Article pp.31-34 du Vol.29 n°312 (2010)

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Service central d’analyses génétiques (Scaggend), Institut de recherche criminelle de la gendarmerie nationale, 5 boulevard de l’Hautil, BP 73727,

95037 Cergy Pontoise Cedex frederic.brard@gendarmerie.

interieur.gouv.fr

L

es traces biologiques à partir desquelles sont déterminés les profils génétiques qui pourront servir à confondre ou à disculper un individu ne sont pas des traces comme les autres. D’abord parce qu’elles sont utilisées dans un contexte judiciaire, ensuite parce qu’elles sont imprévisibles, non standardisées et qu’elles subissent des agressions multiples. Malgré tout, les techniques mises en œuvre pour les analyser ne relèvent pas de la science fiction : la biocriminalistique puise ses savoirs et ses savoir- faire dans les sciences du vivant.

Des traces et des indices

Pour pouvoir réaliser une empreinte génétique, il faut d’abord disposer de traces biologiques. En criminalistique, ces traces proviennent de scènes d’infraction. La première étape consiste à les détecter et à les collecter.

À ce stade, les traces ne constituent en aucun cas des indices ou des éléments de preuve. Seules certaines deviendront des indices, dès lors qu’un lien aura été établi avec l’affaire à la suite d’analyses réalisées en laboratoire.

Pourtant un choix s’impose car il serait illusoire de vouloir tout collecter et tout analyser. La cueillette des traces et leur sélection repose sur l’application d’un principe fondamental appelé principe de l’échange de Locard (voir p. 49), selon lequel « nul ne peut agir avec l’intensité que suppose l’action cri- minelle sans laisser des marques multiples de son passage. Tantôt le malfaiteur a laissé sur les lieux des marques de son activité, tantôt par une action inverse, il a emporté sur son corps ou sur ses vêtements les indices de son séjour ou de son geste»(1). En d’autres termes, quelle que soit l’activité humaine exercée, des échanges entre l’environnement et l’individu qui y évolue s’opèrent inévitablement. Et l’on sait aujour- d’hui que ces échanges sont d’autant plus importants que l’action ou les interactions sont intenses, ce qui est souvent le cas d’un acte criminel. Quant à l’état de stress de l’individu, il est probable qu’il intensi- fie ces phénomènes de relargage.

On peut ainsi concevoir de rechercher et sélectionner les traces d’intérêt en tenant compte de l’action et du déroulement probable des événements. Malgré tout, toute recherche a ses limites et cueillir des traces implique de pouvoir les détecter. À cet égard, des

Les empreintes génétiques en pratique judiciaire

La résolution d’une enquête judiciaire requiert des éléments concrets permettant de répondre à des questions triviales mais fondamentales pour la compréhension des faits constatés : qui ? Quand ? Comment ? Avec quoi ? Et éventuellement, pourquoi ? La découverte de l’auteur des faits et de ses motivations (le mobile) est bien entendu primordiale pour les victimes et la société. C’est pourquoi l’empreinte génétique est aujourd’hui reconnue comme une évolution majeure de l’histoire de l’enquête judiciaire.

Frédéric Brard

(1)Locard E (1920) L’enquête criminelle et les méthodes scientifiques, Flammarion, Paris

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moyens divers et variés sont mis en œuvre, reposant notamment sur l’utilisation de lampes puissantes spé- cifiques avec différentes longueurs d’ondes ou sur celle de réactifs à base de luminol, tel le BlueStar, qui réagis- sent au contact de certaines substances chimiques et biologiques en émettant une luminescence bleue carac- téristique (réaction par chimiluminescence avec les traces de sang – fer/hémoglobine) (2).

Des traces fragiles mais résistantes

Il n’existe pas de définition précise d’une trace biologique ni de liste exhaustive. Tous les éléments issus du corps humain sont susceptibles de constituer une trace biologique d’intérêt, qu’il s’agisse de cellules, de fluides ou encore de tissus biologiques (sang, salive, sperme, urine, poils, dents, os, etc.). Il existe donc une grande diversité de substrats et autant de supports que d’ob- jets existants. Ces supports sont essentiels car, avec l’environnement, ils conditionnent le devenir d’une trace biologique. En effet, il s’agit de matériel vivant en dehors du contexte physiologique. À l’extérieur du corps, les traces biologiques subissent des attaques physicochimiques, enzymatiques et fongiques nombreuses provoquant leur dégradation à plus ou moins court terme. La survie d’une trace est donc très aléa- toire et directement liée à sa nature, à sa quantité et à l’environnement dans lequel elle se trouve.

