UN SIMPLE ET EFFICACE PROCÉDÉ D’EXTRACTION D’ARN À PARTIR DES
BACTÉRIES GRAM+ ET GRAM-
Aymane Madoun
MODULE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE SVI/S5 - 2016/2017
Par l’étudiant:
Techniques de Biologie Moléculaire
- Rappels :
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C’est quoi la biologie moléculaire ?
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Techniques d’extraction d’ADN ?
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Purification d’ADN ?
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Techniques d’extraction d’ARN
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Purification d’ARN
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Comment peut-on doser les AN ?
- Préparation des souches bactériennes et conditions des milieux de cultures :
• Cinq bactéries Gram+ et quatre bactéries Gram- on été utilisées pour l’extraction de l’ARN
- Gram+ : « Enterococcus faecium ATCC 51559 », «
Staphylococcus aureus », « Lactococcus lactis », Lactobacillus reuteri », « Mycobacterium vanbaalenii DSM 7251 ».
- Gram- : « Escherichia coli XLOLR », « Salmonella typhimurium DT8 », « Aeromonas veronii », « Campylobacter jejuni ».
- La plupart de ces bactéries croissent dans des conditions
d’aérobiose pendant 4h-8h à une température 37°C dans un Bouillon cœur-cerveau composé de :
Pour 1 litre de milieu :
- - Extrait cœur-cerveau...17,5 g - - Peptone pancréatique de gélatine ...10,0 g - - Chlorure de sodium...5,0 g - - Phosphate disodique ...2,5 g - - Glucose...2,0 g
• « Mycobacterium vanbaalenii » : 30°C / 48h (Croissance lente)
• « Campylobacter jejuni » : 37°C / (48h-72h) / (89% N2 – 5% CO2 – 6% O2) Dans un milieu « CAMPY agar plates »
• « Lactococcus/lactobacillus » : Milieu MRS / 37°C / 18h
- On ajoute
l’échantillon prélevé à partir d’un liquide ou d’une boîte d’agar - Tampon TE :
(10 mM de Tris-HCL + 1mM d’EDTA) à pH = 7.5
- Centrifugation 5000xg / 5min / 4°C
On prélève 10ml de la solution
• L’isolement de l’ARN et le traitement par ADNaseses selon le protocole du kit commercial « Qiagen ».
• Absorbance à 260nm « Smartpec 3000 » / 1U DO 40μg/ml
• Ratio A260nnm/A280nm
- 10ml de la solution
prélevés Solution d’Acide phénol/éthanol
(5% phénol à ph<7.0 sur 95%
d’éthanol)
Chauffage à 65°C-70°C
Eau sans ARNases ARN
- Détermination de A260 et A280
- Centrifugation 5000xg / 5min / 4°C + Lavage avec 5ml de TE
Tampon T.E + Triton X-100 (sigma)
100°C 10min
- Chloroforme seul ou
chloroforme/méthanol (1:2 / 2:1)
- Inversion 10-15 fois + Centrifugation
12000xg/4°C/10min Centrifugation
1/10
acétate de sodium (3M) ph = 5.2 + 2 à 2.5 V
D’éthanol absolue pré- refroidit
Précipitation
- Centrifugation
12000xg/10min/4°C
Lavage x2 avec 1ml (70%
d’éthanol) x1 (éthanol absolue)
Centrifugation
Séchage à l’ air ambiant
Dissoudre dans 200μl de DEPC
Surnageant
Culot (Dépôt)
- L’intégrité de l’ARN a été testée par séparation de 0.2-1μg d’ARN sur un gel d’agarose à 1.2% contenant 0.66M de formaldéhyde.
- Le gel est placé dans un tampon d’électrophorèse composé de (20mM MOPS / 5mM d’acétate de sodium / 1mM EDTA à ph=7.0) pendant 3h à 90mV
- Traitement par BET (1μg/ml de tampon d’électrophorèse)
- Photographier en utilisant le système de numérisation de gel (GDS 8000 (UVP, Inc.))
- Résultats et discussions
6583 36381908 955 281 Pb
5S 16S 23S
- Ligne 1 et 7
: Marqueurs de poids moléculaire d’ARN- Ligne 2
: ARN total extrait par la méthode «QIAGEN»- Ligne 3
: ARN extrait par méthode d’ébullition(Chloroforme seul)
- Ligne 4
: ARN extrait par méthode d’ébullition(Chloroforme – Méthanol (1:2))
- Ligne 5
: ARN extrait par méthode d’ébullition(Chloroforme – Méthanol (2:1))
- Ligne 6
: ARN extrait par la méthode du « phénol chaud »Comparaison des résultats d’électrophorèse du même fragment d’ARN (E. faecium ATCC 51559) extrait par différentes méthodes
Extraction d’ARN à partir des différentes bactéries par la méthode d’ébullition. La
quantité d’ARN déposée dans chaque ligne est mentionnée après le nom de l’espèce
bactérienne.
- Ligne 1 et 11 : Marqueurs de poids moléculaire d’ARN Ligne 2 : E. faecium (0.5 μg)
- Ligne 3 : S. aureus (0.5 μg)
- Ligne 4 : L. reuteri (1 μg)
- Ligne 5 : L. lactis (1 μg)
- Ligne 6 : A. veronii (1 μg)
- Ligne 7 : E. coli (1 μg)
- Ligne 8 : C. jejuni (0.2 μg)
-Ligne 9 : S. typhimurium (0.2 μg)
- Ligne 10 : M. vanbaalenii (0.2 μg)
Comparaison du Ratio A260/A280 et le rendement d’ARN extrait par différents méthodes
