L'effet de la longueur de la chaine et du ph sur la conformation de polyampholytes alterncs du type (L-lysyl-L-asparty1)n

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L'effet de la longueur de la chaine et du pH sur la conformation de polyampholytes alternCs du type (L-lysyl-L-asparty1)n

HUBERT DAOUST ET SERGE ST-PIERRE'

Ddpartement de chimie, Universite'de Montrdal, C.P. 6210, Montrdal, Quebec H3C3VI R e p le 2 juillet 19742

HUBERT DAOUST et SERGE ST-PIERRE. Can. J. Chem. 53,1861 (1975).

Nous avons rklisk la synthkse, par la mkthode en phase solide, d'une skrie de co-oligopeptides alternks, du type (L-lysyl-L-aspartyl)., (n = 4-10, dans le but d'etudier le comportement des polyampholytes en solution aqueuse, en fonction du p H et de la longueur de la chaine peptidique. Nous avons observe que les spectres de dichrolsme circulaire variaient moins, en fonction de la longueur de la chaine et du pH, que ceux observes avec des homooligo8ectrolytes ne possaant pas de caractere polyampholytique. Nos rkultats suggerent une structure globulaire pour les peptides au point isoklectrique et une structure Btendue en milieu fortement acide ou basique.

HUBERT DAOUST and SERGE ST-PIERRE. Can. J. Chem. 53,1861 (1975).

The synthesis of alternating (L-lysyl-L-aspartyl). co-oligopeptides (n = 4-10) was realized by the solid phase method, to study the effect of chain length and p H on the conformation of polyampholytes in aqueous solution. The c.d. spectra do not show as important a dependance on p H and chain length as those observed with the nonampholytic homooligoelectrolytes. Our results suggest that the peptides are globular in shape when the p H of the solution is close to the isoelectric point but are extended in strong acid and base solutions.

Introduction

Depuis le dCbut des annCes '50, un nombre incalculable de travaux ont ttC effectuts dans le but d'ttudier la stabilitt intrinsique de la conformation helicoi'dale des peptides et polypeptides.

Pour mieux simuler la structure hClicoi'dale qu'on retrouve B l'inttrieur des protCines, oh les seg- ments htlicoldaux comprennent rarement plus d'une vingtaine de rtsidus constcutifs, d'autres auteurs ttudiaient l'influence de la longueur de la chaine peptidique sur 17hClicitt.

Une des premiQes Ctudes du genre fut accomplie par Brand et collaborateurs (1-3), sur les proprittts rotatoires de la poly-L-lysine (PLL) en fonction de la longueur de la chaine.

Robinson et Bott (4), utilisant un copolymhe de D,L-phtnylalanine et de y-L-glutamate de benzyle de poids moltculaire variable, proposirent une relation entre la longueur de la chaine. et son degrC dYhtlicitC. Doty et collaborateurs (5-7) firent de mCme avec le poly-y- L-glutamate de benzyle. Les polypeptides de masse moltculaire tlevte formaient des hClices stables dans des solvants tel le chloroforme, alors que les chaines de faible masse moltculaire

'Adresse actuelle: Department of Chemistry, Uni- versity of California, La Jolla, California.

'La revision reGue le 19 fkvrier 1975.

Ctaient dCsordonnees en solution dilute et de structure-p en solution plus concentrte. Good- man et collaborateurs (8-22) effectuirent le plus grand nombre de travaux dans le domaine, en milieu non-aqueux. Dans le cas des oligomires de y-L-glutamate de mCthyle, ils proposirent que 1'hClicitC s'amorce entre l'hepta et le nonam;re, utilisant b, comme crit2re d'htlicitt. Les oligo- mQes de masse moltculaire plus faible (d.p. < 12) avaient tendance B s'associer dans le dioxanne, alors que les fractions de masse moltculaire suptrieure formaient plus spontantment des htlices (12). Tous les oligopeptides adoptaient la conformation dtsordonnte dans les acides forts, tel l'acide dicloroacttique (DCA). Pour les oligopeptides correspondants du P-L-aspartate de mtthyle, la structure-P commen~ait B l'octamire et I'htlicitC B l'undtcamire, dans une solution B 3% de DCA dam le chloroforme.

Un travail similaire fut accompli avec des oligopeptides solubles dans l'eau. En 1952, Becker et Stahmann (23) mesuraient la rotation sptcifique, [a],25, d'oligomQes de longueur croissante de L-lysine.HC1. Alors que la rotation sptcifique de la poly-L-lysine, de poids moltculaire ClevC, atteignait - 80", celle du 22-mire se rapprochait de -70". Schellman (24), en 1958, avait prCdit que la longueur critique d'une hClice-a, en solution aqueuse, Ctait de 15-20 Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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1862 CAN. J. CHEM. VOL. ^{53, 1975} rtsidus, mais que les interactions entre les

chaines lattrales ttaient responsables d'une stabilitt moindre de cette conformation. De meme, les effets de bouts de chaine, ntgligeables pour un polypeptide de masse moltculaire Clevt, devenaient un facteur prtdominant pour la stabilitt des oligopeptides.

En 1971, Fasman et collaborateurs (25) publiaient les rtsultats d'une ttude par dis- persion optique rotatoire (d.0.r.) sur la relation entre la longueur de la chaine d'oligopeptides de L-lysine et leur htlicitt. 11s dtmontrbrent qu'une chaine comprenant jusqu'B 22 rtsidus de lysine n'avait pas le mCme spectre d.0.r. que le polypeptide correspondant. L'htlicitt s'amor~ait B n = 12; le 22-mbre ne contenait que 13%

d'htlicitt B pH 11.9. De mCme, une ttude des oligombres de l'acide L-glutamique B pH 3.5, par Snipp et al. (26) n'attribuait que 40%

d'htlicitt B la chaine de 17 rtsidus et 70% B la chaine de 40 rtsidus.

