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nano-confinement anisotrope
Kevin Bougis
To cite this version:
Kevin Bougis. Fluctuations et interactions en situation de nano-confinement anisotrope. Autre [cond- mat.other]. Université de Bordeaux, 2016. Français. �NNT : 2016BORD0060�. �tel-01467066�
Thèse en cotutelle
présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR
DE L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX
&
DE L’UNIVERSITÉ DE SÃO PAULO Spécialité : Lasers, Matière, Nanosciences
Fluctuations et interactions en situation de nano-confinement
anisotrope
BOUGIS Kévin
Soutenue publiquement le 28/11/2016 devant un jury composé de :
Rapporteurs M. CONSTANTIN Doru Univ. Paris-Sud
M. LIGOURE Christian Univ. Montpellier
Présidente Mme ZAKRI Cécile Univ. de Bordeaux
Directeur de thèse Mme A. de OLIVEIRA Elisabeth Univ. de São Paulo Membres invités :
Co-directeurs de thèse M. NALLET Frédéric Univ. de Bordeaux Mme NAVAILLES Laurence Univ. de Bordeaux
33600 Pessac cedex, France et à l’ Instituto de Física da USP
Rua do Matão, n. 187
05508-090, São Paulo, Brasil
Web : http ://www.crpp-bordeaux.cnrs.fr/
Web : http ://portal.if.usp.br/ifusp/
Web : https ://www.u-bordeaux.fr/
Sous la direction de Frédéric Nallet [email protected] Elisabeth Andreoli de Oliveira [email protected]
Laurence Navailles [email protected] Financement IdEx Bordeaux, Doctorat International
Résumé
La structure et les interactions qui stabilisent des empilements lamellaires lyotropes de bicouches lipidiques dans leur état fluide sont principalement étudiées par diffusion de rayons X aux petits angles. Les bicouches "poilues" (et dépourvues de charge électrique) sont composées d’un mélange en diverses proportions de lécithine, un phospholipide zwit- terionique, et de Simulsol, un co-tensioactif éthoxylé non ionique similaire à un (court) copolymère dibloc. Ces empilements lamellaires sont utilisés comme matrices hôtes afin de confiner et d’encapsuler des nano-bâtonnets d’ADN qui s’auto-assemblent en différentes structures en fonction du confinement appliqué [26, 22]. L’objectif fixé est de comprendre l’origine des mécanismes qui sont responsables de la formation de ces assemblages supra- moléculaires non régis par des interactions électrostatiques. Dans ce but, on s’intéresse aux mécanismes entropiques et interfaciaux qui sont reliés à l’élasticité membranaire et à des interactions plus spécifiques intervenant aux interfaces bicouche-bicouche ou ADN- bicouche. L’approche expérimentale consiste à modifier différents paramètres physico- chimiques de la matrice hôte tels que l’hydratation du système, la nature chimique du co-tensioactif (blocs hydrophobe ou hydrophile) et la teneur en co-tensioactif au sein de la membrane. Le co-tensioactif a ainsi un rôle clé pour modifier les deux mécanismes en perturbant notamment le caractère "lié" ou "non lié" des systèmes lamellaires en haute dilution. Un modèle thermodynamique est utilisé afin d’interpréter la décroissance expo- nentielle "classique" observée dans des profils de pression osmotique, lorsque l’hydratation est augmentée, sans faire appel à la force "d’hydratation" [122]. Une transition structurale est mise en évidence, à faible hydratation, entre deux phases lamellaires "liées". Le change- ment structural de la bicouche est discuté grâce à un couplage entre confinements latéral et vertical en analogie avec la fameuse transition "brosse-champignon" induit par un confi- nement latéral, pertinente pour de longs polymères linéaires greffés sur des surfaces rigides [10]. La caractérisation de la matrice lamellaire hôte autorise finalement une description des organisations des bâtonnets d’ADN qui semblent directement corrélées aux propriétés physiques des bicouches, ouvrant ainsi quelques perspectives pour leur encapsulation au sein "d’ognons".
Mots clés : phase lamellaire, diffusion de rayons X, transition de décrochage, interac- tions interfaciales, ADN, confinement, transition de phase.
Interactions and fluctuactions under anisotropic nano-confinement
conditions
Abstract
Structure and interactions stabilizing the lyotropic lamellar stack of mixed lipid bilay- ers in their fluid state are mainly investigated by means of small-angle X-ray scattering.
The (electrically-neutral) "hairy" bilayers are composed of a mixture in various propor- tions of lecithin, a zwitterionic phospholipid (by itself and as a natural extract, already a mixture), and Simulsol, an ethoxylated non-ionic cosurfactant (with also some dispersity, owing to its industrial origin) similar to a (short) diblock copolymer. The lamellar stacks are used as hosts to confine and encapsulate DNA nanorod guests which self-organize into different structures depending on the confinement [26, 22]. The challenge here is to understand the mechanisms responsible for the formation of such supramolecular assem- blies which are not based on electrostatic interactions. In this aim, we are interested in entropic and interfacial mechanisms, that is to say mechanisms related to membrane elas- ticity (and therefore, membrane fluctuations) and to specific interactions occurring at the bilayer-bilayer or bilayer-DNA interfaces. The experimental approach consists in varying different physical-chemical parameters of the host such as hydration of the system, chem- ical nature of cosurfactant (regarding both hydrophobic and hydrophilic blocks) and the cosurfactant content inside the lipid membrane. The cosurfactant added plays a key role in modifying both mechanisms, changing in particular the “bound” or “unbound” char- acter of the water-swollen systems. A thermodynamic model is used for interpreting the
“classical” exponential decay obtained in osmotic pressure profiles as a function of hydra- tion, without resorting to “hydration forces” [122]. A structural transition between two different “bound” lamellar phases is brought out at low hydration. The bilayer structural changes are discussed as resulting from a coupling between lateral and vertical confine- ments, somehow in analogy with the so-called “brush-to-mushroom” transition induced by lateral confinement, relevant for long linear polymers grafted onto rigid surfaces [10].
The lamellar host characterization finally allows a description of the DNA nanorods orga- nizations which seem to be directly correlated to the physical properties of the bilayers, opening some perspectives for the encapsulation inside “onions“.
Keywords: lamellar phase, X-ray scattering, “unbinding” transition, interfacial inter- actions, DNA, confinement, phase transition.
Flutuações e interações em situação de
nano-confinamento anisotrópico
Resumo
A estrutura e as interações, que estabilizam os empilhamentos lamelares liotrópicos das membranas lipídicas em seu estado fluido, são estudadas principalmente por espalhamento de raios-x a baixos ângulos. As membranas “peludas” (eletricamente neutras) são com- postas de uma mistura em diversas proporções de lecitina, um fosfolipídio zwiteriônico, e de simulsol, um cotensoativo etoxilado não iônico similar a um copolímero dibloco (curto).
Esses empilhamentos lamelares são utilizados como matrizes hospedeiras, com o intuito de confinar e de encapsular nanobastões de DNA que se auto organizam em diferentes estru- turas, em função do confinamento aplicado [26, 22]. O objetivo fixado é de compreender a origem dos mecanismos responsáveis pela formação dessas organizações supramoleculares, não regidas pelas interações eletrostáticas. Dessa forma, nos interessamos aos mecanis- mos entrópicos e interfaciais, que são ligados à elasticidade membranar e às interações mais específicas que intervêm nas interfaces membrana-membrana ou DNA-membrana. A abordagem experimental consiste em modificar os diferentes parâmetros físico-químicos da matriz hospedeira, como a hidratação do sistema, a natureza química do cotensoativo (blocos hidrofóbicos e/ou hidrofílicos) e a proporção de cotensoativo no interior da mem- brana. O cotensoativo tem então uma função chave para modificar os dois mecanismos, perturbando o estado “ligado” ou “não-ligado” em sistemas lamelares altamente diluídos.
Um modelo termodinâmico é utilizado para interpretar o decréscimo exponencial “clás- sico” observado para os perfis de pressão osmótica, quando se aumenta a hidratação, sem utilizar a “força de hidratação” [122]. Uma transição estrutural é evidenciada, à baixa hidratação, entre duas fases lamelares “ligadas”. A mudança estrutural da membrana é discutida graças ao acoplamento entre confinamento lateral e vertical, em analogia à conhecida transição “escova-cogumelo” induzida pelo confinamento lateral, relevante para longos polímeros lineares funcionalizados em superfícies rígidas [10]. A caracterização da matriz lamelar hospedeira permite, finalmente, uma descrição das organizações dos bastões de DNA que parecem diretamente correlacionados com as propriedades físicas das membranas, deixando, então, algumas perspectivas para sua encapsulação no interior de estruturas semelhantes a ”cebolas”.
