Étude du polymorphisme des métallothionéines par spectrométrie de masse à source Ion-spray

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Étude du polymorphisme des métallothionéines par spectrométrie de masse à source Ion-spray

H. Chassaigne, Ryszard Lobinski

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H. Chassaigne, Ryszard Lobinski. Étude du polymorphisme des métallothionéines par spectrométrie de masse à source Ion-spray. Analusis, EDP Sciences, 1998, 26, pp.M65-M67. �10.1051/analu- sis:199826060065�. �hal-01559798�

L

es métallothionéines (MT) sont un groupe de pro t é i n e s non enzymatiqes de fa i bles poids moléculaires (6 – 7 K d a , e nv i ron 60 acides aminés non aro m at i q u e s ) c ap ables de fi xer des quantités importantes de métaux via les liaisons cystéiniques. Elles se cara c t é risent par un fo rt taux de cystéines et l’absence de ponts disulfure, une fo rt e résistance à la coag u l ation thermique et à la précipitat i o n acide [1,2]. Les MT les plus largement étudiées sont celles issues des mammifères (isolées au niveau du fo i e, du rein et du cerveau) à cause de leur rôle dans le contrôle homéosta- t i q u e, le métabolisme et la détox i fi c ation d’un cert a i n n o m b re de métaux tant essentiels (Cu, Zn) que toxiques (Cd, Hg) [1,2].

Chez les mammifère s , il a été montré que les MT ex i s- tent sous diff é rentes isofo rmes qui sont le produit du poly- m o rphisme génétique cara c t é ristique des gènes MT [3]. Ce p o ly m o rphisme se produit lors de l’évolution d’une espèce v ivante et se traduit par une va ri ation de la stru c t u re pri m a i re des protéines par substitution d’un ou plusieurs acides ami- nés. Les isofo rmes présentant des diff é rences mineures tel qu’un seul acide aminé sont des sous-groupes des isofo rm e s m a j e u res et sont appelées sous-isofo rmes [4]. Si la plupart des isofo rmes majeures ont pu être séquencées [5], l ’ ab s e n c e de données concernant l’identité des sous-isofo rmes est due à la difficulté de séparation et d’identifi c ation de ces der- n i è res.

À l’heure actuelle, la cara c t é ri s ation du poly m o rp h i s m e des MT par ch ro m at ographie en phase liquide (HPLC) est essentiellement basée sur les temps de rétention des espèces et sur l’intensité du signal d’ab s o rption UV. Ces spéculat i o n s e n ge n d rent bien entendu des confusions vo i re des interp r é- t ations contra d i c t o i re s , à cause de l’impossibilité de savo i r réellement quelle espèce est détectée. De plus, pour des é chantillons de MT de même ori gi n e, l ’ u t i l i s ation de tech- niques analytiques et de conditions opérat o i res ap p a re m m e n t

identiques ne conduit pas à des résultats similaires [6-8]. Les ch ro m at ogrammes obtenus diff è rent non seulement au n iveau du pro fil mais aussi au niveau du nombre de pics o b s e rv é s .

La raison principale de ces observations semble être la présence de pics fantômes dans le ch ro m at ogra m m e. Ces d e rn i e rs peuvent provenir des produits d’ox y d ation (dimère s ou produits poly m é ri s é s ) , de diff é rentes confo rm ations ou de d i ff é rentes compositions en métaux des MT (métallofo rm e s ) . L’ i d e n t i fi c ation des métallothionéines éluées en HPLC est a l o rs impossible sans avoir re c o u rs à des techniques fa s t i- dieuses (isolation et séquençage en ligne), à cause de la p u reté insuffisante des étalons et de l’absence de données les c o n c e rnant. L’ é l e c t rophorèse cap i l l a i re de zone off re ap p a- remment une meilleure résolution que l’HPLC (cf. G.

B o rd i n , ce nu m é ro) mais là encore, la détection spectro p h o- t o m é t rique ne permet pas une identifi c ation non ambiguë des fo rmes séparées.