En 1971, Schechter et al. (27) effectuaient une des premibres ttudes sur une strie de co-oligopeptides de longueur croissante en solution aqueuse. La dttermination de la conformation des homologues de la strie (L-tyrosyl-L-alanyl-L- alanyl), dans le but d'ttudier l'effet de la longueur de la chaine et de la densite de charge sur les proprittts antigtniques et immuno- gtniques de ces peptides.

Quoique les prottines soient avant tout des polyampholytes, aucun travail n'a t t t rapport6 concernant l'influence de la longueur de la chaine sur la conformation de peptides posstdant cette proprittt. On relbve cependant plusieurs travaux relatifs A la synthbse et B l'ttude conformationnelle de polypeptides posstdant des proprittts ampholytiques, de stquence altatoire (29, 30) et alternte (31-37). Une des principales limitations A ce genre d'ttude est la synthbse de fractions d'oligopeptides homogbnes et exempts de ractmisation. Yaron et collaborateurs (25, 28) a utilisk une mtthode chromatographique pour obtenir des fractions dont l'homogtntitt, pour les homologues de masse moltculaire suptrieure, laissait A dtsirer. Rtcemment, Bonora et al. (38), utilisaient la synthbe en phase solide pour obtenir des oligopeptides de longueur croissante de l'acide glutamique.

Nous avons tgalement utilist la mtthode de synthbse en phase solide (39) pour obtenir la strie de peptides (L-lysyl-L-aspartyl),, (n = 1-10).

Les couplages ont t t t rtalists A l'aide du rtactif

de Belleau, soit le N-tthoxycarbonyl-tthoxy-2- dihydroquinoline-l,2 (EEDQ) (40-42). Cet agent de couplage, applique pour la premibre fois B la synthbse en phase solide par Sipos et Gaston (42), permet de former l'anhydride mixte de l'acide amint qu'on veut ajouter A la chaine et donne lieu A des couplages rapides, avec un rendement tlevt. Ce rtactif n'occasionne pas la formation de produit secondaire indtsirable comme c'est le cas pour la dicyclohexylcar- bodiimide (DCCI) (39); on peut par constquent utiliser des excbs moindres de dtrivt B O C ~

d'acide amint et diminuer le coilt de la synthbse..

Nous avons ttudit la variation des spectres de dichrolsme circulaire de ces peptides en fonction de la longueur de la chaine et du pH.

L'influence des bouts de chaine sur les spectres d.c. des peptides a t t t tvalute par une mtthode similaire A celle de Fasman et collaborateurs (25). Nous prtsentons tgalement l'tvaluation des fractions d'htlice-a, de structure-p et dtsordonnte par une mtthode baste sur celle que Yang et collaborateurs (43, 44) ont mise au point pour tvaluer la structure secondaire des prottines A partir de spectres d.c. Au lieu des standards prottiniques de Yang, nous avons utilist les valeurs de Greenfield et Fasman (45) des spectres d.c. de la poly-L-lysine en solution aqueuse, sous les formes htlice-a, structure-p ou dtsordonnte. Nos rbultats tendent B dtmon- trer que la longueur de la chaine est un critbre de stabilitt conformationnelle moins important pour les polyampholytes qu'elle ne I'est pour les homopolypeptides ioniques.

Solvants et rioctui

Les solvants et rkactifs pour la synthese en phase solide ont CtC purifies comme suit. Le dichloromkthane a t t t redistill6 sur P205 et utilisC immediatement aprts.

La trikthylamine etait refluke et distillee sur sodium et conservke sous atmosphere d'azote au refrigtrateur.

L'acide trifluoroacCtique etait refluC et distill6 sur P205 et conservC dans des bouteilles scellees. Tous les autres rtactifs et solvants Ctaient de qualit6 reactif analytique et ont etC utilisks comme tels.

La rCsine de Merrifield, soit un copolymere de styrene et de divinyl-benzene (1%) provenait de la compagnie Bio-Rad; elle contenait 1.25 mequiv. de chlore par gramme. Le EEDQ (Aldrich Chemicals, qualit6 Gold Label, +99%) a CtC utilise sans purification supplemen- taire.

Le N-a-Boc-p-L-aspartate de benzyle et le N-a-Boc-N- E-tosyl-L-lysine furent preparks dans notre laboratoire, Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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DAOUST E T ST-PIERRE: CONFOR :MATION DE POLY AMPHOLYTES 1863 selon des mtthodes d6ja dkrites (39, 4648). Le copoly

(L-lysyl-L-aspartyl) a Cte synthetise dans nos laboratoires et cette synthbse est rapportke dans une autre publication (49). Son poids moltculaire moyen en poids est de 31 700, tel que determine par approche h 1'Cquilibre de sedimen- tation.

Purification et analyse des peptides

L'appareil "Osmolyser" (Bio-Rad) a CtC utilise pour le dessalage des peptides. Les resines Sephadex G-10 et G-25 provenaient de la compagnie Pharmacia Canada Ltd., de Montreal.

Les chromatographies sur couche mince ont CtC effectukes sur des plaques de gel de silice G, de la compagnie Baker. Les melanges de solvants suivants ont ete utilis6s: (a) butanol-1 : acide acktique: eau : pyridine (15:3: 12:lO); (b) butanol-1 :acide acetique: eau (4: 1 : 1);

et (c) pyridine: acide aktique: eau (10 : 6: 3). Les Blectro- phorbses ont kt6 effectukes sur papier Whatman No. 1, en utilisant une source de courant de 1200 V, 50 mA, dans une solution tampon a p H 2.8, pendant 90 min. Les chromatographies sur couche mince et les Blectro- phorbses ont kt6 r6v6lks independamment a la ninhydrine (0.2% dans IYa&tone) et au reactif hypochlorite de sodium-o-toluidine - iodure de potassium (50).

Les analyses d'acides aminb ont BtB effectuQs au moyen d'un appareil automatique Beckman, modele 120 (51).

