Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant: aspects biologiques et pathologiques.

Texte intégral

(1)UNIVERSITE MOHAMMED V –SOUISSI– FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE –RABAT ANNEE : 2014. THESE N°: 50. ESPÈCES RÉACTIVES DE L’OXYGÈNE ET STRESS OXYDANT : ASPECTS BIOLOGIQUES ET PATHOLOGIQUES. THESE Présentée et soutenue publiquement le :………………….………….. PAR Mr. DWASSY ABDELLATIF NÉ LE 4 AVRIL 1987 À TAROUDANT. POUR L'OBTENTION DU DOCTORAT EN PHARMACIE MOTS CLES: oxygène, espèces réactives de l’oxygène, antioxydants, stress oxydant, radicaux libres. MEMBRES DE JURY Pr. S. EL HAMZAOUI Professeur de Microbiologie Pr. S. TELLAL Professeur de Biochimie Pr. N. MESSAOUDI Professeur d’Hématologie Biologique Pr. M.O.B. IDRISSI Professeur de Chimie Analytique. PRESIDENT RAPPORTEUR. JUGES.

(2) ‫ﺳﺒﺤﺎﻧﻚ ﻻ ﻋﻠﻢ ﻟﻨﺎ ﺇﻻ ﻣﺎ ﻋﻠﻤﺘﻨﺎ‬ ‫ﺇﻧﻚ ﺃﻧﺖ ﺍﻟﻌﻠﻴﻢ ﺍﳊﻜﻴﻢ‬. ‫< ﺳﻮﺭﺓ ﺍﻟﺒﻘﺮﺓ‪ :‬ﺍﻵﻳﺔ‪31<V‬‬.

(3) UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE – RABAT. DOYENS HONORAIRES : 1962 – 1969 : Professeur Abdelmalek FARAJ. 1969 – 1974 : Professeur Abdellatif BERBICH 1974 – 1981 : Professeur Bachir LAZRAK 1981 – 1989 : Professeur Taieb CHKILI 1989 – 1997 : Professeur Mohamed Tahar ALAOUI 1997 – 2003 : Professeur Abdelmajid BELMAHI 2003 – 2013 : Professeur Najia HAJJAJ - HASSOUNI ADMINISTRATION : Doyen : Professeur Mohamed ADNAOUI Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et estudiantines Professeur Mohammed AHALLAT Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération Professeur Taoufiq DAKKA Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie Professeur Jamal TAOUFIK Secrétaire Général : Mr. El Hassane AHALLAT 1- ENSEIGNANTS-CHERCHEURS MEDECINS ET PHARMACIENS PROFESSEURS : Mai et Octobre 1981 Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajih Pr. TAOBANE Hamid*. Chirurgie Cardio-Vasculaire Chirurgie Thoracique. Mai et Novembre 1982 Pr. BENOSMAN Abdellatif. Chirurgie Thoracique. Novembre 1983 Pr. HAJJAJ Najia ép. HASSOUNI. Rhumatologie. Décembre 1984 Pr. MAAOUNI Abdelaziz Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajdi Pr. SETTAF Abdellatif. Médecine Interne Anesthésie -Réanimation Chirurgie. Novembre et Décembre 1985 Pr. BENJELLOUN Halima Pr. BENSAID Younes Pr. EL ALAOUI Faris Moulay El Mostafa. Cardiologie Pathologie Chirurgicale Neurologie.

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(15) DEDICACES.

(16) A ceux qui me sont les plus chers. A ceux qui toujours crut en moi. A ceux qui m’ont toujours encourage. Je dédie cette thèse à ….

(17) A Mes Très Chers Parents. Tous les mots du monde ne sauraient exprimer l’immense amour que je vous porte, ni la profonde gratitude que je vous témoigne pour tous les efforts et les sacrifices que vous n’avez jamais cessé de consentir pour mon instruction et mon bien-être.. C’est à travers vos. encouragements que j’ai opté pour cette noble profession, et c’est à travers vos critiques que je me suis réalisée. Je vous rends hommage par ce modeste travail en guise de ma reconnaissance éternelle et de mon infini amour. Que Dieu tout puissant vous garde et vous procure santé, bonheur et longue vie pour que vous demeuriez le flambeau illuminant le chemin de vos enfants..

(18) A mes frères et soeurs. Vous m’aviez toujours aidé et ces quelques lignes sont insuffisantes pour exprimer mon profond amour et ma reconnaissance pour les honorables services soutenus. Que cette thèse vous traduire ma profonde affection.. A ma grande famille. En témoignage de mon respect et de mon amour.. A mes amis. En souvenir des agréables moments partagés.

(19) REMERCIEMENT.

(20) A notre maître et Présidente de thèse Mme .S. EL HAMZAOUI Professeur de Microbiologie. Nous vous remercions pour le grand honneur que vous nous faites e n a c c e p t a n t d e p ré s id e r c e t t e t h è s e . Votre compétence, votre dynamisme, ainsi que vos qualités humaines et professionnelles exemplaires ont toujours suscité notre admiration. Qu’il soit permis, cher maître, de vous exprimer notre sincère reconnaissance, notre profond respect et notre plus grande estime..

(21) A notre maître et rapporteur de thèse Mme Saida TELLAL Professeur de Biochimie. V o u s n o u s a v e z in s p ir é le s u je t d e t h è s e , v o u s n o u s a v e z g u id é t o u t au long de son élaboration, avec bienveillance et compréhension, flexibilité et disponibilité ont été les qualités les plus marquantes au cours de cette collaboration. Votre accueil si simple, pour l’un de vos élèves, vos qualités humaines rares, vos qualités professionnelles ont été un enseignant complémentaire pour notre vie professionnelle et privée. Veuillez accepter ici, cher maître, l’expression de notre gratitude et L’expression de notre profonde reconnaissance.

(22) A notre maître et juge de thèse Mme Nezha MESSAOUDI Professeur d’Hématologie Biologique. Nous vous remercions vivement de l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger parmi notre jury de thèse. Nous sommes très reconnaissants de la spontanéité avec laquelle vous avez accepté de juger notre travail. Veuillez croire, cher maître, à l’assurance de notre respect et notre considération.

(23) A notre maître et juge de thèse Mr Mohammed .O.B. IDRISSI Professeur de Chimie Analytique. Permettez nous de vous remercier pour avoir si gentiment accepté d e f a ir e p a r t ie d e n o s ju g e s . En dehors de vos connaissances claires et précises, dont nous avons bénéficié, vos remarquables qualités humaines et professionnelles méritent toute admiration et tout respect. Veuillez trouver ici le témoignage respectueux de notre reconnaissance et admiration..

