Impacts des souches du genre Pseudomonas protéolytiques sur la stabilité des produits laitiers transformées : maitrise et prédiction de la qualité des laits UHT

THESE / AGROCAMPUS OUEST

Sous le label de l’Université Européenne de Bretagne pour obtenir le diplôme de :

DOCTEUR DE L'INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES AGRONOMIQUES, AGRO-ALIMENTAIRES, HORTICOLES ET DU PAYSAGE

Spécialité : « Physico-chimie et Qualité des Bioproduits » Ecole Doctorale : « VIE AGRO SANTE»

Présentée par

François BAGLINIERE

présentée par :

« François BAGLINIERE »

soutenue le 15 Avril 2013 devant la commission d’Examen

Composition du jury :

M. F. NAU Professeur à l’Agrocampus-Ouest Président du jury M. S. MARCHESSEAU Professeur à Polytech’Montpellier Rapporteur M. J-M. CHOBERT Directeur de recherche à l’INRA-BIA, Nantes Rapporteur M. V. MICHEL Responsable du pôle sécurité sanitaire, Actilait Examinateur M. S. SERIEYE Responsable du pôle R & D Expérimental, Candia Examinateur M. F. GAUCHERON Chargé de Recherches à l’INRA, Rennes Directeur de thèse N° ordre : 2013-12

N° Série : B-241

Impacts des souches du genre Pseudomonas protéolytiques sur la stabilité de produits laitiers transformés :

maîtrise et prédiction de la qualité de laits UHT

Remerciements

Mes premiers remerciements vont à Frédéric GAUCHERON (UMR Inra- Agrocampus-Ouest STLO Rennes) qui a été à l’initiative de ce travail. « Un sincère et très grand merci à toi Frédéric pour m’avoir permis de réaliser cette thèse ». Sa réalisation a bénéficié de ton soutien constant tout au long de ces trois ans qui s’est manifesté au travers de tes conseils avisés, de ta patience, de ta disponibilité et de ta générosité.

Un grand merci aussi à Gaëlle TANGUY pour m’avoir co-encadré à l’UMR STLO avec Frédéric. Merci pour toute l’aide que tu m’as apportée.

Je tiens aussi à remercier Isabelle GAUCHER qui, grâce à ces travaux scientifiques précedent, m’a permis de réaliser cette thèse.

J’adresse également tous mes remerciements aux deux autres équipes encadrantes de ce travail, Annie DARY et Gérard HUMBERT (UR AFPA, Université de Lorraine) et Jean-Luc GAILLARD et Caroline AMIEL (UR ABTE) (Université de Caen), pour leur accueil au sein de leur laboratoire et aussi pour toute l’aide qu’ils ont pu m’apporter dans la réalisation de ce projet.

Cette thèse CIFRE a été financée par le Centre National de l’Interprofession et de l’Economie Laitière (CNIEL). Je tiens à remercier tout particulièrement Mr GUYONNET (CNIEL), son représentant, pour m’avoir permis de réaliser ce projet et l’avoir suivi avec intérêt. Je remercie aussi les représentants des sociétés industrielles pour leur participation aux comités de pilotage montrant l’intérêt qu’ils ont toujours porté à ce projet.

J’aimerais remercier l’ensemble des membres du jury qui ont évalué ce travail, particulièrement Mme MARCHESSEAU et Mr CHOBERT, pour avoir accepté la lourde tâche de rapporteur mais aussi Mr SERIEYE et Mme MICHEL pour leurs apports critiques sur ce travail en tant qu’examinateurs. Je remercie sinèrement Mme NAU d’avoir présidé ce jury.

Merci à Isabelle KEMPF pour avoir accepté d’être ma tutrice de thèse de l’école doctorale VAS durant ces trois ans.

Je tiens à remercier Mme Sylvie LORTAL et Mme Joëlle LEONIL directrices de l’UMR STLO, pour m’avoir permis de réaliser ma thèse dans de très bonnes conditions, à la fois humaines et professionnelles.

Je tiens aussi à associer à ces remerciements, très sincèrement, Aurélie MATEOS qui en tant que post-doctorante, a travaillé avec moi sur ce projet.

Merci pour ton aide, pour les connaissances que tu m’as apportées et pour tous

les moments passés à Nancy ou à Caen. A deux, il a été plus facile de réussir à dompter nos petits Pseudomonas !!!

Cette thèse qui a connu des étapes migratoires (Nancy, Caen et Rennes) m’a donné la chance de rencontrer et de côtoyer de nombreuses personnes dans les trois unités de recherche que j’ai fréquentées.

Un grand merci à Emeline et Thomas pour m’avoir permis de tenir le rude hiver lorrain grâce à de bons repas bretons !!! Un grand merci aussi à Magalie pour avoir recommencé à fumer une bonne dizaine de fois, pour m’accompagner dans mes traditionnelles pauses cigarettes avec Oun Ki alias PROFESSEUR CHANG que je remercie grandement au passage. Merci à Emilie, Chantal, Céline, Laurent, Yvonne, Jean-Mi, Anne et Clarisse pour leurs conseils lors de mon séjour à l’URAFPA. Merci aussi aux doctorants et post-doctorants, Aziz, Zeechan, Maïra, Nawara, Hamed, Faïza et Wessam pour m’avoir « aéré » l’esprit quand il le fallait.

Merci à toute l’équipe de l’IUT génie biologique de Caen et au personnel de l’UR ABTE pour m’avoir accueilli en Normandie en tant que gentil voisin breton que j’étais. Merci au deux Nico, Meriam, Florence pour nos super discussions sur l’IRTF avec parfois des petites incompréhensions…

Je tiens aussi à remercier toutes les personnes avec qui j’ai pu travailler à l’UMR STLO. Tout d’abord, mille merci à Benoît pour toutes les connaissances qu’il a pu m’apporter en technologie laitière et aussi pour son aide indispensable lors des expériences UHT. Un grand merci à Eric et Florence pour leurs aides précieuses lors des analyses des laits UHT et aussi à Julien et Valérie pour m’avoir initié au superbe outil (mais compliqué tout de même !!!) qu’est la spectrométrie de masse. Merci aussi à Bénédicte, Anne, Carine, Jean-Yves de l’équipe « Plateforme lait » mais aussi Rachel, Gwen, Victoria, Michel, Yves, Hélène, Sergine, Valérie G, pour avoir pris le temps de répondre à mes questions…

Merci à Nico pour sa bonne humeur de tous les jours et surtout son humour (que je qualifierais de particulier, ahahah !!!).

Un grand merci à tous les stagiaires, CDD, doctorants et post-doctorants

de l’unité rennaise : Clémentine, Naaman, Damien, Ju, Rose-Angela, Florence,

Livia, Michelinha, Gui, Arlan, Fabien, Marion, Céline, Solène, Renam, Sophie,

Vincent, Rozenn… pour tous ces bons moments passés ensemble que ce soit au

travail ou en dehors du laboratoire.

Un immense merci à toute l’équipe baby foot, Stéphane, Marco, Saïd, Xavier, Coralie, Charles, Emilie, Jacques et notre très chère présidente Pascaline, pour m’avoir accepté dans ce cercle très fermé qu’est le baby-foot- corpo (malgré mes nerfs fragiles… Pauvre petite balle en liège !!!)

Un grand merci à Jessica et à ma petite Paulette pour tous les services qu’elles ont pu me rendre en gardant leur bonne humeur… Ne changez rien Mesdames, vous êtes géniales !!!

Merci à Laurence, Anne-Marie, Anne, Danielle, Viviane, Christophe et Laurent pour les innombrables services rendus.

Merci à l’équipe de foot INRA pour m’avoir permis de me défouler pour évacuer la pression !!!

Un très grand merci à mes parents et à ma famille qui m’ont soutenu

durant ces trois ans et à qui je dédie cette thèse. Une très grande pensée à mes

grands parents paternels qui nous ont quittés, il y a quelques années maintenant.

