Caractérisation biochimique et fonctionnelle des partenaires de la protéine chaperonne CDCH8 dans l'imunité dans les plantes

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Caractérisation biochimique et fonctionnelle des

partenaires de la protéine chaperonne CDCH8 dans

l’imunité dans les plantes

Hervé Begue

To cite this version:

Hervé Begue. Caractérisation biochimique et fonctionnelle des partenaires de la protéine chaperonne CDCH8 dans l’imunité dans les plantes. Sciences du Vivant [q-bio]. 2015. �hal-02800025�

Université de Bourgogne

Ecole Doctorale Environnements-Santé M2R Signalisation Cellulaire et Moléculaire

Année 2014-2015 ***

Par Hervé BEGUE

Caractérisation biochimique et fonctionnelle

de la protéine chaperonne Cdc48 dans

l’immunité des plantes

UMR 1347 Agroécologie INRA/Université de Bourgogne/AgroSup Dijon Pôle Mécanisme des Interactions Plantes-Microorganismes - ERL CNRS 6300 Equipe Monoxyde d’Azote et Immunité chez les Plantes

1

Sommaire

I. Introduction ... 2

II. Matériel et méthode ... 4

A. Matériel Biologique ... 4

B. Biologie moléculaire ... 5

C. Filtration sur gel en conditions natives ... 6

D. Pulldown sur billes NiNTA ... 6

E. Viabilité cellulaire : iodure de propidium ... 8

F. Etude de la production des formes actives de l’oxygène (FAO) ... 9

G. Etude de la production de monoxyde d’azote ... 9

III. Résultats ... 9

A. Analyse de l’accumulation de la protéine Cdc48 dans les cellules de tabac élicitées par la cryptogéine ... 9

B. Etude de l’accumulation du transcrit Cdc48 ... 10

C. Cdc48 forme un complexe hexamérique stable. ... 11

D. La protéine GFP-Cdc48 interagit in vitro avec la protéine His-ARF ... 13

E. Rôle de Cdc48 dans l’immunité – étude préliminaire ... 15

IV. Discussion et perspectives ... 18

V. Bibliographie ... 22

Abbréviations :AAA+ ATPase ATPase associated with diverse cellular activities, ADP Adenosine

di-phosphates, ARF ADP ribosyl transferase, ARF-GEF ARF Guanine-nucleotide exchange factor,

ARN Acide ribonucléique, AtMIN7 Arabidopsis thaliana HopM1 interactor 7, ATP Adenosine

triphosphate, Cdc48 cell division cycle 48, CDK cyclin-dependent kinase, CDPK Ca2+-dependent protein kinase, DAF-2DA 4,5-diaminofluorescein diacetate, DAF-2T DAF-2 triazole, DBeQ N2,N4-dibenzylquinazoline-2,4-diamine, dNTP déoxynucléoside triphosphate, DTT Dithiothréitol, EDTA Ethylène diamine tétra–acétique, ERAD Endoplasmic reticulum-associated degradation, FAO Formes actives de l’oxygène, GFP Green fluorescent protein, GTP Guanosine triphosphate, HDAC Histone déacétylase, HEPES acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique, HR Hypersensitive response, IPr Iodure de propidium, LB Lysogeny broth, MAPK Mitogen-associated protein kinase, NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, Ni-NTA Nickel nitrilotriacetic acid, NO Monoxyde d’azote, PAMP Pathogen-associated molecular pattern, PIC Protease cocktail inhibitor, PRR Pattern recognition receptor, RT Retrotranscription, qPCR Real time polymerase chain reaction, SAB Serum albumin bovin, SDS Sodium dodecyl sulfate,

SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis, TAE Tris acide acetique EDTA, TAP Tandem

2

I. Introduction

Dans leur environnement, les plantes sont soumises à des stress variés dont les stress biotiques. Pour faire face à des agressions par des microorganismes pathogènes, la plante met en place une réponse immunitaire. Elle est activée après reconnaissance via des récepteurs membranaires de la cellule végétale, les PRR (pattern recognition receptor), d’un ou plusieurs éléments moléculaires ou structuraux du pathogène (PAMP, pathogen-associated molecular pattern). La cellule hôte est également capable de reconnaître des effecteurs produits par les microorganismes pathogènes via des protéines dites de résistance. Les PAMP, comme les effecteurs, sont communément appelés éliciteurs (Jones & Dangl, 2006).

Suite à la reconnaissance des PAMP ou des effecteurs, une cascade de transduction du signal est initiée et se manifeste notamment par des influx de calcium (Ca2+) à travers la membrane plasmique, la production de formes actives de l’oxygène (FAO) par les NADPH-oxydases (RBOHD et F), la production des formes actives de l’azote comme le monoxyde d’azote (NO) et l’activation des protéines kinases comme les MAPK (mitogen-activated protein kinase) ou/et les CDPK (Ca2+-dependent protein kinase) (Meng & Zhang, 2013). L’ensemble de ces événements

aboutit à une reprogrammation génique permettant ainsi l’expression des gènes de défense pouvant être accompagnée d’une forme de mort cellulaire programmée localisée, la réponse hypersensible (HR hypersensitive response) (Trapet et al., 2015).

Le model tabac-cryptogéine permet d’étudier les réactions de défense des plantes (Bourque et al., 2011). Un traitement à la cryptogéine, protéine globulaire de 10 kDa produite par l’oomycète

Phythophthora cryptogea, permet de simuler une attaque de ce pathogène chez le tabac. La réponse

des cellules à cet éliciteur met en jeux les mêmes acteurs que ceux cités précédemment. Notons que dans ce modèle, les productions de NO et de FAO sont concomitantes, indiquant une régulation croisée entre ces deux entités. En effet, la production de NO est en partie régulée par les FAO produit par NtRBOHD et le NO régule négativement le taux de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Les

deux productions semblent de plus être régulées par des protéines HDAC-2 (histone désacétylases de type 2a et 2b) jouant le rôle de régulateur négatif de la mort cellulaire (Kulik et al., 2015). De plus, pour preuve de la complexité du model, il est intéressant de préciser que la réponse à la cryptogéine est dépendante du stade du cycle cellulaire dans lequel se trouve la cellule de tabac. En effet, le profil d’activation des MAPK et la production de FAO diffèrent lorsque les cellules se trouvent en en phase G1/S ou G2/M (Kadota et al., 2005).

Le NO exerce ses fonctions signalétiques en partie via la modulation de l’activité de protéines cibles par le biais de modifications post-traductionnelles. Celles-ci incluent la métal-nitrosylation, la tyrosine nitration et la S-nitrosylation (Besson-Bard et al., 2008). Chez le tabac, le NO produit suite

3 à un traitement à la cryptogéine induit la S-nitrosylation spécifique de 11 protéines dont Cdc48 (cell

division cycle 48) (Astier et al., 2012).

Cdc48 est une protéine chaperonne très conservée chez la levure, les mammifères (p97/VCP

vasolin-containing protein chez l’homme) et les plantes et qui appartient à la famille des AAA+

ATPase (ATPase associated with various activities). Cdc48 utilise l’énergie de l’ATP pour moduler la structure tridimensionnelle de protéines substrats mal conformées et rétablir leur conformation ou promouvoir leur dégradation via la voie du protéasome. D’un point de vue structural, la protéine chaperonne s’associe en homohexamère, forme active de la protéine, chaque sous-unité étant composée d’un domaine N-terminal, de deux domaines ATPasiques D1 et D2 et d’un domaine C-terminal. La structure générale de l’hexamère peut être décrite comme deux anneaux empilés formés par les domaines D1 et D2 et possédant leurs domaines N-terminaux projetés à l’extérieur de l’hexamère (Hanzelmann & Schindelin, 2011). Le domaine N-terminal est le site de fixation de la plupart des cofacteurs (Baek et al., 2013).