Palavras-chave: fase lamelar, espalhamento de raios-X, transição de desligamento, in- terações interfaciais, DNA, confinamento, transição de fase.
Remerciements
Ce projet de thèse s’est effectué sous la cotutelle des Universités de Bordeaux (France) et de São Paulo (Brésil). Plus particulièrement, ce projet s’est effectué, d’une part, au centre de recherche Paul-Pascal (CRPP) au sein de l’équipe « Matière Molle Structure et Dynamique » (M2SD) et d’autre part, à l’Institut de Physique de l’Université de São Paulo au sein de l’équipe « Grupo de Fluidos Complexos » (GFCx). Au vu de cette collaboration internationale, le nombre de personnes qui ont contribué directement ou indirectement à l’achèvement de cette thèse est nécessairement important. Je tiens donc à tous les en remercier.
Je remercie l’initiative d’excellence de l’Université de Bordeaux (IdEx) pour le finance- ment de sa bourse doctorale « Doctorat international IdEx Bordeaux 2013 » qui a permis non seulement de financer cette thèse mais aussi de donner une grande souplesse à l’en- vironnement de ce projet. Je remercie également l’entreprise SEPPIC qui, dans le cadre d’une collaboration, nous a fourni gracieusement les co-tensioactifs Simulsol, de nature chimique distincte, permettant ainsi d’enrichir pleinement l’étude physico-chimique de nos systèmes. Je remercie aussi le CNRS qui m’a accueilli au sein du CRPP pour effectuer la majeure partie de ces travaux.
Plus précisément, j’aimerai remercier de manière concrète certaines personnes à travers ces quelques pages. Tout d’abord, je remercie Doru Constantin et Christian Ligoure qui ont accepté de lire ces nombreuses pages de manuscrit et d’évaluer mon travail de thèse à travers leur rapport et leurs questions. Ils ont su apporter un regard critique pertinent et bienveillant à l’ensemble de ce travail. De mon point de vue, il est important d’être confronté à une telle démarche scientifique afin d’en retenir une vraie satisfaction per- sonnelle. Je remercie également Cécile Zakri pour avoir accepté de présider mon jury de thèse, malgré une promotion de thésards importante, et pour sa personnalité accueillante et bienveillante. Je remercie, de plus, Philippe Richetti et Cécile Zakri qui m’ont accueilli successivement au sein de leur laboratoire durant ma thèse.
Je remercie bien respectueusement mes trois directeurs de thèse Elisabeth Andreoli de Oliveira, Laurence Navailles et Frédéric Nallet. Je remercie aussi Kévin Bougis qui a su démontrer une grande motivation pour réussir à supporter ses trois directeurs durant ces trois années et j’espère qu’ils lui pardonneront ce trait d’humour déficient et totalement infondé. Au cours de cette longue période de thèse, c’est avec beaucoup de chance que
j’ai découvert une « seconde famille » et il me faudrait réécrire un second manuscrit, ce que rassurez-vous je ne ferai pas, pour détailler les qualités humaines, scientifiques et pé- dagogiques dont ils font preuve au quotidien. Je remercie Elisabeth pour s’être impliquée fortement dans mon accueil au Brésil dans les meilleures conditions au cours de ces trois années et dans mon travail de thèse, notamment par ses nombreuses idées apportées lors de nos discussions, et je sais qu’elle aurait aimé y participer encore davantage. Je la re- mercie d’autant plus pour ses conseils, son optimisme naturel, sa personnalité chaleureuse et bienveillante à mon égard et pour m’avoir fait découvrir la vie et la culture brésilienne qui resteront des souvenirs gravés dans ma mémoire. Je remercie Laurence pour son inves- tissement fort dans le cadre de cette thèse, du montage du projet jusqu’à son terme. Je lui suis très reconnaissant de m’avoir accordé sa confiance sur ce projet depuis mon arrivée en stage de deuxième année de master et d’autant plus pour avoir toléré les réunions de bureau excessives. Elle possède un certain talent et surtout l’intelligence pour instaurer une bonne ambiance constructive de travail afin de favoriser les échanges scientifiques et l’apprentissage des étudiants ce qui apparaît comme nécessaire pour enrichir la qualité du travail individuel et du travail commun. Je crois qu’une personne grandit dès lors qu’elle apprend via des réflexions personnelles ou qu’elle s’inspire des qualités des personnes qui l’entourent : je peux dire que Laurence m’a fait grandir durant cette période de thèse et je la remercie grandement. Je remercie Frédéric pour avoir fait avancer ce projet à pas de géant par ses interventions directes ou tout simplement par ce que j’ai pu apprendre grâce à lui. En plus d’être un humoriste humble, il incarne le scientifique dont chacun devrait s’inspirer tant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Il sera toujours pour moi une référence incontestable et je sais que ce sentiment semble partagé par tous ceux qui ont eu le privilège de le côtoyer.
Pour leur contribution à l’ensemble de ce travail présenté, je remercie Nadia Ziane, Julien Peyencet et Vincent Sénéchal (mon cocobureau). Pour leur contribution, leur aide et pour avoir réussi à me supporter en travaillant directement avec moi, je remercie Jules Sauveroche (le 1erfan des Wilsons), Rafael Leite Rubim (mon binome de toujours), Simon Von-Pine (mon irremplaçable stagiaire au sens propre comme au figuré) et Cécile Gouzon (ma stagiaire préférée).
Je remercie Isabelle Ly pour son aide et sa formation apportées sur les techniques de cryofracture et de microscopie électronique à transmission ainsi que pour sa gentillesse reconnue au sein du laboratoire. Je remercie Annie Février pour m’avoir agréablement accueilli au laboratoire, pour m’avoir formée à diverses techniques qui m’étaient alors in- connues, pour avoir été elle-même outrageusement exploitée et payée uniquement à coups de merci et de plaisanteries, et pour avoir continué d’apporter son aide et sa gentillesse tout au long de ces années jusqu’à mon pot de thèse. Je remercie Monsieur Ahmed Ben- taleb, mon quatrième directeur de thèse, pour sa formation complète à la technique de diffusion de rayons X, pour son altruisme naturel et pour tout simplement la personne d’exception qu’il incarne.
de Oliveira de l’Université de São Paulo, pour son aide sur la modélisation de la diffusion de rayons X des phases lamellaires, pour les séminaires qu’il m’a invité à présenter lors de mes séjours, et pour nos discussions enrichissantes.
Au cours de ma thèse, j’ai eu l’occasion d’effectuer des missions d’enseignement sur trois années à l’école ENSEIRB-MATMECA et j’aimerai remercier Thomas Brunet, pour sa disponibilité et son aide, Olivier Caty et Pierre Lubin, pour m’avoir intégré au sein de leur équipe d’enseignement, Christophe Bacon, pour son aide sur les expériences de travaux pratiques, et Sébastien Guisset pour nos discussions amicales.
Lors de mes séjours au sein de l’équipe GFCx, j’ai eu l’occasion d’être aidé admi- nistrativement ou expérimentalement par certaines personnes que je remercie : Renata Matsumoto, Arnaldo Gomes Oliveira Filho, Dennys Reis, Tarsis Mendes Germano. Au sein du CRPP, je remercie les personnes au sein de la direction, des services bâtiment, gestion et informatique, de l’atelier mécanique et des cellules chimie & instrumentation.
Plus particulièrement, je remercie Nadine Laffargue, Corinne Amengual, Jean-Luc La- borde, Béatrice Dupin (toujours là pour te faire gagner), Caroline Legrand (toujours là pour venir t’embêter), Emmanuelle Hamon et Nathalie Touzé, pour sa folie légendaire et toutes ses autres qualités. Au sein du groupe M2SD, j’aimerai aussi remercier plus particulièrement Annie Colin, Hassan Saadaoui et Carlos Drummond.