Tables des matières

Liste des abréviations……… ¹

Introduction générale………... 3

Synthèse bibliographique ... 9

I LE LAIT ... 11

1. Composition générale ... 11

2. Les différentes substances azotées ... 11

2.1 Les molécules de caséines ... 11

2.2 Les protéines sériques ... Error! Bookmark not defined. 2.3. Substances azotées non protéiques ... 133

3. Les minéraux ... 13

4. Structure et stabilité des micelles de caséines ... 14

II DU LAIT CRU AU LAIT UHT, LES DIFFERENTS TRAITEMENTS ... 16

1. Définition ... 16

2. Les grandes étapes de production de lait UHT ... 17

3. Les technologies de traitement thermique UHT ... 17

4. Modifications biochimiques et microbiologiques thermo-induites ... 18

4.1 Destruction des micro-organismes ... 18

4.2 Modifications de la matière azotée du lait ... 19

4.2.1 Dénaturation des protéines sériques et complexations dans le lait ... 19

4.2.2 Modifications des caractéristiques micellaires ... 19

4.2.3 Inactivation des enzymes endogènes du lait ... 20

4.2.4 Inactivation des enzymes exogènes du lait ... 22

III. DESTABILISATION DU LAIT UHT ... 23

1. Description du phénomène ... 23

2. Les principales causes de déstabilisation ... 24

3. Les micro-organismes : principaux contaminants du lait ... 25

4. La microflore psychrotrophe protéolytique : effets de leurs protéases sur la qualité du lait et des produits laitiers ... 26

IV. LES BACTERIES DU GENRE PSEUDOMONAS ... 27

1. Classification du genre Pseudomonas... 27

2. Caractéristiques du genre Pseudomonas ... 28

3. Importance du genre Pseudomonas en milieu laitier ... 29

4. Les protéases des souches de Pseudomonas isolées du lait... 30

4.1 Caractéristiques biochimiques des enzymes extracellulaires ... 30

4.2 Régulation de la production des protéases extracellulaires ... 31

4.2.1. Effets des facteurs environnementaux ... 31

4.2.2. Effets de facteurs nutritionnels ... 32

4.2.3. Effet du stade de croissance ... 33

4.3 Les métalloprotéases à zinc de la famille des serralysines ... 34

4.3.1 Caractéristiques des serralysines ... 34

4.3.2 Structure des serralysines ... 34

4.3.3 La protéase AprX des bactéries du genre Pseudomonas ... 35

V. LES METHODES D’EVALUATION ET DE PREDICTION DE LA STABILITE DU LAIT AUX TRAITEMENTS THERMIQUES ET AU STOCKAGE ... 36

1. Test à la chaleur ... 36

2. Test à l’alcool ... 37

3. Test au phosphate (test de Ramsdell) ... 37

4. Autres tests ... 38

5. Potentialités de l’Infrarouge à Transformée de Fourier (IRTF) comme outil de prédiction de la stabilité du

lait aux traitements thermiques et au stockage ... 39

5.1 Généralités sur l’IRTF ... 40

5.2 Spectres infrarouges des micro-organismes ... 41

5.3 Application de l’IRTF en microbiologie ... 43

Objectifs et stratégie ... 45

I. RESULTATS OBTENUS PRECEDEMMENT SUR LA DESTABILISATION DES LAITS UHT ... 47

II. ORIGINALITES ET OBJECTIFS SCIENTIFIQUES DE LA THESE ... 49

III. QUESTIONS DE RECHERCHE ... 49

IV. DESCRIPTION GLOBALE DU PROJET ... 50

1. Phase 1 : sélection et caractérisation de 32 de souches du genre Pseudomonas. ... 50

2. Phase 2 : étude de la stabilité de lait UHT suite à des contaminations de laits modèles par 10 souches du genre Pseudomonas préalablement sélectionnées ... 51

3. Phase 3 : utilisation de la spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourrier (IRTF) pour identifier des souches de Pseudomonas et juger de leur caractère protéolytique ... 52

V. CALENDRIER INTEGRANT LES DIFFERENTES PHASES ... 53

Matériels et méthodes ... 55

I. MATERIELS ET METHODES DE LA PHASE 1 ... 57

1. Souches utilisées ... 57

2. Méthodes ... 58

2.1 Conditions et milieux de culture ... 58

2.2 Détection et séquençage du gène aprX ... 58

2.2.1 Extraction d’ADN ... 58

2.2.2 Amplification du gène par PCR ... 59

2.2.3 Séquençage ... 60

2.3 Etude du caractère protéolytique de chaque souche ... 60

2.3.1 Détection de protéases extracellulaires par zymographie ... 60

2.3.2 Quantification de l’activité protéolytique extracellulaire d’une souche bactérienne. ... 61

2.3.3 Détermination du poids sec des cultures des différentes souches de Pseudomonas ... 61

II. MATERIELS ET METHODES DE LA PHASE 2 ... 63

1. Matériels ... 63

1.1 Souches utilisées ... 63

1.2 Lait cru ... 63

1.3 Perméat d’ultrafiltration ... 64

2. Méthodes ... 64

2.1 Purification de l’enzyme AprX de la souche P. fluorescens F ... 64

2.1.1 Culture bactérienne et récupération du milieu extracellulaire ... 64

2.1.2 Chromatographie d’exclusion stérique ... 64

2.1.3 Vérification de la pureté par électrophorèse en milieu réducteur ... 65

2.2. Préparation du lait UHT ... 65

2.3 Analyses biologiques et microbiologiques ... 67

2.3.1 Culture des souches de Pseudomonas ... 67

2.3.2 Dénombrement de la Flore Aérobie Mésophile totale (FAM) ... 67

2.3.3 Dénombrement des cellules somatiques ... 67

2.4. Analyses physico-chimiques et biochimiques ... 67

2.4.1 pH ... 67

2.4.2 Test de stabilité au phosphate ... 68

2.4.3. Distribution de taille des particules ... 68

2.4.4 Potentiel zêta ... 68

2.4.5 Teneur en eau des culots d’ultracentrifugation ... 69

2.4.6 Matière azotée totale (MAT) ... 69

2.4.7 Azote non caséinique (NCN) ... 69

2.4.8 Azote non protéique (NPN) ... 70

2.4.9 Analyse des peptides présents dans la fraction NCN par chromatographie liquide haute performance en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse en tandem ... 70

III. MATERIELS ET METHODES DE LA PHASE 3 ... 71

1. Matériels ... 71

1.1 Souches utilisées ... 71

1.2 Appareil Infrarouge à Transformée de Fourier ... 71

2. Méthodes ... 73

2.1 Conditions et milieux de culture des souches de Pseudomonas ... 73

2.2 Réalisation des spectres IRTF et traitement des données spectrales ... 74

2.2.1 Procédure générale ... 74

2.2.2 Réalisation des différents spectres IRTF ... 75

2.2.3 Sélection et traitement des spectres Infrarouge ... 76

2.2.4 Traitement statistique des données spectrales ... 78

Résultats et discussion ... 81

Chapitre 1: Sélection et caractérisation de 32 souches de Pseudomonas spp en fonction de leur caractère protéolytique ... 83

I. INTRODUCTION ... 83

II. SELECTION, CARACTERISATION ET CLASSIFICATION D’UNE TRENTAINE DE SOUCHES APPARTENANT AU GENRE PSEUDOMONAS EN FONCTION DE LEUR CARACTERE PROTEOLYTIQUE ... 84

1. Détection du gène aprX chez les différentes souches de Pseudomonas ... 84

2. Détection et estimation des masses moléculaires apparentes des protéases extracellulaires actives par zymographie ... 86

3. Classification des souches en fonction de leur activité protéolytique ... 88

4. Séquençage du gène aprX de 6 souches de Pseudomonas ... 91

III. CONCLUSION ... 94

Chapitre 2: Etude de la stabilité de laits UHT suite à des contaminations de lait cru par 10 souches de Pseudomonas préalablement sélectionnées en fonction de leur caractère protéolytique ou après addition de l’enzyme AprX purifiée ... 97