L’ i o n i s ation électro s p ray (et sa ve rsion assistée pneuma- tiquement appelée ion-spray) est une technique de désolva- t at i o n - i o n i s ation à pression at m o s p h é rique actuellement en pleine expansion. Elle permet de générer des ions mu l t i- ch a rgés en phase ga zeuse à partir de composés labiles de hauts poids moléculaires tels que les poly p eptides. Ces ions mu l t i ch a rgés peuvent être analysés par un spectro m è t re de masse à secteur quadri p o l a i re. La corr é l ation entre le rap p o rt m / z mesuré et l’état de ch a rge (z) permet une déterm i n at i o n rapide et précise des masses moléculaires des protéines [9- 1 1 ] .

Cette étude illustre les potentiels de la technique IS-MS dans le cadre de la cara c t é ri s ation du poly m o rphisme des métallothionéines. Il s’agit de déterminer le nombre de sous- i s o fo rmes potentiellement présentes dans la MT-2 du foie de l apin et de les cara c t é riser en terme de masses moléculaire s .

Analyse directe des MT par spectrométrie de masse à source Ion-spray (IS-MS) Les conditions de pH acides sont re s p o n s ables de la pert e p rogre s s ive des métaux, conduisant ainsi aux fo rmes apo des métallothionéines (dépourvues de métaux). Des études ont montré que le cadmium était perdu à pH 2.0 (apo-MT). Dans la gamme de pH 3.0 – 5.0, les fo rmes Cd4–MT sont pré- s e n t e s , tandis qu’au delà de pH 5.0, on a fo rm ation des com- p l exes Cd7–MT [12]. Pour les va l e u rs de pH interm é d i a i re s , des fo rmes partiellement métallées (Cd5– M T, C d6–MT) peu- vent se fo rm e r. Par conséquent, l ’ a n a lyse directe des MT par IS-MS doit s’accompagner d’un contrôle précis du pH de la s o l u t i o n .

M 65 ANALUSIS MAGAZINE, 1998, 26, N° 6

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Dossier

Metals and Biomolecules

■ Étude du polymorphisme des métallothionéines par spectrométrie de masse à source Ion-spray

H. Chassaigne et R. Lobinski

CNRS EP 132, Université de Pau et des Pays de l’Adour, Helioparc, 2 avenue du Président Angot, 64 000 Pau, France

Ion-spray mass spectrometry (IS-MS) is shown to be an attractive technique to identify and to dif- ferentiate among the sub-isoforms of metallo- thioneins (MT). Different modes of application of IS-MS are discussed using the example of MT–2 rabbit liver prepurified by size - ex clusion and a n i o n - ex ch a n ge ch ro m a t o g r a p hy. Direct IS-MS mode, microbore HPLC with on-line IS-MS detec- tion of fully cadmiated (Cd₇–MT isofoms), HPLC with post-column acidification and detection of the apo-MT isoforms by IS-MS, and with post- column acidification and detection of the Cd ion by IS-MS are discussed.

Article available at http://analusis.edpsciences.org or http://dx.doi.org/10.1051/analusis:199826060065

La fi g u re 1 montre l’évolution du spectre IS-MS re c o n s- t ruit de la métallothionéine MT–2 avec le pH (pour 3 va l e u rs de pH : 1 . 8 , 4.0 et 6.0). On peut observer une perte de réso- lution et de sensibilité (diminution du rap p o rt signal/bru i t ) l o rsque le degré de métallation augmente. A pH 1.8, 5 sous- i s o fo rmes diff é rentes de la fo rme apo-MT–2 sont observ é e s , dont 4 ont été séquencées (MT–2a, M T – 2 b, MT–2c et MT–2d) [5]. A pH 4.0, les fo rmes métallées Cd4– M T – 2 ap p a ra i s s e n t , la fo rme MT–2d étant cependant noyée dans le b ruit de fo n d. A pH 6.0, il n’est plus possible d’identifier les signaux individules des sous-isofo rmes de MT–2. Dans le s p e c t re re c o n s t ru i t , une enveloppe assez large dans la ga m m e de masses 6800 – 7000 indique uniquement la présence du c o m p l exe Cd7– M T – 2 .

L’ a n a lyse directe des MT par IS-MS avec contrôle de pH p e rmet de déterminer le nombre d’atomes de Cd incorp o r é s par molécule de MT. Les pro fils identiques des spectres des fo rmes apo-MT–2 et Cd4–MT–2 (correspondance entre les pics d’une même sous-isofo rme dans les deux spectres sépa- rés de 442.0 Da) confi rme la présence de sous-isofo rmes et non d’art é fa c t s .