Ce sont les interactions avec les cofacteurs qui définissent dans quelle voie de signalisation la protéine Cdc48 est impliquée. Les cofacteurs interagissant de façon directe possèdent en général des domaines particuliers. Ces domaines sont de type UBX (ubiquitin regulatory x), UBX-like¸ la boîte SHP (suppressor of high-copy PP1, intervenant dans la macro-autophagie), le domaine VBM (VCP

binding motif) et le domaine VIM (VCP interacting motif) ou encore PUB et PUL (Stolz et al.,

2011).

Projet de recherche :

Les travaux précédents de l’équipe ont démontré que la S-nitrosylation de Cdc48 conduit à l’inhibition de son activité ATPasique in vitro (Astier et al., 2012). Toutefois, l’incidence de ce mécanisme et, plus généralement, la fonction de Cdc48 dans l’immunité des plantes ne sont pas/peu connus. L’objectif du présent travail a été d’initier l’étude du rôle de Cdc48 dans les réponses de défense de la plante en utilisant le modèle cryptogéine-tabac. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la dynamique d’accumulation de Cdc48 et à sa structuration lors de la réponse immunitaire déclenchée par la cryptogéine dans des cellules de tabac sauvages mais également dans la lignée cellulaire CL5 invalidée dans l’expression des protéines HDAC-2 et présentant une mort cellulaire exacerbée. Dans un deuxième temps, nous avons tenté de confirmer son interaction avec la protéine ARF, un partenaire potentiel préalablement identifié dans l’équipe et connu pour jouer un rôle dans l’immunité chez les plantes. Enfin, nous avons apporté des premiers éléments quant à sa fonction dans les réponses de défense via l’utilisation d’une lignée surexpresseur de Cdc48.

4

II. Matériel et méthode

A. Matériel Biologique

1. Culture cellulaire

Les trois types de suspensions cellulaires utilisées dans cette étude ont été générés au laboratoire à partir de cals provenant de tissus foliaires et ont tous comme fond génétique celui de Nicotiana

tabacum cv. Xanthi. Il s'agit de la lignée sauvage, de la lignée CL5 où l'expression des histones

désacétylases de type 2, HDAC-2a et HDAC-2b,est invalidée via une approche RNAi (Bourque et

al., 2011) et de la lignée Cdc48-TAP sur-exprimant la protéine recombinante Cdc48 avec une

étiquette de purification par affinité en tandem (vecteur pYL436, Arabidopsis Biological Resource

Center, The Ohio State University, USA). Les cultures sont maintenues sous agitation (130 rpm),

lumière et température continues (25°C). Tous les 7 jours, les suspensions se trouvant en fin de phase exponentielles sont repiquées pour entretenir les lignées ou diluées au demi dans du milieu de culture frais afin de servir aux mesures biologiques dans les 24 heures.

2. Plants de tabac Nicothiana benthamiana

Les expériences d’infiltration de feuilles sont réalisées sur plants de tabac Nicotiana benthamiana âgés de minimum 2 mois.

3. Cryptogéine

La cryptogéine est produite au laboratoire selon le protocole établi par Bonnet et al. (1996). Elle est extraite et purifiée à partir de filtrat de culture de Phytophthora cryptogea. Après dosage par mesure d’absorbance à 280 nm, la cryptogéine est préparée sous forme de solution mère à une concentration de 100 µM dans de l’eau ultrapure. Pour chaque expérience sur suspension cellulaire, la concentration finale de cryptogéine est de 100 nM.

4. Western blot

Les cellules de tabac sont broyées manuellement dans de l’azote liquide. Pour l’étude de l’abondance de Cdc48, l’extraction protéique est réalisée dans 300 µ L de tampon de lyse (Hepes 50 mM pH 7,5; EDTA 5 mM ; NaCl 100 mM ; DTT 5 mM ; cocktail d'inhibiteurs de protéases EDTA

free (PIC, Roche) pendant 5 minutes sur glace. Ce mélange est alors centrifugé 10 minutes à 20800

g à 4°C. Le surnageant est récupéré et le dosage protéique effectué via la méthode de Bradford. Les protéines totales sont dénaturées pendant 5 à 10 minutes à 95°C dans du bleu de charge (Tris-HCl 12 mM, glycérol 10 % (v/v), SDS 0,02 % (m/v), DTT 80 mM, bleu de bromophénol 0,025 % m/v). La séparation des protéines se fait par électrophorèse SDS-PAGE à l’aide d’un gel de séparation à 10 % (m/v) d’acrylamide. Les protéines ainsi séparées sont transférées sur membrane de nitrocellulose (GE Healthcare) à 100 V pendant 1 heure dans un tampon de transfert (Tris 50 mM ; Glycine 40 mM ; SDS 0,0375 % (m/v) ; méthanol 20 % (v/v). Une coloration au Rouge

5 Ponceau (0,2 % m/v ; acide acétique 5 % v/v) permet de vérifier la qualité du dépôt et l’efficacité du transfert. Après décoloration à l’eau, la membrane est saturée 1 h à température ambiante dans du TBS (Tris Buffer Saline) tween 0,1 % (v/v), additionné de lait écrémé à 5 % (m/v) ou de SAB 2 % (m/v, albumine sérique bovine). Les anticorps primaires sont mis en contact de la membrane 1 h à température ambiante (tableau 1). Après deux lavages de 5 min au TBS Tween 0,1 %, les membranes sont mises en contact avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, la membrane est lavée 2 fois pendant 10 min avec du TBS Tween 0,1 %. La révélation se fait à l’aide d’un kit chimiluminescent (Lumiglo, Cell Signaling).

Tableau 1 Caractéristiques des anticorps utilisés dans cette étude

Anticorps Protéine cible Dilution Tampon de dilution et de saturation Origine

Primaire

Anti-Cdc48 1/1000 TBST 0,1% 2% SAB Lapin

Anti GFP 1/2500 TBST 0,1% 2% SAB Lapin

Anti-His (x6) 1/1000 TBST 0,1% 5% Lait Souris

Secondaire

Anti-Ig Lapin 1/20000 TBST 0,1% 2% SAB

Anti-Ig Souris 1/1000 TBST 0,1% 5% Lait

B. Biologie moléculaire

1. Extraction des ARNs totaux et Synthèse d’ADNc

Les ARN totaux ont été extraits des différentes lignées cellulaires en utilisant du TRIzol® Reagent (Life Technologies). Le protocole suivi est celui préconisé par le fournisseur. Après dosage au nanodrop, les échantillons sont dilués de façon à avoir 1000 ng d’ARN dans 5 µ L d’eau. Une rétrotranscription est réalisée sur 500 ng d’échantillons dans un volume final de 10 µ L grâce au kit DyNamo™ (Thermo Fischer). Ces 10 µ L sont composés de 5 µl de tampon de réaction (RT buffer) comprenant un mix de dNTP et de MgCl2 (10 mM), 0,5 µL d’oligo dT (100 ng.µ L-1) servant

d’amorces à la synthèse d’ADNc et 1 µ L de la transcriptase inverse M-MuLV possédant en plus une activité RNAse. Le reste correspond aux 500 ng d’ARN et à l’eau. Ce mélange est incubé 10 minutes à 25°C pour permettre l’extension des amorces oligo dT, puis 1 heure à 37°C pour permettre la synthèse d’ADNc. L’enzyme est désactivée par une incubation de 5 minutes à 85°C. Les ADNc sont conservés à -20°C. Cinq cent autres nanogrammes d’ARN sont déposés sur gel d’agarose (1 % m/v), tampon TAE 0,5x (TRIS 20 mM ; Acide acétique 0,58% (v/v) ; EDTA 0,5 mM) puis révélés au bromure d’éthidium pour apprécier la qualité des ARN ribosomaux.