I. INTRODUCTION ... 97

II. ETUDE DE LA DESTABILISATION DE LAITS UHT SUITE A LA CONTAMINATION DES LAITS CRUS PAR 10 SOUCHES DU GENRE PSEUDOMONAS ... 100

1. Résultats obtenus suite à des contaminations de laits crus par 10 souches de Pseudomonas ... 100

1.1 Préparation des laits crus contaminés et traitements UHT ... 100

1.1.1 Caractéristiques des laits crus écrémés avant réfrigération à 7°C ... 100

1.1.2 Choix des concentrations en Pseudomonas inoculés dans les laits crus, dénombrement de cette flore après 72h de réfrigération... 100

1.2. Suivi de la déstabilisation des laits UHT au cours du stockage ... 102

1.2.1 Observation visuelle des laits UHT après 90 jours de stockage ... 102

1.2.2. Evolution de la stabilité des laits UHT au cours du stockage évaluée par le test au phosphate ... 102

1.2.3. Distribution de la taille des particules des laits UHT au cours du stockage ... 104

1.2.4. Potentiel zêta des particules des laits UHT au cours du stockage ... 106

1.2.5. Hydratation micellaire des laits UHT au cours du stockage ... 107

1.2.6. Teneurs en NCN et NPN des laits UHT au cours du stockage ... 107

1.2.7. Séparation et identification des peptides présents dans la fraction NCN par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem. ... 109

2. Discussion ... 117

2.1 Souches déstabilisantes ... 117

2.2 Souches non déstabilisantes ... 119

3. Conclusion ... 121

III. ETUDE DE LA DESTABILISATION DE LAITS UHT SUITE A LEUR CONTAMINATION PAR 0,2 MG/L DE PROTEASE APRX PURIFIEE A PARTIR DE LA SOUCHE P. FLUORESCENS F ... 122

1. Purification de la protéase AprX de la souche P. fluorescens F ... 122

2. Etude de la déstabilisation de laits UHT suite à l’addition de 0,2 mg/L de protéase AprX purifiée ... 125

2.1. Caractéristiques du lait avant réfrigération à 6°C ... 125

2.2. Suivi de la déstabilisation des laits UHT au cours du stockage ... 125

2.2.1 Observation visuelle des laits UHT après 90 jours de stockage ... 125

2.2.2. Evaluation de la stabilité des laits UHT au cours des 90 jours de stockage à l’aide du test au phosphate ... 125

2.2.3. Distribution de la taille des particules des laits UHT au cours des 90 jours de stockage ... 126

2.2.4. Potentiel zêta des particules des laits UHT au cours des 90 jours de stockage ... 128

2.2.5. Hydratation micellaire des laits UHT au cours des 90 jours de stockage ... 128

2.2.6. Teneur en NCN et NPN des laits UHT au cours du stockage ... 129

2.2.7. Séparation et identification des peptides présents dans la fraction NCN par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem. ... 130

3. Discussion ... 134

4. Conclusion ... 135

IV. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION MINIMALE EN PROTEASE APRX NECESSAIRE POUR DESTABILISER LE LAIT UHT AVANT LES 90 JOURS DE STOCKAGE. ... 136

1. Résultats ... 136

1.1. Préparation des laits UHT contaminés ... 136

1.1.3 Caractéristiques du lait avant réfrigération à 7°C ... 136

1.1.2 Choix des concentrations en enzymes ajoutées avant traitement UHT ... 136

1.2. Suivi de la déstabilisation des laits UHT au cours du stockage ... 136

1.2.1. Observation visuelle des laits UHT après 90 jours de stockage ... 137

1.2.2. Teneur en NCN des laits UHT au cours du stockage ... 137

2. Conclusion ... 138

V. CONCLUSION ... 138

Chapitre 3: Utilisation de la spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IRTF) pour identifier des souches de Pseudomonas et juger de leur caractère protéolytique ... 141

I. INTRODUCTION ... 143

1. Choix de la fenêtre spectrale permettant de discriminer le spectre d’une souche protéolytique du spectre d’une souche non protéolytique ... 144

2. Détermination d’un seuil de détection de la contamination du lait par les Pseudomonas par spectroscopie IRTF ... 145

2.1 Objectifs ... 145

2.2 Obtention et analyse des spectres ... 145

2.3 Discussion ... 148

3. Détermination d’un seuil de discrimination de bactérie protéolytique et non protéolytique dans un échantillon lait contaminé par Pseudomonas par spectroscopie IRTF ... 148

3.1 Objectif ... 148

3.2 Obtention et analyse des spectres ... 148

3.3 Discussion-conclusion ... 150

III. DISCRIMINATION DE SOUCHES PROTEOLYTIQUES ET DE SOUCHES NON PROTEOLYTIQUES EN MILIEU LAIT ... 150

1. Réalisation en milieu lait d’une banque de données spectrales de 20 souches de Pseudomonas (10 protéolytiques et 10 non protéolytiques) ... 150

1.1 Objectif ... 150

1.2 Obtention et analyse des spectres ... 151

1.3. Discussion ... 152

2. Discrimination d’une souche protéolytique et d’une souche non protéolytique dans un même échantillon de lait ... 152

2.1 Objectif ... 152

2.2 Obtention et analyse des spectres ... 153

3. Discussion-conclusion... 154

IV. DISCRIMINATION DE SOUCHES DE PSEUDOMONAS PROTEOLYTIQUES ET DE SOUCHES NON PROTEOLYTIQUES A PARTIR DE COLONIES CULTIVEES SUR GELOSE CFC+ 10 % LAIT. REALISATION D’UNE BANQUE DE DONNEES SPECTRALES DE 20 SOUCHES DE PSEUDOMONAS (10 PROTEOLYTIQUES ET 10 NON PROTEOLYTIQUES). ... 154

1. Objectif ... 155

2. Obtention et analyse des spectres ... 155

2.1 Classification hiérarchique ... 155

2.2 Analyse discriminante avec TQ-Analyst ... 156

3. Conclusion-discussion ... 159

V. CONCLUSION ... 160

Conclusion et perspectives ... ¹⁶⁵

Références bibliographiques ... 173

Annexes ... ¹⁹⁵

I. ANNEXE 1 ... 196

II. ANNEXE 2 ... 198

III. ANNEXE 3 ... 196

IV. ANNEXE 4 ... 198

V. ANNEXE 5 ... 203

Valorisation des résultats ... 205

1

Liste des abréviations

ABTE Aliments bioprocédés toxicologie environnements ADN Acide désoxyribonucléique

AFPA Aliment et fonctionnalité des produits animaux ARN Acide ribonucléique

ARNr Acide ribonucléique ribosomal

ATCC American type culture collection

Bet Bromure d’éthidium

BHI Brain heart infusion

C Cytosine

CFC Cétrimide, fucidine et céphalosporine CIP Collection de l’institut Pasteur

CNIEL Centre national de l’interprofession et de l’économie laitière CNRZ Centre national de recherches zootechniques

CPG Chromatographie en phase gazeuse

Da Dalton

DLUO Date limite d’utilisation optimale dNTP Désoxy nucléotide tri-phophate

DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen DTGS Sulfate de triglycine deutérié

EDTA Acide éthylène diamine tétra-acétique EGTA Ethylene glycol tetra-acetic acid

ESI-MS/MS Spectrométrie de masse en tandem à source d’ionisation électrospray FAM Flore aérobie mésophile