S.vnthPse des oligopeptides

L'attachement du premier acide amin6 a la resine, soit le N-a-Boc-j3-L-aspartate de benzyle, s'est effectue selon le procede habitue1 (39), en faisant rkagir 20 g de resine chloromethylk (25 mmol de C1) avec 6.5 g (20 mmol) de derive d'acide aspartique. La quantite d'acide amine ainsi fixte a Cte determink, par analyse quantitative,

a

0.37 mmol/g de resine. Au cours de toutes les opbations de la synthkse en phase solide, ~ o u s avons utilise comme solvant le dichloromethane. Le EEDQ ( 1 5 z dans I'Cthanol absolu) (42) a CtC utilise comme agent de couplage. Pour chaque couplage, nous avons utilise un triple excbs molaire de derive d'acide amink, en solution concentrk dans le dichloromethane et le mdme ex&

de EEDQ dans I'Cthanol. A partir du dixibme residu attache a la chaine, chaque couplage a Cte rCpCtC avec des quantitts fraiches des mdmes rkactifs, pour s'assurer d'un rendement quantitatif a chaque etape. La completion de chaque couplage a CtB v6rifik par la methode colorim6trique de Kaiser et al. (52), puis par analyse quantitative d'acides amints, juste avant le couplage suivant.

Apres chaque couplage, la resine Btait lavee avec de larges quantitb de dichlorom6thane. A p r b le couplage d'un derive de lysine, nous pr6levions environ 1 g de resine et procedions ensuite a la reaction de dtprotection du derive Boc. Cette reaction Btait effectuke au moyen de I'acide trifluoroacktique (TFA) a 50% dans le dichloromkthane, pendant 20 min. Aprbs de copieux lavages au dichlorom6thane, la neutralisation Ctait effectuee au moyen d'une solution de trikthylamine 10% (v/v) dans le dichlorom6thane. Cette mdme skrie d'opbations a BtB rkp6tk jusqu'a I'obtention de I'eicosapeptide.

Le clivage de chaque khantillon de peptide du support a kt6 effectuk en faisant barboter un faible courant de HBr anhydre et exempt de brome dans une suspension

du complexe de rbine-peptide dans le TFA. Avant d'dtre barbott dans la suspension, le HBr gazeux Ctait prealablement lave dans du tetrahydronaphtalene- 1,2,3,4, puis dans de I'anisole maintenu

a

30°, enfin s k h 8 sur Drierite et P20,. Le groupement tosyl a 136 clive au moyen d'une reduction par le sodium dans I'ammoniac liquide. Nous avons adouci les conditions de la reaction conventionnelle (39) en ajoutant goutte B

goutte une solution de peptide dans I'ammoniac liquide.

Nous avons ajoute la solution bleu fonce a la solution de peptide jusqu'a ce que cette dernibre atteigne une couleur bleue pile persistante; au bout de 15 s, nous arrdtions la riaction en y ajoutant brusquement de chlorure d'ammonium solide. La solution devenait alors incolore et limpide. Aprbs Cvaporation de I'ammoniac et sechage sous vide, le peptide et le sel Ctaient dissous dans un volume minimum d'acide acitique a 2%. La solution Btait dessalke au moyen de I'"0smolyser" et lyophiliste.

La completion des reactions de clivage par HBr/TFA et de detosylation Btait alors vkrifik par r.m.n. et spec- troscopie u.v. pour la prbence de groupements aromatiques rksiduels. De mdme, les spectres i.r. des peptides ne rkvblent aucune bande typique aux esters entre 1750 et 1800 cm-'.

Chaque peptide a ensuite subi une premiere purification sur resine IRC-50, prkalablement reg6n6rk avec une solution d'acide acktique

a

50% et l a v k I'eau jusqu'a neutralitt. La solution de peptide Ctait alors appliquQ a la rtsine et le peptide Btait Blue dans un gradient de bicarbonate d'ammonium de 0 a 0.5 M. Le pic principal de peptide Ctait alors detect6 par spectrophotomttrie a 230 nm et la fraction lyophiliske. La purification finale de chaque peptide a CtB effectuk sur resine Sephadex G-10 (de I'octapeptide au dodkcapeptide) ou G-25 (du tetradkcapeptide a I'eicosapeptide) dans I'eau. Seules les fractions correspondant au maximum d'absorption, detect6 comme prkedemment, ont etC conserv6es et lyophilis6es. Dans tous les cas, un seul maximum d'absorption a kt6 d6tecte.

Pureid des peptides

Le tableau 1 nous montre les rksultats de I'analyse d'acides aminks des peptides et rkvble des rapports respectifs lys/asp trbs voisins de 1. Les chromatographies sur couche mince de tous les peptides, dans les trois systbmes de solvants enumQb prkedemment, ne rkvelaient qu'une seule tache bien definie dans tous les cas, par developpement a la ninhydrine ou a I'hypochlorite de sodium-o-toluidine - iodure de potassium.

TABLEAU 1. Rtsultats de I'analyse quantitative d'acides amints des diffirents peptides

Rapport Rapport

Peptide thkorique expQimental ( 1 y s - a ~ ~ ) ~ lys/asp lys/asp

4 1.00 0.95

5 , 1.00 1.07

6 1 .OO 1.02

7 1.00 1.04

8 1 .OO 0.95

9 1

.oo

^1.00

10 1 .OO 0.93

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1864 CAN. J. CHEM. VOL. 53, 1975

Enfin, 1'electropho~se sur papier, a p H 2.8, apporte les memes conclusions, utilisant les rnemes reactifs de d6veloppement des taches.

I1 est difficile de calculer le rendement global de la synthese jusqu'i I'obtention du peptide pur, a cause des prelevements que nous avons effectues chaque Btape pour recueillir le peptide de longueur d6sirke. Nous ne pouvons qu'estimer grossierement le poids de resine- peptide prelevk; selon nos estimations, le rendement global, bas6 sur le poids d'acide aspartique attache ?I la resine du depart, se situe aux environs de 50% pour I'octapeptide et diminue jusqu'a environ 15% pour I'eicosapeptide.