2. PCR temps réel

Le kit SYBR ® Green PCR Master Mix (Life Technologies) est utilisé pour réaliser cette partie de l’étude. Les réactions de PCR quantitatives sont réalisées en plaques 96 puits avec un volume final de 15 µ L. Ce volume comprend 5 µ L d’ADNc dilué au 50eme, 7,5 µ L de Go Taq® qPCR Master

6

Mix, 0,3 µ L de chaque amorce (10 µM) et 1,9 µ L d’eau. La PCR en temps réel est réalisée à l’aide

de l’appareil ViiA™ 7 (Life Technologies) sur le logiciel ViiA™ 7 Software v1.2. Pour la normalisation des Ct, le gène codant pour la protéine ribosomale L25 est utilisé (Schmidt & Delaney, 2010). La condition T0 est choisie comme calibrateur. Les amorces utilisées sont les

suivantes : Cdc48 sens : 5’ GCACCCACAACTCTTCAAATC 3’ anti-sens : 5’ GCTTTCACTTTCTCCAGCC 3’ ; L25 sens : 5’ CCCCTCAC CACAGAGTCTGC 3’ anti-sens : 5’ AAGGGTGTTGTCCTCAATCTT 3’. La formule utilisée pour calculer l’expression relative est : 2-∆∆Ct avec ∆∆Ct =∆CT condition X –∆CT calibrateur et ∆Ct = Ct gène cible-CT gène L25.

C. Filtration sur gel en conditions natives

L’étude de la taille du complexe comportant Cdc48 est réalisée grâce à la technique de chromatographie de filtration sur gel en conditions natives sur colonne Superose 6™ 10/300 GL (GE Healthcare, domaine d’exclusion 5 à 5000 kDa). La calibration de cette dernière a été effectuée au laboratoire avec le kit de calibration High Molecular Weight (GE Healthcare) comprenant la thyroglobuline (660 kDa), la ferritine (440 kDa), l’aldolase (158 kDa), la conalbumine (75 kDa) et l’ovalbumine (43 kDa). Les protéines totales des cellules sauvages et CL5, traitées ou non à la cryptogéine sont extraites dans un tampon favorisant le maintien des complexes protéiques (Hepes 20 mM pH 7,5 ; glycérol 5 % v/v ; KCl 0,1 M ; DTT 1 mM ; Na3VO4 1 mM ; EDTA 1 mM ; PMSF

1 mM, PIC) et dosées par la méthode de Bradford. Un à 2 mg de protéines totales sont séparées sur colonne Superose 6™, des fractions protéiques de 1 mL sont récoltées puis concentrées par précipitation au TCA (acide tri-chloroacétique) (1 mL TCA 20 % v/v 1 h 4°C). Les protéines sont ensuite centrifugées (20 800 g, 10 minutes 4°C) et les culots sont lavés deux fois à l’acétone DTT 0,5 % (m/v). Les culots sont alors séchés à l’évaporateur sous vide puis repris dans du bleu de charge. La présence de la protéine Cdc48 dans chaque fraction est révélée par Western blot (partie

II. A. 4).

D. Pulldown sur billes NiNTA

Cette expérience consiste à démontrer in vitro l’interaction entre la protéine recombinante GFP-Cdc48 exprimée transitoirement dans des feuilles de tabac et la protéine recombinante His-ARF, préalablement fixée sur billes de sépharose Ni-NTA. Ces constructions sont disponibles au laboratoire.

1. Transformation d’Agrobacterium tumefasciens

Un à 2 µg de plasmide pH7WGF2 (portant la résistance à la spectinomycine) portant la séquence codante pour la protéine recombinante GFP-Cdc48 sont incubés avec 100 µ L de bactéries

Agrobacterium tumefasciens GV3101 (portant les résistances à la rifampicine et à la gentamycine),

7 thermique 5 minutes dans l’azote liquide puis 5 minutes à 37°C et l'ensemble est placé dans la glace. Après ajout de 500 µ L de milieu nutritif LB (lysogeny broth) puis incubation de 2 à 4 heures à 28°C sous agitation, les bactéries sont étalées sur boîtes de Pétri contenant du LB (2 % m/v) agar (1,7 % m/v) supplémenté des antibiotiques adéquats à la sélection des bactéries compétentes ayant été transformées, c’est-à-dire rifampicine (50 µg.mL-1), spectinomycine (100 µg.mL-1) et gentamycine (50 µ g.mL-1). Les boîtes sont placées à l’étuve à 28°C pendant 48 heures.

2. Pré-culture & culture

Quarante-huit heures après l’étalement sur boîte, une unité formant colonie pour chaque condition est placée dans 3 mL de LB supplémenté des antibiotiques rifampicine (50 µg.mL-1), spectinomycine (100 µ g.mL-1) et gentamycine (50 µg.mL-1) pendant 24 heures à l’étuve sous agitation (180 rpm ; 28°C). Cent microlitres de pré-culture sont ensuite incubés dans 10 mL de milieu LB supplémenté des mêmes antibiotiques que précédemment et d’acétosyringone (20 µM), composé phénolique induisant l'expression des gènes de virulence des bactéries augmentant ainsi l’efficacité de l’infiltration. Les bactéries sont de nouveaux incubées 24 h à l’étuve sous agitation (180 rpm ; 28°C).

3. Infiltration

Après 24 heures de culture, les bactéries sont centrifugées pendant 15 minutes à 9200 g, puis les culots re-suspendus dans du milieu MES 10 mM, MgCl2 10 mM, acétosyringone 100 µM jusqu’à

obtenir une densité optique à 600 nm égale à 1. Les bactéries sont alors incubées 4 heures à température ambiante. L’infiltration des feuilles consiste en l’introduction des bactéries de manière mécanique par la face inférieure d’une ou plusieurs feuilles à l’aide d’une seringue dépourvue d’aiguille. La figure 1 propose une frise chronologique résumant l’expérience d’infiltration.

Figure 1 Frise chronologique de l'expérience d'infiltration

J-5

Transformation des Agrobacterium:

•Etalement sur boîte de Pétri (28°C; 48 h)

J-2

Pré-culture:

•Récupération d’une UFC dans 3 mL LB + antibiotiques

•Mise à l’étuve (28°C; 24 h; 180 rpm)

J-1

Culture:

•Reprise de 100 µL de pré-culture dans 10 mL de LB + antibiotiques + Acétosyringone (20 µM)

•Mise à l’étuve (28°C; 24 h; 180 rpm)

Jour J

Infiltration:

•Reprise des bactéries dans tampon MES (10 mM) MgCl2(10 mM) Acétosynringone

(100 µM)

•D0660nm=1

•2 à 4 h à température ambiante

•Infiltration des feuilles

J+5

Pull-down:

•Broyage des feuilles

•Extraction protéique et dosage

8

4. Vérification de la transformation

De par la présence de l’étiquette GFP, il est possible de vérifier par épifluorescence la présence de la protéine recombinante dans la feuille. Pour cela, des disques foliaires de 5 mm de diamètre sont prélevés grâce à un emporte pièce, puis placés entre lame et lamelles. La visualisation de la GFP est effectuée grâce à unmicroscope à épifluorescence.