G Guanine

HPLC Chromatographie liquide haute performance HCT Heat Coagulation Time

INRA Institut national de la recherche agronomique

IR Infrarouge

IRTF Infrarouge à transformée de Fourier KDa KiloDalton

LC-MS/MS Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem Lps Lipopolysaccharides

m/V masse/volume

MAT Matière azotée totale

Mb Méga bases

MC Milieu complexe MIR Moyen infrarouge NaN

Azoture de sodium NCN Non casein nitrogen

nd Non déterminé

NPN Non protein nitrogen

PA Activateurs du plasminogène

PAI Inhibiteurs des activateurs du plasminogène pb Paire de bases

PCA Plate count agar

PCR Polymerase chain reaction

2 PI Inhibiteurs de la plasmine

RMN Résonance magnétique nucléaire rpm Rotation par minute

SDS Sodium dodecyl sulfate

Spp Species

STLO Science et technologie du lait et de l’œuf TCA Acide tricholoroacétique

TE Tris EDTA

TEMED Tétraméthyléthylènediamine TFA Acide trifluoroacétique TSA Tryptone soja agar

V/V Volume/volume

UFC Unité formant colonie UHT Ultra haute température UMR Unité mixte de recherche

UPGMA Unweighted pair group method with average UR Unité de recherche

UV Ultra violet

α-Lac α lactalbumine

β-Lg β lactoglobuline

Introduction générale

3

Introduction générale

4

5 En France, le lait est fortement présent dans l’alimentation avec environ 10 kg de produits laitiers consommés par an et par habitant (CNIEL, 2011). Qu’il soit sous forme liquide ou bien transformé, il est considéré comme un produit essentiel de l’alimentation. En 2011, la production annuelle française a atteint près de 24 milliards de litres de laits, avec 2,5 milliards de litres consommés sous forme de laits liquides conditionnés.

Le lait cru ne pouvant se conserver tel quel, sa composition en faisant un milieu extrêmement favorable à la prolifération de micro-organismes, des traitements technologiques, plus particulièrement des traitements thermiques, lui sont appliqués afin de prolonger sa conservation. C’est pourquoi actuellement en France, 92 % des laits liquides conditionnés sont des laits ayant subi un traitement UHT (Ultra Haute Température). Ce traitement thermique consiste à chauffer le lait à une température élevée (entre 140 et 150°C) pendant un temps très court (2 à 5 s seulement). Ce traitement thermique, court mais intense, permet au lait de garder la majorité de ses qualités organoleptiques et d’être conservé pendant 3 mois à température ambiante (Date limite d’utilisation optimale (DLUO)).

Cependant, il arrive parfois que le lait UHT se déstabilise avant sa DLUO. En effet, l’industrie laitière doit faire face à des problèmes d’instabilité du lait UHT au cours de sa conservation. Cette déstabilisation se traduit par des phénomènes de déphasage ou de gélification dans la brique ou au cours du chauffage du lait UHT chez le consommateur. Ces phénomènes font intervenir les protéines du lait, et en particulier les micelles de caséines, qui, en perdant leur stabilité, s’agrègent et sédimentent ou coagulent à un degré plus ou moins élevé. La recherche des causes de ces déstabilisations a fait l’objet de nombreuses recherches depuis des décennies et il est évident qu’elles sont multifactorielles.

Parmi les facteurs impliqués dans cette déstabilisation, la qualité du lait cru mise en œuvre, les traitements technologiques et les conditions de stockage après traitement thermique sont importants à considérer. De façon schématique, deux grandes causes peuvent induire la déstabilisation de lait UHT au cours du stockage : les causes enzymatiques et les causes physico-chimiques. Excepté les laits de mauvaise qualité microbiologique due à de mauvaises conditions d’hygiène ou à des contaminations, une partie des causes enzymatiques sont principalement à mettre en relation avec une croissance anormale de bactéries psychrotrophes dans le lait cru (Dogan & Boor, 2003). Ces bactéries se multiplient à basse température et sécrètent une ou plusieurs protéases qui sont thermorésistantes (Sørhaug & Stepaniak, 1997).

Bien que le lait soit en général traité thermiquement avant transformation, une partie de ces

6 protéases n’est donc pas inactivée par des traitements thermiques intenses et peut en conséquence dégrader les protéines de lait au point de les déstabiliser et de les faire coaguler ou gélifier. Cette problématique « instabilité des laits UHT au cours du stockage » est connue de longue date mais pas totalement comprise et résolue. La résolution de ces problèmes de déstabilisation constitue un enjeu scientifique mais aussi économique important car ils limitent la durée de vie des laits UHT et engendrent un coût de non-qualité évalué à plusieurs dizaines de milliers d’euros par an.

Afin de limiter les problèmes de déstabilisation des laits au cours et après traitements thermiques, des méthodes rapides, généralement peu coûteuses et faciles à mettre en place, sont appliquées sur les laits crus à l’entrée de l’usine. Les principales méthodes consistent en l’évaluation de la stabilité du lait vis-à-vis de la chaleur, d’une addition d’éthanol ou de phosphate. Le principe de ces tests réside globalement en une déstabilisation physico- chimique du lait. La réponse à ces tests n’est pas corrélée car leur principe est différent. Le test au phosphate modifie le pH et les équilibres minéraux, le test à l’alcool altère la constante diélectrique du milieu et en conséquence les solubilités minérales, l’hydratation et l’organisation des protéines alors que le traitement thermique induit de nombreuses réactions physiques (dénaturation protéique) et chimiques entre les constituants du lait (réactions de Maillard, formation de ponts S-S, désamidation, …). Actuellement, ces tests permettent un tri de ces laits potentiellement instables mais ne sont pas totalement satisfaisants : de nombreuses

« fausses réponses » sont données par ces tests. Bien qu’il semble illusoire de trouver un test universel, parfait, et pas cher, il est intéressant d’explorer de nouvelles voies de détection et notamment celles cherchant spécifiquement, directement et avec une bonne sensibilité les micro-organismes impliqués dans cette déstabilisation.

Dans l’optique de maitriser au mieux la qualité des laits crus avant leur transformation,

l’interprofession laitière représentée par le CNIEL (Centre National de l’Interprofession et de

l’Economie Laitière) a participé avec l’unité mixte de recherche Science et Technologie du

Lait et de l’Œuf (UMR STLO, Inra Agrocampus-Ouest, Rennes) à des projets de recherches

dédiés à la compréhension de l’instabilité des laits UHT au cours du stockage. Récemment,

une étude réalisée par Gaucher et al. (2011) sur des laits modèles (épurés

microbiologiquement par microfiltration), a montré que la protéase de P. fluorescens CNRZ

798 avait un effet marqué sur la déstabilisation du lait. Cette déstabilisation se traduisait par

une apparition de sédiment gélifié dans le lait UHT après 3 mois de stockage à 20°C.

7 Ces résultats ont montré le rôle déstabilisant des bactéries du genre Pseudomonas via leurs protéases thermorésistantes. Ces bactéries pourraient être la cause principale de la déstabilisation du lait UHT au cours de sa conservation.

L’objectif principal de cette thèse CIFRE, financée par le CNIEL et effectuée à l’UMR STLO en partenariat avec l’unité de recherche Animal et Fonctionnalités des Produits Animaux (UR AFPA, Université de Lorraine, Nancy) et l’unité de recherche Aliments Bioprocédés Toxicologie Environnements (UR ABTE, Université de Caen) était double.

Premièrement, il s’agissait d’un point de vue scientifique, de comprendre les modifications induites par les protéases extracellulaires des bactéries du genre Pseudomonas sur la micelle de caséine afin de mieux maîtriser la qualité du lait cru et des produits laitiers dont ils sont issus. Deuxièmement, il s’agissait d’un point de vue industriel de mettre au point un test de stabilité applicable sur le lait cru permettant de prédire la stabilité du lait UHT au cours du stockage afin d’obtenir une meilleure gestion des laits crus avant traitement thermique mais aussi de maîtriser l’impact de la qualité des laits crus sur la qualité des produits transformés.

Ce manuscrit de thèse est divisé en 5 parties. Il est exposé, dans un premier temps une synthèse bibliographique ayant permis d’élaborer les hypothèses à la base de ce travail, dans un second temps les objectifs de la thèse et la stratégie mise en œuvre pour y répondre, dans un troisième temps le matériel et les méthodes utilisés, dans un quatrième temps les résultats des expériences réalisées et pour finir la conclusion générale et les perspectives de ce travail.