Mesures de dichroisme circulaire

Les spectres d.c. ont kt6 enregistrks au moyen d'un spectropolarimetre Durrum-Jasco, de modkle ORD/

UV-5, muni d'un attachement d.c. install6 par Sproul Scientific (modele SS-20). Tous les spectres ont Cte enregistrks

a

23

+

I", la temperature Btant maintenue constante au moyen d'un bain a circulation d'eau Haake.

Les cellules de quartz utilisees Ctaient de qualitt Suprasil (Hellma); les chemins optiques Btaient de 1.00, 0.10 et 0.01 cm.

Le spectropolarimetre a kt6 calibre en utilisant les valeurs standards de De Tar (53). L'acide d-10-cam- phorsulfonique nkcessaire a la calibration a kt6 prealablement recristallist deux fois a partir du produit com- mercial (Aldrich Chemicals, 99%, [aIDZ0

+

19.9" (c 2, HzO), dans I'acide acetique glacial et skche rigoureusement a 50" sous vide, sur Pz05. Sous ces conditions, le point de fusion est de 195" et la rotation spkcifique [alDZo +22.1° (c 1, HzO). Ces valeurs restent invariables apres une cristallisation supplkmentaire. Une valeur de calibration de +8216 deg cmZ dmol-I a kt6 utiliske et revkrifike pkriodiquement avec une solution fraiche du standard.

L'ellipticite moyenne par residu, [el, exprimee en deg cmZ dmole-l, a ete calculCe selon la relation:

oh est I'ellipticit6 observke, en degrks, a la longueur d'onde h, L est le chemin optique de la solution (en cm), p.m.r. est le poids molCculaire moyen d'un residu de la chaine et c la concentration de peptide en g/cm3.

Nous avons p r b a r e les solutions pour le dichroisme circulaire de la f a ~ o n suivante. Une quantitk d'environ 5 mg de peptide Btait pesee dans un ballon jaugk de 5 ml et dissoute dans I'eau decarbonatk ou dans une solution de NaF- 0.05 M. La solution Btait filtrke sur Millipore (type GSWPO-1300, Millipore, Bedford, Mass.). Des khantillons de 0.5 ml de cette solution stock Ctaient mesures precisement dans des fiacons et gard6s au con- gdateur jusqu'i usage. Une minime fraction de cette solution etait utiliske pour la determination de la concentration par analyse quantitative d'acides aminks.

A I'exception des mesures pour determiner I'effet de la concentration, des solutions dont la concentration variait entre 0.01 et 0.05% ont kt6 prtparees en diluant le volume requis de solution stock avec de I'eau ou la solution a 0.05 M de NaF. Nous avons ajuste le pHdes solutions en y ajoutant lentement du NaOH ou du HCI 4 N a I'aide d'une micropipette. Le p H ktait lu avant et apres I'en-

registrement d'un spectre et la moyenne not&. L'effet de dilution a kt6 Ctudit en utilisant une solution

a

1%

de peptide dans une cellule de 0.01 cm et une solution 0.005% dans une cellule de 1 cm.

Nous avons compare les spectres d.c. obtenus avec notre appareil avec ceux obtenus par Greenfield et Fasman (45) avec la poly-L-lysine sous les formes htlice-a, structure-8 et dCsordonn6e. L'khantillon de poly-L-lysine (Sigma Chemicals) possMait un poids molkulaire moyen de 100 000 (comparativement $I

120 000 pour I'dchantillon utilise par Fasman). Nous avons reproduit exactement les conditions utilistes par ces derniers pour la preparation des khantillons et I'enregistrement des spectres, pour les trois formes de la poly-L-lysine. Les valeurs d'ellipticitk rnoyenne par residu sont en moyenne reproductibles a +2% de 250 A 215 nm, ? 5% de 215 a 205 nm et

+

10% de 205

a

^{200 nm.}

Cette derniere difference s'explique par le bruit de fond particulierement intense dans cette region du spectre, dij i~ une trop grande Bnergie au photomultiplicateur (0.5 kV a 200nm, solvant seul) de notre instrument. C'est pourquoi tous nos spectres sont rapportes de 250

a

205 nm.

Pour plus de prkaution, les spectres d.c. de quelques solutions de copolypeptide ont kt6 remesures au moyen d'un spectropolarim6tre Cary 61 et ont montrk une excellente reproductibilitk, de 250 a 205 nm, avec les spectres enregistrks par I'appareil Durrum-Jasco.

Mesure du p H

Les valeurs de p H ont CtC mesurks au moyen d'un p H mitre digital Radiometer, modele PHM52, relie

a

une electrode combinee Radiometer, de type GK2302G.

Le p H metre fut calibre a I'aide de tampons standards (Fisher Scientific Co.) a p H 7.00, 10.00 et 4.01, precis a

+

0.02 unite de pH.

Mkthode d'ana1.vse conformationnelle des peptides Pour Cvaluer le pourcentage relatif (A) d'h6lice-a, de structure-8 et de structure d&sordonnke, nous avons utilise une mdthode d'analyse comparable a celle de Yang et collaborateurs (43, 44). requation de base peut sVcrire comme suit,

a

une longueur d'onde donnee:

oh les 0, representent les ellipticites respectives des spectres standards de la poly-L-lysine (45) sous la forme helice-a, structure-8, et d6sordonnde; 0 est la valeur donnee par nos Bchantillons.

On peut tirer les parametres fH,

fD

et ^fR de la resolution des n kquations, oh n est le nombre de valeurs de longueur d'onde utilisks. Nous avons rCsolu, dans tous les cas, un systkme de 45 huations, incluant toutes les valeurs de 0 comprises entre 250 et 205 nm, par la methode de Cramer, au moyen d'un programme adapte a un ordinateur CDC 6400.

Enfin, le programme a kt6 test6 en effectuant le calcul des fi pour la myoglobine et la papalne, utilisant les Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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DAOUST ET ST-PIERRE: CONFOR .MATION DE POLYAMPHOLYTES 1865 valeurs d'ellipticitk et les standards de Yang et col-

laborateurs (43) pour ces protkines. Les valeurs de f, respectives se comparaient bien ii celles de Yang.