Lors de mes trois séjours au Brésil, j’ai eu la chance de rencontrer des personnes qui m’ont fait découvrir une culture brésilienne si chaleureuse et si amicale. Je remercie Cássio Alves, Vini, André, Sun Yang, Eraldo Sales, Dayana Domingos, mes collocataires lors de ma seconde année de thèse et plus spécifiquement Jorgivan Dias et Erike Cazaroto. Pour leur amitié, je remercie Emerson Rodrigo Teixeira da Silva, Barbara Bianca Gerbelli (et sa famille) & Pedro Leonidas Oseliero Filho, pour m’avoir accueilli parmi eux en troisième année #GOT, Vivian Vieira, Talita Fujimoto & Thiago Fraga, Rafael Serafim & Renata Bicev. Je remercie d’autant plus mon couple favori Rafael Leite Rubim & Nathassia Dresselt ainsi que leur famille respective pour leur générosité et pour m’avoir accueilli si chaleureusement.
Je remercie les personnes avec lesquelles j’ai passé de bons moments lors de ces trois années passées en grande partie au CRPP : Kévin Zimny, Martin Depardieu, Birte Rie- chers, Eva Koumousi, Yu Wang, Alan Luna, Manu Mercé, Jonathan Idier, Rémy Robert- son, Armand Roucher, Deniz Pekin, Sophie Bernadet, Elodie Roussarie, Aurélie Vigne (ma panda physicienne...et biologiste ?), les meilleurs cocobureaux Pierre-Etienne Rouet, Vincent Sénéchal et leurs poissons rouges/noirs, Florian Aubrit, Marie-Charlotte Tatry, Artem Kovalenko & Hélène Parant, Antoine Robert, mes jolis mariés Bosi Mao & Anthony Ranson, Laura Chacon, Mayada Selmi, Deise Maria, Marília Gabriela Cabral, Thamires Moreira, Kévin Ehrhardt (mon colocataire du mois), Nadia Ziane, Maxime Thivolle, Mi- chael Ramin, Mounir Benkoulouche, Amarande Robine, Thomas Missègue, la promotion
2013 avec Katerina Kampioti, Laura Alvarez Frances, Pauline Anaclet & son loulou Thi- bault Innocent, Marion Baillot, Marie Haddou et Laure Boucard.
Les professeurs ont un impact majeur sur nos choix d’orientation, et je tiens à remercier ici ceux qui ont aidé à guider certains de mes choix jusqu’à ce doctorat : José Canelas (au lycée, par sa pédagogie et sa personnalité il m’a donné goût à la physique-chimie), Marie- Agnès Bachelot (en première année d’université, par sa façon d’enseigner et sa disponibilité envers l’ensemble de ses élèves, elle m’a rassuré sur mon choix de rejoindre l’Université au détriment de la classe préparatoire) et par leur qualité en tant que professeurs à l’université, Rodolf Boisgard, Julien Burgin et Bertrand Dauphole. Bien que depuis tout petit j’aie gardé cette impression qu’entreprendre des études était important, je remercie aussi Clémence Faugère qui est la raison principale pour laquelle j’ai entrepris cette thèse.
Parce qu’ils ont participé à embellir la fameuse année de rédaction, par leurs rires et leurs personnalités, je remercie la SuperTeamStagiaire : Lucie Theillier, Margarida Abrantes Barros, Cécile Gouzon et Simon Von-Pine.
Parce que je tiens particulièrement à eux, je remercie aussi Alexis de la Cotte, Pierre Fauché & sa future femme Florianne Courdurier, l’inévitable, l’incontournable, l’inéluc- table Margot Stasse & Jérémie Valerian and the unicorn or just unique Mélodie Auriol.
Je remercie mes cobureaux successifs Eric Schoentgen (j’en profite aussi pour remercier Gildas B. Premel) et Rafael Leite Rubim (et sa merveilleuse femme Nathassia Dresselt).
Je suis conscient de la chance que j’ai eu de partager mon bureau avec les meilleurs, à tous les niveaux, et je les remercie sincèrement.
Parce que les années de fac ont été longues, je remercie les personnes qui m’ont marqué par leur personnalité et leur amitié et qui, pour certaines, m’ont suivi jusqu’à la fin de ce doctorat : Erwan Capitaine, Mokrane Hadj Bachir, Ludovic Quintard, Morgane Gandil, Quentin d’Acremont, Jean-Baptiste Perraud, David Rivière, Anais-Coline Machado, An- toine Deblais, Olivier Périé, Yussuf Karakaya, Jean-Baptiste Rabat, Max Oms, Morgan Vachon, Loic Merceron et Emilie Anonier-Frix.
Je remercie aussi mes amis les plus proches qui me soutiennent/supportent depuis le lycée ou le collège : Alexandre Leborgne & sa future femme Adeline Lemas, Sébastien Tarissa, Maud Bastiment, Pierre-Jean Fournié, Jean-Baptiste Cibois, Pauline Courrège &
Thomas Odriozola, Quentin Roumanet, Romain Dao & Coralie Devaux (alias ma petite Dinde).
Enfin, après cette longue liste, je remercie toute ma famille et tous les amis de la famille pour leur soutien et leur amour. Je remercie ceux qui me sont bien entendu essentiels car ils sont ceux qui me connaissent le mieux : ma mère, mon père, mon frère, ma sœur, ma grand-mère, ma marraine et mon parrain.
« There is no word for "thank you" in Dothraki. »"
(Jorah Mormont)
Table des matières
Résumé i
Abstract v
Resumo ix
Remerciements xi
Table des matières xv
Table des figures xxi
Liste des tableaux xxvii
Introduction générale 1
État de l’Art & Matériels et Méthodes 5
1 Introduction 7
1.1 Molécules amphiphiles et leurs auto-assemblages . . . 7
1.1.1 Définition d’une molécule amphiphile . . . 7
1.1.2 Auto-assemblage en différentes structures . . . 8
1.1.3 Micelles cylindriques . . . 10
1.1.4 Bicouches . . . 11
1.1.4.1 Phase lamellaire . . . 12
1.1.4.2 Vésicules . . . 12
1.2 Thermodynamique de la bicouche . . . 13
1.2.1 Interactions latérales . . . 13
1.2.1.1 Interactions intra-bicouche . . . 13
1.2.1.2 Surfaces « décorées » de polymères . . . 15
1.2.2 Description élastique . . . 18
1.2.2.1 Elasticité de la bicouche . . . 18
1.2.2.2 Effet élastique de polymères greffés sur une membrane . . 19
1.2.3 Etats de la bicouche . . . 21
1.3 Interactions inter-bicouches de l’empilement lamellaire . . . 23
1.3.1 Elasticité de l’empilement lamellaire . . . 23
1.3.2 Interactions de van der Waals entre bicouches . . . 25
1.3.3 Interactions électrostatiques entre deux plaques chargées . . . 27
1.3.4 Interactions stériques répulsives entre des surfaces décorées de po- lymères . . . 29
1.3.5 Ondulations d’Helfrich . . . 30
1.3.6 Phases lamellaires « liées » ou « non liées » . . . 32
1.4 Encapsulation de bâtonnets d’ADN entre des lamelles . . . 34
1.4.1 L’acide désoxyribonucléique . . . 34
1.4.1.1 Quelques propriétés générales . . . 34
1.4.1.2 Les phases liquides cristallines de bâtonnets d’ADN en solution aqueuse . . . 36
1.4.2 Confinement d’ADN dans des phases lipidiques cationiques . . . 37
1.4.3 Confinement d’ADN dans des phases lipidiques non ionique . . . 40
2 Matériels et Méthodes 45 2.1 Préparation des échantillons . . . 45
2.1.1 Préparation des membranes lipidiques . . . 45
2.1.2 Préparation de l’ADN . . . 48
2.1.3 Préparation des échantillons dits « ternaires » . . . 50
2.1.4 Préparation d’ognons . . . 50
2.1.4.1 Cisaillement et dispersion . . . 50
2.1.4.2 Extrusion . . . 51
2.2 Observation microscopiques . . . 51
2.2.1 Microscopie optique à lumière polarisée . . . 51
2.2.2 Microscopie en épifluorescence . . . 52
2.2.3 Cryofracture et microscopie électronique à transmission . . . 52
2.2.4 Cryo-microscopie électronique . . . 53
2.3 Diffusion dynamique de la lumière . . . 53
2.3.1 Instrument utilisé . . . 54
2.3.2 Modélisation . . . 54
2.4 Diffusion de rayons X . . . 56
2.4.1 Dispositifs utilisés . . . 56
2.4.1.1 Nanostar . . . 56
2.4.1.2 Anode . . . 57
2.4.2 Modèle d’ajustement de diffractogrammes . . . 58
L’empilement lamellaire de bicouches lipidiques 63
3 Stabilisation d’empilements lamellaires de bicouches lipidiques : effets du
confinement et effets stériques 65
3.1 Mise en évidence du confinement de la bicouche . . . 65 3.1.1 L’état « non lié » : exemple des bicouches composées de Simulsol
[Ac. O, n=6] . . . 66 3.1.2 L’état « lié » : exemple des bicouches composées de Lécithine . . . . 70 3.1.3 Transition de décrochage : bicouches composées d’un mélange de
Lécithine et de Simulsol [Ac.O, n=6] . . . 74 3.1.4 Régimes d’hydratation dilué et intermédiaire : transition de phase
entre un empilement lamellaire « concentré » et un empilement la- mellaire « dilué » . . . 75 3.1.4.1 Contrôle du confinement lamellaire par l’hydratation du