La partie présentant les résultats est organisée en 3 chapitres. Le premier expose la

sélection de 32 souches de Pseudomonas potentiellement protéolytiques. Le deuxième

présente les résultats obtenus suite à la contamination préalable de lait UHT par 10 souches de

Pseudomonas et AprX. Pour finir le troisième et dernier chapitre expose les potentialités de

l’outil IRTF comme outil de prédiction de la stabilité des laits.

Introduction générale

8

.

Synthèse bibliographique

9

Synthèse bibliographique

Synthèse bibliographique

10

11

I Le lait

1. Composition générale

Le lait issu de la sécrétion mammaire de la vache en période de lactation, est un produit liquide complexe et hétérogène caractérisé par différentes phases en équilibre instable.

Il présente une phase aqueuse, essentiellement constituée de protéines sériques, de lactose mais aussi de vitamines et de sels minéraux, une phase colloïdale composée de micelles de caséines (caséines et sels minéraux) et une phase composée de matière grasse (globules gras) en émulsion.

Sa composition au niveau quantitatif est variable et dépend de nombreux facteurs (physiologique, génétique, environnementaux et zootechnique) (Walstra et al., 2006 et Palmquist et al., 1993). La composition moyenne du lait entier de vache est présentée dans le Tableau I.

Tableau I. Composition moyenne et gamme de concentrations du lait entier de vache.

(Walstra et al., 2006)

Composants

Concentration moyenne

(% p/p)

Gamme de concentrations

(% p/p)

Eau 87,1 85,3 - 88,7

Matière grasse 4 2,5 Ŕ 5,5

Matières sèches non grasses 8,9 7,9 Ŕ 10,0

Lactose 4,6 3,8 Ŕ 5,3

Protéines 3,3 2,3 Ŕ 4,4

Caséines 2,6 1,7 Ŕ 3,5

Protéines sériques 0,6 ---

Substances azotées non protéiques 0,06 ---

Substances minérales 0,7 0,57 Ŕ 0,83

Acides organiques 0,17 0,12 Ŕ 0,21

2. Les différentes substances azotées 2.1 Les molécules de caséines

Les majeures parties des protéines du lait sont représentées par les caséines (80 % des

protéines totales). Ce sont des protéines phosphorylées, qui ont la particularité de fixer du

calcium et d’interagir pour former les micelles de caséines. Cette micelle est composée de 4

types de caséines, α

, α

, β et κ. Ces molécules précipitent à pH 4,6. La composition et les

caractéristiques physico-chimiques de ces caséines sont présentées dans le Tableau II.

12 Tableau II. Compositions et caractéristiques physico-chimiques des caséines (Walstra et al., 2006).

Caséine αs1

(variant B-8P*)

Caséine αs2

(variant A-11P*)

Caséine β (variant A2-5P*)

Caséine κ (variant A-1P*)

Nombre de variants génétiques 8 4 12 11

Masse moléculaire (Da) 23 615 25 226 24 023 19 037

Concentration (g/L de lait) 12 à 15 3 à 4 9 à 11 2 à 4

Nombre d’acides aminés 199 207 209 169

Nombre de résidus :

Acide glutamique 25 24 19 12

Acide aspartique 7 4 4 4

Phosphosérine 8 11 5 1

Proline 17 25 31 29

Cystéine 0 2 0 2

Résidus apolaires (%)** 28 25 31 29

Hydrophobie (kJ/résidu) 4,89 4,64 5,58 5,12

Nombre de glycosylation 0 0 0 0 à 5

Charge à pH 6,6 (mV) -22 -14 -13 -3

pHi calculé 4,94 5,37 5,14 5,61

Précipitation CaCl₂ à 37 et 4°C (pH 7) + / + + / + + / - - / -

* nombre de résidus phosphorylés présents sur la molécule de caséine

** recalculé à partir de la somme des résidus A, V, I, L et F sur le nombre total de résidus

2.2 Les protéines sériques

Les protéines sériques représentent environ 15 % des protéines du lait. Elles sont

principalement représentées par la β-lactoglobuline ( β -Lg), l’α-lactalbumine ( α -Lac), mais

aussi par les immunoglobulines, la sérum-albumine et les protéoses-peptones. Elles ne

précipitent pas à pH 4,6. La β -Lg et l’ α -Lac représentent, respectivement, 50 et 20 % des

protéines sériques (Walstra et al., 2006). Ces 2 protéines globulaires de 18,3 et 14,2 kDa, sont

dénaturées par des traitements thermiques. La β-Lg présente 11 variants génétiques, (dont les

plus fréquents sont de types A et B) tandis que l’ α -Lac n’en présente que 2 (A et B). L’ α -

Lac a la particularité de fixer le calcium, lui permettant de stabiliser sa conformation (Walstra

et al., 2006). Les immunoglobulines (IgG, IgA, IgM et IgE) sont des glycoprotéines ayant un

rôle d’anticorps. Les IgG sont prédominantes dans le lait. Les protéoses-peptones constituent

la fraction protéique mineure du lactosérum. Elles sont constituées de composants issus de la

protéolyse enzymatique (fragments de caséines β), du composant PP3 (lactophorine) qui est

une glycoprotéine de 28 kDa. La fraction protéique du lactosérum présente également de

13 nombreuses enzymes telles que la lactoperoxydase, la xanthine-oxydase, la lipoprotéine lipase, la plasmine et les lyzozymes.

2.3. Substances azotées non protéiques

Les substances azotées non protéiques constituent la fraction « Non Protein Nitrogen » (NPN). Elles sont présentes en faibles quantités (5 % de l’azote total du lait). Cette fraction se compose principalement d’urée, d’acide urique, d’acide orotique, de créatine, de créatinine, d’ammoniaque, de peptides et d’acides aminés libres (Walstra et al., 2006). Parmi ces petits peptides, l’urée est la plus importante en termes de quantité (plus de 200 mg/L).

3. Les minéraux

Les minéraux sont relativement en faible quantité dans le lait (environ 7 % de la matière sèche). Ils sont présents dans la phase soluble et micellaire. La composition de cette fraction minérale est présentée dans le Tableau III. Des équilibres existent entre les différentes formes minérales de la phase soluble et de la phase colloïdale. Différentes modifications physico-chimiques, telles que l’acidification, l’addition ou l’élimination de minéraux, et les variations de températures peuvent changer ces équilibres (Figure 1).

Tableau III. Concentrations et répartition des principaux minéraux du lait à pH 6,7 (Holt &

Jenness, 1984).

Constituants Concentrations (en mM)

% de soluble Totale Soluble Micellaire

Calcium 29,4 9,2 20,2 31

Phosphate inorganique 20,9 11 10 54

Magnésium 5,1 3,3 1,8 65

Citrate 9,2 8,2 1 89

Sodium 24,2 24,2 0 100

Potassium 34,7 34,7 0 100

Chlorure 30,2 30,2 0 100

Figure 1. Principaux équilibres minéraux du lait (Brulé, 1981)

14 La phase aqueuse contient principalement les éléments sodium, potassium et chlorure sous forme d’ions libres, tandis que les éléments calcium, magnésium et citrate s’associent sous forme de sels MgCit

et de CaCit

.

La phase micellaire contient majoritairement du phosphate, du calcium et minoritairement du magnésium et du citrate.

Le phosphate inorganique est présent à la même concentration dans la phase aqueuse que dans la phase micellaire. Dans la phase aqueuse, il est principalement sous forme d’ion libre (environ 10 mM, cependant son état d’ionisation dépend fortement du pH) mais peut s’associer au calcium pour former des sels de CaHPO

(0,6 mM).

4. Structure et stabilité des micelles de caséines

Par l’intermédiaire de liaisons ioniques (phosphate et calcium) et d’interactions hydrophobes, les caséines peuvent s’associer pour former des micelles de caséines. Ces micelles (environ 90 % des caséines), de forme sphérique (diamètre moyen compris entre 150 et 300 nm), sont composées de 10

molécules de caséines par micelle (Walstra et al., 2006).