5. Pull-down sur billes de sépharose Ni-NTA

Les protéines totales de feuilles transformées ou non (témoin négatif d’expression de GFP-Cdc48) sont extraites dans 400 µl de tampon d’interaction (Hepes 50 mM pH7,5 ; NaCl 100 mM ; DTT 1 mM ; EGTA 4 mM ; EDTA 4 mM ; MgCl2 2 mM ; Na3VO4 100

µM ; 2-glycérophosphate 50 mM ; Saccharose 10 % (m/v) ; Nonidet P40 0,3 % (v/v) ; PIC) et dosées via la méthode de Bradford. Vingt microgrammes de chaque échantillon sont alors prélevés comme témoin d’expression de GFP-Cdc48 (figure 2 :« input »).

Pour les différentes conditions, 500 µg de protéines diluées dans 250 µL de tampon d’interaction sont mis en contact avec 20 µ L de billes couplées à la protéine recombinante His- ARF ou non (témoin

négatif d’interaction entre ARF et Cdc48) sous agitation à 4°C sur la nuit (figure 2 « Bille His-ARF » ou « Bille φ » respectivement).

Après incubation et centrifugation (8200 g, 30 s) le surnageant est conservé (protéines n’ayant pas adhéré aux lots de billes, figure 2 :« Post »). Quatre lavages (500 µ L Tampon d’interaction, 8200 g, 30 s) sont réalisés puis l’élution des protéines liées aux billes est effectuée par chauffage 3 minutes à 100°C dans du bleu de charge (partie II. A. 4). La présence des protéines est ensuite analysée par Western blots (partie II. A. 4) dirigés contre les étiquettes His et GFP.

E. Viabilité cellulaire : iodure de propidium

La détermination du pourcentage de mort cellulaire est réalisée grâce au marquage des cellules mortes par l’iodure de propidium (λex : 536nm ; λem : 617nm). En effet, cet agent intercalant ne

Figure 2 Déroulement du pull-down. Schéma

des différentes étapes de l’expérience de pull-down sur billes NiNTA-His-ARF incubées avec des feuilles exprimant la protéine GFP-Cdc48.

- Broyage des feuilles - Extraction protéique - Dosage Bille His-ARF Bille φ 500 µg de protéines totales

Bille His-ARF Bille φ

“Post” “Post” 500 µg de protéines totales Feuille infiltrée ou “Feuille +” Feuille non-infiltrée ou “Feuille –” “Input” “Input”

- Incubation sous agitation - 4°c sur la nuit

- Lavages

- Elution des protéines accrochées aux billes

Western Blot: - Anti-His - Anti-GFP

9 peut pénétrer que dans les cellules dont la membrane est endommagée. Pour chaque point de lecture, 200 µ L de suspension cellulaire sont dilués au demi dans du milieu de culture. Après ajout de 4 µ L d’iodure de propidium (10 µM) et mélange par inversion, 20 µ L de suspension cellulaire marquée sont déposés entre lame et lamelle. La lecture d’au moins 300 cellules sur 3 lames indépendantes se fait par microscopie à épifluorescence. Pour juger de la significativité des résultats, des tests Anova ont été réalisés en prenant comme valeur seuil p<0,05.

F. Etude de la production des formes actives de l’oxygène (FAO)

La production de peroxyde d’hydrogène (H2O2) sur suspensions cellulaires est mesurée grâce à la

chimioluminescence du luminol qui réagit avec le H2O2 en présence de peroxydases. Pour cela les

différentes lignées cellulaires sont équilibrées 1 heure sous agitation à 25°C dans du milieu M10 (Mes 10 mM, pH 5,3 ; mannitol 240 mM, CaCl2 500 µM, K2SO4 500 µM) avec une densité

cellulaire de 0,1 g.mL-1. Après traitement, la quantification de H2O2 se mesure sur un triplicat de

250 µ L de suspension cellulaire auxquels l’automate (Lumat, Berthold Technologies) ajoute 350 µ L de milieu H50 (Hepes 50 mM, pH 8,5 ; mannitol 240 mM, CaCl2 500 µM, K2SO4 500 µM) et 50 µL

de luminol (23 µM final, A 8511 SIGMA). Afin de pouvoir exprimer les données en µmoles de H2O2 par gramme de poids frais de cellules, une gamme étalon est réalisée en incubant des quantités

croissantes d’H2O2 (0 à 25 nmoles)avec les différentes suspensions cellulaires et en mesurant la

luminescence correspondante.

G. Etude de la production de monoxyde d’azote.

La détection du NO intracellulaire est possible grâce au 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA) traversant les membranes biologiques. Les différentes lignées cellulaires sont filtrées et re-suspendues dans du milieu M10 à une densité de 0,1 g.mL-1. Les cellules sont incubées avec la sonde DAF-2DA (20 µM) pendant 1 h sous agitation et à l’abri de la lumière. Pour enlever l’excès de sondes, les suspensions sont lavées 3 fois avec du tampon M10 puis transférées dans des plaques 24 puits (1 mL par puits ; Nunclon Delta Surface, THERMO Scientific). Après 30 minutes d’incubation, les cellules sont traitées à la cryptogéine. La production de NO est mesurée par un spectrofluoromètre (Mithras ; Berthold Technologies) grâce aux filtres d’excitation 485 nm et d’émission 510 nm.

III. Résultats

A. Analyse de l’accumulation de la protéine Cdc48 dans les cellules de tabac élicitées par la cryptogéine

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’accumulation de la protéine Cdc48 dans les cellules de tabac sauvages ou CL5 dont la réponse immunitaire a été induite par la cryptogéine.

10 Pour ceci, des anticorps dirigés contre Cdc48 ont été utilisés. Les Western blots obtenus montrent que dans la lignée sauvage, la protéine Cdc48 s’accumule dans les 6 premières heures de traitement pas l’éliciteur (figure 3.A). Entre 24 et 48 h de traitement à la cryptogéine, la teneur en Cdc48 diminue du fait de la mort des cellules (Bourque et al, 2011). Dans la lignée CL5 (figure 3.B), au temps T0 la protéine présente un taux d’accumulation supérieur à celui observé dans la lignée sauvage. Toutefois, aucune augmentation du taux de Cdc48 n’a été relevée. Au contraire, son accumulation n’est plus détectée après 6 heures de traitement par l’éliciteur.

Figure 3. Analyse de l’accumulation de la protéine CDC48 dans les cellules sauvages et CL5 en réponse à la cryptogéine. Les cellules sauvages (A) et CL5 (B) ont été traitées pendant 28

heures avec de la cryptogéine (100 nM), puis des Western blots (WB) dirigés contre la protéine Cdc48 ont été réalisés sur les extraits protéiques totaux. L’expérience a été réalisée 3 fois, la figure montre une expérience représentative.

B. Etude de l’accumulation du transcrit Cdc48

Afin de vérifier si l’accumulation de la protéine CDC48 était corrélée à une accumulation du transcrit correspondant, la technique de la PCR en temps réel (RT-qPCR) a été utilisée. Suite à des problèmes techniques, cette analyse n’a pu être réalisée que dans les cellules CL5.

La figure 4A présente le profil des ARNm extraits des cellules CL5 traitées ou non par la cryptogéine au cours du temps. Contrairement aux cellules contrôles, les ARNm extraits des cellules CL5 présentent une dégradation croissante initiée à partir de 100 minutes de traitement environ. Ce résultat est en accord avec les précédents travaux de l’équipe montrant que les cellules CL5 présentent une mort cellulaire accélérée lors de la stimulation de la réponse immunitaire (Bourque et al, 2011). Concernant l’accumulation du transcrit Cdc48, le calcul des expressions relatives (2-∆∆Ct) ne montre aucune variation du transcrit au court du temps (figure 4.B). Il semblerait que le taux d'ARNm codant pour la protéine chaperonne soit constant jusqu’au début de la dégradation des ARN totaux. Ce résultat pourrait expliquer le profil protéique observé figure 3.B. Ainsi, l’ensemble des données présentes figures 3 & 4 suggèrent que le taux protéique de Cdc48 chez la lignée CL5 est constant jusqu’à la dégradation générale des ARNm.