système et par la densité de greffage . . . 75 3.1.4.2 La structure électronique de la bicouche . . . 80 3.1.5 Régime peu hydraté : transition de phase entre du Simulsol hydraté
et un empilement lamellaire . . . 85 3.1.5.1 Transition de phase entre du Simulsol hydraté et l’état
« non lié » des bicouches de Simulsol [Ac. O, n=6] . . . 85 3.1.5.2 Transition de phase entre du Simulsol hydraté et un em-
pilement lamellaire « concentré » pour des bicouches mixtes 86 3.2 Thermodynamique des bicouches lipidiques empilées fluctuantes . . . 87
3.2.1 Interactions essentiellement d’origine stérique : les ondulations d’Hel- frich . . . 87 3.2.2 Deux empilements lamellaires aux propriétés élastiques distinctes . 88 3.2.3 Modélisation thermodynamique d’empilements de bicouches mixtes 91 3.2.4 Fluctuations de membranes composées de Lécithine . . . 93 3.3 Conclusion . . . 97
4 Physico-chimie de l’empilement lamellaire 99
4.1 Effet de l’insaturation au sein de la bicouche . . . 99 4.1.1 Etat de phase de la bicouche . . . 100 4.1.2 Faible densité de greffage en co-tensioactif . . . 101 4.1.2.1 Membranes avec du Simulsol [Ac. S, n=6] . . . 101 4.1.2.2 Membranes avec du Simulsol [Ac. S, n=15] . . . 104 4.1.3 Haute densité de greffage en co-tensioactifs . . . 106 4.1.3.1 Membranes avec du Simulsol [Ac. S, n=6] . . . 106 4.1.3.2 Membranes avec du Simulsol [Ac. S, n=15] . . . 107 4.2 Effet de la longueur de la chaîne aliphatique . . . 109 4.2.1 Membranes avec du Simulsol [Ac. L, n=6] . . . 109
4.2.2 Membranes avec du Simulsol [Ac. L, n=15] . . . 112 4.3 Effet de la longueur hydrophile sur des membranes fluides . . . 115 4.3.1 Faible densité de greffage en co-tensioactifs . . . 115 4.3.2 Haute densité de greffage en co-tensioactifs . . . 116 4.3.3 Bicouches de tensioactifs apparentés à des copolymères diblocs . . . 119 4.4 Conclusion . . . 122
Encapsulation d’ADN & Création de Vecteurs 127
5 Des nano-bâtonnets d’ADN structurés et confinés via des mécanismes entro- piques et interfaciaux dans un empilement lamellaire lipidique 129 5.1 Les organisations de bâtonnets d’ADN au sein d’une phase aqueuse . . . . 130 5.1.1 Le diagramme de phase . . . 130 5.1.2 La phase cholestérique . . . 132 5.1.3 La phase hexagonale . . . 132 5.1.4 La phase orthorhombique . . . 134 5.2 Les confinements vertical et latéral des membranes régissent les différentes
organisations de l’ADN au sein de la phase lamellaire . . . 134 5.2.1 Les principales organisations de bâtonnets d’ADN confinés au sein
d’un complexe lipidique . . . 137 5.2.2 La coexistence entre l’organisation nématique de bâtonnets d’ADN
et l’organisation isotrope au sein d’empilements lamellaires . . . 139 5.2.3 L’organisation nématique au sein de l’empilement lamellaire de bi-
couches . . . 143 5.2.4 La transition nématique-hexagonale au sein de la phase lamellaire . 146 5.2.5 La structure hexagonale inverse de lipides neutres pour organiser
l’ADN . . . 148 5.3 Effet des interactions interfaciales stériques stabilisant les structures d’ADN 151 5.3.1 Effet de la densité de greffage en Simulsol à la surface de la bicouche152 5.3.1.1 Membranes de Simulsol [Ac. O, n=6] . . . 152 5.3.1.2 Membranes de composition 56(L)/44(S) . . . 156 5.3.1.3 Membranes de composition 70(L)/30(S) . . . 159 5.3.1.4 Membranes de composition 95(L)/5(S) . . . 161 5.3.1.5 Membranes de Lécithine . . . 163 5.3.2 Effet de la longueur de la chaîne éthoxylée du co-tensioactif . . . . 167
5.3.2.1 Membranes composées de Lécithine et Simulsol [Ac. O, n=10] . . . 167 5.4 L’organisation des molécules d’ADN soumise aux différents régimes de
confinement des membranes . . . 170 5.5 Conclusion . . . 172
6 De l’empilement lamellaire de bicouches aux ognons dispersés 175 6.1 Cisaillement de phases lamellaires . . . 176 6.1.1 Pâte cisaillée multilamellaire . . . 176 6.1.2 Effet du cisaillement sur les propriétés structurales et élastiques des
bicouches empilées . . . 178 6.2 La thermodynamique de l’empilement lamellaire initial induit des proprié-
tés physiques spécifiques des ognons dispersés au maximum à 15% . . . . 178 6.2.1 Multilamellarité vésiculaire et densité de greffage membranaire . . . 180 6.2.1.1 Vésicules multilamellaires . . . 180 6.2.1.2 Vésicules uni-lamellaires . . . 183 6.2.1.3 Contrôle de la pression osmotique . . . 185 6.2.2 Influence des régimes d’hydratation de la phase lamellaire initiale
sur le diamètre hydrodynamique des vésicules . . . 185 6.3 Contrôle de la stabilité et de la géométrie des ognons . . . 192 6.3.1 Etude cinétique . . . 192 6.3.2 Méthode de l’extrusion . . . 192 6.4 Conclusion . . . 196
Conclusion générale et perspectives 197
Annexes 201
A Substantial abstract in english 203
A.1 Introduction . . . 203 A.1.1 Motivation and goals . . . 203 A.1.2 "Bound" or "unbound" lamellar phases . . . 204 A.2 Materials and Methods . . . 206 A.2.1 Samples preparation . . . 206 A.2.2 Microscopic observations . . . 207 A.2.3 X-ray scattering . . . 207 A.2.4 Nallet model . . . 208 A.3 Interfacial effects in complexes DNA-lipid bilayers-water . . . 209 A.4 Interfacial mechanisms in a lamellar matrix of lipid bilayers . . . 211 A.4.1 Highly hydrated domain : "Unbinding" transition . . . 212 A.4.1.1 Description in terms of Vertical and Lateral confinements 212 A.4.1.2 "Unbound" state . . . 214 A.4.1.3 "Bound" state . . . 215 A.4.2 Poorly hydrated domain : Lamellar-Lamellar transition . . . 216 A.4.2.1 Phase coexistence . . . 216
A.4.2.2 Molecular reorganization . . . 217 A.5 Interfacial mechanisms : comparison between the lamellar matrix and the
complexes . . . 219 A.5.1 Nematic-Hexagonal transition . . . 219 A.5.2 Organizations & Confinements . . . 220 A.6 Conclusion . . . 222
Bibliographie 225
Table des figures
1.1.1 Description simplifiée d’une molécule amphiphile. . . 8 1.1.2 Description géométrique d’une molécule amphiphile via la conservation
du volume. . . 9 1.1.3 Exemples d’auto-assemblages de systèmes lyotropes. . . 10 1.1.4 Micelles cylindriques organisées suivant une symétrie hexagonale (2D) se-
lon un paramètre de mailleα. . . 11 1.1.5 Représentation d’une phase lamellaire de bicouches. . . 12 1.1.6 Représentation schématique (vue en coupe) des différentes variétés de vé-
sicules dispersées dans un solvant. . . 14 1.2.1 Les différentes conformations de polymères. . . 17 1.2.2 Illustration de la structure de bicouches. . . 22 1.3.1 Représentation schématique des différents états de contrainte d’un smec-
tique A lyotrope d’épaisseur de membraneδet de périodicité d’empilement d. . . 24 1.4.1 Phases anisotropes de l’ADN. . . 38 1.4.2 Représentation des deux organisations hexagonales lipidiques encapsulant
l’ADN. . . 39 1.4.3 Organisations de l’ADN au sein d’un empilement de bicouches. . . 41 1.4.4 Synthèse de principaux résultats de l’étude des complexes lipidiques élec-
triquement neutres confinant de l’ADN. . . 42 2.1.1 Les molécules amphiphiles utilisées dans la composition des bicouches. . . 47 2.1.2 Les différentes étapes de la préparation de l’ADN. . . 49 2.3.1 Exemple de courbe d’auto-corrélation de l’intensité de diffusion de la lu-
mière. . . 55 2.4.1 Variation du facteur de structure ˜S avec (a) le paramètre de Caillé η et
(b) le nombre de bicouches corrélées N pour différents vecteurs d’onde de diffusion q. . . 59 2.4.2 Représentation schématique du facteur de forme de la bicouche décrit par
le modèle de Nallet. . . 60
2.4.3 Variation du facteur de forme P selon les épaisseurs hydrophile δH et hydrophobe δT et le rapport des contrastes de densité électronique ∆ρ∆ρT
H. . 61 3.1.1 Hydratation d’empilements lamellaires de bicouches, composées exclusi-
vement de Simulsol [Ac. O, n=6], analysée par diffusion de rayons X. . . . 66 3.1.2 Confinements vertical et latéral mis en évidence pour des empilements de
membranes de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 67 3.1.3 Évolution des différentes épaisseurs décrivant la bicouche de Simulsol [Ac.