(24) . SOMMAIRE Liste des figures……………………………………………………………………………….6 Liste des tableaux……………………………………………………………………………..8 Liste des abréviations…………………………………………………………………………9 Introduction………………………………………………………………………………….12 I. Rappels sur le stress oxydant…………………………………………………………….14 I-1. Le paradoxe de l’oxygène…………………………………………………………14 I-2. Le radical libre…………………………………………………………………….15 I-3. La défense antioxydante…………………………………………………………..16 I-4. La définition du stress oxydant……………………………………………………17 II. Espèces réactives de l’oxygène…………………………………… …………………....18 II-1. Principale formes réactives de l’oxygène………………………………………...18 II-2. Aspect physicochimique des formes réactives de l’oxygène…………………….18 II-2-1. Propriétés thermodynamiques……………………………………………20 II-2-2. Propriétés cinétiques……………………………………………………..23 II-2-3. Modes d’action des radicaux superoxydes et hydroxyles………………..25 II-3. Les sources endogènes des formes réactives de l’oxygène………………………31 II-3-1. L’auto-oxydation des petites molécules…………………………………31 II-3-2. Le peroxysome…………………………………………………………...32.

(25) II-3-3. Le réticulum endoplasmique et le cycle catalytique du Cyt P450……….32 II-3-4. La xanthine oxydase……………………………………………………..33 II-3-5. Les enzymes de la voie de l’acide arachidonique ……………………....35 II-3-6. La NADPH oxydase……………………………………………………..35 a. La famille de la NADPH oxydase ou NOX…………………………….35 b. La NADPH phagocytaire ou NOX2……………………………………39 II-3-7. La mitochondrie …………………………………………………………42 a. La structure de la chaine respiratoire mitochondriale et de l’ATP synthase…………………………………………………………………….43 b. Le fonctionnement mitochondrial et la production de FRO……………45 c. La modulation de l’activité mitochondriale…………………………….48 d. L’effet des FRO sur la mitochondrie…………………………………...51 III. Maintien de la balance…………………………………………………………………52 III-1. Systèmes antioxydants endogènes enzymatiques……………………………….53 III-1-1. La superoxyde dismutase ou SOD……………………………………...53 a. Structure et fonction de la SOD1….........................................................54 b. Structure et fonction de la SOD2……………………………………….55 c. Structure et fonction de la SOD3……………………………………….56 III-1-2. La catalase………………………………………………………………57 III-1-3. La glutathion peroxydase……………………………………………….58 III-1-4. Les peroxyrédoxines et les thiorédoxines……………………………….59.

(26) III-2. Systèmes antioxydants endogènes non enzymatiques………………………….60 III-2-1. La bilirubine…………………………………………………………….60 III-2-2. L’acide lipoïque ………………………………………………………...61 III-2-3. Le glutathion…………………………………………………………….64 III-2-4. Le coenzyme Q10……………………………………………………….65 III-2-5. L’acide urique…………………………………………………………..65 III-2-6. La mélanine……………………………………………………………..66 III-2-7. La mélatonine…………………………………………………………...66 IV. Rupture de la balance…………………………………………………………………..67 IV-1. Facteurs contribuant à augmenter le stress oxydant……………………………67 IV-2. Une alimentation déséquilibrée : un facteur important de stress oxydant………69 IV-3. Dommages créés aux biomolécules par le stress oxydant………………………70 IV-3-1. Dommages oxydatifs de l’ADN………………………………………...70 a. Oxydation de l’ADN par le radical hydroxyle………………………….70 b. Formation d’adduits avec les aldéhydes ………………………………71 IV-3-2. Dommages oxydatifs des protéines……………………………………..73 IV-3-3. Dommages oxydatifs des lipides ……………………………………….77 V. Evaluation biologique du statut de stress oxydant…………………………………….82 V-1. Détermination directe des ERO…………………………………………………..83 V-1-1. Anion superoxyde………………………………………………………..84.

(27) a. Chimiluminescence……………………………………………………..84 b. Résonance Paramagnétique Electronique (RPE)……………………….85 V-1-2. Peroxyde d’hydrogène …………………………………………………..86 a. Détection en présence de peroxydase…………………………………..86 b. Détection par fluorescence via la dichlorofluorescéine (DCF)………...87 V-2. Mesure de la capacité antioxydante globale ……………………………………..88 V-3. Mesure indirecte des lésions……………………………………………………...91 V-3-1. Peroxydation lipidique …………………………………………………..91 V-3-2. Oxydation des protéines…………………………………………………92 V-3-3. Oxydation de l’ADN…………………………………………………….93 V-4. La génomique et la protéomique…………………………………………………95 VI. Utilité d’un bilan sanguin de stress oxydant ………………………………………....97 VII. Stress oxydant et pathologies humaines……………………………………………...98 VIII. Lutte contre le stress oxydant……………………………………………………....103 VIII-1. Prévention nutritionnelle……………………………………………………..105 VIII-1-1. Micronutriments……………………………………………………..105 a. Les vitamines………………………………………………………….105 i. La vitamine C……………………………………………………105 ii. La vitamine E…………………………………………………...106 iii. les caroténoïdes………………………………………………...108.

(28) b. Les oligoéléments …………………………………………………….108 i. Le zinc…………………………………………………………...108 ii. Le sélénium……………………………………………………..110 VIII-1-2. Microconstituants antioxydants……………………………………...111 a. Les composés phénoliques ou polyphénols ………………………….111 i. Les antioxydants phénoliques naturels ……………………….....111 ii. Les antioxydants phénoliques de synthèse……………………..114 b. Les sulfures d’allyle…………………………………………………...115 VIII-2. L’approche biologique……………………………………………………….116 Conclusion…………………………………………………………………………………..118 Résumé Références bibliographique.

(29) LISTE DES FIGURES Figure 1: La dégradation de l’hypoxanthine en acide urique…………………………..……..34 Figure 2: Les différents isoformes de la NADPH oxydase…………………………………...36 Figure 3 : Assemblage et activation de la NOX phagocytaire (NOX2)……………….……...40 Figure 4. Cascade d’activation de Nox 2 et formation d’anion superoxyde……………........41 Figure 5 : la chaîne respiratoire mitochondriale d’après Mandavilli et al……………….......44 Figure 6 : la répartition des FRO au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale d’après Beal et al………………………………………………………………………………….…...48 Figure7 : Anion superoxyde (O2●–) et superoxyde dismutase (SOD)……………………….54 Figure 8 : Structure chimique de l’acide alpha-lipoïque et de l’acide dihydrolipoïque…… 62 Figure 9 : Mécanismes de protection des antioxydants endogènes (vitamines C et E, glutation) par les acides alpha-lipoïque et dihydrolipoïque……………………………………………...63 Figure 10 : Produits endogènes de l’ADN………………………….………………………...73 Figure 11. Produits endogènes de la chaîne latérale des acides Aminés………………..……77 Figure 12. Produits formés à partir des phospholipides………………………………….…...82 Figure 13. Schéma de l’effet Zeeman électronique et du signal RPE………………….……..85 Figure 14. Schéma récapitulatif de formation de DCF lors de la détection intracellulaire de H2O2………………………………………………………………………………..………...87 Figure 15: Photographie de l’appareil RPE mobile type JEOL FR30 permettant la mise en.