118 90 MM (kDa) Cdc48 T0 6 h 12 h 24 h 28 h

WB α-Cdc48: cellules sauvages

A

WB α-Cdc48 : cellules CL5

B

11

Figure 4 Etude de l'expression du gène Cdc48 chez la lignée CL5. Les cellules CL5 sont

traitées ou non à la cryptogéine (100 nM) pendant 6 heures. (A) Après extraction des ARN totaux grâce au TRIzol® et dosage, 500 ng d’ARN sont déposés sur gel d’agarose (1 % m/v) pour apprécier la qualité des ARN ribosomaux. (B) Le graphique représente l’expression relative (2-∆∆Ct) du messager Cdc48 dans les cellules CL5 jusqu’à 90 minutes de traitement. Le gène constitutif choisi est celui codant pour une protéine ribosomale (L25), le calibrateur interne est le temps zéro. Les barres représentent ± l’écart type (n=2).

C. Cdc48 forme un complexe hexamérique stable.

La protéine Cdc48 (90 kDa) est active sous forme homo-hexamérique (540 kDa). Pour étudier la taille du complexe in vivo lors de la réponse cellulaire à la cryptogéine, nous avons utilisé la chromatographie d’exclusion en condition native. La colonne Superose 6™ permet de séparer les protéines et/ou les complexes extraits des cellules en fonction de leur masse moléculaire et de leur encombrement stérique entre 5 et 5 000 kDa. L’étude par Western blot des fractions de 1 mL récupérées durant l’élution a permis d’observer dans quelle(s) fraction(s) se trouve la protéine Cdc48 et ainsi de déterminer si cette protéine chaperonne se trouve en hexamère, en monomère ou encore complexée à d’autre protéines (figure 5).

Dans les cellules de tabac sauvages non traitées par la cryptogéine, Cdc48 se répartit dans les fractions 5, 6 et 7 (figure 5.A). La fraction 6 correspond à une masse moléculaire d’environ 669 kDa qui pourrait être celle de Cdc48 sous forme hexamérique associée ou non avec 1 ou plusieurs partenaires protéiques de faible masse moléculaire. Deux bandes immunoréactives sont observées

T0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240 360 C o n tr ô le C ry p to g é in e 28S 18S 28S 18S ARN ribosomaux ARN_t ARNt 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Traitement cryptogéine (100nm) Contrôle Temps (min) E x p re ss io n re la ti v e : 2 Δ Δ C t

A

B

Traitement à la cryptogéine (min)

ARN ribosomaux

12 pour ces fractions : une d’environ 90 kDa correspondant à la masse molaire du monomère de CDC48, une seconde de haut poids moléculaire. Le fait que la bande de haut poids moléculaire soit présente dans les fractions 5 et 6 nous conforte dans l’hypothèse qu’elle pourrait correspondre à l’hexamère formé par Cdc48 qui n’aurait pas pu être dénaturé par le traitement SDS dans le SDS-PAGE. Notons que cette bande immunoréactive de haut poids moléculaire s’est avérée particulièrement stable. En effet, différents traitements drastiques des échantillons protéiques comme les températures élevées ou l’absence de chauffage, l’urée 8 M, divers détergents ou encore la sonication n’ont pas permis sa dissociation en protéines de plus faible masse molaire. Concernant la ligné CL5, nous observons la présence de Cdc48 dans les fractions 5, 6, 7 de haut poids moléculaires comme pour la lignée cellulaire sauvage, mais également dans la fraction 8 (figure

5.A). Le profil est ainsi plus étalé, ce qui suggère que Cdc48 est sous forme hexamérique, mais que

ce complexe est moins stable que chez le type sauvage. En revanche, une seule bande immunoréactive de 90 kDa est détectée.

Dans les cellules de tabac sauvages traitées par la cryptogéine, la protéine Cdc48 est principalement retrouvée de nouveau dans les fractions 5, 6 et 7 quel que soit le temps de traitement (figure 5.B). Le traitement n’influe donc pas sur la taille du complexe et Cdc48 reste sous forme hexamérique. Dans les cellules CL5 élicitées par la cryptogéine (figure 5.C), deux observations ont été faites. D’une part, contrairement aux cellules CL5 non traitées, deux bandes immunoréactives ont été détectée : une correspondant à 90 kDa et une seconde de haut poids moléculaire comme observée dans la lignée sauvage traitée ou non par la cryptogéine. D’autre part, l’induction de la réponse immunitaire par l’éliciteur conduit à la répartition de Cdc48 dans la fraction 4 correspondant à des masses moléculaires plus élevées, ce profil étant soutenu jusqu’à 4 h et suggérant une interaction stable avec des partenaires de taille suffisante pour engendrer un incrément de masse visible en filtration sur gel. Après 4 h de traitement, la protéine Cdc48 n’est presque plus visible en raison de la diminution de son abondance dans les cellules CL5 comme montré figure 3.B.

Notons que dans cette analyse, ni à l’état basal ni durant la réponse à la cryptogéine nous ne retrouvons la protéine Cdc48 dans les fractions 9-10 correspondant à la masse molaire du monomère, ceci pour les deux lignées cellulaires étudiées. In vivo, la protéine est donc sous forme héxamérique et l’élicitation ou le génotype cellulaire n’influent pas sur cette structuration.

13

Figure 5 Etude de la taille du complexe formé par Cdc48. Après un traitement ou non à la

cryptogéine, les protéines ont été extraites dans un tampon natif puis séparées sur une colonne Superose 6™. Les fractions récupérées ont été précipitées au TCA, puis la protéine Cdc48 a été révélée par Western blot. Les masses moléculaires correspondant aux fractions ont été déterminées par calibration de la colonne et sont notées au-dessus des gels. (A) Filtration sur gel des protéines extraites des cellules CL5 et sauvages non traitées par la cryptogéine. (B) Filtration sur gel des protéines des cellules sauvages durant un traitement à la cryptogéine. (C) Filtration sur gel des protéines des cellules CL5 durant le traitement à la cryptogéine. L’expérience a été réalisée 2 fois, la figure montre une expérience représentative.

D. La protéine GFP-Cdc48 interagit in vitro avec la protéine His-ARF

Afin d’appréhender le rôle de Cdc48 dans l’immunité des plantes, une stratégie visant à identifier des partenaires protéiques de celle-ci a été entreprise. Dans cet objectif, une série de Co-immunoprecipitations de Cdc48 a été réalisée sur cellules de tabac sauvages en suspension traitées ou non par la cryptogéine durant 5 minutes à 6 heures. Suite à une analyse par spectrométrie de masse, environ 200 partenaires potentiels ont été identifiées (Claire Rosnoblet, communication personnelle). Ceux-ci incluent la protéine ARF (ADP ribosylation factor), petite GTPase impliquée

14 dans le trafic membranaire et dans l’immunité des plantes (Coemans et al., 2008; Nomura et al., 2006). C’est sur l’interaction entre cette dernière et la protéine Cdc48 que nous nous sommes focalisés dans la présente étude.