De nombreuses études ont été menées afin de comprendre comment se forme et s’organise la micelle de caséines. A ce jour, sa structure n’a pas encore été clairement établie. Il existe actuellement quelques modèles de représentation de la micelle de caséines dont les 2 principaux sont le modèle des submicelles (Morr, 1967 ; Schmidt, 1982 ; Ono & Obata, 1989

; Walstra, 1999) (Figure 2) et le modèle à structure ouverte (Holt & Horne, 1996) (Figure 3).

Selon les observations réalisées par cryo-microscopie à transmission et des analyses en diffusion des rayons X (Marchin, 2007), il s’avèrerait que le modèle à structure ouverte soit le plus admis par la communauté scientifique pour représenter la micelle de caséines.

Figure 2. Modèle submicellaire de Walstra (1999)

15 Figure 3. Modèle à structure ouverte de Holt & Horne (1996)

Le modèle de Holt & Horne (1996) (Figure 3), représente la micelle de caséines comme une particule hydratée, poreuse, de forme sphérique. Des « nanoclusters » de phosphate de calcium (organisation minérale dans la phase micellaire) permettent de lier les différentes molécules de caséines. Ces « nanoclusters » (Figure 4) sont composés d’une enveloppe peptidique (1,6 nm d’épaisseur) présentant une partie centrale de phosphate de calcium (4,8 nm de diamètre). Deux à 3 centres phosphates (clusters) correspondant aux résidus sérine phosphorylés sont présents au sein des molécules de caséines. Cependant, la caséine κ, qui ne présente pas de centre phosphate, est dans l’incapacité de se lier aux

« nanocluster ». Cette caséine n’est donc pas présente dans ce modèle d’association minérale.

Selon Horne (2006), il doit donc exister d’autres types d’interactions permettant la cohésion de caséines formant ainsi la micelle.

Figure 4. Représentation schématique d’un « nanocluster » de phosphate de calcium (Holt &

Timmins, 1997)

Il est intéressant de noter que selon Holt & Horne (1996), les parties C-terminales de la caséine κ apparentées à des « cheveux » composent une couche diffuse chevelue autour de la micelle, qui en piégeant les molécules d’eau (barrière d’hydratation) entrainent des forces de dispersion entre les différentes molécules du milieu dispersant. Il est également admis que

Nanocluster de phosphate de calcium

16 la position externe de la caséine κ confère à la micelle une stabilité et par l’intermédiaire de répulsions électrostatiques empêche leur agrégation. Selon Marchin (2007), les caséines β, αs

et αs

seraient aussi présentes à l’extérieur de la micelle. Nous pouvons donc constater qu’à ce jour l’organisation micellaire, et les différents acteurs impliqués dans sa stabilité ne sont pas bien connus. Quelques caractéristiques de la micelle de caséines sont présentées dans le Tableau IV.

Tableau IV. Quelques caractéristiques de la micelle de caséines (Wade et al., 1996 ; Fox, 2003 ; Holt et al., 2003)

Caractéristiques Valeur

Gamme de taille (nm) 50 Ŕ 500

Diamètre moyen (nm) 150 Ŕ 200

Hydratation (g d’eau / g de protéines) 2

Charge (mV) -18 Ŕ -20

Poids (g) 2,2 x 10^-15

Masse moléculaire (hydratée) (Da) 10⁶ à 3.10⁹

Voluminosité (cm³ / g) 4,4

Densité (hydratée) (g / cm³) 1,0632

Nombre de « nanoclusters » pour 1 micelle de rayon 108 nm et de masse

7,2 x 10⁸ Da 830

Nombre de particules par mL de lait 10¹⁴ - 10¹⁶

Distance moyenne entre les particules (nm) 240

La micelle de caséines peut donc être considérée comme une suprastructure moléculaire stable grâce aux différentes interactions présentes entre les diverses molécules de caséines. Cependant, il existe des conditions qui déstabilisent la micelle comme les pH acides, les hydrolyses enzymatiques de diverses origines et les environnements minéraux. La déstabilisation de ces micelles entraîne la coagulation ou la précipitation du lait.

II Du lait cru au lait UHT, les différents traitements

1. Définition

Le traitement thermique UHT est un procédé de chauffage, qui peut être direct ou

indirect, appliqué pendant quelques secondes à une température d’environ 140°C. Ce

chauffage est exercé en flux continu, de façon ininterrompue. Malgré sa durée très courte, ce

traitement doit détruire tous les micro-organismes , et inactiver les enzymes et toxines présentes,

acteurs potentiels d’une altération du lait pouvant le rendre impropre à la consommation. Le

lait doit ensuite être conditionné dans un contenant stérile, de façon aseptique. Le contenant

17 doit être hermétique à l’intrusion d’éléments étrangers, et opaque, évitant ainsi tous effets non désirés de la lumière (Décret du 25 mars 1924, article 3 modifié par le décret n°77-1026 du 7 septembre 1977, paru au JORF du 14 septembre 1977).

En France, le lait UHT est considéré comme un lait stérile, propre à la consommation, pouvant être conservé trois mois à température ambiante.

2. Les grandes étapes de production de lait UHT

Le lait est dans un premier temps écrémé puis standardisé en matière grasse. Il est ensuite pasteurisé (environ 90°C/20s) puis homogénéisé sous une pression comprise entre 50 et 200 bars. Le lait est ensuite stérilisé par un procédé UHT (indirect ou direct, cf partie 3) puis conditionné de façon aseptique (Figure 5).

Figure 5. Les grandes étapes du procédé UHT, en système indirect (Leseur & Melik, 1985).

3. Les technologies de traitement thermique UHT

Deux procédés de stérilisation existent actuellement : le procédé UHT indirect et le

procédé UHT direct. Dans le procédé indirect, le traitement thermique est réalisé à partir

d’échangeurs de chaleur à plaque et/ou tubulaire. Dans le procédé direct, le traitement

thermique est réalisé par injection de vapeur d’eau de qualité alimentaire. Il est intéressant de

noter que la charge thermique dans le procédé UHT indirect est plus importante que dans le

procédé UHT direct (Datta et al., 2002) (Figure 6). Une charge thermique (aire sous la

courbe) plus élevée implique plus de dégradations biochimiques sur les différents composés

du lait.

18 Figure 6. Profils thermiques en fonction du temps de chauffage dans les systèmes direct (un exemple) et indirect (2 exemples) de stérilisation UHT (Walstra et al., 2006).

Malgré une durée de séjour du produit à 90°C nettement plus longue (plus d’une dizaine de secondes en procédé indirect contre quelques secondes en procédé direct), le procédé indirect permet une récupération de chaleur plus importante, abaissant ainsi les coûts d’opérations. Il est possible de procéder à l’homogénéisation avant ou après le traitement UHT. Il est intéressant de noter que les installations de type « indirect » sont donc avantageuses à l’achat, de même qu’à l’entretien pour les industries laitières.

4. Modifications biochimiques et microbiologiques thermo-induites

4.1 Destruction des micro-organismes

Le lait cru peut contenir un grand nombre de genres et d’espèces de bactéries différentes. La totalité des micro-organismes sous forme végétative est détruite par le traitement UHT. Cependant certaines bactéries (des genres Bacillus et Clostridium) peuvent sporuler, augmentant ainsi leur thermorésistance. Si la majorité des spores présentes dans le lait sont inactivées par le traitement UHT, certaines spores de Bacillus sporothermodurans peuvent résister au traitement UHT (Scheldeman et al., 2006). Quelques valeurs d’inactivation thermique de micro-organismes et de spores sont présentées dans le Tableau V.

Te m pé rat ur e (°

C)

Temps (s)

19 Tableau V. Temps de réduction décimale de quelques bactéries et spores dans

différents milieux (Walstra et al., 2006).