O, n=6], par contraste de densité électronique via le modèle de Nallet (voir Section 2.4.2), avec le confinement appliqué. . . 69 3.1.4 Gonflement lamellaire des bicouches de Lécithine. . . 70 3.1.5 Etude du confinement des bicouches de Lécithine. . . 71 3.1.6 Évolution des différentes épaisseurs qui caractérisent les bicouches de Lé-
cithine. . . 73 3.1.7 Lois de gonflement lamellaire de bicouches empilées de compositions dis-
tinctes par leur teneur molaire en Simulsol [Ac.O, n=6]. . . 74 3.1.8 Couplage entre un confinement latéral, représenté par une aire moléculaire
à l’interface eau-bicouche Σ, et un confinement vertical, illustré par une périodicité lamellairedpour différentes densités de greffage en co-tensioactif. 76 3.1.9 Représentation schématique et à l’échelle des effets de confinements verti-
cal (axe z) et latéral (plan⊥), de l’hydratation et de la densité de greffage en co-tensioactif polymèrique sur l’empilement lamellaire « dilué ». . . 78 3.1.10 Évolution des confinements critiques, indiquant des transitions de phase
ou de régime d’hydratation, avec la densité de greffage en co-tensioactif polymèrique. . . 79 3.1.11 Comportement de la membrane face au confinement vertical appliqué. . . 80 3.1.12 Analyse de la déformation de la bicouche obtenue par contraste de densité
électronique. . . 81 3.1.13 Propriétés communes à chaque composition de bicouches issues de l’ana-
lyse par contraste de densité électronique (voir Section 2.4.2). . . 83 3.1.14 Diffractogrammes d’une phase de Simulsol [Ac. O, n=6] hydraté à diffé-
rentes concentrations avant la transition en phase lamellaire. . . 85 3.1.15 Mise en évidence de la transition de phase entre du Simulsol [Ac. O, n=6]
hydraté et un empilement lamellaire « concentré » pour des bicouches mixtes. . . 86 3.2.1 Ondulations d’Helfrich décrites à l’aide du paramètre de Caillé. . . 88 3.2.2 Propriétés élastiques des empilements lamellaires « dilués » et « concen-
trés » pour les compositions de membrane mixtes. . . 89 3.2.3 Modélisation d’empilements de bicouches par une description thermody-
namique de l’énergie libre d’excèsfexc du système. . . 92
3.2.4 Décomposition spinodale mise en évidence par le modèle thermodyna- mique employé. . . 94 3.2.5 Limite du modèle thermodynamique pour décrire les bicouches empilées
de Lécithine. . . 95 4.1.1 Etat cristallisé de bicouches mixtes. . . 100 4.1.2 Cristallisation de la bicouche pour de longs co-tensioactifs saturés intro-
duits dans sa composition. . . 102 4.1.3 Effet de la composition hydrophobe de co-tensioactifs courts greffés sur
des bicouches empilées en faible concentration. . . 103 4.1.4 Effet de la composition hydrophobe de longs co-tensioactis polymériques
greffés à la membrane en faible concentration. . . 105 4.1.5 Lois de dilution de bicouches empilées composées de mélange de Lécithine
et de Simulsol [Ac. S, n=6]. . . 106 4.1.6 Transition dans le gonflement lamellaire de bicouches empilées constituées
de Lécithine et d’une forte concentration de longs co-tensioactifs. . . 108 4.2.1 Caractérisation d’empilements lamellaires composés d’un mélange de Lé-
cithine et de Simulsol [Ac. L, n=6]. . . 111 4.2.2 Coexistence de phases, entre un empilement lamellaire « concentré » et
un empilement lamellaire « dilué », mise en évidence pour des bicouches constituées de Lécithine et de longs co-tensioactifs polymériques de com- position hydrophobe distincte. . . 113 4.2.3 Mise en évidence des confinements appliqués aux empilements de bi-
couches composées d’un mélange de Lécithine et de longs co-tensioactifs de composition hydrophobe distincte. . . 114 4.3.1 Effet de la longueur de chaînes éthoxylées sur le gonflement lamellaire pour
des bicouches fluides constituées par du co-tensioactif en faible concentra- tion. . . 117 4.3.2 Effet de la longueur de chaînes éthoxylées sur le gonflement lamellaire pour
des bicouches fluides constituées par du co-tensioactif en haute concentra- tion. . . 118 4.3.3 Effet de la longueur de chaînes éthoxylées sur le gonflement lamellaire pour
des bicouches fluides constituées uniquement de tensioactifs polymériques. 121 4.4.1 Synthèse des résultats obtenus par variation de la physico-chimie des mem-
branes. . . 123 5.1.1 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN en solution aqueuse. . . 131 5.1.2 Caractérisation expérimentale de la phase cholestérique d’ADN. . . 133 5.1.3 Caractérisation expérimentale de la phase hexagonale d’ADN. . . 135 5.1.4 Caractérisation par diffusion de rayons X de la phase supposée orthorhom-
bique d’ADN. . . 136
5.2.1 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe lipidique composé de Lécithine (23%) et de Simulsol [Ac. O, n=6] (77%). 138 5.2.2 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées à 77% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 140 5.2.3 Caractérisation expérimentale de la phaseLIα. . . 142 5.2.4 Caractérisation expérimentale de la phaseLNα. . . 145 5.2.5 Caractérisation expérimentale de la phaseLHα. . . 147 5.2.6 Caractérisation expérimentale de la phaseHIIC. . . 149 5.2.7 Structure hexagonale de micelles lipidiques inverses contenant de l’ADN
caractérisée par microscopie. . . 151 5.3.1 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de tensioactifs Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 153 5.3.2 Caractérisation par diffusion de rayons X de systèmes ternaires Simulsol
[Ac. O, n=6]-ADN-eau. . . 154 5.3.3 Caractérisation par microscopie de systèmes Simulsol [Ac. O, n=6]-ADN-
eau. . . 155 5.3.4 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de Lécithine (56%)et de Simulsol [Ac. O, n=6] (44%). . 157 5.3.5 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées à 44% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 158 5.3.6 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de Lécithine et de 30% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . . 160 5.3.7 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées à 30% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 161 5.3.8 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de Lécithine et de 5% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 162 5.3.9 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées à 5% de Simulsol [Ac. O, n=6]. . . 163 5.3.10 Exemple de caractérisation par diffusion de rayons X de domaine multi-
phasique. . . 164 5.3.11 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de Lécithine. . . 165 5.3.12 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées de Lécithine. . . 166 5.3.13 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN confinés au sein d’un complexe
lipidique composé de Lécithine et de 30% de Simulsol [Ac. O, n=10]. . . . 168 5.3.14 Comparaison des confinements appliqués aux membranes ternaires et bi-
naires composées à 30% de Simulsol [Ac. O, n=10]. . . 169 5.4.1 Diagramme de phases général caractérisé par les confinements vertical et
latéral. . . 171
6.1.1 Caractérisation expérimentale de la pâte cisaillée multilamellaire. . . 177 6.1.2 Etude des propriétés structurales et élastiques de la pâte cisaillée. . . 179 6.1.3 Etude des propriétés de la bicouche de la pâte cisaillée par contraste de
densité électronique. . . 179 6.2.1 Caractérisation par diffusion de rayons X des ognons multilamellaires