La stratégie choisie pour confirmer l’interaction entre ARF et Cdc48 a été le pull-down sur billes de sépharose couplées à des extensions acides nitriloacetique complexées au nickel (Ni-NTA). Ces billes interagissent de façon spécifique avec les protéines portant des étiquettes histidines, telle que His-ARF préalablement générée au laboratoire. Cette expérience consiste premièrement à fixer les protéines recombinantes His-ARF sur billes de sépharose Ni-NTA. Dans un deuxième temps, ces billes sont mises en contact avec un extrait protéique de feuilles exprimant de façon transitoire la protéine recombinante GFP-Cdc48. Après incubation et lavages des billes, les protéines interagissant avec la protéine His-ARF sont déposées sur gel SDS-PAGE. La présence de GFP-Cdc48 et de His-ARF est finalement révélée par Western blot ciblant les étiquettes. Une feuille n’exprimant pas GFP-Cdc48, ainsi que des billes Ni-NTA non couplées à His-ARF ont été utilisées comme témoins négatifs.

Figure 6 Les protéines Cdc48 et ARF interagissent entre-elles in vitro. (A) Vérification par

microscopie à épifluorescence de l’expression de la protéine recombinante GFP-Cdc48 dans les feuilles de Nicotiana benthaminana. (B) Résultat du pull-down. Après extraction des protéines totales, 250 µg de protéines sont mis en contact avec les différents lots de billes. Après incubation et lavages, les protéines sont séparées par SDS-PAGE. La révélation des protéines se fait par Western blot en utilisant les anticorps dirigés contre l’étiquette GFP ou l’étiquette His. L’expérience a été réalisée 1 fois.

100 µm 100µm

-

+ -

+ -

+

Extraits totaux Pull-down

Infiltration (GFP-Cdc48)

+

+ -

α-GFP

α-His

A

B

Feuille infiltrée

Feuille non-infiltrée

Billes His-ARF

GFP-Cdc48

His-ARF

15 L’expression transitoire de GFP-Cdc48 a été a été confirmée par microscopie à épifluorescence (figure 6.A). Dans les cellules épidermiques foliaires, la vacuole occupe l’essentiel de la cellule. La protéine GFP-Cdc48 semble localisée dans le cytosol et, dans certaines cellules, dans le noyau. Les résultats du pull-down sont présentés dans la figure 6.B.

En accord avec les résultats de microscopie à épifluorescence (figure 6.A), la protéine GFP-Cdc48 est bien présente dans l’extrait total de feuilles transformées. La protéine His-ARF est quant à elle bien immunodétectée dans les billes couplées à celle-ci. Lorsque l’extrait protéique des feuilles transformées par GFP-Cdc48 est mis en contact des billes couplées à His-ARF, une bande immunoréactive d’environ 130 kDa correspondant à GFP-Cdc48 est détectée, quoique faiblement. Ce signal n’est toutefois pas présent lorsque les billes couplées à His-ARF ont été incubées avec les extraits protéiques des feuilles non transformées. Il n’est pas non plus visible lorsque les extraits protéiques de feuilles transformées ont été incubés avec les billes non couplées à His-ARF. Cette expérience nous a ainsi permis de confirmer in vitro l’interaction entre Cdc48 et ARF.

E. Rôle de Cdc48 dans l’immunité – étude préliminaire

L’implication de la protéine Cdc48 dans l’immunité et, plus généralement, dans les processus moléculaires sous-jacents à la physiologie de la plante a été peu étudiée. Une difficulté réside dans le fait que les mutants invalidés dans l’expression de la protéine ne sont pas viables (Bae et al, 2009). Lors de mon stage, une lignée cellulaire sur-exprimant la protéine Cdc48 a été établie (lignée Cdc48-TAP). Celle-ci a été obtenue via l’insertion dans le génome de cellules Xanthi d’une séquence codant la protéine recombinante Cdc48 couplée à une étiquette de purification par affinité en tandem (TAP) du côté C-terminal de la protéine. Grâce à cette lignée, nous avons pu initier une analyse fonctionnelle du rôle de Cdc48 dans la

réponse immunitaire induite par la cryptogéine chez le tabac.

Dans un premier temps, nous avons confirmé par Western blot que les cellules Cdc48-TAP expriment bien la protéine recombinante de manière constitutive. En effet, comme le montre la figure 7, en plus de la protéine chaperonne endogène, dans la lignée cellulaire Cdc48-TAP les anticorps dirigés contre Cdc48 reconnaissent une seconde protéine d’environ 135 kDa correspondant à protéine de fusion Cdc48-TAP. Dans un deuxième temps, des évènements caractéristiques de la

réponse cellulaire à la cryptogéine ont été analysés dans cette lignée comparativement à la lignée

180 135 100 78 Cdc48-TAP Cdc48 MM (kDa) Sauvage Cdc48-TAP

Figure 7 Western blot anti-Cdc48. Les

protéines totales de cellules non transformées (sauvages) et transformées avec le plasmide Cdc48-TAP ont été extraites, déposées sur gel SDS-PAGE et révélées avec un anticorps Cdc48.

16 sauvage ou CL5. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement à la mort cellulaire (réaction hypersensible) et à la production de FAO et de NO.

Le taux de mort cellulaire a été déterminé en utilisant l’iodure de propidium (IPr). La fluorescence de cette sonde est accrue lorsqu’elle est complexée au double brin d’acides nucléiques. Seules les cellules possédant des membranes détériorées étant perméables à l’IPr, il est possible de visualiser les cellules mortes par émission d’une fluorescence rouge après excitation à 536 nm.Ainsi, le taux de mort cellulaire correspond au rapport du nombre de cellules IPr positives sur le nombre de cellules totales. Les suspensions cellulaires sauvages, Cdc48-TAP et CL5 ont été traitées par la cryptogéine pendant 0 à 8 h. La lignée CL5 a été choisie comme témoin positif car, comme discuté précédemment (figure 4), elle présente une mort cellulaire précoce et exacerbée en présence de cryptogéine (Bourque et al., 2011). Dans les cellules sauvages, la mort cellulaire progresse lentement et atteint environ 20 % après 8 heures d’élicitation par la cryptogéine (figure 8.A). Concernant la lignée CL5, conformément aux résultats préalablement obtenus au laboratoire (Bourque et al., 2011; Kulik et al., 2015), la mort cellulaire induite par l’éliciteur est plus rapide et plus conséquente. Elle est de l’ordre de 25 % dès 2 heures de traitement et atteint environ 60 % après 8 heures. De façon intéressante, le taux de mort cellulaire des cellules Cdc48-TAP s’est avéré plus important que celui des cellules sauvages lors de la stimulation de la réponse immunitaire (figure 8.A). En effet, à partir de 4 h de traitement à la cryptogéine, la mort cellulaire des cellules Cdc48-TAP est significativement supérieure et est de l’ordre de 25 %. Cette différence par rapport aux cellules sauvages est maintenue jusqu’à 8 h de traitement où la mort cellulaire atteint 35 %. La production de H2O2 induite par la cryptogéine a été mesurée par luminescence dans la lignée

Cdc48-TAP comparativement à la lignée sauvage (figure 8.B). Nous n’avons pas inclus la lignée CL5, les productions de FAO et de NO dans cette lignée étant extrêmement faibles en réponse à la cryptogéine (Kulik et al., 2015). Dans les lignées sauvages et Cdc48-TAP, la cryptogéine déclenche une production rapide et transitoire de H2O2 optimale après environ 20 minutes de traitement.

Aucune différence significative, en termes quantitatif et de cinétique n’a été observée entre les deux lignées.