Micro-organisme ou spore Milieu de chauffage

Température (°C)

D*

(min)

Lactobacillus spp Lait entier 65 0,5 à 2

Lactococcus lactis ssp. lactis Sérum à pH 4,6 63 0,32

Listeria monocytogenes Lait entier 72 0,02 à 0,05

Salmonella spp Lait écrémé 63 0,06 à 0,1

Escherichia coli Lait écrémé 63 0,13

Pseudomonas fluorescens Tampon 60 3,2

Spore de Bacillus sporothermodurans Lait écrémé 121 2 à 3,5 Spore de Bacillus stearothermophilus Lait écrémé 121 2,5 à 4 Spore de Clostridium tyrobutyricum Lait entier 110 0,5

*

4.2 Modifications de la matière azotée du lait

4.2.1 Dénaturation des protéines sériques et complexations dans le lait

Il est considéré qu’un traitement thermique de quelques minutes, à une température supérieure à 90°C, dénature la majorité des protéines sériques. Plus le traitement est intense, plus la dénaturation est forte. Cette dénaturation correspond au changement de conformation des protéines avec la formation de nouvelles liaisons covalentes (de type SH / S-S) et non covalentes dites interactions hydrophobes (De la Fuente et al., 2002 ; Sawyer et al., 2002).

Deux études réalisées par Dannenberg & Kessler (1986) et Walstra et al. (2006) ont montré que 30 % de l’α-Lac et 60 % de la β-Lg étaient dénaturées par le traitement UHT. Ces 2 protéines peuvent interagir en formant des complexes α-Lac-β-Lg ou encore se fixer individuellement par ponts disulfures sur la caséine κ.

4.2.2 Modifications des caractéristiques micellaires 4.2.2.1. Modification de la taille

Une augmentation de la taille micellaire de 25 à 30 nm a été observée par Anema & Li (2003) pour un lait traité 30 min à 90°C. Cette augmentation est expliquée par la complexation des protéines sériques aux caséines à la surface de la micelle.

4.2.2.2 Modification de l’hydratation

Rüegg et al. (1979) ont montré, par la méthode des isothermes de sorption d’eau, que

l’hydratation micellaire pouvait être réduite de 1,04 % et 1,12 % après respectivement un

20 traitement UHT de 2,4 s à 150°C (procédé direct) et un traitement UHT de 15 s à 141°C (procédé indirect). Par l’intermédiaire d’une autre méthode d’évaluation de l’hydratation micellaire (mesure de l’extrait sec du culot d’ultracentrifugation à 90 000 g / 1 h), Fox (1981) il a été observée après un traitement à 140°C de 4 s une diminution de l’hydratation micellaire d’autant plus importante que le temps de chauffage était long.

4.2.2.3 Modification du potentiel zêta

De nombreuses réactions thermo-induites peuvent modifier le potentiel zêta des micelles. Par exemple, un traitement thermique intense (110°C et 150°C pendant 25 min) peut entraîner une dégradation du lactose et une légère acidification (Berg & Van Boekel, 1994) réduisant les charges négatives et diminuant ainsi le potentiel zêta des micelles. Cependant un effet contraire peut être observé, dû aux réactions de Maillard, qui consiste en une lactosylation des caséines (réaction entre le lactose et les fonctions amines des caséines).

Cette réaction neutralise les charges positives des groupements NH

entraînant ainsi une augmentation en valeur absolue du potentiel zêta (O’Connell & Fox, 1999). D’autres réactions faisant intervenir la caséine κ micellaire telles que sa complexation avec les protéines sériques dénaturées, pourraient entraîner une réduction de la valeur absolue de ce potentiel. Les diverses réactions citées sont donc capables de modifier positivement et négativement le potentiel zêta. Cependant, il a été démontré qu’avec des traitements thermiques de 50 min à 135°C (Darling & Dickson, 1979) ou de 25 min à 120°C (Anema &

Klostermeyer, 1997), aucune variation de ce potentiel n’était observée au niveau des micelles.

4.2.3 Inactivation des enzymes endogènes du lait

La majorité des enzymes endogènes du lait (phosphatase alcaline, phosphatase acide, catalase, lipoprotéine lipase, lactoperoxydase et xanthine oxydase) (Walstra et al., 2006) sont inactivées par une pasteurisation. Le traitement UHT étant plus intense que la pasteurisation, nous pouvons admettre par extrapolation qu’il permet aussi d’inactiver ces enzymes.

Cependant la plasmine (protéase alcaline du lait), et la cathepsine D (protéase acide issue des cellules somatiques présentes dans le lait) ne sont que partiellement inactivées (Walstra et al., 2006).

La plasmine appartient à un système appelé système plasminogène-plasmine. Il est

composé de 5 éléments : le plasminogène (zymogène inactif), les inhibiteurs des

plasminogène-activateurs, les activateurs du plasminogène, la plasmine et les inhibiteurs de la

21 plasmine, (Bastian & Rodney, 1996). Le système plasmine Ŕplasminogène est présenté Figure 7.

Figure 7. Le système plasmine-plasminogène dans le lait (Nielsen, 2002).

La plasmine (EC 3.4.21.7) est une protéase alcaline de 88 kDa, qui a la capacité d’hydrolyser les caséines β, α

et α

. L’activité de type « trypsique » de cette protéase à sérine est maximale à un pH et température de 7,5 et 37°C, respectivement (Humbert & Alais, 1979). L’α

-antiplasmine et l’α

-macroglobuline sont les 2 inhibiteurs majeurs de la plasmine (PI) (Politis, 1996). La β-Lg serait capable de s’associer à la plasmine par des ponts disulfure pendant le traitement thermique agissant ainsi comme un inhibiteur de l’enzyme (Crudden et al., 2005).

De nombreuses études ont été réalisées afin de déterminer les valeurs d’inactivation thermique des différents acteurs du système plasmine-plasminogène. Ces valeurs sont présentées dans le Tableau VI. On peut remarquer que, quel que soit le traitement thermique effectué, une activité résiduelle plasminique est toujours présente.

La cathepsine D fait partie des différentes protéases sécrétées par les cellules

somatiques (cathepsines B, L et G et l’élastase). Elle est secrétée sous forme de procathepsine

D (forme inactive). Ce précurseur de 45 kDa peut donner forme à la pseudocathepsine D de

43 kDa (par autolyse) ou à la cathepsine D de 39 kDa (hydrolysée par des protéases à

cystéine). Cette dernière peut aussi être hydrolysée et donner forme à 2 types de cathepsine D,

l’une à chaîne longue (31 kDa) et l’autre à chaîne courte (14 kDa).

22 Tableau VI. Inactivation thermique des différents éléments appartenant au système plasmine-plasminogène (Gaucher, 2007). Inhibiteur de la plasmine (PI), activateur du plasminogène (PA) et inhibiteur des activateurs du plasminogène (PAI)

Elément Valeurs d'inactivation thermique Références bibliographiques

Plasmine

Inhibition de la plasmine par préchauffage à

Newstead et al., 2006 90°C pendant 30 à 60 s suivies d'une stérilisation

UHT (140°C / 4 s

D*= 13 s à 140°C Saint Denis et al., 2001

D= 10 s à 140°C Alichanidis et al., 1986

Pas d'activité plasminique détéctée

Korycka-Dahl et al., 1983 dans les laits UHT commerciaux

D= 7,2 s à 142°C Driessen & Van der Waals, 1978

Plasminogène D= 11 s à 140°C Saint Denis et al., 2001

90 % d'inactivation par traitement UHT Korycka-Dahl et al., 1983 PI 36 % d'inhibition dans le lait après chauffage

Prado et al., 2006 74,5°C pendant 15 s

PA D = 16 s à 140°C Saint Denis et al., 2001

D = 32 s à 140°C Lu & Nielsen, 1993

PAI 80 % d'inactivation dans le lait après chauffage

Prado et al., 2006 à 74,5°C pendant 15 s

* D : Temps de réduction décimale = temps de chauffage nécessaire pour réduire d’un log la population bactérienne ou le nombre de spores

Peu de travaux ont été réalisés sur l’inactivation thermique du système enzymatique cathepsine. Cependant, il a été démontré qu’un chauffage à 72°C pendant 15 s inactive à plus de 90 % l’activité enzymatique (Hayes et al., 2001). Un traitement thermique de 10 min à 70°C inactive totalement la cathepsine D (O’Driscoll et al., 1999). Par ailleurs, après le chauffage d’un lait à 99°C pendant 60 s, une activité résiduelle d’environ 10 % provenant de la procathepsine D est encore détectée dans le lait (Larsen et al., 2000).