(30) évidence de radicaux libres dans des échantillons sanguins. Spectre RPE du radical ascorbyl dans le plasma humain. ………………………………………………………….…………...89 Figure 16 : Illustration de la peroxydation lipidique……………..…………………………..91 Figure 17 : Formation d’un adduit MDA-TBA…………………………….………………...92 Figure 18: Dosage de l’ADN oxydé par l’essai “COMET”…………………….……………94 Figure 19 : principe des puces à ADN………………………………………….…………….96 Figure 20 : Conséquences pathogènes du stress oxydant …………………………………102 Figure 21 : Structure de la vitamine c…………………… ………………………………...105 Figure 22 : Structure de la vitamine E……………………………………………..……….106 Figure 23 : Quelques flavonoïdes………………………………………………………..….113 Figure 24 : Effets antioxydants des constituants de l’alimentation……………………….116.

(31) Liste des tableaux Tableau I: Les principales espèces réactives de l’oxygène ……………………………..……18 Tableau II : Propriétés oxydo-réductrices des espèces réactives de l’oxygène………..……23 Tableau III : Les NADPH oxydases - localisations, rôles et facteurs régulateurs……..…….37 Tableau IV : Les systèmes antioxydants chez l’homme……………………………..……….53 Tableau V : Effet de l’alimentation sur l’oxydation de l’ADN…………………….…… ….70 Tableau VI : Relations entre les maladies et le stress oxydant…………………….…….…101 Tableau VII : Les grandes familles de polyphénols………………………………….…..…112.

(32) LISTE DES ABREVIATIONS ADN. acide désoxyribonucléique. ADNmt. ADN mitochondrial. ADNn. ADN nucléaire. AOX. antioxydant. AGPI. Acide gras polyinsaturée. ATP. adénosine triphosphate. CAG. capacité antioxydante globale. CAT. catalase. CYP. cytochrome P450. Cys. cystéine. Cyt c. cytochrome C. Da. dalton. DUOX. dualoxidase. ERO/EOA. espèces réactives de l’oxygène. EGF. epidermal growth factor. FAD. flavine adénine dinucléotide. FRO. formes réactives de l’oxygène. GDP. guanine diphosphate. GPx. glutathion peroxydase. GR. glutathion réductase. GSH. glutathion. GSSH. glutathion bisulfure.

(33) GST. glutathion transférase. GTP. guanine triphosphate. 4-HNE. 4 hydroxynonénal. HO2•. Hydroperoxyle. HOCl. Acide hypochlorique. H2O2. peroxyde d’hydrogène. KDa. Kilo dalton. LOO•. radical lipoperoxyde. LOOH. hydroxylipoperoxyde. LOOP. peroxyl lipidique. MDA. malone-dialdéhyde. 2-ME. 2-méthoxy. NADH. nicotinamide adénosine dinucléotide. NADPH. nicotinamide adénosine dinucléotide phosphate. NO. monoxyde d’azote. NOX. NADPH oxydase. O2•-. anion superoxyde. O2. dioxygène. OH•. radical hydroxyle. ONOOH. nitroperoxyde. ONOO-. Peroxinitrites. PDGF. platelet direvated growth factor. P38-MAPK. p38 mitogen activated protein kinase. RAC. Oncogène RAC. RAS. Oncogène RAS (Rous avian sarcoma).

(34) Rho-GDI. Rho GDP-dissociation inhibitor. ROO•. Radical peroxyle. SAPKs. Stress Activating Protein Kinase. SOD. superoxyde dismutase. TBA. thiobarbiturique. Trx. thiorédoxine. XDH. xanthine déshydrogénase. XO. xanthine oxydase.

(35) Introduction “Oxygen has been a trouble-maker since the very beginning.” Doris Aberlo “The same thing that makes you live can kill you in the end” Neil Young. Découvert par Scheele en 1772, l’Oxygène (ou dioxygène O2) fut identifié dans l’air par Lavoisier en 1774 qui décrivit son rôle capital dans la combustion et lui donna son nom à partir du grec oxys et gennan ce qui signifie « qui génère de l’acide ». Il est le premier à lui soupçonner un rôle néfaste mais il fût guillotiné avant d’avoir pu le prouver.. Gaz indispensable à la vie, l’oxygène est nécessaire pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine tri-phosphate (ATP) par l’intermédiaire des chaînes mitochondriales de transport d’électrons. Ce gain d’électrons aboutit à la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), appelées également formes réactives de l’oxygène par certains auteurs, au potentiel oxydant très élevé dont font partie les radicaux libres.. Les radicaux libres ont été découverts dans les systèmes biologiques il y a près de soixante ans. C’est en 1956 qu’Harman évoque une hypothèse concernant le vieillissement cellulaire : il serait dû à l’accumulation des dommages cellulaires et moléculaires causés par les radicaux libres dus à l’oxygène. Ces radicaux libres, utiles à l’organisme à faibles doses, sont produits par divers mécanismes physiologiques. Lorsque la production devient excessive, les différents systèmes antioxydants se mettent en place mais peuvent être -1-.

(36) dépassés. Ce déséquilibre entre la production des ERO et les capacités cellulaires anti-oxydantes correspond au stress oxydant. Le stress oxydant est étroitement lié au vieillissement cellulaire et à de nombreuses pathologies.. L’importance physiologique des multiples actions des espèces réactives de l’oxygène, et la composante «stress oxydant» de nombreux processus pathologiques justifient l’intérêt de ce travail dont les objectifs sont : • La compréhension des mécanismes de maintien de l’équilibre de la balance entre les pro-oxydants et les systèmes de défense (antioxydants). • La détermination des facteurs contribuant à la rupture de cette balance. • L’évaluation biologique du statut de stress oxydant. • La détermination de l’impact des espèces réactives de l’oxygène (ERO) dans la pathologie humaine et le rôle des antioxydants dans la réduction et la prévention du stress oxydant.. -2-.