17

Figure 8 Réponse à la cryptogéine de la lignée Cdc48-TAP. (A) Détermination du pourcentage

de mort cellulaire par l’iodure de propidium sur suspension cellulaire pendant le traitement à la cryptogéine. Pour chaque temps de traitement au moins 300 cellules sont comptabilisées sur 3 lames différentes. L’expérience a été réalisée 2 fois. Test statistique : Anova ; *** p<0,05. (B) Détection de la production H2O2 pendant le traitement à la cryptogéine ou à l’eau par

chimiluminescence, sur les lignées Cdc48-TAP et sauvages. Les cellules ont été équilibrées à une densité cellulaire de 0,1 g de cellules par mL. La réalisation d’une gamme étalon a permis de calculer la quantité de H2O2 produit par gramme de cellules fraîches. (C) Détection de la production

de NO par les cellules Cdc48-TAP et sauvages pendant un traitement à la cryptogéine. La détection du NO est réalisée par mesure de la fluorescence du DAF-2T ramenée en unité de fluorescence relative (UFR). La fluorescence suite au traitement à la cryptogéine a été corrigée par la valeur obtenue dans le contrôle et le temps zéro ayant été rapporté à une valeur nulle. (B), (C) : Les barres d’erreur correspondent à ± l’écart type (n=3).

Concernant la production de NO, là encore celle-ci a été mesurée dans les lignées Cdc48-TAP et sauvage en utilisant une sonde sensible au monoxyde d’azote, le DAF-2DA, suivant un protocole établi au laboratoire (Kulik et al, 2015). Cette méthode indirecte est basée sur la mesure d’espèces réactives de l’azote dérivées de l’oxydation du NO qui nitrosyle le DAF-2 (forme intracellulaire du DAF-2DA) en DAF-2 triazole fluorescente (DAF-2T) (Jourd’heuil, 2002). Nous observons que le traitement par la cryptogéine induit chez les cellules de type sauvage et les cellules Cdc48-TAP une

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 20 40 60 80 Xanthi Cry TAP Cry Xanthi contrôle TAP contrôle 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 0h 2h 4h 6h 8h Xanthi TAP CL5 *** n.s. *** *** *** *** *** *** n.s. n.s. 0 5000 10000 15000 20000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Xanthi TAP F lu o re sc e n ce D A F -2 T ( U F R ) H2 O2 (n m o l. g -1 M F ) M o rt c e ll u la ir e (% ) Temps Temps (min) Temps (min) A B C

18 production de NO manifestée par une augmentation de fluorescence qui apparaît dès les 20 premières minutes et augmente régulièrement (figure 8.C). Aucune différence significative n’a été relevée entre les deux lignées cellulaires.

En conclusion, nous n’avons pas noté de différences temporelle et quantitative dans la lignée Cdc48-TAP quant à l’induction de deux événements précoces caractéristiques de la réponse immunitaire, à savoir la production de NO et de ROS. En revanche, la surexpression de Cdc48 se traduit par une mort cellulaire plus intense et plus rapide, suggérant un rôle de cette protéine dans ce processus clé de l’immunité végétale.

IV. Discussion et perspectives

Dans cette étude, nous avons initié la caractérisation et l’analyse fonctionnelle de la protéine Cdc48 dans la réponse immunitaire des plantes en utilisant le modèle cryptogéine-tabac. Nos résultats montrent que Cdc48 est présente sous forme hexamérique in vivo et s’accumule dans les cellules de tabac sauvages lors de l’induction de la réponse immunitaire. Nous avons confirmé son interaction

in vitro avec la protéine ARF et apporté des premiers arguments expérimentaux en faveur de son

rôle dans le contrôle de la mort cellulaire.

Dans la lignée sauvage, le taux protéique de Cdc48 augmente dans les premières heures d’élicitation par la cryptogéine, puis plus significativement à des temps tardifs. Dans les cellules CL5, ce taux, de même que celui du transcrit, est constant jusqu’à une chute drastique qui intervient après 4 heures (figure 3). Sur la base de la qualité des ARN extraits des cellules CL5, nous avons avancé l’hypothèse selon laquelle la chute drastique de l’accumulation de Cdc48 après 6 h de traitement résulterait d’une dégradation générale des ARN totaux (figure 4). Ces résultats sont à corréler à ceux obtenus pour l’analyse de la viabilité cellulaire. En effet, dans les cellules CL5 la dégradation des ARNm coïncide avec l’induction d’une mort cellulaire rapide et exacerbée (figure

8).

Il est utile de noter que les expériences de qPCR que nous avons menées nous permettent de comparer uniquement l’abondance des ARNm Cdc48 au sein d’une lignée puisque nous avons effectué des quantifications relatives. Il serait intéressant en perspective de comparer la teneur en messager entre la lignée CL5 et les cellules sauvages en réalisant une quantification absolue. Cette expérience nous permettrait de savoir s’il existe une différence en termes de quantité d’ARNm

Cdc48 entre les deux lignées. D’autre part, du fait d’une qualité d’ARN non satisfaisante, il nous a

été impossible de réaliser l’analyse de l’accumulation du transcrit Cdc48 dans les cellules sauvages. Cette analyse devra être menée afin d’expliquer si la variation de la teneur en Cdc48 dans ces cellules est liée à l’expression du gène ou à la stabilité de la protéine.

19 L’activité de la protéine Cdc48 nécessite son homohexamérisation et l’implication de cette protéine dans une voie de signalisation spécifique est fonction de ses cofacteurs (Stolz et al., 2011). Grâce à l’utilisation de la filtration sur gel en conditions natives nous avons observé que dans la lignée sauvage la protéine Cdc48 est sous forme homohexamérique, seule ou complexée à des partenaires de petite taille (figure 5). En effet, l’encombrement stérique influençant aussi l’élution en conditions natives, les complexes ne migrent généralement pas à des masses moléculaires correspondant à la stricte somme des masses qui les composent. Ainsi, si Cdc48 est éluée dans des fractions correspondant à environ 669 kDa, l’hexamère peut être seul ou lié à des partenaires de petite taille. Les fonctions de Cdc48 sont médiées par ses cofacteurs, par exemple Ufd1 (34 kDa) et Npl4 (68 kDa) sont les partenaires de p97 dans l’ERAD (ER-associated degradation). Or, un complexe stable avec de tels partenaires engendrerait une élution dans des fractions correspondant à des tailles supérieures, suggérant que dans nos cellules Cdc48 interagit transitoirement, ou en tous cas de manière insuffisamment stable avec des partenaires conséquents, pour une visualisation en filtration sur gel.

N’ayant jamais observé Cdc48 en conditions natives sous forme monomérique, nous déduisons de notre analyse que la protéine Cdc48 forme un complexe hexamérique stable chez le tabac. Ce résultat corrobore ceux obtenus chez d’autres organismes où la présence constitutive du complexe héxamérique a été observée comme chez le rat (Kondo et al., 1997), l’espèce Xenopus (Peters et al., 1990) et l’espèce Trypanosoma (Roggy & Bangs, 1999). Une étude chez Arabidopsis thaliana, utilisant également la filtration sur gel, a là encore montré que la protéine AtCdc48 se trouve sous forme hexamérique (Rancour et al., 2002). Dans cette même étude, par le biais d’une seconde stratégie, la sédimentation sur gradient de glycérol, il a été montré que la protéine Cdc48 se trouve effectivement majoritairement sous forme d’hexamère (640 kDa), mais aussi sous une forme complexée à d’autres protéines (740 kDa) et également en faible quantité en monomère seul ou associé à une protéine adaptatrice (125 kDa), formes que nous n’avons pas observé chez le tabac dans nos conditions.

