le phosphate de calcium est généralement incorporé sous forme de nanoclusters. Les modèles se différencient l'un de l'autre par des points de vue différents concernant l'homogénéité / hétérogénéité de la matrice et la distribution des nanoclusters dans la matrice.

Les nanoclusters sont constitués d’un "cœur minéral" de phosphate de calcium hydraté avec

un diamètre ~4-5 nm (Marchin et al., 2007; Schukla et al., 2009; Bouchoux et al., 2010). Ils

sont liés aux caséines par les résidus phosphosérines et jouent un rôle de cohésion entre les

protéines dans la structure micellaire. Dans d'une micelle il y aurait de 200 à 300 nanoclusters selon les études (Bouchoux et al., 2010; de Kruif et al., 2012), ce qui représenterait seulement

~1-2% en volume de la micelle. Cette quantité de nanoclusters n'est pas suffisante pour créer assez de connexions entre les protéines puis maintenir la stabilité de la matrice protéique. Les interactions non covalentes entre les protéines comme les forces hydrophobes, hydrogène ou électrostatiques peuvent aussi contribuer à la connexion des protéines et stabiliser la structure interne de la micelle.

On appelle "modèles homogènes" les modèles qui suggèrent que les protéines dans la micelle sont distribuées de façon homogène, les seules substructures dans la micelle étant des nanoclusters de phosphate de calcium. Il est généralement considéré que la distribution des nanoclusters est aléatoire dans la matrice protéique (Holt, 1992; Marchin et al., 2007;

McMahon et Oommen, 2008), et certains auteurs suggèrent qu'ils sont préférentiellement situés à la surface de la micelle (Shukla et al., 2009).

Les modèles à sous-micelles suggèrent que la matrice protéique dans la micelle est constituée de sous-unités de petite taille (~10 nm). Les nanoclusters seraient situés entre les sous-micelles et serviraient à relier les sous-micelles ensemble (Schmidt, 1980). Il est aussi suggéré que les nanoclusters seraient situés dans les sous-micelles (Walstra, 1999).

Dans les dernières études, Bouchoux et al. (2010) ont proposé le modèle d'éponge (ou modèle en cellule). Selon ce modèle, la micelle serait une matrice protéique hétérogène, constituée de régions denses et de régions vides. Les régions denses sont constituées des caséines et des nanoclusters et difficiles à compresser, elles occupent 50% en volume total de la micelle avec une taille compris entre 10 et 40 nm. Les régions vides correspondent aux espaces compressibles qui sont peu ou non remplis par les caséines. Certaines études récentes semblent confirmer l'existence de régions vides ou "trous" dans les micelles (Dalgleish, 2011;

Trejo et al, 2011).

Figure I.3: Structure interne de la micelle de caséine selon Bouchoux et al., (2010).

I.1.2.4 Physico-chimie et dynamique micellaire

Les micelles sont des structures "dynamiques", qui échangent des ions (calcium et phosphate principalement) et des caséines avec la phase solvante. Une modification, même infime de l'environnement physico-chimique des micelles peut provoquer des modifications importantes de leurs compositions et donc de leurs propriétés.

Cette dynamique et ces équilibres entre phases solvante et colloïdale sont régis par des

paramètres thermodynamiques tels que le pH, la température, la concentration des différentes

entités. Cette réactivité des micelles à leur environnement est illustrée sur la Figure I.4. En

fonction des paramètres physico-chimiques modifiés, on peut induire sélectivement des

changements de composition soit au niveau des caséines (ex: température), soit au niveau

minéral (ex: acidification), soit des deux (ex: séquestration du calcium). On peut également

induire des modifications de différents types d'interactions entre les caséines telles que les

forces électrostatiques (en changeant le pH), les forces hydrophobes ou hydrogène (en

changeant la température ou rajoutant l'urée), etc.

Figure I.4: Dynamique micellaire au cours de la modification de différents paramètres physico-chimiques des micelles de caséines (Gaucheron, 2005).

I.1.2.4.1 Acidification

L'acidification du lait est une étape fondamentale dans de nombreux procédés de transformation des produits laitiers, comme la production de yaourts ou de certains fromages.