(37) I. Rappels sur le stress oxydant I-1.. Le paradoxe de l’oxygène. L’oxygène, apparu voici trois milliards d’années dans l’atmosphère terrestre, est une molécule indispensable à la vie. Comme source d’énergie, les organismes. dits. aérobies. utilisent. des. réactions. d’oxydo-réduction. (chimiotrophes) reposant sur des interactions entre donneurs d’électrons (réducteurs) et accepteurs d’électrons (oxydants). L’oxygène, en tant que récepteur final d’électrons dans l’organisme, se transforme en molécules d’eau au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette réaction est importante puisqu’elle est associée avec la production de 38 molécules d’adénosine triphosphate (ATP) à haut potentiel énergétique (contre 2 seulement dans un processus anaérobie). Le processus de réduction de l’oxygène en eau n’est toutefois pas parfait car 2 à 3 % de l’oxygène sont transformés en espèces réactives de l’oxygène (ERO) particulièrement réactionnelles [1]. Dans une première étape, le radical libre anion superoxyde est formé, ce qui conduit par la suite à la production d’autres ERO comme le peroxyde d’hydrogène, l’oxygène singulet, le radical hydroxyle, l’acide hypochloreux, des dérivés nitrés, ... De part leur nature instable, les ERO sont toxiques et interagissent avec toute une série de substrats biologiques importants. Des dénaturations de protéines, des inactivations d’enzymes, une oxydation du glucose, des cassures au niveau de l’ADN avec possibilité de mutation et des processus de peroxydation lipidique peuvent alors apparaître avec des conséquences souvent irréversibles pour la cellule [2].. -3-.

(38) I-2. Le radical libre. Il s’agit d’un atome ou d’une molécule qui contient un (ou plusieurs) électron(s) non paire(s), comme conséquence de la perte d’un (ou plusieurs) électron(s) de l’orbite externe, aboutissant à la formation d’une demi-liaison qu’il faut satisfaire par un pillage local d’électron(s). Les radicaux libres réagissent avec les tissus voisins causant des lésions oxydatives par extension de proche en proche, lésant les acides nucléiques, les lipides, les protéines et les hydrates de carbone. Les espèces réactives de l’oxygène peuvent être des radicaux libres (O2-. : anion superoxyde, .OH : radical hydroxyle) ou des molécules non radicalaires mais néanmoins hautement instables (O2 singulet).La plupart des radicaux libres proviennent de la chaîne respiratoire, du NADPH, et de l’activité de la xanthine oxydase, alors que les espèces réactives du NO sont essentiellement produites par la NO-synthase. La production de radicaux libres est donc largement physiologique: elle est déterminée, dirigée, et utile. Parmi les exemples les plus communs, on peut citer la production de superoxyde pendant la phagocytose, et la libération de NO par l’endothélium, qui constitue un des mécanismes de régulation du tonus vasculaire. Les radicaux libres interviennent aussi dans la signalisation cellulaire. Bien que physiologique, la production de radicaux libres peut être accidentelle et potentiellement délétère, comme par exemple la fuite d’électrons de la chaîne respiratoire mitochondriale, ou ceux résultant de l’auto-oxydation des catécholamines. Cette production radicalaire est dommageable si elle est prolongée ou incontrôlée, dépassant les capacités de neutralisation de -4-.

(39) l’organisme. D’autres productions sont anormales, pathologiques, toujours dommageables, et sans objectif physiologique, comme par exemple celles résultant de la fumée de cigarettes, des polluants, de l’ozone ou survenant lors d’ischémie–reperfusion tissulaire [3].. I.3 La défense antioxydante. Notre organisme est équipé de tout un système complexe de défenses antioxydantes. enzymatiques. et. non. enzymatiques,. localisé. dans. les. compartiments intra- et extracellulaire. Un antioxydant (AOX) est une substance qui inhibe ou retarde significativement l’oxydation d’un substrat, alors qu’elle présente une concentration très faible dans le milieu où elle intervient [4,3].. Les antioxydants agissent de plusieurs manières. Leur mécanisme d’action peut être direct ou indirect, en tant que partie de la structure d’enzymes et/ou cofacteurs d’enzymes antioxydantes, comme dans le cas des éléments traces (Cu, Fe, Mn ,Zn …). Les mécanismes les plus fréquents sont l’interruption de la spirale oxydative (vitamines C et E, NADPH, glutathion), la prévention des dégâts par la mise à disposition d’électrons (céruloplasmine, vitamine C, superoxyde dismutase, GSHPx), et la réparation des molécules de DNA (Zn, acide folique, niacine). Les antioxydants sont interdépendants. En donnant un électron, ils deviennent eux-mêmes des radicaux libres qui doivent se rééquilibrer, autrement dit être réduits : ainsi le tocophéryl résultant de l’oxydation. du. tocophérol,. dépend. -5-. de. l’ascorbate. qui. devient. du.

(40) déhydroascorbate, lui-même régénéré par le glutathion, qui dépend à son tour de la NADPH pour sa réduction, constituant une spirale antioxydante [3].. I.4 La définition du stress oxydant. La perturbation de l’équilibre endogène entre radicaux libres et antioxydants de courte ou longue durée, provoque des effets délétères dus, soit à une défense antioxydante défaillante, soit à un état pro-oxydatif accru, nommé stress oxydant [5, 3]. En 1991, Sies a défini la notion de stress oxydant comme l’incapacité de l’organisme à se défendre contre l’agression des ERO, suite à un déséquilibre lié, soit à une production accrue des ERO, soit à une diminution de la capacité de défenses antioxydantes [6]. Un déséquilibre redox prolongé a des conséquences en pathologie et dans le vieillissement des tissus [7].. -6-.

(41) II. Espèces réactives de l’oxygène II.1 Principales formes réactives de l’oxygène. Les principales formes réactives de l’oxygène ou FRO sont énumérées dans le tableau I : Tableau I: Les principales espèces réactives de l’oxygène [8].. II.2 Aspect physicochimique des ERO. Il est maintenant reconnu que de nombreux désordres pathologiques impliquent, à un degré plus ou moins important, le stress oxydant. Celui-ci est caractérisé par l’intervention d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) qui sont des espèces chimiques dérivant du dioxygène O2, par réduction. C’est ainsi que le radical superoxyde (O2.-) provient formellement de l’addition d’un seul -7-.

(42) électron sur le dioxygène [réaction (1)], tandis que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) résulte de l’addition de deux électrons sur le dioxygène et par conséquent de l’addition d’un seul électron sur le radical superoxyde [réaction (2)]. Quant au radical hydroxyle (.OH), il est le produit de la réduction du peroxyde d’hydrogène par un seul électron [réaction (3)]. Les espèces O2.-, H2O2 et .OH constituent les protagonistes majeurs du stress oxydant. Les sources cellulaires de ces ERO sont principalement d’origine mitochondriale (chaîne respiratoire) [9], mais elles peuvent également provenir de divers processus métaboliques comme par exemple la transformation de certains xénobiotiques par les systèmes enzymatiques de type cytochrome P450 [10].. Alors que le dioxygène qui a donné naissance à ces espèces est chimiquement peu réactif, les ERO possèdent une réactivité chimique qui leur est propre et qui est, le plus souvent, délétère vis-à-vis des biomolécules. La connaissance de leurs propriétés physico-chimiques, c’est-à-dire de leurs propriétés thermodynamiques et cinétiques, permet de mieux comprendre la réactivité chimique au niveau moléculaire de ces entités. Il est alors possible de prévoir le rôle potentiellement toxique que les ERO peuvent jouer dans de nombreux désordres pathologiques [11].. -8-.