On sait aujourd’hui que la température, l’oxygène, l’eau, la lumière, la pression et bien d’autres para-

mètres influencent la préservation des échantillons biologiques. Quant aux supports des traces, ils sont la source d’inhibiteurs parfois puissants et peuvent avoir un effet protecteur ou destructeur majeur.

Quoiqu’il en soit, certaines traces de plus de 125 mil- lions d’années ont pu servir de support à des analyses génétiques. Le temps n’est donc pas systématique- ment défavorable à l’utilisation des traces biologiques.

Ainsi, ce qui différencie une trace biologique d’un prélèvement biologique médical est avant tout sa diversité, sa quantité et sa qualité, et surtout les conditions environnementales dans lesquelles elle se situe.

Au moment de la cueillette, les chances de succès à l’analyse sont d’ores et déjà définies mais nul n’en a connaissance.

Détermination de la nature des traces biologiques

Une fois transmis au laboratoire, les prélèvements biologiques subissent une analyse minutieuse. La tota- lité des traces présentes sur le support et détectables est recherchée, puis caractérisée. S’agit-il de sang, de sperme, de salive ? Il est souvent déterminant pour l’enquête de connaître le type cellulaire ou tissulaire à l’origine du profil génétique. Pour cela, les laboratoires recherchent une activité enzymatique carac- téristique (amylase salivaire, phosphatase acide) à l’aide de tests empruntés à la biologie médicale ou utilisent des méthodes immunochromatographiques

Une fois détectées, prélevées et identifiées, les traces biologiques subissent une série d’opérations. Tout d’abord, l’échantillon est soumis à une lyse afin de libérer l’ADN des cellules. Cette étape est suivie d’une extraction qui peut être organique (phénol-chloroforme), faire appel à des résines (chelex), des colonnes de purification (silice) ou encore, et de plus en plus, à des billes magnétiques. De nombreux kits sont disponibles sur le marché et s’adaptent bien aux contraintes d’automatisation des procédures. Cela permet d’obtenir un ADN d’excellente qualité et de se débarrasser d’un grand nombre d’inhibiteurs ou de molécules accessoires.

L’ADN ainsi extrait est ensuite quantifié par des méthodes fluorimétriques ou le plus souvent par PCR en temps réel. Une fois quantifié, l’ADN est amplifié en utilisant des trousses de réactifs commercialisées qui permettent l’amplification simul- tanée (dans un même tube) de quinze loci STR autosomaux et d’une partie du gène de l’amélogénine. Ce dernier permet la détermination du genre puisqu’il présente une délétion de six paires de bases sur le chromosome X par rapport au chromosome Y. Les kits multiplex reposent sur l’utilisation de sondes nucléiques (amorces) marquées par quatre à cinq fluo- rophores. Une fois amplifiés, les fragments d’ADN marqués sont séparés par électrophorèse capillaire. Cette technique, couplée à un laser, permet de détecter les fluorochromes asso- ciés aux fragments d’ADN qui migrent en fonction de leur taille.

On peut ainsi calculer le nombre de motifs répétés pour chaque locus étudié et y associer un allèle caractéristique par rapport à une échelle de référence. En quatre heures, 96 traces peuvent ainsi être génotypées après la PCR. Le nombre de loci analysés peut varier en fonction des pays mais il est recom- mandé d’étudier au moins dix loci pour une utilisation en identification humaine.

(2)Vandenberg N, van Oorschot RA (2006) J Forensic Sci 51, 361-70

De la trace au profil génétique : des techniques classiques de biologie moléculaire

Détection des traces biologiques

Amplification enzymatique (PCR multiplex 15 STR) Séparation des fragments par électrophorèse capillaire Validation du profil génétique déterminé Enregistrement du profil génétique dans la base

ADN nationale et stockage de la trace

au SCPPB Prélèvement

Lyse Extraction Quantification

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fondées sur l’expression de protéines ou d’antigènes particuliers spécifiques du tissu considéré (prostate specific antigen – PSA – pour le sperme). Bien entendu, les techniques microscopiques couplées aux méthodes de coloration sont essentielles, notamment lorsqu’il s’agit de rechercher la présence de sperma- tozoïdes. Enfin, la tendance actuelle est à l’utilisation de la biologie moléculaire et plus spécialement à la recherche d’ARN spécifique pour identifier la nature des cellules en présence (3,4). Quoiqu’il en soit, cette étape est fondamentale car elle permet de conser- ver un lien étroit entre la trace biologique détectée et le profil génétique déterminé ultérieurement.