HPLC en phase inverse des formes Cd₇ – MT avec détection par IS-MS

L’ a n a lyse des MT par ch ro m at ographie en phase inve rse en condition acide (par exemple avec 0.1% T FA) pose deux p ro blèmes majeurs : la durée importante des ch ro m at o- grammes des fo rmes apo (jusqu’à 120 min) [13] et la fa i bl e i o n i s ation des espèces au niveau de la source Ion-spray, d u e à la présence du T FA. La métallation des MT diminue l’hy- d rophobicité des espèces ch ro m at ograp h i é e s , réduisant ainsi le temps d’analy s e. L’ é q u i l i b re de complex ation du cadmium par les MT étant fo rtement dépendant du pH, le contrôle du pH de la phase mobile est pri m o rdial. Le choix de la solu- tion tampon doit notamment assurer que la spéciation des c o m p l exes Cdx–MT n’est pas altérée lors de leur passage sur la colonne ch ro m at ogra h i q u e. Dans la gamme de pH 3.0 – 5 . 5 , aucune condition d’élution de la fo rme Cd4–MT pure (non accompagnée d’autres complexes Cdx–MT) n’a pu être t ro u v é e, tandis que le complexe Cd4–MT–2 est observé en a n a lyse dire c t e. Par conséquent, le pH a été choisi tel qu’il a s s u re la présence des isofo rmes sous fo rmes de complexe s C d7– M T. Un pH plus élevé n’améliore pas la qualité de la s é p a ration et entraîne d’autre part une dégra d ation des condi- tions d’ionisation dans la source et donc une perte impor- tante de sensibilité.

Un ch ro m at ogramme de MT–2 obtenu à pH 6.0 en ch ro- m at ographie micro b o re est présenté en fi g u re 2. Ce ch ro- m at ogramme comprend deux pics majeurs 1 et 2, p r é c é d é s par trois pics mineurs. Les spectres de masse pris au maxi- mum des pics 1 et 2 permettent une déterm i n ation précise des masses moléculaires des espèces éluées (Fi g. 3a). Ces s p e c t res sont re l at ivement complexes et présentent des pro- fils diff é rents pour chacun des pics 1 et 2, d’où la diffi c u l t é d ’ i n t e rp r é t ation à ce niveau d’étude. Seules les masses des fo rmes Cd7–MT–2 (MT–2a, MT–2b et MT–2c) sont fa c i l e- ment identifi ables.

HPLC en phase inverse des formes Cd₇–MT avec acidification post-colonne et détection

des formes apo–MT par IS-MS

L’ a n a lyse des fo rmes Cd7–MT off re un double ava n t age. La durée d’analyse est considérablement réduite (env i ron 50 min) comparée à la séparation des fo rmes ap o – M T. Elle per- met d’autre part l’obtention d’une bonne résolution des dif- f é rentes sous-isofo rmes et la déterm i n ation des masses molé- c u l a i res des complexes Cd7– M T, qui par soustraction de la c o n t ri bution en masse du Cd, p e rmet l’at t ri bution d’un pic à une fo rme ap o – M T.

L’ a n a lyse à pH ≥ 6.0 présente cependant des inconv é- nients. On observe une perte considérable en sensibilité à cause des conditions d’ionisation médiocres au niveau de la s o u rce Ion-spray. De plus la complex ation du Cd peut ne pas ê t re un simple éch a n ge de protons (éch a n ge de 14 H⁺ p o u r

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Figure 2. Chromatogramme de la métallothionéine MT–2 obtenu en HPLC en phase inverse avec détection IS-MS. Milieu tampon acétate d’ammonium 5 mmol L^–1pH 6.0. Colonne: Vydac C₈15 cm ×1 mm ×5 µm. Injection: 1 µg MT–2. Gradient: 0 – 50 min:

5 – 8% CH₃CN.