(43) II-2-1 Propriétés thermodynamiques. La spontanéité thermodynamique d’une réaction chimique est donnée par la valeur algébrique de sa variation d’enthalpie libre standard (∆G°). Lorsque la réaction chimique est une réaction d’oxydo-réduction, comme c’est le cas pour les réactions impliquant des radicaux libres, la variation d’enthalpie libre standard est reliée aux potentiels standard des couples mis en jeu(∆G°= nF∆E°, n étant le nombre d’électrons échangés, F la charge d’une mole d’électrons (96 500 Coulomb) et ∆E° la différence entre le potentiel standard du couple oxydant (E°couple. ) et celui du couple réducteur (E°couple. Ox. Red. )). La. spontanéité thermodynamique (∆G°< 0) peut alors être corrélée à la variation de potentiel standard de la réaction d’oxydo-réduction (∆E°> 0). Remarquons que ∆E°> 0 résulte de la supériorité de E°couple Ox devant celle de E°couple Red (E°couple Ox> E°couple Red). Les principaux couples d’oxydo-réduction (Ox/Red) des ERO, ainsi que leurs potentiels standards à pH =7 (E° Ox/Red) sont rassemblés dans le tableau II. Les valeurs de E° élevées (et positives) traduisent un pouvoir oxydant important, tandis que les valeurs de E° négatives impliquent un effet réducteur.. Le potentiel standard le plus élevé (2,34 V.) (tableau II) caractérise le couple .OH/H2O et traduit le grand pouvoir oxydant du radical hydroxyle, par échange d’un seul électron. En effet, parmi les ERO, le radical .OH est celui qui, thermodynamiquement, est le plus avide d’électron. Il est capable d’oxyder tout réducteur appartenant à un couple dont le potentiel standard est inférieur à 2,34. -9-.

(44) V. Ce qui est le cas de la majorité des composés bio-organiques (l’inégalité E° OH/H2O > E° Ox/Red, implique la réaction spontanée de .OH avec Red).. .. L’espèce la plus réductrice est le radical superoxyde O2.- (-0,33 V) (tableau II). Celui-ci est donc susceptible d’être oxydé en dioxygène par tout oxydant appartenant à un couple dont le potentiel standard est supérieur à -0,33 V. Remarquons que le radical superoxyde O2.- peut également être oxydant (0,93 V) (tableau II) en donnant naissance à du peroxyde d’hydrogène.. Une autre propriété importante des radicaux libres est leur capacité à réagir entre eux. Cette propriété peut être directement déduite des potentiels standards. Par exemple, le radical hydroxyle réagit sur lui-même pour former du peroxyde d’hydrogène [réaction (4)]. Cette réaction est thermodynamiquement favorable en raison de l’inégalité suivante qui est vérifiée : E° .OH/H2O > E° H2O2/.OH (2,34 V > 0, 30 V) (tableau II). De même, le radical superoxyde réagit sur luimême pour donner du dioxygène et du peroxyde d’hydrogène [réaction (5)], car l’inégalité entre les potentiels standard est favorable (0,93 V > - 0,33 V) (tableau II). Dans ce dernier cas, la réaction s’appelle une réaction de dismutation, car le radical superoxyde donne naissance conjointement à une espèce plus oxydée (O2) et à une espèce plus réduite (H2O2) que lui-même.. - 10 -.

(45) Dans le cas des couples échangeant deux électrons (O2/H2O2 et H2O2/H2O), il est également aisé de démontrer que la réaction de dismutation du peroxyde d’hydrogène [réaction (6)] est thermodynamiquement favorable (1,34 V > 0,30 V) (tableau II).. Enfin, remarquons qu’entre O2 et H2O, il y a un échange de quatre électrons (tableau II), ce qui correspond à l’échange effectué lors des réactions de combustion. En résumé, les potentiels standards d’oxydoréduction des couples concernant les intermédiaires réduits de l’oxygène permettent de prévoir les réactions thermodynamiquement possibles entre ERO, mais également les réactions des ERO avec les substrats biologiques (bases de l’ADN, nucléotides, acides aminés, peptides, protéines, phospholipides…). Formellement, cela nécessite la connaissance des potentiels standards des couples biologiques correspondants et, en particulier des couples échangeant un seul électron. Cependant, ces potentiels standards sont loin d’être tous connus et pratiquement, l’étude expérimentale des processus radicalaires pallie souvent l’absence de données [12, 13].. - 11 -.

(46) Tableau II : Propriétés oxydo-réductrices des espèces réactives de l’oxygène [12].. II-2-2 Propriétés cinétiques. La vitesse d’une réaction chimique (thermodynamiquement spontanée) est un paramètre crucial de la réactivité entre deux molécules (radicalaires ou non). Rappelons brièvement que la vitesse d’une réaction chimique entre deux réactifs est proportionnelle à la concentration de ces réactifs, le coefficient de proportionnalité symbolisé par k étant appelé la constante de vitesse. Celle ci est toujours inférieure ou au plus égale à une valeur limite supérieure (1010 mol-1 .L.s-1) imposée par la diffusion des molécules. Par exemple, les réactions chimiques entre espèces non radicalaires ont généralement des constantes de vitesse plutôt faibles (comprises entre 10-2et 102 mol-1.L.s-1), ce qui traduit le fait que ces réactions ne peuvent avoir lieu sans un apport énergétique supplémentaire (énergie d’activation) limitant ainsi la vitesse de la réaction. Au - 12 -.

(47) contraire, dans le cas des réactions chimiques mettant en jeu des espèces radicalaires, les constantes de vitesse sont généralement très élevées et par conséquent très proches de la valeur limite (1010 mol-1.L.s-1), ce qui signifie que la réaction se produit à chaque rencontre entre un radical et sa cible moléculaire (sans apport énergétique particulier). Prenons le cas du radical hydroxyle .OH qui illustre parfaitement notre propos. Ses constantes de vitesse avec de nombreux substrats biologiques (bases de l’ADN, nucléotides, acides aminés, peptides, acides gras polyinsaturés, phospholipides…) sont de l’ordre de 108 à 1010 mol-1.L .s-1 [14]. Par conséquent, la durée de vie d’un radical hydroxyle en milieu biologique est extrêmement faible, elle ne dépasse pas quelques microsecondes (10-6s). Le radical .OH est donc une espèce qui ne diffuse quasiment pas au sein des milieux biologiques et qui réagit sur le lieu même de sa production, ce qui lui confère une toxicité extrême. Le radical superoxyde O2.- a une réactivité beaucoup plus nuancée dans la mesure où, mis à part quelques cibles spécifiques (en particulier les enzymes superoxyde dismutases, SODs, dont il est le substrat (k (O2.- + SOD) = 2.109 mol-1.L.s-1)), il réagit très lentement avec les molécules biologiques. Ses constantes de vitesse sont généralement inférieures à 102 mol-1.L .s-1 , vis-à-vis de nombreux substrats bio-organiques (ADN et ses constituants, protéines et leurs constituants, lipides membranaires…) [15]. Cependant, le radical superoxyde se dismute relativement rapidement à pH = 7 (constante de vitesse : 6.105 mol-1.L.s-1 [15]), en l’absence d’enzyme, si bien qu’il disparaît plus vite en réagissant sur lui-même qu’en attaquant les systèmes moléculaires. Par. - 13 -.