après dispersion. . . 180 6.2.2 Détermination expérimentale du caractère multilamellaire des ognons. . . 181 6.2.3 Etude des propriétés élastiques des ognons dispersés multilamellaires. . . . 183 6.2.4 Effet du régime d’hydratation de l’empilement lamellaire sur la distance
inter-membranaire au sein des ognons multilamellaires. . . 184 6.2.5 Caractérisations expérimentales des ognons unilamellaires dispersés. . . . 186 6.2.6 Effet du contrôle de la pression osmotique sur la distance inter-membranaire
au sein d’ognons multilamellaires dispersés. . . 187 6.2.7 Effet du régime d’hydratation de l’empilement lamellaire sur les tailles des
ognons dispersés. . . 189 6.2.8 Effet de la composition membranaire sur la taille des ognons dispersés. . . 191 6.3.1 Etude de la stabilité des ognons dispersés au cours du temps. . . 193 6.3.2 Contrôle de la taille des ognons par la méthode d’extrusion. . . 194 A.1 DNA organizations inside a lamellar stack of bilayers. . . 204 A.1 Amphiphilic molecules used in the bilayers composition. . . 207 A.2 Schematic representation of the bilayer form factor described by Nallet’s
model. . . 209 A.1 Effect of Simulsol content on the complexes phase diagram. . . 211 A.1 Unbinding transition brought out by the vertical and lateral confinements
applied on bilayers lamellar stack composed of different Simulsol [Ac. O, n=6] molar content. . . 213 A.2 Lateral and vertical confinements controlled by a coupling between the
hydration and the cosurfactant grafting density. . . 214 A.3 Thermodynamic description of the lamellar unbound state. . . 215 A.4 Thermodynamic description of the lamellar bound state. . . 216 A.5 Lamellar-lamellar phase transition. . . 217 A.6 Deformation of the membrane against the confinement. . . 218 A.1 Nematic-heganonal phase transition in complexes induced by the lamellar-
lamellar transition in the host. . . 220 A.2 Comparison of confinements applied on the bilayers between the lamellar
host and the complexes with DNA. . . 221
Liste des tableaux
1.4.1 Propriétés physiques de l’ADN dans les conditions physiologiques. . . 35 1.4.2 Diagramme de phase de bâtonnets d’ADN (50nm) en solution tampon
d’acétate d’ammonium à 0.25 M. . . 37 2.1.1 Propriétés des différentes molécules. . . 46 2.1.2 Compositions des différentes membranes de Lécithine et de Simulsol. . . . 48
Introduction générale
Cadre général et objectifs
La formation d’une planète débute dès lors qu’un nuage, constitué de poussières et de gaz, orbite autour d’une proto-étoile. Par interaction gravitationnelle avec la proto- étoile et par collision entre chaque grain de poussière, une accrétion a lieu et entraîne la formation d’objets, à l’aspect globalement sphérique, d’une taille de l’ordre du millier de kilomètres (rayon= 6371kmpour la Terre) au bout d’un temps d’équilibre qui se mesure en millions d’années. Le processus de formation d’une telle planète s’apparente alors à un mécanisme d’auto-assemblage des grains de poussières.
À une échelle de taille un milliard de fois plus petite, un phénomène similaire d’auto- assemblage est observé en présence de molécules amphiphiles au sein d’une solution. Ces molécules forment alors des objets de taille nanométrique sous la forme de micelles, de bicouches, de vésicules ou d’organisations plus complexes. Parmi ces molécules, on re- trouve la catégorie des tensioactifs, qui sont utilisés principalement dans les domaines de la cosmétologie et de la pharmacologie, ou bien des molécules « naturelles » comme certains lipides ou certaines protéines. Les lipides et les protéines sont majoritairement connus comme principaux constituants de la membrane cellulaire. Ils sont présents, par exemple, dans la composition de la myéline qui est une membrane multilamellaire. Celle- ci isole électriquement les fibres nerveuses appelées axones, à l’image d’une gaine de fils électriques, et augmente la vitesse de conduction de l’influx nerveux [35]. Lorsque cet auto-assemblage est altéré par les conditions physico-chimiques et qu’une rupture de la structure a lieu, il est le marqueur de maladies dégénératives du système nerveux comme les maladies d’Alhzeimer et de sclérose en plaques.
La compréhension des interactions au sein d’une structure périodique de bicouches multilamellaires apparaît alors essentielle, d’un point de vue médical ou biologique, mais représente aussi une motivation pour des applications telles que la création de biosenseurs [123, 103, 61, 130] ou de liposomes, utiles pour la vectorisation [95, 62, 130]. Les propriétés locales, c’est-à-dire à l’échelle de la bicouche, ou les propriétés globales de l’empilement peuvent être alors façonnées par un mélange des lipides avec, par exemple, des tensioactifs ou des polymères amphiphiles. Un aspect particulier de la bicouche est, par ailleurs, distingué lorsqu’elle ne présente pas d’organisation particulière dans son plan. Elle est
considérée être dans un état « fluide ». Ainsi, l’empilement de telles bicouches possède une symétrie de phase smectique A et est qualifiée de phase lamellaire Lα.
L’étude fondamentale des mécanismes responsables de la stabilité de ces structures lipidiques, lamellaires et auto-assemblées a été le sujet de nombreuses investigations ex- périmentales et théoriques. Les « forces d’hydratation » [76], les interactions d’ondulation des membranes [49] et l’attraction de van der Waals [104] s’imposent alors comme des concepts centraux pour expliquer la formation de systèmes lamellaires de bicouches non chargées qui, par conséquent, ne dépendent pas d’interactions électrostatiques. Diverses techniques expérimentales sont alors employées telles que l’appareil à force de surface (SFA) [119], la diffusion dynamique de la lumière (DLS) [101], les mesures de pression osmotique [75, 76, 109], la diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) [127] et en incidence rasante (grazing-incidence SAXS) [129].
Elargissant le potentiel de ces édifices supramoléculaires, ces structures sont utilisées en tant que matrice hôte modèle pour l’encapsulation et le confinement de macromolécules telles que l’acide désoxyribonucléique (ADN). À l’origine, ce sont des complexes constitués de lipides cationiques qui ont été privilégiés pour interagir électrostatiquement avec ces longs polyélectrolytes anioniques [117]. Ces systèmes auto-assemblés sont alors décrits expérimentalement [117, 65, 66] et théoriquement [47, 92]. Bien qu’ils présentent des avantages certains comme celui de pouvoir se lier électrostatiquement aux membranes de cellules spécifiques (lipofection) [68, 16], ils peuvent, malgré tout, présenter un degré de cytotoxicité in vitro causée par la présence de leurs charges positives [131, 25].
Mais de manière surprenante, il est possible aussi de confiner ces macromolécules, sans avoir recours aux interactions électrostatiques, au sein d’empilements lamellaires de bi- couches lipidiques électriquement neutres, notamment dans un régime d’hydratation im- portante [116, 115]. Ces bicouches sont constituées principalement de Lécithine, un phos- pholipide zwiterrionique, et d’une faible teneur en co-tensioactif non ionique, introduit de manière à diminuer la rigidité des membranes. Dans ce contexte, l’entropie prend alors un rôle prépondérant dans les mécanismes responsables du confinement de bâtonnets d’ADN au sein des couches aqueuses séparant chaque membrane de l’empilement lamellaire [20].