Les contaminations humaines : un risque pris en compte

Travailler avec du matériel d’origine humaine suppose de prévenir tout risque de contamination par les opérateurs et les intervenants. Il est donc essentiel d’interdire à tout individu, dès que possible après la commission des faits, de pénétrer sur les lieux d’une infraction afin d’éviter le dépôt de traces biologiques indissociables et indiscernables des traces liées aux faits criminels et qui ne feraient que majorer la charge de travail des enquêteurs. À cet effet, les premiers intervenants procèdent toujours au gel des lieux. Il s’agit de délimiter un périmètre à l’aide d’une tresse et d’en contrôler strictement l’accès de façon à n’y pénétrer que revêtus de tenues de protection individuelles adéquates(5) et selon des procédures définies. Mais la situation n’est pas toujours idéale car une scène de crime ne peut être appréhendée comme telle qu’à partir du moment où des éléments probants sont rassemblés.

La prévention contre les contaminations exogènes ne doit pas se limiter à la seule scène d’infraction. Une fois collectées, les traces biologiques et leurs supports vont être acheminés vers un laboratoire agréé. Or les manipulations liées au transport et la prise en charge des traces sont autant d’étapes à risque de contamination. C’est pourquoi des mesures ont été prises dès 1985 au sein de la gendarmerie pour mettre en

place une chaîne de police technique et scientifique cohérente, depuis la scène d’infraction jusqu’au laboratoire.

Aujourd’hui, le conditionnement des traces biologiques sur les scènes d’infraction fait l’objet d’une attention particulière et obéit à des règles strictes. L’expérience ayant démontré que la préservation des traces biologiques est optimale lorsque les échantillons sont séchés et en milieu anoxique, la grande majorité de ces traces est conditionnée et transite à température ambiante.

Le transport est sécurisé et les températures peuvent être suivies de façon à prévenir toute rupture de la chaîne du froid pour les prélèvements qui le nécessi- tent. À l’issue des analyses, les traces biologiques résiduelles continuent de bénéficier d’un traitement spécifique afin de permettre soit un complément d’analyse, soit une contre-expertise jusqu’à leur destruction éventuelle une fois l’affaire définitivement jugée ou prescrite.

Pour certaines d’entre-elles, depuis la création du fichier national automatisé des empreintes génétiques (FNAEG) en 1998, la conservation se poursuivra dans des conditions de température, d’hygrométrie, d’éclairement et d’empoussièrement rigoureusement contrôlées au service central de préservation des prélèvements biologiques (SCPPB), conçu et géré par la gendarmerie pour recevoir les scellés contenant les traces biologiques ayant donné lieu à la détermination d’un profil géné- tique non identifié (6).

Quand l’ADN se dégrade

Si, dans la majorité des cas, l’analyse des STR (short tandem repeats, unités de quelques nucléotides répé- tées) ne pose aucune difficulté, certains échantillons soumis à des conditions extrêmes ou très anciens ne permettent pas la détermination d’un profil génétique à partir des microsatellites (7,8). Deux raisons expli- quent cette situation. Soit l’ADN nucléaire a été fragmenté, interdisant ainsi toute amplification génique par PCR, soit il n’y pas ou pas assez d’ADN nucléaire en présence. C’est le cas des prélèvements

(3)Zubakov D et al. (2010) Int J Legal Med 124, 217-26 (4) Juusola J, Ballantyne J (2007) J Forensic Sci 52, 1552-62

(5)Rutty GN et al. (2003) Int J Legal Med 117, 170-4 (6)Brard F (2007) Le service central de préservation des prélèvements biologiques, INHES La documentation française, Les fichiers des empreintes génétiques, 95-8 (7)Andelinovic S et al.

(2005)Croat Med J 46, 530-9

(8)Ginther C et al. (1992) Nat Genet 2, 135-8 Structure et transmission de l’ADNmt

A.Pour obtenir un résultat fiable et pertinent avec l’ADNmt, on en séquence les régions hypervariables (HV1, HV2 et HV3) de la région contrôle, une portion qui est le siège de nombreux polymorphismes stables.

B.Au sein d’une même famille, la transmission de l’ADNmt suit un schéma bien spécifique, avec une répartition transversale qui ne permet pas d’identifier un individu sur cette seule base.

Par exemple, les enfants de deux sœurs nées d’une même mère biologique (cousins) partagent le même ADNmt (mais pas le même ADN nucléaire).

