Effet du stress osmotique sur la croissance racinaire du peuplier : approche par génomique fonctionnelle à l'échelle de la zone de croissance

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Effet du stress osmotique sur la croissance racinaire du peuplier : approche par génomique fonctionnelle à

l’échelle de la zone de croissance

Marie-Béatrice Bogeat-Triboulot, Aude Hummel, Sébastien Duplessis, Annegret Kohler

To cite this version:

Marie-Béatrice Bogeat-Triboulot, Aude Hummel, Sébastien Duplessis, Annegret Kohler. Effet du stress osmotique sur la croissance racinaire du peuplier : approche par génomique fonctionnelle à l’échelle de la zone de croissance. IFR 110, Nov 2006, Nancy, France. 17 p. �hal-02812516�

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Effet du stress osmotique sur la croissance racinaire du peuplier :

approche par génomique fonctionnelle à l’échelle de la zone de croissance

Marie-Béatrice Bogeat-Triboulot, Aude Hummel Sébastien Duplessis, Annegret Kohler

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Introduction

Tolérance à la sécheresse :

¾ maintenir son statut hydrique (potentiel hydrique) de façon à :

maintenir de la croissance

éviter de passer en dessous d’un potentiel critique (cavitation)

survivre

ª Maintenir un ratio gains/pertes d’eau le moins défavorable (absorption/évaporation)

limiter les pertes par la fermeture stomatique

maximiser l’absorption par

– maintien du potentiel d’absorption

ª maintien/augmentation du volume de sol exploité par les

racines : maintien de la croissance racinaire (au moins tant que le déficit hydrique n’est pas trop fort)

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Introduction

¾ L’élongation racinaire

dans l’apex

= divisions + élongation cellulaire

CL d’apex de racine : zone d’élongation

¾ Etude cinématique :

taille de zone de croissance

Vitesse de croissance locale (VCL):

diffère le long de cette zone de croissance

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extensibilité des parois

Pression du suc vacuolaire sur

les parois

Introduction

¾ modèle biophysique de l’élongation cellulaire : 3 paramètres

moteur : pression de turgescence

contrôle : extensibilité des parois & conductance hydraulique membranaire

eau

paroi cellulaire

tonoplaste

plasmalemme P_i

Π

_i

Ψ

_o ^Lp

métabolisme du C, transport…

expansines, XET, … aquaporines

¾ effets du déficit hydrique sur ces paramètres via une régulation génique ?

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Questions

¾ Quel est l’impact de différents niveaux de stress osmotique sur croissance racinaire de peuplier?

¾ Est-il possible de faire des analyses de l’expression du génome à une échelle infra zone de croissance?

¾ Quels sont les gènes dont l’expression est affectée par le stress osmotique ?

identification de régulons

sélection de gènes d’intérêt

différence d’expression selon la position dans la zone de croissance

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Matériel et méthodes

¾ Populus deltoïdes x nigra cv Lambro

¾ culture hydroponique

¾ bouture de 3 semaines

¾ racines âgées de 5-15 jours

¾ stress osmotique à base de PEG 3350, 2 niveaux:

120 g/l : ~ -2.5 bar

200 g/l : ~ -6.5 bar

¾ mesure quotidienne de la longueur des racines avec un réglet

¾ récolte d’échantillons pour analyse de VCL, qPCR et réseaux d’ADNc

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Vitesse de croissance de la racine

) 120g/l PEG : chute puis récupération complète après 4 jours

) 200g/l PEG : chute plus forte et récupération très partielle

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Temps (jour)

Vitesse de croissance (cm/j)

stress 120 stress 200

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Profil de vitesse de croissance relative

Distance au centre quiescent (mm)

0 2 4 6 8 10 12 14

Vitesse de croissance locale (h-1)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Témoin 1 Témoin 2 S120-1 S120-2

0 2 4 6 8 10 12 14

-

^{S 200}

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Démarche

OBJECTIF : analyse du transcriptome (via réseaux d’ADNc) sur des petits échantillons (d’1 mg à un contenu cellulaire (!))