Rbsultats et discussion La synthzse des peptides

La synthtse en phase solide s'est rtvClCe un moyen remarquablement efficace et rapide pour obtenir des oligopeptides de longueur croissante rigoureusement homogenes. Pour cette premitre Ctude sur les oligoampholytes, nous avons prCferC choisir deux acides amints simples, tels la lysine et l'acide aspartique, pour les raisons suivantes.

Premitrement, les dCrivCs de la lysine sont reconnus pour n'occasionner aucun probl2me majeur lors de synthtse par la mtthode de Merrifield, si le groupe de protection de l'amine en E est choisi judicieusement (39). Pour une synthbe rkpttitive comme celle que nous rap- portons ici, nous devions choisir un groupe trbs rtsistant

a

la prtsence d'acide trifluo- roacttique

a

50% dans le dichloromtthane, pour que la dkprotection du groupe N-a-Boc soit vraiment dlective. Des essais prkliminaires nous ont montre que le groupement carboben- zoxy ne convenait pas

a

nos besoins,

a

cause de son instabilitt en milieu acide. C'est pourquoi nous avons choisi le groupement tosyle, qui est d'une stabilitk remarquable

a

l'hydrolyse acide et qu'on peut enlever facilement par rtduction par le sodium dans l'ammoniac liquide; tel que dCcrit dans la partie exphimentale, les conditions que nous avons utilistes pour cette dCprotection nous ont donnC satisfaction.

Deuxitmement, le choix de l'acide aspartique, de prCfCrence

A

l'acide glutamique, a t t t fait dans le but d'kviter les difficultts qu'ont ren- contries d'autres chercheurs (38, 54) lors de l'utilisation de cet acide amint en synthese en phase solide.

Troisi2mement7 le choix de la lysine, de prtfkrence

a

d'autres acides aminCs

a

chaine lattrale basique, tels le tryptophane ou l'histidine par exemple, a Ctt fait dans le but d'obtenir des spectres de dichroisme circulaire dtpourvus des complications inhtrentes aux acides amints aromatiques (55-57).

Quatritmement, la poly-L-lysine est un polypeptide ionique dont le comportement en solution aqueuse a suscitC un nombre incalculable de travaux a cause des trois conformations qu'elle peut prksenter, selon les parametres de

la solution. Ce polypeptide est reconnu princi- palement pour la stabilitt de son htlice-a, donnant lieu

A

des spectres de dichroisme circulaire caracttristiques de cette conformation (45). Par contre, les polypeptides de l'acide aspartique et de ses esters (58-60) manifestent des propriCtCs particulitres concernant la stabilitC et la chiralitC des htlices qu'ils forment en solution aqueuse ou organique. Le comportement en solution aqueuse de polypeptides alternts composts de ces deux rtsidus d'acides amints, compliquk des probltmes propres aux polyampholytes, s'avere le sujet d'une Ctude des plus intkressantes. Dans cette premiere Ctude, nous n'avons considCrk que l'effet de la longueur de la chaine et du p H sur la conformation des chaines.

Dichroisme circulaire

Nous illustrons, dans les figs. 1-3, l'influence de la longueur de la chaine sur l'allure des spectres de dichroi'sme circulaire. Nous avons choisi d'Ctudier le phCnomene a trois p H extremes, soient 2, 7 et 12, oh la charge globale sur le peptide est respectivement positive, nulle et ntgative. Pour une plus grande clartk, nous n'avons prtsentt sur les figures que les spectres de quatre peptides. Pour faciliter la comparaison

FIG. 1. Influence de la longueur de la chaine sur le spectre d.c. de quatre peptides de la skrie (lys-asp), h p H 2.00, h 22", dans une solution aqueuse de NaF 0.02 M (concentration en peptides: 0.01% plv).

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1866 CAN. J. CHEM.

FIG. 2. Influence de la longueur de la chaine sur le spectre d.c. de quatre peptides de la strie (lys-asp). a pH 7.00, i3 22", dans une solution aqueuse de NaF 0.02 M (concentration en peptides: 0.01% p/v).

FIG. 3. Influence de la longueur de la chaine sur le spectre d.c. de quatre peptides de la s6ie (lys-asp). i3 pH 12.00 i3 22", dans une solution aqueuse de NaF 0.02 M (concentration en peptides: 0.01% p/v).

enfre les divers spectres, nous avons conservC la mCme Cchelle pour toutes les figures. Les rCsultats sont exprimts en degrC cm2 dmol-' et reprtsentent l'ellipticitt molaire par rCsidu d'acide amint. Le poids moltculaire moyen par

VOL. 53. 1975

rtsidu a Ctt assign6

a

121.65, soit la moyenne pondtrt d'un rtsidu lysyl (128.2) et aspartyl (1 15.1). On observe en premier lieu, a un p H donne, une ltg&re augmentation de la bande d'ellipticitt ntgative autour de 225 nm, de l'octapeptide au polypeptide. A pH 7, cepen- dant, on observe une ltg&re bande positive pour l'octapeptide et l'eicosapeptide. La diffkrence d'ellipticitt autour de 225 nm est nettement supCrieure lorsque l'on compare l'eicosapeptide et le polypeptide. Globalement, l'ellipticitt dans cette rtgion du spectre passe, de l'octapeptide au polypeptide, de - 1900

a

- 6700 deg cm2 dmol-'

A

pH 2.0, de

+

¹⁰⁰⁰

a

-3000 deg cm2 dmol-'

a

p H 7.0 et de -200 B -4000 deg cm2 dmol-' a p H 12.0. Qualitativement, on peut Cgalement constater que la bande ntgative de dichroisme autour de 200 nm diminue d'in- tensitt lorsque l'on augmente la longueur de la chaine, quelque soit le pH.