Poursuivant ces travaux pionniers, E. R. Teixeira da Silva entreprend, au cours de sa thèse, d’explorer le domaine plus confiné (moins hydraté) en effectuant une étude systéma- tique du diagramme de phase de systèmes similaires. Un des principaux résultats obtenus est la mise en évidence d’un riche polymorphisme dans l’organisation que prennent les bâtonnets d’ADN confinés au sein de l’empilement de bicouches. Par augmentation de la concentration en ADN, différentes structures surviennent avec la succession résumée de l’organisation isotropeLIα, de l’agencement nématiqueLNα, de l’arrangement rectangulaire LRα et de la structure hexagonale LHα. Cependant, l’origine des mécanismes responsables de tels auto-assemblages concentrés demeure, en partie, non élucidée. Le travail de thèse présenté s’inscrit donc principalement dans une démarche de caractérisation des inter- actions régissant les auto-assemblages de ces complexes lipidiques contenant ou non des
Contributions
Différents mécanismes éventuels sont considérés tels que des mécanismes entropiques ou interfaciaux. En effet, l’ADN n’est pas confiné entre deux plaques rigides et, par consé- quent, la membrane se doit d’avoir un rôle prédominant dans ces domaines d’hydratation peu élevée. La modification de l’élasticité membranaire est envisagée afin de varier les effets entropiques tandis qu’une modification des interactions spécifiques, à l’interface bicouche- bicouche ou bicouche-ADN, paraît intéressante pour varier les effets interfaciaux. Pour ce faire, le choix considéré est d’introduire un co-tensioactif, structurellement apparenté à un (petit) copolymère dibloc, au sein des membranes composées de lécithines.
Par variation de la nature chimique du co-tensioactif et de sa teneur au sein de la mem- brane, il est possible d’élargir le champ des interactions opérant au sein de l’empilement lamellaire, méthode débutée par nos partenaires brésiliens et s’avérant être prometteuse [42]. Ces interactions sont alors séparées d’une part, en composante verticale aux bicouches et, d’autre part, en composante latérale au plan des bicouches. À l’aide de techniques et de modélisation de la diffusion de rayons X aux petits angles couplées à des techniques de microscopies, le diagramme de phase, la fluidité membranaire, le confinement et la transi- tion de « décrochage » de ces empilements lamellaires, au départ dépourvus de molécules d’ADN, sont étudiés. Cette approche permet alors une corrélation quantitative avec les empilements renfermant les différentes organisations de l’ADN. Une comparaison est no- tamment effectuée entre les confinements, qui délimitent les transitions de phases, et les propriétés structurales et élastiques des bicouches, qui dépendent, chacune, de l’hydrata- tion du système et de la composition membranaire. Les interactions de type polymère, engendrées par les chaînes éthoxylées du co-tensioactif, révèlent leur part importante sur la stabilisation et le confinement de ces structures gouvernées par l’hydratation du système.
Organisation de la thèse
L’organisation du manuscrit s’établit sur six chapitres. Le premier chapitre décrit quelques généralités associées aux auto-assemblages de molécules amphiphiles. Un état de l’art de la description thermodynamique de la bicouche et de l’empilement lamellaire est, de plus, donné. Une synthèse bibliographique des complexes lipidiques, cationiques et neutres, confinant des macromolécules d’ADN est brièvement rapportée. Le second chapitre détaille la formulation des échantillons, les différentes techniques expérimentales utilisées ainsi que les modèles appliqués aux techniques de diffusion de la lumière. En- semble, ces deux chapitres forment la 1re partie.
Le troisième chapitre correspond à une analyse précise et détaillée d’un empilement lamellaire de bicouches sans ADN, composée de lécithine et d’un co-tensioactif choisi tout particulièrement, de nature chimique fixée. À l’aide de cette membrane modèle,
la thermodynamique, le confinement et la structure de l’empilement de bicouches sont caractérisés par variation de la teneur en co-tensioactif et de l’hydratation du système.
Le quatrième chapitre correspond à une description physico-chimique de l’empilement lamellaire des bicouches. À partir de la méthode de caractérisation définie au chapitre précédent, les systèmes, qui se distinguent maintenant par une modification de la nature chimique du co-tensioactif, sont comparés par leur diagramme de phase, par l’état de phase de la bicouche et par la compétition entre les interactions verticales et latérales.
La nature chimique du co-tensioactif diffère, d’un système à l’autre, par les longueurs des parties hydrophobe et hydrophile et par la présence éventuelle d’une insaturation au sein de la partie hydrophobe. Assez naturellement, une 2e partie est constituée de la réunion de ces deux chapitres.
L’intérêt du cinquième chapitre, qui ouvre la 3e et dernière partie, est porté sur la caractérisation des interactions intervenant entre les bâtonnets d’ADN et les membranes lipidiques. Les différentes organisations des bâtonnets d’ADN sont définies en termes de confinements vertical et latéral appliqués à la bicouche fluide. Les effets entropiques et interfaciaux sont alors discutés par comparaison avec l’empilement lamellaire sans ADN de la partie précédente. Enfin, le sixième chapitre permet une ouverture du projet sur la vectorisation, cette dernière pouvant s’effectuer au sein d’ognons formés par cisaillement de ces systèmes lamellaires. La taille des ognons et leur caractère multilamellaire sont décrits (revenant à l’utilisation d’un co-tensioactif unique) par un contrôle de la pression osmotique, de la composition membranaire et de l’hydratation du système.
État de l’Art & Matériels et Méthodes
« The perfect blossom is a rare thing. You could spend your life looking for one, and it would not be a wasted life. »
(Moritsugu Katsumoto)
Introduction
1.1 Molécules amphiphiles et leurs auto-assemblages
Notre étude se penche sur des systèmes, à l’échelle nanométrique, résultant de l’auto- assemblage de molécules amphiphiles en solution aqueuse. Une brève description de ces molécules, aux propriétés surprenantes, et de leurs auto-assemblages est présentée dans cette section introductive. L’attention est alors plus particulièrement centrée sur les com- plexes qui sont analysés au sein de cette thèse.
1.1.1 Définition d’une molécule amphiphile
Bien qu’elle soit commune, la molécule d’eau présente d’étonnantes propriétés pour interagir avec son environnement. Cette molécule polaire, pouvant établir des liaisons hydrogènes (liaisons orientées), présente une coordination tétraédrique. Cela lui permet une grande variété d’associations comme c’est le cas pour le carbone que l’on retrouve sous la forme de chaînes moléculaires (polymères, protéines), de composés cycliques, ou bien encore sous la forme de cristaux à deux ou trois dimensions (feuillets de graphène, graphite, diamant). Ainsi, la molécule d’eau interagit fortement avec ses analogues, mais elle interagit également avec d’autres molécules polaires via des interactions électrosta- tiques dipôle-dipôle (qu’ils soient induits ou permanents) ou bien dipôle-ions, dès lors que ces dites molécules s’ionisent en solution. Même si les interactions liées à la polarité des molécules sont privilégiées dans ces énumérations, la molécule d’eau peut néanmoins interagir avec des molécules non polaires si des liaisons hydrogènes sont possibles. Toutes ces molécules présentant ces « affinités » avec l’eau sont alors caractérisées comme étant
« hydrophiles ». Maintenant, si l’eau est mise en commun avec des molécules ne présentant aucune de ces « affinités », elle va tendre à vouloir rester entourée par d’autres molécules d’eau (interactions attractives plus intenses). Il en résulte alors un regroupement de ces molécules, appelées « hydrophobes », entre elles et autour duquel les molécules d’eau
vont s’assembler. Les chaînes hydrocarbonées sont, à titre d’exemple, considérées comme hydrophobes.
Certaines molécules, que l’on nomme amphiphiles, présentent ces deux caractéristiques simultanément et se définissent, pour la plupart, en deux parties distinctes comme repré- sentées sur la Figure 1.1.1 : une partie hydrophile de longueurδH, communément qualifiée de « tête » et interagissant de manière intense avec l’eau, et l’autre partie hydrophobe de longueur δT , qualifiée quant à elle de « queue », et préférant alors « éviter » les molé- cules d’eau. Grâce à cette particularité, ces molécules présentent d’originales propriétés d’auto-assemblage en solution aqueuse.