Cette acidification peut être induite par l'ajout direct d’un acide ou par l’activité de certaines bactéries lactiques.

La diminution du pH du lait, jusqu'à pH 5.2 à température ambiante affecte essentiellement

la fraction minérale des micelles de caséines en entraînant la solubilisation du calcium, du

citrate et phosphate inorganique (Le Graet et Brulé, 1993; Gaucheron, 2005; Marchin et al.,

2007). La baisse de pH entraîne la protonation des ions phosphate (HPO4

^2- 

H

2

PO4

^-

) et

citrate (Citrate

^3-

HCitrate

^2-

) ce qui induit un déplacement de l'équilibre des minéraux de la

phase micellaire vers la phase aqueuse (les sens "a" dans la figure I.1). En même temps, la

capacité de liaison de la caséine pour le calcium diminue en raison d’une réduction de la

charge négative des résidus phosphosérines et des groupements carboxyliques (Baumy et

Nrulé, 1988). Par conséquent, le phosphate de calcium associé aux micelles de caséine est

dissous et libéré dans la phase aqueuse du lait. Comme il est montré dans le tableau I.4, la

diminution de pH de 6.7 jusqu'à 5.2 permet de dissoudre progressivement le calcium et le

23

phosphate. A pH 5.2, la plupart du phosphate (85%) et du calcium (73%) est solubilisée (Gaucheron, 2005).

Tableau I.4: Composition des minéraux dans les micelles et la phase aqueuse (soluble) en fonction de pH (Marchin et al., 2007). Ca: calcium, Pi: phosphate inorganique.

La diminution du pH permet donc de dissocier les phosphates et le calcium des caséines, cependant la micelle ne se dissocie pas en raison du maintien d'interactions hydrophobes intermoléculaires qui elles, subsistent à pH acide (Holt et Horne, 1996; Lucey et al., 1997;

Marchin et al., 2007). Marchin et al. (2007) ont remarqué par diffusion de rayon X (Small Angle X-ray Scattering, SAXS) qu'à pH 5.2, les nanoclusters de phosphate de calcium colloïdaux n'existent plus dans la micelle alors que la micelle reste intacte avec une taille semblable à celle de son état natif.

Même si la structure de la micelle reste globalement intacte, l'acidification à pH 5.0 conduit

à la disparition de l'hétérogénéité de surface de la micelle (Figure I.5). Il est suggéré que cette

disparition de l'hétérogénéité est due à la réorganisation interne des composants de la micelle

de caséine (Ouanezar et al., 2012). A pH 5.0, la charge des caséines dans la micelle, ainsi que

celles des groupements phosphosérines après dissolution des nanoclusters est neutralisée, ce

qui entraine une diminution des interactions électrostatiques. Les forces hydrophobes

deviennent dominantes entre caséines conduisant probablement à la réorganisation de la

structure interne de la micelle (Horne, 1998; 1999).

Fig. I.5: Images d'AFM de la micelle de caséine à pH 6.7 et à pH 5.0 (Ouanezar et al., 2012), la barre blanche représente une échelle de 100nm.

La diminution de pH entraîne également une perte des forces répulsives et conduit, à des pH au-dessous de 5.0, à la gélification ou l’agrégation des micelles. La quantité du calcium libre sous forme d'ion (Ca

²⁺

) augmente lors de l'acidification, ce qui induit une neutralisation et un écrantage des charges négatives de la micelle (De La Fuente, 1998). Il en résulte une diminution des répulsions électrostatiques entre les micelles. Ainsi une diminution progressive de pH au dessous de pH 5.0 permet de gélifier les dispersions de micelles de caséine. De plus, si le pH est descendu jusqu'au pH 4.6, qui est le point isoélectrique de caséine κ, les brosses de caséines κ deviennent moins affines avec l'eau et ont tendance à précipiter, ce qui provoque un effondrement des barrières répulsives entre les micelles conduisant à l'agrégation ou précipitation des micelles (Holt et Horne, 1996; De Kruif, 1998;

1999).

On peut donc remarquer que dans le gamme de pH entre 6.7 et 5.0, on peut modifier la

quantité des minéraux et surtout des nanoclusters dans les micelles sans dissocier ou agréger

les micelles. Une telle modification physico-chimique des micelles pourrait donc être un outil

intéressant pour étudier les interactions entre les composés à l'intérieur de la micelle.