En criminalistique, on étudie la séquence primaire des régions hypervariables HV1etHV2et le polymorphisme de répétition de HV3.

B A

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qui ont été soumis à des températures très élevées lors d’un incendie ou encore des échantillons biologiques putréfiés. De même, nous savons aujourd’hui que les os anciens, les dents (hormis la pulpe dentaire) et la tige des cheveux sont dépourvus d’ADN nucléaire.

C’est pourquoi, au milieu des années 1990, la communauté forensique s’est intéressée à l’ADN mitochondrial (ADNmt).

De par sa structure circulaire et sa taille réduite (figure p. 23, A) (9,10), cette molécule offre une résistance à la dégradation supérieure à celle de l’ADN génomique.

Cette résistance et sa présence dans les cellules humaines en de multiples copies (11)en font un sub- strat de choix par rapport à l’ADN nucléaire.

L’ADNmt constitue une chance unique pour certains échantillons d’établir un lien entre trace et individu.

Dans les autres cas, l’étude de l’ADNmt est un moyen efficace d’exclure la possibilité qu’un individu donné soit à l’origine d’une trace.

Malheureusement, du fait de son mode de transmission matrilinéaire et en bloc (sous forme d’haplotype), l’ADNmt n’a pas le pouvoir de discrimination de l’ADN nucléaire. En effet, il ne résulte pas de la combinaison aléatoire d’ADN parentaux mais est transmis en l’état par la mère à ses enfants. Ainsi, tous les individus d’une même fratrie possèdent un ADNmt identique, celui de leur mère biologique, alors que des frères et sœurs (à l’exception des jumeaux vrais) ne disposent pas du même ADN nucléaire (figure p. 23, B).

Son avantage majeur est donc avant tout quanti- tatif. Pourtant, il arrive que l’étude des régions hypervariables de l’ADNmt soit vaine. Des circonstances vraiment extrêmes, telles que l’effondrement des tours duWorld Trade Centerle 11 septembre 2001, ont démontré qu’il fallait pouvoir recourir à un polymorphisme ponctuel, c’est-à-dire reposant sur l’étude de fragments les plus petits possibles.

Àcet égard, l’analyse des SNP (single nucleotide poly- morphisms) offre une possibilité extraordinaire (12). Forme de variation la plus fréquente dans le génome humain (un tous les kilobases) et marqueurs très stables, leur étude se développe considérablement, même s’ils ne sont pas à ce jour utilisés en routine.

Le pouvoir de discrimination des STR autosomaux pourrait être atteint en analysant 50 SNP (13,14), ce qui semble en effet raisonnable sachant qu’une puce à ADN présente en théorie un potentiel d’au moins mille SNP.

Toutefois, l’histoire de la criminalistique a démontré que seules les méthodes les plus simples ont été déve- loppées et maintenues par les laboratoires. À ce jour, la méthode d’analyse des SNP et l’interprétation des résultats, jugées trop complexes, ont un peu retardé le recours à cette méthode pour l’identification humaine.

Enfin, le développement international des bases de données génétiques fondées sur les microsatellites autosomaux n’encourage pas les laboratoires à sys- tématiser l’utilisation de cette technologie.

Le support de prélèvement standardisé FTA permet la lyse des cellules, la protection de la dégradation par les UV, l’inhibition de la croissance bactérienne, des champignons, l’inactivation de nombreux virus… Il suffit de prélever les cellules buccales d’individus , de les déposer sur le papier imprégné

et de laisser sécher . Au moment du contact avec le support, une lyse s’opère et l’ADN relargué est piégé et protégé contre de nombreux facteurs de dégradation. Une fois sec, l’ADN (nucléaire et mitochondrial) peut être conservé en l’état pendant de nombreuses années sans dégradation majeure. Mieux encore, l’utilisation de ce papier permet d’éviter l’étape d’extraction de l’ADN. En effet, au laboratoire il suffit de prélever un cercle de papier de 1 à 2 mm de diamètre et de démarrer l’amplification génique ^.

Les cartes FTA

(9)Anderson Set al. (1981) Nature 290, 457-65 (10)Andrews RM et al.