(48) conséquent, le radical superoxyde ne présente pas de toxicité « directe » vis-àvis des matériaux biologiques. Toutefois, la présence in vivo d’enzymes telles Que les SODs, qui accélèrent sa dismutation [réaction (5)], semble impliquer un effet relativement délétère des radicaux O2.- . Les différentes hypothèses rendant compte de cette toxicité « différée» sont proposées dans le prochain paragraphe.. D’autres radicaux libres, comme les radicaux peroxyles RO2. appartenant eux aussi à la famille des ERO, possèdent des propriétés cinétiques intéressantes. Ces dernières seront évoquées à l’occasion de la description du mode d’action des radicaux hydroxyles (également dans le prochain paragraphe).. II-2-3 Modes d’action des radicaux superoxydes et hydroxyles Comme nous venons de le voir, les radicaux O2.- ne réagissent pas directement avec les substrats bio-organiques. Les hypothèses permettant de mieux comprendre sa toxicité « différée » mettent toutes l’accent sur la possibilité pour les radicaux superoxydes d’être à l’origine de la formation d’autres espèces radicalaires (ou moléculaires), beaucoup plus réactives qu’euxmêmes. C’est ainsi que, selon Haber et Weiss [16,25], le radical superoxyde réagirait avec le peroxyde d’hydrogène [réaction (7)] en donnant naissance à des radicaux hydroxyles dont on connaît l’extrême toxicité. Cependant, cette réaction qui, en réalité est très lente, nécessite la présence d’un catalyseur (Fe3+) pour être efficace. Une deuxième hypothèse concerne la formation d’anion peroxynitrite ONOO- via la réaction bi-radicalaire entre le radical superoxyde et - 14 -.

(49) le monoxyde d’azote .NO [réaction (8)]. Le peroxynitrite est connu pour endommager de nombreuses cibles biologiques (ADN, protéines, lipides…) [17,25]. Une troisième hypothèse est relative à la formation de peroxyde d’hydrogène H2O2 par réaction de dismutation des radicaux superoxydes [réaction (5)], le peroxyde d’hydrogène étant à l’origine de l’apparition de radicaux hydroxyles par la réaction de Fenton [réaction (9)] en présence de traces de cations métalliques [18 ,25]. Remarquons enfin, que la forme protonée HO2. (forme acide conjuguée de O2.-, pKa (HO2./O2.- = 4,8)) est sensiblement plus réactive que la forme basique O2.- [15 ,25]. Cette observation constitue une quatrième hypothèse de toxicité « différée » des radicaux superoxydes via une diminution de pH. Il est possible que chacune de ces hypothèses participent ensemble, ou séparément, selon les circonstances, aux effets délétères des radicaux superoxydes.. Dans le cas des radicaux hydroxyles, l’attaque des molécules biologiques est directe et elle se traduit par leur oxydation mono-électronique (enlèvement d’un seul électron à la fois), générant ainsi d’autres radicaux libres localisés sur les cibles elles mêmes. Les sites radicalaires, ainsi créés, peuvent apparaître sur. - 15 -.

(50) des atomes de carbone, d’azote, de soufre ou d’oxygène. Les oxydations initiées par les radicaux .OH peuvent s’effectuer selon trois voies possibles : — La première est un transfert de charge illustré ici par la réaction du radical OH sur la glycine (acide aminé constitutif des protéines) [réaction (10)]. Cette. .. réaction permet au radical hydroxyle de s’emparer d’un électron apparié (ici un électron du doublet de l’atome d’azote) et de générer un site radicalaire sur la fonction amine de la glycine (sous sa forme déprotonée).. — La deuxième voie est relative à l’arrachement d’un atome d’hydrogène, H, sur les molécules organiques. À titre d’exemples, les réactions (11) et (12) illustrent ce phénomène sur la molécule de glycine (sous sa forme amphotère). Deux sites radicalaires différents peuvent ainsi être formés, l’un sur l’atome d’azote [réaction (11)], l’autre sur l’un des atomes de carbone [réaction (12)].. — La troisième voie s’exprime au niveau des systèmes moléculaires comportant des doubles liaisons, comme par exemple, les bases de l’ADN (guanine,adénine, cytosine, thymine), les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine, phénylalanine, histidine), ou encore les acides gras polyinsaturés. En effet, les radicaux hydroxyles, toujours avides d’électrons, s’additionnent sur les doubles. - 16 -.

(51) liaisons en donnant naissance à des sites radicalaires sur des atomes de carbone. La réaction (13) symbolise ce dernier mode d’action.. Les sites radicalaires générés à la suite de l’action des radicaux .OH sur les différentes cibles biologiques ont une réactivité chimique propre qui a pu être mise en évidence grâce à de nombreuses études in vitro effectuées sur des modèles plus simples que la réalité biologique. Ainsi, la caractérisation de l’action des radicaux hydroxyles sur l’ADN a nécessité l’étude de chaque base de l’ADN prise séparément, puis l’étude de certains nucléotides, celle des polynucléotides et enfin celle de l’ADN [19, 20, 25]. Les résultats de ces recherches, depuis une quinzaine d’années, ont permis d’identifier les divers dommages chimiques « stables » (c’est-à-dire non radicalaires) formés à la suite de l’action des radicaux hydroxyles sur l’ADN. Parmi les lésions chimiques qui ont pu être caractérisées, outre celles des quatre bases oxydées, citons les ruptures de brins (simples ou doubles) résultant non pas de l’attaque des radicaux .OH sur les bases, mais de leur réaction sur les groupes sucrephosphates, les sites abasiques issus également de l’attaque des radicaux .OH sur les groupes sucre-phosphates, ainsi que. les pontages ADN-protéines. provenant de réactions bi-radicalaires « mixtes » entre l’ADN et les protéines qui l’entourent. Dans le cas des dommages oxydatifs infligés aux protéines par les radicaux hydroxyles, la même démarche expérimentale que celle précédemment évoquée dans le cas de l’ADN, a été appliquée, c’est-à-dire des modèles les plus simples (acides aminés pris séparément) aux plus compliqués (protéines et complexes protéiques). Les résultats font apparaître diverses - 17 -.