Afin de mieux illustrer l'influence de la longueur de la chaine sur la conformation des peptides, nous avons choisi premikement une mtthode similaire

A

celle que Yaron et al. (25) avaient utiliste pour Cvaluer la longueur critique d'une htlice et l'importance des effets de bouts de chaine dans le cas d'oligom&res de longueur croissante de L-lysine. Ces derniers avaient supposC l'existence de la relation suivante entre la rotation molaire par rtsidu et la longueur de la chaine:

oh [m], est la rotation moyenne par rCsidu dans une chaine dtsordonnCe

A

une longueur d'onde

A;

[m]interne et [m]bo,ts sont respectivement la rotation due aux rCsidus situCs au centre de la chaine et en bouts de chaine; n est le nombre de rtsidus dans la chaine. Toute dtviation de la linCaritt de cette tquation devrait indiquer l'amorce d'une forme ordonnCe de structure secondaire.

Nous avons supposC qu'une telle relation peut &tre convertie en termes d'ellipticitk molaire et s'tcrire :

oh [el, est I'ellipticitC molaire

a

220 nm, calculke B partir du spectre d.c.; [8]interne, [8]boucs et n correspondent aux termes semblables de l'tq. 4.

A partir du graphique de [el en fonction de lln, on doit obtenir les valeurs de [8]interne et de Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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DAOUST ET ST-PIERRE: CONFORMATION DE POLYAMPHOLYTES 1867

[8],o,,, comme ttant respectivement l'ordonnte

B l'origine et la pente des droites. Ces courbes, B pH 2.0,7.0 et 12.0, sont reprtsenttes B la fig. 4.

Comme le montre la figure, la 1inCaritC de l'tq. 5 est respectCe pour tous les oligopeptides, de l'octapeptide B l'eicosapeptide, aux trois p H Ctudits. On remarque cependant que les trois points correspondant au polypeptide sont en dehors de leur tract respectif. A pH 7.0 et 12.0, l'ellipticitt du polypeptide varie d'environ 1000 deg cm2 dmol-l de la 1inCaritC. A pH 2.0, cependant, cette difftrence est d'environ 2500 deg cm2 dmol-'. La contribution des rtsidus internes B 17ellipticitC est la plus faible (-2500 deg cm2 dmol-') lorsque la charge globale des peptides est nulle et la plus forte (-4100 deg cm2 dmol-l) lorsque la charge globale est positive. Par contre, la contribution des bouts de chaine demeure forte, soit de l'ordre de

+

1600 deg cm2 dmol-', pour toutes les valeurs de pH. Quoique trbs approximative, cette valeur nous donne une excellente idte de l'importante contribution des bouts de chaine B l'ellipticitt.

Elle nous permet aussi de justifier les bandes positives d'ellipticitt obtenues avec les courtes chaines. Elle explique enfin les faibles intensitts des bandes ntgatives pour les peptides de masse molCculaire plus tlevte.

En deuxibme lieu, nous avons choisi de mettre en relief l'effet de la longueur de la chaine et du p H sur la conformation des peptides en calculant, B partir de chaque spectre d.c., la fraction d'htlice et de structures beta et dtsor- donnCe de chaque peptide, pour une valeur de pH donnte. Le rtsultat de ce calcul est rtsumt dans le tableau 2. Comme on pouvait s'y attendre d'aprbs l'allure des spectres d.c., la fraction htlicoi'dale calculte est trbs faible sur toute la gamme des pH et longueurs de chaines.

M&me pour le polypeptide B p H 2.0, qui donne

0 0.05 0.10

I/"

FIG. 4. Ellipticitk k 222 nm en fonction de l'inverse de la longueur de la chaine a diffkrents pH.

TABLEAU 2. Calcul des fractions des trois conformations par la mkthode de Yang et Martinez

(1~s-asp).

valeur de n

f~ fD f~

4 5 6 7 8 9 10 Poly

la bande d'ellipticitt nCgative la plus forte autour de 220 nm, fH ne dtpasse par 20%. Par contre, fp calcult demeure relativement constant, variant entre 10 et 30%. La fraction dCsordonnte demeure toujours importante, soit plus grande que 60% dans tous les cas. I1 faut toutefois se rappeler que le rapport fH/& est sujet B des erreurs importantes, d Q B la similaritt de l'emplacement de la bande d'ellipticitt ntgative autour de 220 nm dans le spectre d.c. de ces deux conformations de polypeptide. Une autre source d'erreur importante dans l'haluation des fractions fH, fe et f, par cette mtthode est I'existence de charges tlectrostatiques per- manentes sur les chaines B toutes les valeurs de pH. I1 en rtsulte la possibilitt toujours existante d'attraction tlectrostatique intra et intermoltcu- laire, dont on ne peut tenir compte en utilisant comme modble un polypeptide ionique simple comme la poly-L-lysine. Cette particularitk des polyampholytes contribue certainement B une estimation quelque peu erronte de la structure Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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1868 CAN. J. CHEM. VOL. 53, 1975

secondaire au point isotlectrique des peptides.

Cette source d'erreur est probablement ntgligeable aux valeurs p H extremes, 2 et 12, oh les peptides se comportent essentiellement comme la poly-L-lysine ou l'acide poly-L-aspartique charges.

En dtpit des limitations que nous venons d'tnumtrer, nous considtrons cette mtthode d'analyse comme ttant des plus valables. Son attrait principale est de tenir compte de tous les points d'un spectre, permettant de choisir les intervalles de longueur d'onde dtsirts. Dans notre cas, nous avons choisi un intervalle de 1 nm, apr6s avoir vtrifie que l'utilisation de plus petits intervalles, constquemment, un plus grand nombre d'tquations, ne modifiaient pas sensiblement la valeur des fractions obtenues.

11 ressort de cette ttude que la longueur de la chaine n'est pas un facteur predominant de la stabilitt conformationnelle des polyampholytes alternb, si nous nous basons sur la variation de leurs spectres de dichroisme circulaire. Nous pensons que l'existence d'une charge permanente sur les chaines, quelque soit le pH, joue le r6le principal dans l'organisation de la structure des moltcules en solution,

A

cause des interactions intra et intermoltculaires qui en rtsultent.