I.1.2.4.2 Alcalinisation

Une alcalinisation (hausse de pH) d'un lait entraîne la diminution de la teneur en minéraux dans la phase aqueuse (Vaia et al., 2006; Ahmad et al., 2009). L'augmentation de la teneur en OH

^-

change l'état d'ionisation des minéraux (H

2

PO4

^-

HPO4

^2-

CaHPO

4

) et déplace l'équilibre des minéraux vers la micelle (les sens "b" dans la figure I.1). Simultanément, on peut remarquer une perte de turbidité dans le lait lorsque le pH est augmenté (Van Dijk, 1991;

1992; Vaia et al., 2006). Au-delà de pH 9, le lait devient "transparent", ce qui indique la dissociation des micelles. Pour certains auteurs (Ahmad et al., 2009), la dissociation des micelles est attribuée à l'ionisation des caséines qui modifie les interactions entre caséines.

L'augmentation de la charge négative des résidus phosphosérine sur les caséines lorsque pH augmente, conduit à une meilleure affinité entre les caséines et les ions Ca

²⁺

. Les interactions entre les caséines sont affectées par cette ionisation donc les micelles sont dissociées. Pour d'autres auteurs (Van Dijk, 1991; 1992; Vaia et al., 2006), il est plus généralement considéré que l'augmentation du pH change la qualité de solvant dans lequel les cohésions hydrophobes entre les caséines sont affaiblies, conduisant à une dissociation des caséines les unes avec les autres.

L'alcalinisation permettrait de déplacer les minéraux de la phase aqueuse vers la micelle, modifiant les interactions entre caséines soit par changement de qualité du solvant, soit par ionisation des caséines.

I.1.2.4.3 Température

Les micelles de caséine sont des structures relativement résistantes au traitement thermique:

par exemple le chauffage des micelles à 90°C pendant 24 min ne semble pas provoquer la

dissociation ou la coagulation des micelles (Famelart et al., 2004). En revanche, un traitement

thermique très sévère au-delà de 140°C pendant 1 min provoque la dissociation des brosses de

caséine κ et une coagulation des micelles de caséine (O’Connell et Fox., 2003; Huppertz et de

Kuif, 2008). Il existe peu d'études des micelles à des températures de l'ordre de 50°C, il

semble que la taille et la structure de la micelle ne soient pas changées à 48°C (Jimenez-

Lopez, 2007).

Le traitement thermique des micelles de caséines induit une modification de la distribution des minéraux entre la phase soluble et la phase micellaire (Holt, 1995). L'augmentation de la température entraîne une ionisation des ions phosphate et citrate présents en phase aqueuse (Figure I.1 sens 1b et 4b), ce qui augmente les teneurs en CaHPO

4

et CaCitrate

^-

et donc un déplacement de ces ions vers la micelle (les sens "b" dans le figure I.1). Cette modification est parfaitement réversible si le traitement thermique est effectué à 85°C pendant 10 min (Law, 1996). En revanche, un traitement plus sévère que 90°C induit des modifications irréversibles.

Lorsque la température diminue aux alentours de 4°C, certaines caséines, particulièrement la caséine β, sortent de la micelle (De La Fuente, 1998). Ceci est la conséquence de l’affaiblissement des interactions hydrophobes au sein de la micelle (Aoki et al., 1990). Après 24h à 4°C, plus de 26% des caséines β sont solubilisées (Creamer et al., 1977) et si le traitement est prolongé, la quantité de caséine β dissociée peut atteindre jusqu’à 40% (Davies et Law, 1983). Ce mécanisme est parfaitement réversible après quelques heures passées à 20°C. Cependant, malgré la perte d’une fraction de la caséine β, la taille et la structure interne des micelles restent inchangées (Marchin et al., 2007).

D'ailleurs, il est classiquement considéré que le changement de température modifie les interactions hydrogène et hydrophobes entre les protéines (Baldwin, 1986; Creighton, 1990;

Cooper, 2000; Vogt et al., 1997). Lorsque la température augmente, les liaisons hydrophobes deviennent plus stables (Baldwin, 1986; Creighton, 1990) alors que les liaisons hydrogène sont destabilisées (Cooper, 2000; Ross et Rekharsky).