(52) lésions chimiques « stables » [21,25], parmi lesquelles les fonctions carbonyles (-C = O) occupent une place importante. La carbonylation des protéines résulte de l’oxydation (par enlèvement d’atomes H) des chaînes saturées d’acides aminés aliphatiques comme par exemple la glycine ou l’alanine [22,25]. Dans le cas des acides aminés comportant un atome de soufre (méthionine, cystéine), celui-ci peut-être la cible des radicaux .OH conduisant alors à des fonctions sulfoxydes (-SO), à des ponts disulfures (-S-S-) ou à des fonctions sulféniques (S-OH). Quant aux acides aminés aromatiques, par addition des radicaux hydroxyles sur les doubles liaisons, ils donnent lieu à des oxydations spécifiques comme par exemple la formation de bityrosine dans le cas de la tyrosine et celle de N-formylkynurénine dans le cas du tryptophane. À côté de ces lésions oxydatives, des phénomènes de fragmentation des chaînes polypeptidiques sont également observés. Soulignons le fait que la fragmentation se produit non pas au niveau des liaisons peptidiques (-CONH) qui relient les acides aminés entre eux, mais au niveau des chaînes aliphatiques carbonylées.. Cependant, tous les acides aminés d’une même protéine ne sont pas « égaux » face à l’attaque des radicaux hydroxyles, en raison de la structure tridimensionnelle de chaque protéine qui permet de distinguer les acides aminés de « surface », accessibles au solvant, des acides aminés « masqués», situés dans les zones hydrophobes de la protéine. C’est ainsi que certains sites actifs enzymatiques localisés au plus « profond » des chaînes polypeptidiques sont peu sensibles à l’action des radicaux hydroxyles, le pourcentage d’inactivation ne dépassant pas 10 % de l’ensemble des radicaux hydroxyles initiateurs du. - 18 -.

(53) phénomène [23,25]. Cela signifie que la majeure partie des radicaux .OH (90 %) disparaissent, par réaction avec les acides aminés qui leur sont accessibles, avant de pouvoir atteindre le site enzymatique. Si les dommages oxydatifs générés par action des radicaux hydroxyles sur l’ADN, ou les protéines, sont de mieux en mieux caractérisés, leurs mécanismes de formation ne sont pas toujours parfaitement élucidés. Cependant, le trait commun de ces mécanismes est l’intervention d’intermédiaires radicalaires tels que les radicaux peroxyles, RO2. qui appartiennent eux aussi à la famille des ERO. En effet, les peroxy-radicaux apparaissent comme des radicaux « secondaires » issus de l’addition de dioxygène sur les sites radicalaires carbonés R. [réaction (14)], provenant euxmêmes de l’attaque des radicaux .OH sur les molécules organiques. Les constantes de vitesse de ce type de réactions sont de l’ordre de 108 à 109 mol-1 .L.s-1, quelle que soit la nature du radical R., si bien que la vitesse des réactions correspondantes est très élevée. En présence de dioxygène (milieu aéré), il y a transformation totale des radicaux centrés sur le carbone, en radicaux centrés sur l’oxygène.. Les radicaux peroxyles RO2. sont des espèces oxydantes. Leurs propriétés cinétiques sont intermédiaires entre celles des radicaux hydroxyles et celles des radicaux superoxydes. En effet, leurs constantes de vitesse sont généralement comprises entre 102 et 108 mol-1 .L.s-1 , ce qui leur confère une certaine toxicité directe. Parmi leurs modes d’action qui sont très divers [24,25], soulignons celui de l’arrachement d’atome H qui joue un rôle particulièrement important dans la peroxydation des lipides membranaires. Ces derniers, en raison du - 19 -.

(54) rapprochement des longues chaînes carbonées qui les constituent, sont regroupés en structures compactes qui autorisent la propagation des dommages radicalaires. Ainsi, un radical peroxyle lipidique, symbolisé ici par LO2., peut aisément arracher un atome d’hydrogène d’une chaîne carbonée voisine (LH), initiant la formation d’un nouveau radical centré sur le carbone, L. [réaction (15)]. Ce dernier réagit alors avec l’oxygène pour donner naissance à un autre radical peroxyle [réaction (16)]. Les réactions consécutives (15) et (16) peuvent se répéter, provoquant la propagation en chaîne des lésions oxydatives au sein des systèmes membranaires.. Une telle propagation des sites radicalaires amplifie notablement le phénomène d’oxydation initié par les radicaux hydroxyles [25].. II-3. Les sources endogènes des formes réactives de l'oxygène. Dans l'organisme, il existe de nombreuses sources de formes réactives de l’oxygène (FRO) dont l’importance varie selon les tissus. On distingue deux groupes de FRO selon leur origine enzymatique ou non [26,28].. II-3-1 L’auto-oxydation des petites molécules. L'auto-oxydation de molécules telles que la dopamine, l'adrénaline, les flavines et les hydroquinones est une source de FRO [29]. Le produit direct de. - 20 -.

(55) ces auto-oxydations est souvent l'O2•-. Ainsi, l'auto-oxydation de la dopamine est en partie impliquée dans le processus apoptotique lors de pathologies neurodégénératives, notamment lors de la maladie de Parkinson [27]. Il a été mis en évidence que la formation de quinone par auto-oxydation de la dopamine endogène jouait un rôle majeur dans la dysfonction dopaminergique observée de Cette maladie [30,31]. II-3-2 Le peroxysome. Un peroxysome est un organite cellulaire entouré par une membrane simple et ne contenant pas de matériel génétique. Un peroxysome contient de nombreuses enzymes générant une grande quantité d’H2O2. Toutefois l'H2O2 généré est rapidement détoxifié par la catalase peroxysomale. Cette utilisation par la catalase joue un rôle particulier dans l’homéostasie. Cette réaction est particulièrement rénale et hépatique puisqu’un dysfonctionnement de la catalase peroxysomale accélère l'atteinte rénale chez les patients diabétiques [32].. II-3-3 Le réticulum endoplasmique et le cycle catalytique du cytochrome P450. Le réticulum endoplasmique est un sous compartiment de la cellule. Il est séparé. en. réticulum. endoplasmique. rugueux. et. lisse.. Le. réticulum. endoplasmique lisse contient des enzymes qui catalysent des réactions de détoxification des drogues liposolubles et d’autres métabolites toxiques. La plus. - 21 -.