4.2.4 Inactivation des enzymes exogènes du lait

Le lait peut contenir de nombreux micro-organismes de genres différents. Ces micro-

organismes sont détruits par la stérilisation UHT, contrairement à certaines de leurs enzymes

qui résistent à ce traitement thermique intense. Une activité enzymatique résiduelle peut donc

être encore présente dans le lait après traitement UHT. La flore psychrotrophe serait la

principale cause. En effet, il a été démontré, sur 46 souches de bactéries psychrotrophes, que

leurs lipases et protéases pouvaient conserver respectivement en moyenne 31 et 35 % de leurs

activités après un traitement thermique de 5 s à 140°C (Griffiths et al., 1981). Les lipases des

genres Pseudomonas, Moraxella et Achromobacter avec des activités résiduelles comprises

23 entre 70 et 90 % après un traitement thermique de 5 s à 140°C sont considérées actuellement comme les plus thermorésistantes (Griffiths et al., 1981). Ces genres de bactéries sécrètent aussi des protéases qui sont connues comme étant aussi les plus thermorésistantes. Après un traitement thermique de 5 s à 140°C, leurs activités résiduelles sont comprises entre 40 et 60

% (Griffiths et al., 1981).

Actuellement ce sont les enzymes du genre Pseudomonas qui ont été les plus étudiées.

Quelques valeurs d’inactivation thermique de ces enzymes sont présentées dans le Tableau VII.

Tableau VII. Inactivation thermique de quelques protéases et lipases de Pseudomonas (Gaucher, 2007)

Enzyme Souches Inactivation thermique Référence bibliographique Protéase

P. fluorescens D = 124 s à 140°C Kroll & Klostermeyer, 1984 P. fluorescens D = 1,2 min à 140°C Vercet et al., 1997

P. fluorescens AR 11 D = 60 s à 140°C Alichanidis & Andrews, 1977

P. fluorescens MC 60 90 % d’activité résiduelle après

chauffage à 149°C pendant 4 s Adams et al., 1975

P. fluorescens B 52, 6, 189, B5, 53, B12, 51

% d’activité résiduelle après chauffage à 149°C pendant 30 s : 60, 60, 56, 56, 35, 27, 10 (respectivement)

Richardson & Te Whaiti, 1978

Lipase

P. tolaasii D = 79 s à 140°C Baral & Fox, 1997 P. fluorescens D = 500 s à 130°C Walstra et al., 2006

* D : Temps de réduction décimale = temps de chauffage nécessaire pour réduire d’un log la population bactérienne ou le nombre de spores

III. Déstabilisation du lait UHT

1. Description du phénomène

Généralement, le phénomène de gravité entraîne une sédimentation « naturelle » et

inévitable des particules colloïdales du lait UHT. Une étude réalisée par Dalgleish (1992) a

permis de déterminer les vitesses de sédimentation des micelles natives. Les vitesses de

sédimentation des petites micelles de diamètres 100 nm et des grosses micelles de diamètres

400 nm sont respectivement de 0,05 et 0,13 cm / semaine. Ce phénomène de sédimentation

24 peut donc être considéré comme un phénomène lent car le dépôt n’est visible qu’après 3 mois de stockage.

La déstabilisation du lait UHT se traduit par la formation de gel ou encore par l’apparition de sédiments. Dans la littérature, la distinction d’un gel par rapport à un sédiment n’est pas clairement définie. Selon Kocak & Zadow (1985) la formation du gel, dont l’apparence est semblable à un caillé, est liée à une augmentation de la viscosité apparente d’environ 10 mPa.s. Le sédiment peut être apparenté à un léger dépôt plus ou moins compact.

D’après Dalgleish (1992), le dépôt de matières sous forme de sédiments dans le fond de l’emballage évoluerait sous forme d’une gélification due à l’interaction des caséines entre elles (forte concentration dans le dépôt). De Koning et al. (1985) et Venkatachalam et al.

(1993) ont montré que certains laits UHT déstabilisés pouvaient redevenir des laits liquides homogènes après agitation. Cette réversibilité du phénomène ne serait pas toujours possible.

Cette sédimentation provient de la déstabilisation des micelles de caséines. Les modifications au niveau de la concentration, de la voluminosité, de la densité et des propriétés de surfaces des micelles de caséines entraînent une sédimentation le plus souvent irréversible (Dalgleish, 1992 ; Rattray et al., 1997). Le dépôt est formé d’un réseau protéique qui, par des modifications au niveau des interactions inter- et intra-moléculaires mais aussi au niveau de la rétention d’eau, peut être apparenté à un gel. Plus le lait est concentré, plus les interactions sont grandes car la probabilité de rencontre des particules devient plus importante (Datta &

Deeth, 2001). Le changement de conformation des micelles de caséines et les diverses réactions physico-chimiques liées à ce changement seraient, selon Manji & Kakuda (1988), la base du mécanisme de déstabilisation. Cependant les causes de ces modifications anormales des micelles de caséines ne sont pas clairement élucidées à ce jour.

2. Les principales causes de déstabilisation

Parmi les causes impliquées dans cette déstabilisation, la qualité du lait cru mis en

œuvre, les traitements technologiques et les conditions de stockage après traitement thermique

sont importants à considérer. De façon schématique, 2 grandes causes peuvent induire la

déstabilisation du lait UHT au cours du stockage : les causes enzymatiques et les causes

physico-chimiques (Figure 8).

25 Figure 8. Causes enzymatiques et physico-chimiques pouvant induire la déstabilisation du lait UHT au cours de son stockage (Gaucher, 2007)

La recherche des causes de ces déstabilisations a fait l’objet de nombreux travaux depuis des décennies et il est évident qu’elles sont multifactorielles. La cause enzymatique a été la plus étudiée. Récemment, 2 études réalisées par Gaucher et al. (2009, 2011) ont déterminé (sur des laits modèles préalablement épurés microbiologiquement par microfiltration) que les protéases des cellules somatiques et la plasmine commerciale (ajoutée) n’avaient pas d’effet sur le phénomène de déstabilisation alors que la protéase d’une bactérie psychrotrophe, P. fluorescens CNRZ 798, avait un effet marqué sur la déstabilisation.

Cette déstabilisation se traduisait par une apparition de sédiment gélifié dans le lait UHT au cours des 3 mois de stockage à température ambiante. Excepté les laits de mauvaise qualité microbiologique due à des conditions d’hygiène ou à des contaminations, une partie des causes enzymatiques est donc principalement à mettre en relation avec une croissance anormale de bactéries psychrotrophes dans le lait cru. C’est pourquoi après avoir brièvement présenté les différents micro-organismes contaminant du lait, nous nous intéresserons aux protéases des bactéries psychrotrophes et plus particulièrement aux protéases appartenant au genre Pseudomonas, car leur présence semble être une des causes majeures de déstabilisation du lait UHT.

3. Les micro-organismes : principaux contaminants du lait

Le lait issu de la mamelle d’une vache saine contient un taux de bactéries normalement inférieur à 10

UFC (Unité Formant Colonie) / mL (Kurweil & Busse, 1973).

Cependant de nombreuses contaminations par les bactéries peuvent avoir lieu lors de la traite.

Ces contaminants issus le plus souvent du fumier, des fèces, du sol et de l’eau peuvent se