Figure 1.1.1–Description simplifiée d’une molécule amphiphile. La tête (« head ») polaire de la molécule s’étend sur une longueur δH et la queue (« tail ») hydrocarbonée sur une longueur δT.
Différents types de molécules amphiphiles peuvent être listés, présentant des morpho- logies distinctes, libérant des charges ou non en solution, et utilisés pour diverses appli- cations. Les tensioactifs, par exemple, sont des molécules amphiphiles utilisées afin de modifier la tension superficielle à l’interface entre deux milieux qu’elle soit liquide-liquide, liquide-gaz ou liquide-solide. Parmi les molécules amphiphiles à structure des plus « clas- siques », on peut citer les copolymères à blocs qui sont constitués d’un assemblage d’au moins deux motifs de répétition (deux monomères distincts) où l’un possède des proprié- tés hydrophiles tandis que l’autre est hydrophobe. Enfin, à l’état naturel, on retrouve des molécules aux fonctions indispensables telles que les lipides présents dans la composition des membranes cellulaires par exemple, ou bien des macromolécules telles que certaines protéines.
1.1.2 Auto-assemblage en différentes structures
Les différences d’interactions entre les parties hydrophile et hydrophobe avec les mo- lécules d’eau donnent naissance à deux « forces opposées », idée proposée par Charles Tanford vers 1980. Ces deux forces tendent à définir une aire moyenne interfaciale a par molécule en contact avec la phase aqueuse. En effet, l’attraction entre les parties hy- drophobes, plus intense que l’interaction partie hydrophobe-molécule d’eau, induit une association entre les molécules amphiphiles, tandis que la répulsion hydrophile, qui est électrostatique ou stérique, a pour conséquence d’augmenter la surface de contact avec
la phase aqueuse. Il en résulte que ces molécules amphiphiles, de longueur l = δH +δT , auto-assemblées en solution peuvent se définir géométriquement, voir Figure 1.1.2, en faisant appel à la conservation du volume moléculaire v supposé invariant :
v =a∗l=constante (1.1.1)
Figure 1.1.2 –Description géométrique d’une molécule amphiphile via la conservation du volume. La molécule décrit une surface moyenne a d’interaction avec le solvant et s’étend sur une longueur moyenne l.
Cette définition géométrique se veut proche du concept de « packing parameter », ou paramètre d’empilement, introduit par Israelachvili [59, 60] pour différencier les molécules, dont les chaînes hydrocarbonées demeurent fluides, par leurs contraintes géométriques une fois auto-assemblées en solution. Cet auto-assemblage, selon une structure donnée, n’est en rien aléatoire et dépend de la nature chimique de la (ou des) molécule(s) et des conditions physico-chimiques du système telles que la température, le potentiel hydrogène (pH), la concentration, la force ionique et la salinité de la solution. La structure obtenue à l’état d’équilibre est alors régie par les interactions entre ces molécules :
- la gêne stérique qui varie selon les longueurs hydrophile et hydrophobe, le nombre de chaînes hydrocarbonées et la présence d’insaturations ;
- les interactions électrostatiques s’il y a présence de charges en solution pour des molécules ioniques, cationiques, catanioniques (s’il y a combinaison ou mélange) et zwi- terrioniques (présence de charges positive et négative au sein de la molécule).
Les molécules associées selon un assemblage bien défini peuvent donc se transformer d’une structure à une autre lorsque les conditions de la solution sont modifiées ; comme il est illustré Figure 1.1.3 pour un système lyotrope lorsque la concentration en tensioactifs
varie. Ainsi, lorsque le confinement du système augmente, des micelles sphériques (Figure 1.1.3, a) se transforment en une phase de micelles cylindriques (Figure 1.1.3, b). Celles- ci peuvent donner alors naissance, lorsque la quantité de solvant diminue, à une phase éponge ou bien directement à une phase contenant des bicouches étendues voire sous forme empilée (Figure 1.1.3, c). Si la concentration augmente davantage, l’auto-assemblage finit par se modifier en structures inversées (Figure 1.1.3, d et e). Les structures présentées ici ne sont que quelques exemples simples de mésophases où chaque domaine délimitant une unique phase est séparée par un domaine dit biphasique.
Figure 1.1.3 – Exemples d’auto-assemblages de systèmes lyotropes. Ceux-ci diffèrent par leur courbure qui est définie principalement suivant les interactions latérales (dépendantes des conditions environnementales) entre les têtes polaires, d’une part, et entre les chaînes hydrocarbonées, d’autre part. (a) Micelles sphériques directes (le solvant demeure à l’exté- rieur). (b) Micelles cylindriques directes. (c) Bicouches ordonnées sous forme d’empilement.
(d) Micelles cylindriques inverses (le solvant demeure contenu à l’intérieur. (e) Micelles sphériques inverses.
1.1.3 Micelles cylindriques
La micelle est composée d’une monocouche de tensioactifs qui auront tendance à se regrouper sous la forme d’une sphère, à haute dilution, afin de minimiser l’énergie libre
du système. Dès lors que la concentration est augmentée ou bien que les interactions entre molécules sont telles qu’elles ont tendance à définir une aire interfaciale plus petite, ces molécules amphiphiles forment des micelles plus allongées de forme cylindrique. Ces agrégats de « bâtonnets », de taille large et polydisperses, peuvent s’organiser de façon hexagonale dans une représentation 2D, voir Figure 1.1.4. Comme illustré Figure 1.1.3, on retrouve ce type de micelles sous forme directe, c’est-à-dire que le solvant est à l’extérieur des micelles, ou bien sous forme inverse, avec le solvant à l’intérieur des micelles, en fonc- tion notamment de la nature du solvant et globalement des conditions physico-chimiques environnementales.
Figure 1.1.4–Micelles cylindriques organisées suivant une symétrie hexagonale (2D) selon un paramètre de maille α.
1.1.4 Bicouches
La bicouche est composée de deux monocouches de tensioactifs inversées l’une par rap- port à l’autre de manière à ce que les chaînes aliphatiques minimisent leur contact avec le solvant. Les molécules, qui la composent, présentent une tête hydrophile petite en propor- tion par rapport au volume total de la molécule ; pointant ici le volume important occupé par les chaînes hydrocarbonées au sein de cette bicouche, spécialement lorsque celle-ci est à l’état fluide, voir Section 1.2.3. Les bicouches, apparentées de manière simplifiée aux membranes cellulaires, peuvent en solution, notamment en fonction de leur courbure lo- cale, s’assembler au sein d’un domaine plus important comme c’est le cas pour les phases lamellaires ou les vésicules.
1.1.4.1 Phase lamellaire
Les bicouches interagissent entre elles et s’arrangent sous la forme d’un empilement la- mellaire comme représenté Figure 1.1.5. A l’état fluide, la bicouche est en moyenne plane latéralement dans le plan X-Y et fluctue autour d’une position d’équilibre selon la di- rection z. On définit alors une épaisseur « géométrique » de membrane (ou de bicouche), δm = 2l = 2(δH +δT), et une distance de répétition entre les bicouches d appelée aussi paramètre d’ordre d’empilement ou périodicité. Si l’on considère une extension « infinie » des bicouches suivant les directions X et Y devant l’épaisseur de la membrane, on peut postuler une longueur moyenneLsuivant l’axe X et une longueur moyenne ∆ suivant l’axe Y et ce pour toutes les bicouches. On peut alors définir un sous-volume de la phase lamel- laire, V = d.L.∆, regroupant une bicouche et le solvant contenu entre deux membranes consécutives de telle sorte que Vtotal =k.V, aveck un entier. Suivant cette considération géométrique, il est possible de définir le volume occupé par les tensioactifs, ou les lipides, commeVlip=k.δm.L.∆. Il vient naturellement une définition de la fraction volumique en lipides :
φlip = Vlip Vtotal
= δm
d (1.1.2)
Figure 1.1.5–Représentation d’une phase lamellaire de bicouches. Les bicouches, d’épais- seur δm, sont empilées suivant la direction z avec un ordre d’empilementdet sont séparées les unes des autres par une couche de solvant.
1.1.4.2 Vésicules
Lorsque la bicouche présente une courbure sous certaines conditions, il devient alors plus favorable de former des bicouches recourbées en une sphère, de façon spontanée, plu-