Donc le changement de la température (4-50°C) permet de modifier les interactions (hydrogène, hydrophobes) entre les caséines sans altérer l'intégrité des micelles. Il serait intéressant de jouer sur la température pour étudier ces interactions entre les micelles.

I.1.2.4.4 Chlorure de Sodium (NaCl)

L'addition de NaCl dans le lait induit une sortie de calcium (Ca

²⁺

) de la micelle de caséine

et une entrée des ions Na

⁺

(Gaucheron et al., 2000; Huppertz et Fox, 2006). Cependant cette

sortie de calcium de la micelle ne s'accompagne pas une sortie de phosphore dans la micelle, ce qui indique que le calcium échangé n'est pas issu des nanoclusteurs de phosphates de calcium. Il s'agirait plutôt de calcium simplement liées aux phosphosérines (Le Graët et Brulé, 1993; Huppertz et Fox, 2006). L'augmentation des teneurs en ions Na

⁺

et Ca

²⁺

dans la phase aqueuse réduit la charge de surface des micelles par l'effet d'écrantage et conduit à une diminution de pH (Youravong et al., 2002; Rabiller-Baudry et al., 2005; Huppertz et Fox, 2006). De plus, le remplacement des ions divalents (Ca

²⁺

) dans les micelles par les ions monovalents (Na

⁺

) entraine une augmentation de l'hydratation des micelles de caséine (Famelart et al., 1999; Huppertz et Fox, 2006).

Donc l'addition du NaCl nous permet de modifier plus ou moins des propriétés des micelles de caséine au niveau de leurs charges et de leur hydratation globale.

I.1.2.4.5 Agent chélatant du calcium

L'addition d'un chélatant du calcium (ex: Acide Ethylène Diamine Tétraacétique (EDTA)) dans le lait permet de complexer instantanément le calcium ionique et induit une solubilisation croissante des nanoclusters de phosphate de calcium et une dissociation simultanée des Ca

²⁺

liés aux phosphosérines. Il en résulte la dissociation de la micelle de caséine (Udabage et al., 2000; Pitkwoski et al., 2008).

Une récente étude de Huppertz et al. (2007 a,b) montre que la dissociation des micelles en

présence de chélatant peut être évitée lorsque la structure interne de la micelle est réticulée par

la transglutaminase (TGase). TGase est une enzyme qui catalyse la formation de liaisons

covalentes entre des groupements amines libres (ex. lysines) et le groupement gamma-

carboxamide des glutamines (Griffin et al., 2002). La micelle réticulée par TGase a une taille

et une structure très proches de celles de la micelle native (Huppertz et De Kuif, 2008), même

si une certaine augmentation de la taille des micelles réticulées a été remarquée, indiquant une

augmentation de l'hydratation de la micelle. La micelle réticulée présente une bonne stabilité

sous différentes conditions physicochimiques (Huppertz et al, 2007 a,b; Huppertz et De Kruif,

2008).

L'addition de chélatant du calcium dans une dispersion de micelles réticulées est une condition intéressante, parce qu'elle permet d'enlever la totalité du calcium dans la micelle tout en maintenant l'intégrité de la micelle (Huppertz et al, 2007 b).

I.1.2.4.6 Urée

L'addition de 6 M d'urée dans un lait conduit à la dissociation de la totalité des micelles de caséine et donc à la transparisation du lait (Holt, 1998). Une fois de plus, la réticulation de la micelle par la Tgase permet d'éviter cette dissociation et de maintenir la structure micellaire proche de son état initial (une légère augmentation de taille de la micelle réticulée est observée lors de l'ajout d'urée) (Huppertz et al., 2007 b).