¾ tester l’extraction et dosage des ARN sur des mini-échantillons

qPCR sur 5 gènes choisis (fortement exprimés dans la racine principale et régulés pendant le développement racinaire; Kohler et Martin, non publié)

Specific Tissue Protein Aquaporine TIP

Acide Phosphatase Major Latex-Like Protein Protéine BURP

établir le niveau d’expression dans un échantillon de taille ‘classique’

apex entier : 20 mm long x 3 = 90 mg MF

tester l’extraction ARN sur mini-échantillons et mesurer le niveau d’expression dans ces ‘mini’ échantillons

1/2 cylindre de 1 mm diamètre, 2 mm long : 1 à 2mg MF

comparer expression de ces 5 gènes sur ces 2 types d’échantillons

si OK:

¾ extraire ARN de mini-échantillons, amplification et analyse de l’expression des gènes sur réseaux d’ADNc.

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Récolte d’échantillons dit ‘macro’

VLC

0 8 20

apex de racine

1 échantillon ‘macro’ = 3 apex de 20 mm de long 3x 25-30 mg = 70-90 mg MF

Extraction

100 à 1000 ng d’ARN / mg MF

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Apex de racine

Récolte d’échantillons dit ‘mini’

Profil de longueur de cellules

VLC

d(apex)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Extraction des ARN

qPCR

Amplification Puces à ADN+

½ cylindre 2mm long 1-2 mg MF 20 à 600 ng d’ARN/mg de MF

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Expression dans l’apex entier (qPCR)

) stimulation de l’expression pour Spé , TIP et Burp P

) stress 120-6h, 200-6h et 200-4j : croissance fortement réduite ET forte accumulation des transcrits de Spé, TIP et Burp

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Temps (jour)

Echantillons "macro" (apex entier)

Specific T P TIP Latex m-l P Acid Phos. BurpP

Niveau de régulation

0 10 20 30 40 50

120-6h 120-4j 200 -6h 200-4j

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Comparaison apex entier- zone 2-4 mm

-20 -10 0 10 20 30 20040 400 600 800

120-4j

120-4j 2-4mm 200-4j

200-4j 2-4mm

Expression dans l’apex entier / dans les 2mm apicaux

) corrélation ‘macro’-’mini’ non nécessaire

) mini-échantillons : problèmes fréquents avec ligne de base

) quantité d’ARN? limite de détection?

) tests préliminaires OK

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Analyse sur réseau d’ADNc

¾ zone 2-4 mm d’un apex racinaire : 1-2 mg de MF

¾ Extraction : Picopure

¾ Amplification : Riboamp (1 ou 2 cycles selon la quantité initiale)

¾ Réseau de 15k : 7500 EST dupliquées de racines, feuilles et bois de 2 génoptypes de peuplier (P. trichocarpa x deltoides et P. tremula x tremuloides) correspondant à ~4600 gènes modèles de P. trichocarpa (Tuskan et al, 2006)

1 répétition de S120 - 6h

2 répétitions de S120 - 4j versus 1 pool

2 répétitions de S200 - 4j de 6 témoins

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0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Temps (jour)

Expression génique : qPCR / réseau d’ADNc

) ça marche !

) les 5 gènes : qualitativement identique, quantitativement différent

Comparaison RT qPCR - réseau ADNc

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 200 400 600 800

120-6h-réseau 120-4j-qPCR 120-4j-réseau 200-4j-qPCR 200-4j-réseau

(17)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Temps (jour)

) aquaporine PIP : réponse qualitativement proche de celle de TIP

) autres gènes fortement régulés : souvent impliqués dans la réponse aux stress biotiques ou abiotiques

• stress osmotique : osmotine

Exemple de gènes fortement régulés

Gènes fortement régulés

PIP GST CCoA MT ARP1 extensin-l P osmotin peroxidase

-10 -5 0 5 10 15 20 25 60 70 80

120-6h 120-4j 200-4j

NA

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Conclusions et perspectives

) _ç

a marche !

Extraction

Amplification

Expression par qPCR et réseaux d’ADNc

réseaux d’ADNc : résultats récents : analyse plus complète à venir …

Futur:

¾ analyse de l’expression génique dans d’autres zones

fin de la zone de croissance (6-8 mm)

zone mature

¾ plus de répétitions

¾ diminuer encore la taille des échantillons : microdissection laser