L'effet de la charge empeche en tout temps ces peptides d'acqutrir une conformation vraiment stable et organiste, comme on retrouve chez les homopolypeptides ioniques non-chargb.

Leur nature ampholytique n'exclut cependant pas une certaine rigiditt de la structure. Une ttude viscosimttrique, mente en parallde avec les mesures de dichroisme circulaire, sur le polypeptide (61), jette quelque lumi6re sur les rtsultats prtctdents. Selon la thtorie de Harris et Rice (62), la conformation des polyampholytes alternts en solution aqueuse peut Ctre relite d'assez pr6s

A

celle des polytlectrolytes simples, lorsque le pH de la solution est tloignt du point isotlectrique.

L'efet du p H

A pH fortement acide, seuls les groupement amino de la lysine sont sous forme NH,'; les carboxyles de l'acide aspartique sont protonb, donc tlectriquement neutres. Sous ces conditions, la poly-L-lysine donne lieu

A

un spectre d.c. typique de chaine ttendue, selon Tiffany et Krimm (63, 64). Les spectres d.c. des oligoampholytes et du polyampholyte, en solution acide, diff6rent fortement des spectres de la poly-L-

lysine chargte. C'est

A

ce p H que nos spectres d.c. manifestent les valeurs les plus ntgatives pour la bande d'ellipticitt autour de 220 nm, de m&me que les pourcentages d'hklicitt (f,) les plus tlevb. Le graphique de la fig. 4 nous indique Cgalement une plus grande contribution des rtsidus internes A l'ellipticitt autour de 220 nm.

On voit aussi A cette figure que la dtviation

A

la lintaritt du polypeptide A p H 2.0 est la plus importante.

La prtsence de rtsidus d'acide aspartique, situts A intervalles rtguliers entre les rtsidus de lysine chargts, ne semble donc pas jouer, en solution acide, le simple r6le d'espaceur qu'on pourrait leur attribuer a priori. En plus de permettre l'augmentation de la distance entre les charges porttes par les groupements NH,', les rtsidus d'acide aspartique semblent con- tribuer A la formation de liaisons hydrog6ne' stabilisant la conformation du squelette du peptide. Toutefois, m&me pour le copolypeptide, cette conformation, si nous la supposons A tendance htlicoYdale, est fortement dCformte, en se basant sur les calculs effectuts; il serait logique de supposer dans ce cas une htlice ttendue, d'apr&s les constatations suivantes. La chaine lattrale portant le groupement NH,' de la lysine est constitute de quatre CH,; elle poss&de donc une longueur qui lui conftrent une certaine flexibilitt. Toujours A cause de la longueur de cette chaine, nous pouvons supposer ntgligeable l'existence d'interaction ion- dip6le entre le groupe NH,' et les liaisons amide du squelette. Si cette hypoth6se s7av6re exacte, l'existence de liaisons hydroghe stabilisant la structure secondaire du squelette est concevable. Enfin, la flexibilitt de la chaine lattrale de la lysine, relit au fait que chacun de ces rtsidus est skpart de l'autre par un rtsidu d'acide aspartique, permet, selon nous, aux groupements NH,' de se placer A une distance d'interaction minimum l'un de l'autre.

De cette f a ~ o n , l'tnergie tlectrostatique de rtpulsion est inftrieure

A

l'tnergie de stabilisa- tion de l'htlice.

Le deuxi2me fait appuyant ces hypothbes est tirt des travaux de dichroisme circulaire effectuts par Brahms et Spach (58) sur l'acide poly-L-aspartique (APLA). Ces travaux ont demontrt que I'APLA, comme l'acide poly-L- glutamique (APLG), forme des htlices-a en solution acide (pH 4.3). Toutefois, l'ellipticitt manifestte par la transition n-n* de 1'APLA Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 134.122.89.123 on 02/09/21 For personal use only.

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DAOUST ET ST-PIERRE: CONFOR MATION DE POLYAMPHOLYTES 1869

est beaucoup plus faible que pour 1'APLG ou la PLL, indiquant une stabilitt moins grande de I'htlice en solution. Cependant, la chiralitt de cette htlice est la meme, soit une hklice-or droite.

Nous pouvons donc, B la lumi&e de ces faits, suggtrer pour le polypeptide en milieu fortement acide, une conformation d'hklice-a droite, ttendue B cause de la rtpulsion tlectrostatique des charges positives, mais partiellement sta- biliste par les liaisons hydroghe du squelette.

La dtformation suppltmentaire peut ttre caude, comme dans le cas de I'APLA, par I'interaction dip6le-dip6le du groupement carboxylique avec les liaisons amides.

Les rtsultats viscosimttriques appuient tgalement l'existence d'une htlice ttendue, le comportement du polypeptide en solution acide ressemblant au cas d'un bgtonnet rigide. I1 eut t t t tr2s inttressant d'ttudier le comportement des oligoampholytes par viscosimttrie. Mal- heureusement, leur faible masse moltculaire ne nous a pas permis d'obtenir des difftrences de temps d'koulement suffisantes, meme pour I'eicosapeptide. C'est pourquoi les ttudes de structure des autres oligoampholytes en solution aqueuse ne sont bastes que sur leurs spectres d.c. et les rtsultats obtenus avec le polypeptide.

L'augmentation de I'ellipticitt autour de 220 nm en fonction de la longueur de la chaine serait imputable B la diminution progressive des effets de bouts de chaine. On voit var contre aue mtme avec l'eicosapeptide, la courbe en milieu acide de la fig. 4 ne dtvie pas de la lintaritt. Si on suppose juste l6hypoth6se tmise

B

l'tq. 5, cela signifie qu'aucune forme de structure secondaire n'est amorcte lorsque la chaine contient jusqu'h vingt rtsidus.