Les mécanismes de dénaturation des protéines et assemblages protéiques par l'urée ne sont pas encore complètement élucidés, et font encore l'objet de nombreuses études fondamentales (Das et Mukhopadhyay, 2009; Zangi et al., 2009; Lim et al., 2009; Canchi et al., 2010). La majorité des études réalisées portent sur l'effet de l'urée sur des protéines globulaires, et donnent donc des pistes pour comprendre l'effet de l'urée sur la micelle. D'une manière générale, il est classiquement considéré que les molécules d'urée altèrent les forces hydrophobes et hydrogène inter- et intra-protéique; et c'est cette raison somme-toute approximative, qui est généralement invoquée pour expliquer la dissociation de la micelle de caséine. Selon les dernières études sur les mécanismes de dénaturation (= dépliement) des protéines sous l'effet de l'urée, on peut toutefois être un peu plus précis sur les mécanismes potentiels de déstabilisation induits par l'urée (Rossky, 2008; Lim et al., 2009; Zangi et al., 2009; Canchi et al., 2010). Les mécanismes directs sont distingués des mécanismes indirects.

Le mécanisme direct considère que l'urée interagit directement avec les protéines, la déstabilisation des protéines peut être expliquée par le fait que les protéines interagissent plus fortement avec l'urée qu'avec les protéines elles mêmes (protéine-protéine) ou qu'avec l'eau (protéine-eau) (Lim et al., 2009; Zangi et al., 2009). Le mécanisme indirect, quant à lui, considère que l'urée intervient sur les interactions eau-eau, changeant l'affinité entre protéine- eau ainsi affectant indirectement les forces hydrophobes entre les protéines.

Dans cette thèse, nous utilisons l'urée comme agent pour modifier différentes types

d'interactions (ex. hydrogène ou hydrophobes) entre les caséines.

La première partie de cette étude bibliographique montre que les micelles de caséines sont des espèces colloïdales aux propriétés spécifiques: ce sont des objets "mous" et en même temps "dynamiques", c'est-à-dire en équilibre permanent avec leur environnement. La suite de l'étude bibliographique va porter sur la filtration membranaire en général, avec une attention particulière portée sur la filtration d'espèces colloïdales.

I.2 La filtration membranaire

I.2.1 Généralités et modes de fonctionnement

I.2.1.1 Définition

La filtration membranaire est une opération unitaire qui peut être utilisée pour concentrer, purifier ou fractionner les constituants dispersés dans un solvant, et ce, à l'aide d'une membrane généralement poreuse et semi-perméable. Les substances traversant les pores de la membrane constituent la fraction "perméat" tandis que les molécules retenues se trouvent dans le "rétentat" (Figure I.6).

Figure I.6: Représentation schématique d'une opération de séparation par membrane.

I.2.1.2 Classification

Les filtrations membranaires sont classifiées selon le seuil de coupure (ou le diamètre de

pores) de la membrane et la force motrice mise en jeu pour permettre d’effectuer la séparation

(différence de pression appliquée ou de potentiel électrique par exemple). Dans le cas des opérations de filtration basée sur une différence de pression hydrostatique, on distingue quatre grands types de filtration: osmose inverse, nanofiltration, ultrafiltration, microfiltration (Figure I.7).

Figure I.7: Les opérations de séparation membranaires fondées sur une différence de pression hydrostatique, classées sur une échelle de taille de pore.

L'osmose inverse est sensée ne laisser passer que les molécules d'eau. On ne parle d'ailleurs pas de taille de pores dans ce cas, l'eau perméant à travers la membrane en passant à travers le réseau polymérique dont elle est constituée plus qu'en passant réellement à travers des

"pores". Cette opération est utilisée pour déminéraliser complètement l'eau de mer ou adoucir l'eau potable.

La nanofiltration offre la capacité, très intéressante, de séparer des composés de faible poids moléculaire à des pressions qui sont relativement faibles par rapport à l'osmose inverse (Figure I.7). En plus, des phénomènes d'exclusion stérique (= par la taille), des phénomènes de répulsion électrostatiques (= par la charge) sont visibles en nanofiltration. D'une manière générale, les ions multivalents sont mieux retenus que des ions monovalents, même de taille identique. Les composés "neutres" de masse moléculaire supérieurs à 300 daltons (Da) sont généralement complètement retenus par ces membranes. La nanofiltration est utilisée à différentes fins, souvent pour déminéraliser et concentrer simultanément des fluides:

adoucissement d’eau, pré-concentration de jus de fruit, production d'acides organiques,

concentration et déminéralisation simultanées des lactosérums en industrie laitière.