(56) connue de ces enzymes est le cytochrome P450 qui oxyde les acides gras insaturés et les xénobiotiques tout en produisant des ERO.. Les cytochromes P450 (CYP450) sont des complexes enzymatiques qui utilisent le dioxygène pour oxyder un substrat [33,34]. Le fonctionnement des CYP450 requière un agent réducteur, généralement le NADPH. La réaction catalysée par le CYP450 peut être résumée par l’équation suivante :. Où AH est le substrat et RH2 l’agent réducteur. Il existe chez l’homme de multiples isoformes des CYP450 qui sont chacun spécifique d’un ou plusieurs substrats. Ces substrats peuvent être un stéroïde, un acide biliaire ou un xénobiotique. La réaction catalysée par le CYP450 peut parfois conduire à la formation d’O2•- lorsque l’O2 subit une réduction monovalente. Certains CYP450, tels que le CYP2E1 impliqué dans le métabolisme de l’alcool, sont particulièrement pourvoyeurs d'O2•-. La majorité des CYP 450 sont localisés dans le réticulum endoplasmique. Certains sont cependant de siège mitochondrial [35]. Ces CYP450 mitochondriaux possèdent une composante supplémentaire, la ferrédoxine qui joue le rôle de donneur d’électrons intermédiaire entre le NADPH et le substrat. Cette réaction de transfert est catalysée par la ferrédoxine réductase. Lorsque la concentration de ferrédoxine est limitée, la ferrédoxine réductase peut être responsable de la formation d'O2•- [36].. - 22 -.

(57) II.3.4 La xanthine oxydase. La xanthine oxydase (XO) est une des deux formes de la xanthine oxydoréductase (XOR), l’autre étant la xanthine déshydrogénase (XDH) chez l’homme [37]. La XOR est chez l'homme la principale enzyme responsable de la dégradation des bases puriques. Elle catalyse les deux dernières étapes, c’est à dire l’oxydation de l’hypoxanthine en xanthine et catalyse la xanthine en acide urique :. Figure 1: La dégradation de l’hypoxanthine en acide urique [38].. La xanthine oxydase est une enzyme soluble qui produit ainsi des ERO [38]. Cette enzyme est présente dans le sang, les cellules endothéliales des capillaires, et dans le foie et l'intestin grêle. La localisation cellulaire de la - 23 -.

(58) xanthine oxydase est principalement cytoplasmique. La production des ERO par la xanthine oxydase est faible en condition basale, mais jouerait un rôle dans les phénomènes d'ischémie - reperfusion [39-40]. La xanthine oxydase entraîne la réduction de l’oxygène en O2•-. Cependant, in vivo, l’essentiel de l’oxydation de la xanthine et de l’hypoxanthine est assuré par la xanthine déshydrogénase qui utilise préférentiellement comme accepteur d’électrons la NAD+ [37, 41, 42]. Dans les conditions normales, le métabolisme des bases puriques entraine donc une source négligeable d’anion superoxyde [34]. La conversion de la XDH en XO peut cependant survenir au cours du syndrome d’ischémie - reperfusion. Une forte production d’anion superoxyde est alors être observée au cours de ce phénomène [34].. II.3.5 Les enzymes de la voie de l’acide arachidonique. L’acide arachidonique provient de l’hydrolyse des phospholipides par la phospholipase A2. L'acide arachidonique est un acide gras polyinsaturé qui joue un rôle de second messager via une voie de signalisation impliquant le contrôle de la protéine kinase C et de la MAP kinase p38. Ainsi dans les phénomènes d’apoptose ou de prolifération cellulaire, on observe la libération de grandes quantités de FRO [43,44]. L'acide arachidonique est le substrat de la lipooxygènase pour la synthèse des leucotriènes. Cette synthèse met en jeu une série d’oxydations qui implique la production de FRO. La production de FRO par. - 24 -.

(59) cette voie pourrait jouer un rôle dans le cadre de l'initiation de la réponse inflammatoire.. II.3.6 NADPH Oxydase a. La famille de la NADPH oxydase ou NOX. La NADPH oxydase (NOX) est un complexe enzymatique membranaire qui catalyse la réaction d’oxydation de la NADPH par le dioxygène (O2), et produit ainsi du NADP+, du H+ et de l'O2•- [45-46]:. Les NOX sont des protéines multimériques transmembranaires. Elles siègent au sein de la membrane plasmique, membrane nucléaire et de certaines membranes intracellulaires, vacuoles phagocytaires ou phagosomes et vésicules sécrétoires (figure 2) [47].. - 25 -.

(60) Figure 2: Les différents isoformes de la NADPH oxydase [48]. Les membranes cellulaires sont indiquées en gris, les protéines essentielles en jaune, les protéines activatrices en vert et les protéines de liaison en bleu. PM : membrane plasmatique.. Chez l'Homme, il existe 7 variantes de la NADPH Oxydase: NOX 1, 2, 3, 4, 5 et DUOX (dualoxidase) 1 et 2. La NADPH oxydase a été initialement décrite dans les cellules phagocytaires (principalement NOX2) où elle joue un rôle fondamental dans la réponse immunitaire lors de la lutte contre les microorganismes. Les principales fonctions des NOX sont rappelées dans le tableau ci-dessous (tableau III).. - 26 -.

(61) Tableau III : Les NADPH oxydases - localisations, rôles et facteurs régulateurs [49, 47, 50, 51]. 51].. • Structures: Les différents homologues de la NADPH oxydase se distinguent par leur sous-unité alpha du flavocytochrome b558. NOX1, NOX3 et NOX4 possèdent une sous-unité alpha très proche de la sous-unité gp91 de NOX2. NOX5 possède à son extrémité N-terminale un domaine « calmoduline-like » contenant quatre sites de fixation du calcium. A ce titre NOX5 est inductible par le calcium [52]. Les enzymes DUOX possèdent également un domaine de fixation du calcium ainsi qu’un domaine à activité peroxydase à leur extrémité N-terminale, extracellulaire. Comme l’illustre la figure 3, toutes les isoformes de - 27 -.

(62) NOX sont des protéines membranaires et sont localisées dans la membrane plasmique. En outre, NOX1 a été trouvé à la membrane plasmique dans les cavéoles [53], NOX2 dans les membranes des phagosomes et NOX4 dans la membrane mitochondriale [54] et sur la membrane des cellules endothéliales [55], ainsi que dans le noyau [56].. La NOX2 est la seule NADPH oxydase phagocytaire. Les NADPH oxydases non phagocytaires présentent certaines caractéristiques fonctionnelles communes [57-58]: - leur activité enzymatique est environ trois fois plus faible que celle de NOX2. - après activation, la production d’anion superoxyde ne devient détectable qu’au bout de quelques minutes à quelques heures, contre quelques secondes pour la NOX2. - elles présentent une faible activité basale responsable d’une production continue d’anion superoxyde. - la plupart des NOX non phagocytaires siègent au niveau de la membrane plasmique. • Fonctions: Les NADPH oxydases exprimées sur des épithéliums de surface (colon, poumon…) ont un rôle de défense antibactérienne [50, 51, 59]. Les enzymes DUOX sont impliquées dans la biosynthèse des hormones thyroïdiennes [60]. Le rôle majeur des NOX est de participer à la transmission du signal en réponse à plusieurs hormones et facteurs de croissance. Ainsi l’activité de NOX1 et NOX4 est augmentée dans les cellules musculaires lisses vasculaires par la - 28 -.