(1999)Nat Genet 23, 147 (11)Bogenhagen D, Clayton DA (1974) J Biol Chem 249, 7991-5 (12) Gill P (2001) Int J Legal Med 114, 204-10 (13) Borsting C et al. (2009) Forensic Sci Int Genet 4, 34-42

(14) Musgrave-Brown E et al. (2007) Forensic Sci Int Genet 1, 186-90

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Profils génétiques et interprétation statistique : la valeur de l’homologie

Deux profils génétiques différents ne peuvent en théo- rie provenir que de deux individus distincts. Mais, même si l’on exlut le cas des vrais jumeaux, deux profils génétiques semblables proviennent-ils nécessai- rement du même individu ? La réponse est évidem- ment non, puisqu’à l’instar des groupes sanguins, plusieurs personnes peuvent posséder les mêmes allèles pour un locus STR donné. Dès lors, la seule homologie entre deux profils génétiques ne saurait suffire à en garantir l’origine commune sauf si le nombre de loci analysés est tel qu’il est impossible que cette simi- litude soit le fait du hasard, ce que Raphaël Coquoz nomme une correspondance purement fortuite (15). C’est pourquoi chaque comparaison de profils géné- tiques donne lieu à une analyse statistique systé- matique utilisant les données provenant d’études de populations (fréquence des allèles référencés pour les microsatellites étudiés). Mais cette approche est limitée car elle ne repose que sur une seule hypothèse (la rareté d’un profil génétique) et est inapplicable dans le cas des profils complexes résultant de mélanges d’ADN.

Aussi, depuis plusieurs années, une nouvelle approche statistique, fondée sur les probabilités conditionnelles et inspirée de l’approche bayesienne, qui découle du théorème de Bayes, est utilisée pour interpréter la correspondance de deux profils génétiques. En pratique, cela consiste à calculer un rapport de vraisemblance reposant sur deux hypothèses qui s’opposent, du type : H1, le profil génétique de la trace provient du suspect et de la victime (hypothèse de l’accusation) et H2, le profil génétique de la trace provient de la victime et d’un individu inconnu (hypothèse de la défense).

Le résultat obtenu, sous la forme d’un rapport de probabilités, permet de mesurer le poids d’une hypothèse par rapport à l’autre (15).

Biotechnologies et criminalistique : évolution et perspectives

La criminalistique est une science jeune qui dispose d’un potentiel encore inexploré. Elle bénéficie en permanence des avancées technologiques de l’en- semble des domaines scientifiques, et en la matière, celui de la biologie ne manque pas d’innovations.

Au cours de la prochaine décennie, la biocriminalistique connaîtra sans aucun doute un deuxième élan. Trois évolutions majeures sont attendues. La première est la miniaturisation : les systèmes d’analyses actuels sont inadaptés au terrain et n’ont pas été optimisés pour rendre des résultats rapidement.

Les progrès considérables réalisés dans le domaine des nanotechnologies et de la microfluidique devraient aboutir à court terme à la commercialisation d’au- tomates transportables permettant de coupler les étapes d’extraction, d’amplification et d’électro- phorèse et d’obtenir un profil génétique en moins d’une heure.

La deuxième évolution attendue concerne la datation des traces biologiques. En effet, si de nombreux travaux ont permis de réduire progressivement les seuils de détection et d’amplification de l’ADN, de contour- ner les inhibiteurs et d’analyser des échantillons en état avancé de dégradation, la question de l’âge d’une trace biologique demeure sans réponse. Des travaux récents sur des molécules telles que des ARN et des protéines spécifiques pouvant servir d’horloge permettent d’en- visager de pouvoir évaluer le délai écoulé depuis le dépôt d’une trace biologique. Il deviendrait alors possible non seulement de sélectionner les traces en fonction de leur date de dépôt, mais aussi de tenter de répondre par une approche biologique nouvelle à la question « quand ? ».

La troisième évolution viendra de la puissance de l’in- formatique. L’abaissement des seuils de détection a conduit à l’obtention de profils génétiques complexes provenant de l’ADN de multiples contributeurs.

Confrontés à ces profils, l’expert est souvent limité dans son interprétation au-delà de trois contributeurs.

Aidés par les analyses complémentaires reposant sur les STR non autosomaux et le développement de logi- ciels élaborés d’interprétation de mélanges, les experts en empreintes génétiques devraient pourvoir rapidement exploiter ces résultats. G

(15)Coquoz R, Taroni F (2003) Preuve par l’ADN, 2^eéd., Coll. Sciences forensiques, Presses poly- techniques et universitaires romandes, 244-66

Dégradation d’un prélèvement biologique maintenu dans un conditionnement inadéquat

Système d'analyse combiné portable pemettant l'extraction de l'ADN, l'amplification de 8 STR et la séparation des fragments d'ADN amplifiés en moins de 30 minutes. Des améliorations devraient permettre à court terme d'obtenir une meilleure résolu- tion et d'augmenter le nombre de loci analysables simultanément.