L'ultra- et la micro-filtration sont utilisés pour la concentration ou séparation des particules ou d'objets colloïdaux (protéines, polymères, etc.) dont les dimensions vont de 2 nm à plusieurs µ m. L'ultrafiltration utilise des membranes dont le diamètre des pores est généralement compris entre 2 nm et environ 100 nm. De telles membranes laissent passer les petites molécules (eau, sels) et arrêtent les molécules de masse molaire élevée (polymères, protéines). L'ultrafiltration est exploitée dans de nombreuses applications comme la concentration de solutions macromoléculaires (concentration des protéines du lactosérum par exemple, concentration des protéines totales du lait), l'élimination de macro-solutés présents dans les effluents ou dans l'eau destinée à un usage industriel ou médical. La microfiltration retient les particules ayant une dimension supérieure à 100 nm et généralement inférieure à 10-20 µm. Les bactéries, les levures, certaines émulsions et colloïdes peuvent être retenus par microfiltration. Cette opération est très utilisée dans les domaines agroalimentaire et pharmaceutique. Par exemple dans l'industrie laitière, elle est utilisée pour éliminer les bactéries du lait ou séparer les micelles de caséine des protéines du lactosérum. Elle permet également de clarifier le jus de fruit, la bière, ou le vin. Dans le domaine pharmaceutique, elle permet de retirer les micro-organismes des solutions sans réaliser de traitement thermique aux produits, bénéfique au maintien des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles des produits.

I.2.1.3 Modes de fonctionnement I.2.1.3.1 Frontal/Tangentiel

Les opérations de séparation à membrane mettant en jeu un gradient de pression peuvent être conduites selon deux modes: la filtration frontale et la filtration tangentielle (Figure I.8).

La filtration frontale consiste à faire passer le fluide à filtrer perpendiculairement à la surface de la membrane. Dans ce cas toutes les espèces retenues par la membrane s'accumulent à sa surface (Figure I.8 a). Ce mode d'opération est peu onéreux, cependant l'opération n'est généralement pas réalisée de manière continue.

Lors de filtrations menées en mode tangentiel (Figure I.8 b), le fluide circule parallèlement

à la membrane entraînant ainsi un cisaillement ( τ

w

) qui permet de limiter l’accumulation de

matière à la surface de la membrane. Ce mode de filtration est préférentiellement utilisé à

l'échelle industrielle car il permet d'obtenir des flux de perméation supérieurs à ceux du mode

"frontal", de limiter les phénomènes de colmatage et d'obtenir une meilleure sélectivité de l'opération. Il a l'avantage également de pouvoir réaliser les opérations de manière continue.

Figure I.8: Comparaison des modes de fonctionnement frontal (a) et tangentiel (b)

I.2.1.3.2 Pression transmembranaire / Flux constant(e)

La filtration peut être réalisée soit à pression, ( Δ P) constante, soit à flux de perméation (J) contant. ΔP correspond à la différence de pression entre les compartiments rétentat et perméat, et est généralement appelée pression transmembranaire. Elle est la force motrice responsable du flux de matière à travers la membrane. Le flux de perméation (J) caractérise le volume de solvant (V

f

) à travers la membrane par unité de temps (t) et d'aire de la membrane (A

m

) :

(Eq. I.1) Le choix du mode à pression ou à flux constant dépend généralement des contraintes d'utilisations industrielles de l'opération de filtration. Généralement, en industrie laitière, les opérations sont conduites en utilisant un "mix" de ces deux modes: le mode à flux constant est utilisé au début de la filtration pour assurer la continuité de l'opération avec les opérations amont et aval. Puis, du fait de l'augmentation de pression, le choix est fait par l'opérateur de travailler à pression constante. Ce mode permet de ne pas dépasser une pression de consigne (choisie pour limiter les problèmes de colmatage ou assurer la sécurité des installations). Dans ce cas, le flux de perméation chute mais permet de finir de traiter le produit réceptionné avant d'enchainer sur l'opération de nettoyage. Au niveau de la recherche scientifique, selon le contexte et l'objectif de l'étude, les deux modes sont utilisés pour étudier la filtration.

I.2.2 Concepts fondamentaux