-

Les spectres d.c. des peptides en solution basique ont I'allure des spectres en solution acide. Toutefois. la bande d'ellivticitt autour de 220 nm est toujours moins ntgative, pour un peptide donnt, que dans le cas de la solution acide. On voit tgalement,

B

la fig. 4, que la contribution

B

l'ellipticitt totale par les rtsidus internes est moindre qu'en milieu acide. En solution fortement basique, le peptide est chargt ntgativement, A cause de la prtsence des groupements carboxyl de l'acide aspartique sous forme COO-. Les groupements amine de la lysine sont sous forme NH,. D'une part, on note en milieu basique une plus grande viscositt intrins&que de la solution qu'en milieu acide.

Cette difftrence est cependant minime. D'autre

part, les calculs du pourcentage de chaque forme, tirts des spectres d.c., nous montrent un pourcentage plus faible d'hklicitt qu'en milieu acide et un pourcentage plus Clevi de chaine "ttendue". Si le raisonnement prtctdent est applicable, la courte chaine lattrale de l'acide aspartique, moins flexible que celle de la lysine, ne permettrait pas aux groupements carboxyliques chargts de se maintenir

B

une distance suffisante I'un de l'autre pour annuler l'effet de rtpulsion tlectrostatique. De plus, il est possible

B

l'ion COO- d'interagir fortement avec les liaisons polaires du squelette et nuire

B

la formation des liaisons hydrogene. Le niveau d'organisation des courtes chaines en solution basique semble tgalement moins important que prtctdemment.

Aux environs du point isotlectrique des peptides. nous avons affaire B un vhtnom6ne com- plttehent difftrent. Les rtsukats de viscosimttrie indiquent une chute importante de la viscositt intrins6que' signe d'une forte association des chaines causte par l'attraction tlectrostatique d'ions de signe contraire portts par les chaines lattrales des peptides. Un fait inttressant

B

signaler est la diminution de l'ellipticitt de la bande de dichroi'sme circulaire autour de 200 nm lorsque les solutions de peptide tendent vers un p H neutre. Dans le cas d'homopolypeptides chargts, cette bande est tr6s intense, de l'ordre de - 50 000 deg cm2 dmol-l pour la poly-L- lysine (45). Dans notre cas, l'intensitt de cette bande ne dtpasse pas - 15 000 deg cm2 dmol-I pour le polypeptide B p H 7.0. Ces rtsultats nous porte B croire 9 l'adoption, par les polyampholytes, d'une forme globulaire compacte au point isotlectrique. Comme la dilution ne semble pas affecter les spectres d.c. dans ces conditions, du moins dans les limites expkrimen- tales de concentration permissibles (1-0.005%), nous croyons ^,que l'association est surtout intramoltculaire. Des essais de variation de temptrature sur le spectre d.c. nous portent aux memes conclusions. Le fait que les chaines tendent B se replier sur elles-mtmes lorsqu'on approche du point isoklectrique aurait alors pour effet de diminuer le moment dipolaire rtsultant de chaque chaine et par constquent l'ellipticitk des transitions n-n

*

et n-n

*,

comme on l'observe sur les spectres d.c.

B

p H 7.0.

Comme le montre la fig. 4, l'effet de la longueur de la chaine dans ces conditions semble le moins important.

(10)

1870 _CAN._{J. CHEM.}VOL. 53, 1975

A la lumitre de ces rtsultats. il nous apparait ^19.M. GOODMAN e t I. G. ROSEN. Biopolymers, 2, 537 que la conformation d'un polya~pholyte iiternk, ^(1964).

20. M. GOODMAN, M. LANGSAM et I. G. ROSEN.

compost de risidus d'acide aspartique et de Biopolymers,4,305(1966)~

lysine, diffire forkment de celles des h o m o ~ o 1 ~ - _21.M. GOODMAN. J. Polym. Sci. 49.150 (1961).

peptides respectifs. Cette propriktt de polyam- 22. M. GOODMAN, A. S: V E R D I N I , ~ . TONIOLO, W. D.

pholyte conftre B ces peptides une resemblance P H I L L I P S ~ ~ F . BOVEY. ~ O C . Natl. Acad. Sci. 64,444 (1969).

indtniable avec les prottines globulaires, pour _23,

R. R, BECKER et M. A. STAHMANN. J. Am. Chem.

lesquelles ils peuvent tventuellement servir de _Sot,_74,38 (1952).

modtle. Ce travail montre Cgalement que la 24. J. A. SCHELLMAN. J . Phys. Chem. 62, 1485 (1958).

longueur de la chaine n'est -pas un crittre ^25.A. YARON, E . KATCHALSKI, A. BERGER, G. D.

primordial pour qu'un polyampholyte adopte ^FASMANet H. A. SOBER. ~ i o ~ o l ~ m e r s , 10,110(1971).

26. R. L. SNIPP, W. G. MILLER^^ R. E. NYLUND. J. Am.

sa conformation la plus stable en solution, con- _Chem,_Sot._87,₃₅₄₇_(1965).

trairement aux homopolypeptides ou polytlec- ^27.B. SCHECHTER, I. SCHECHTER, J. RAMACHANDRAN,

trolytes simples. D'autres travaux restent A A. CONWAY-JACOBS et M. SELA. Eur. J. Biochem. 20, fair; pour dtterminer exactement la structure 301 (1971).

secondaire qu'adoptent ces peptides en solution 28- ~ ; o ~ ~ ~ ~ ; ~S. F. . SCHLOsSMAN. 1 ~ 1 3 ~ !

aqueuse et la raison pour laquelle ils manifestent _29.E. R. BLOUT e t M. IDELSON. J. Am. Chem. Soc. 80,

des proprittts de dichrolsme circulaire aussi 4909 (1958).

compliqutes. ^30.^{M. ATREYI}et R. C. GUPTA. Bull. Chem. Soc. Jap.46, 2795 (1973).

Nous remercions le Ministkre de 19Education de la 31. T. VAJDA. Chem. Ind. 785

Province de Qukbec ainsi que le Conseil national de 3 2 T. VAJDA. Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 46, 221 recherche du Canada pour I'aide financikre a p p o r t k i

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