Dans la lignée CL5 non traitée par la cryptogéine, la protéine Cdc48 se trouve globalement sous la même forme que dans les cellules sauvages mais son profil d’élution est plus étalé avec un signal visible également dans la fraction 8 correspondant à des poids moléculaires plus faibles (de l’ordre de 440 kDa) (figure 5). Cette observation suggère que l’hexamère est moins stable ou en court de formation. En effet, d’après la masse moléculaire correspondante à la fraction 8, Cdc48 pourrait être sous une forme intermédiaire entre le monomère et l’héxamère. Dans cette même lignée, suite au traitement par la cryptogéine Cdc48 est également éluée dans la fraction 4, correspondant cette fois à des masses moléculaires plus élevées. Cette observation n’a pas été faite dans la lignée sauvage. Il est donc envisageable que dans les cellules CL5 présentant une mort cellulaire exacerbée en réponse

20 à la cryptogéine, Cdc48 héxamérique établisse une interaction stable avec d’autres protéines. Identifier ces partenaires stables de Cdc48 dans les cellules CL5 lors de l’élicitation serait une perspective intéressante. Cette expérience permettrait de vérifier si, en réponse à la cryptogéine, Cdc48 interagit avec d’autres partenaires que ceux précédemment identifiés par l’équipe dans les cellules sauvages et dont l’affinité pour Cdc48 est supérieure, ou avec les mêmes partenaires mais de manière plus stable.

La protéine Cdc48 chez le tabac se trouve donc sous une forme hexamérique, structure correspondant à la forme active. Afin de mieux cerner la fonction de Cdc48 dans l’immunité, des partenaires de Cdc48 ont été identifiés dans les cellules de tabac sauvages élicitées ou non par la cryptogéine. Ces protéines incluent ARF pour laquelle nous avons confirmé in vitro l’interaction avec Cdc48 par une stratégie de pull-down. La faible intensité du signal observé sur la figure 6.B suggère toutefois que cette interaction est peu intense ou de courte durée. Les résultats obtenus par filtration sur gel ne montrant pas un important incrément de masse de Cdc48 hexamérique sont en accord avec cette hypothèse. De plus, il semblerait que cette interaction soit indirecte. En effet, en testant une interaction directe in vitro entre les protéines purifiées ARF et Cdc48 en présence ou non de leur cofacteur (GTP et ATP respectivement), aucune interaction n’a été décelée (résultat non montré). Enfin, le fait que la protéine ARF ne contienne aucun domaine protéique nécessaire à l’interaction avec Cdc48 comme les domaines UBX ou encore VIM confirme que l’interaction est très certainement indirecte.

Néanmoins, nous pensons que la protéine ARF est une cible intéressante pour notre étude, cette protéine jouant un rôle dans l’immunité chez la plante. En effet, le taux de transcrit codant pour la protéine ARF1 augmente fortement chez des plants de Nicotiana benthamiana traités par l’éliciteur INF1 produit par Phythophthora infestans, ou encore après inoculation du pathogène Pseudomonas

cichorii (Coemans et al, 2008). Dans cette même étude, la réduction de l’expression de ARF1 induit

une résistance moindre face à ces mêmes stress biotiques. D’autre part, chez A. thaliana la protéine HopM1, facteur de virulence synthétisé par Pseudomonas syringae, est capable de promouvoir la dégradation de la protéine AtMIN7 par la voie du protéasome (Nomura et al, 2006). AtMIN7 (A.

thaliana HopM1 interactor 7) fait partie des protéines ARF-GEF (ARF-guanine nucleotide exchange factor), qui convertissent ARF-GDP en ARF-GTP et ainsi activent la protéine ARF. La

dégradation de AtMIN7 et, in fine, l’inactivation de la protéine ARF accroissent donc la virulence de Pseudomonas syringae. D’autre part, suite à une attaque pathogène chez le tabac, une autre AAA+ ATPase, NtAAA1, est spécifiquement produite durant la phase précoce de la HR (Sugimoto

et al., 2004). Lee & Sano (2007) ont ensuite montré que NtAAA1 interagit avec ARF, cette

interaction étant impliquée dans les mécanismes moléculaires nécessaires au maintien de l’équilibre entre la formation et la suppression des lésions suite à une attaque pathogène. Enfin, dans des

21 cellules épithéliales gastriques infectées par la bactérie Helicobacter pylori, une analyse de l’interactome de la protéine VCP, homologue humain de Cdc48, a conduit à l’identification de ARF (Yu et al., 2013), validant ainsi nos résultats.

La protéine Cdc48, comme tous ses orthologues, est une protéine vitale pour le développement de l’individu (Imamura et al, 2012; Bae et al, 2009). L’utilisation de mutants déplétés pour le gène codant Cdc48 nous est donc impossible. L’utilisation d’inhibiteurs d’orthologues de Cdc48 chez les mammifères, tels que l’EeyarestatinI (Wang et al., 2008) ou le DBeQ (N 4 -dibenzylquinazoline-2,4-diamine) (Chou et al., 2011) n’a par ailleurs pas donné de résultat concluant concernant la réponse à la cryptogéine (données non montrées). L’obtention d’une lignée cellulaire exprimant à la fois la protéine endogène et la protéine recombinante Cdc48-TAP était pour nous l’opportunité d’étudier l’impact que peut avoir la surexpression de la protéine chaperonne sur des événements cellulaires de la réponse immune. En réponse à la cryptogéine, la lignée Cdc48 –TAP présente une production de FAO et de NO tout à fait similaire à celle des cellules sauvages. En revanche, en terme de viabilité cellulaire, nous avons pu observer que la lignée TAP est plus sensible à l’éliciteur que la lignée sauvage, cette sensibilité étant moins marquée que celle de la lignée CL5. Il est intéressant de rapprocher ce résultat à celui relatif à l’analyse de l’accumulation de la protéine décrit

figure 3. En effet nous avons noté que dans les cellules sauvages, Cdc48 s’accumule en réponse à la

cryptogéine au cours du temps. Dans la lignée CL5, une accumulation plus forte est décelée en absence de traitement éliciteur. Ainsi, il existe une corrélation entre le taux d’accumulation de la protéine et la mort cellulaire. La validité physiologique de cette corrélation reste toutefois à établir. Plus généralement, la protéine Cdc48 ayant été décrite comme garante de la viabilité cellulaire (Wu

et al., 1999), il peut paraître assez surprenant que sa sur-expression engendre une mortalité

cellulaire plus importante. Néanmoins, il a été montré que la cryptogéine induit chez les cellules de tabac BY-2 un arrêt de croissance, puis un arrêt du cycle cellulaire en G1 et G2 avant d’induire la mort cellulaire. L’arrêt en phase G2 est dû à la dégradation de la protéine CDKB1 par la voie du protéasome et une inhibition par des modifications post-traductionnelle de la protéine CDKA. Les protéines CDKA et CDKB1 sont nécessaires au passage G2-M chez les plantes (Ohno et al., 2011). Nous pourrions imaginer que la sur-expression de Cdc48 ait pour effet de diriger plus rapidement la protéine CDKB1 vers le protéasome et ainsi de potentialiser l’effet de la cryptogéine.

Des expériences complémentaires restent à réaliser pour valider les résultats préliminaires décrits dans cette étude. Premièrement, nous devons vérifier que la protéine recombinante Cdc48-TAP est bien active, ce qui pourrait être vérifié par filtration sur gel, Cdc48 ne formant des hexamères que si elle est apte à hydrolyser l’ATP. Deuxièmement, à ce jour nous ne possédons qu’une seule lignée Cdc48-TAP. Une réserve est donc à émettre sur nos résultats, puisque nous ne pouvons pas savoir si ce que nous observons est dû à la sur-expression de Cdc48 ou à une perturbation indépendante,

22 générée par l’insertion du transgène. Pour répondre à cela, l’équipe tente de mettre en place une seconde lignée sur-exprimant la protéine Cdc48 mais cette fois-ci avec une étiquette GFP en position N-terminale, construction qui nous ouvrira également d’autres perspectives, dont l’étude de la localisation subcellulaire de cette protéine.

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