Figure 1. Evolution du spectre de masse IS-MS de la métallo- thionéine MT–2 du foie de lapin en fonction du pH. A n a ly s e directe de solutions de MT–2 à 100 µg mL^–1à pH 1.8 (25 mmol L^–1HCl 0.1M dans CH₃OH/H₂O, 30/70), pH 4.0 (5 mmol L^–1de tam- pon acétate d’ammonium dans CH₃OH/H₂O, 30/70) et pH 6.0 (5 mmol L^{– 1} de tampon acétate d’ammonium dans CH₃O H / H₂O, 30/70).

fo rmer Cd7– M T ) , d’où le pro blème de l’at t ri bution d’un pic à une fo rme ap o – M T. Enfi n , les espèces détectées à ce pH p e u vent contenir d’autre métaux que le cadmium (pri n c i p a- lement Cu et Zn), le calcul de la stœch i o m é t rie des métaux p o u vant n’être qu’une simple spéculat i o n .

Une nouvelle ap p ro che permettant de résoudre ces diff é- rents pro blèmes peut être l’acidifi c ation post-colonne des espèces séparées en ch ro m at ograp h i e. L’ a c i d i fi c ation perm e t de couper les liaisons avec les métaux (Cd et Zn) et de m e s u rer le signal IS-MS des fo rmes ap o – M T, d’où une ana- lyse plus sensibl e.

Le ch ro m at ogramme de MT–2 obtenu après acidifi c at i o n est identique à celui obtenu à pH 6.0 (cf. Fi g. 2). Les s p e c t res de masse pris au maximum des pics 1 et 2 sont ici c a ra c t é ristiques des fo rmes apo–MT–2 (MT–2a, MT–2b et MT–2c) (Fi g. 3b). Les spectres sont considérablement sim- p l i fiés par rap p o rt à ceux des fo rmes métallées. Les spectre s étant quasiment identiques pour les pics 1 et 2 (ex c ep t é l ’ abondance de MT–2b), on peut en déduire qu’il s’agit de d i ff é rents complexes métalliques des 3 sous-isofo rm e s M T – 2 a , MT–2b et MT–2c. Le pic 1 contient des fo rm e s mixtes Cd–Zn (Cd4Z n3, C d5Z n2, C d6Zn) ainsi que les fo rm e s C d7. Le second pic correspond majori t a i rement aux com- p l exes Cd7– M T – 2 .

HPLC en phase inverse des formes Cd₇–MT avec acidification post-colonne et détection

des ions métalliques par IS-MS

R é c e m m e n t , L eblanc [14] a proposé une méthode d’acidifi- c ation post-colonne pour couper les liaisons MT-métal et ainsi perm e t t re la déterm i n ation des métaux associés par la t e chnique IS-MS utilisée dans le mode élémentaire (SCID :

d i s s o c i ation induite par collision dans la source). Cette tech- nique off re la possibilité de détecter les métaux complex é s par les MT sans avoir re c o u rs à l’analyse ICP-MS.

Cette technique est cependant limitée dans la mesure où, pour qu’un ion métallique soit détectabl e, le complexe doit au préalable être détruit. Cela limite donc son ap p l i c ation à l ’ a n a lyse de Cd et Zn, le cuiv re étant plus fo rtement lié à la métallothionéine et donc non détectabl e.

Conclusion

Cette étude montre le potentiel considérable de l’IS-MS pour la cara c t é ri s ation du poly m o rphisme des métallothionéines et des complexes qu’elles fo rment avec les métaux. En analy s e d i recte par IS-MS, le contrôle précis du pH de la solution p e rmet de va l o riser la qualité et la quantité de l’info rm at i o n o b t e nue (étude des fo rmes ap o , C d4 et Cd7). En ce qui c o n c e rne l’analyse ch ro m at ographique des fo rmes Cd7–M T, l ’ a c i d i fi c ation post-colonne permet d’améliorer la sensibilité du signal dans le mode moléculaire et d’at t ri buer un pic à une fo rme ap o - M T, tandis que le mode élémentaire perm e t la déterm i n ation du métal libéré lors de l’acidifi c at i o n .

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M 67 ANALUSIS MAGAZINE, 1998, 26, N° 6

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Figure 3. Spectres de masse IS-MS pris au maximum des pics 1 et 2 du chromatogramme de MT–2 (cf. Fig. 2) a) sans acidifi- cation post-colonne, b) avec acidification post colonne (avec HCOOH/CH₃OH, 30/70, soit un pH final de 1.9).