- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Gourlet, P. (1995). Contribution à l'étude moléculaire et pharmacologique des récepteurs du VIP, de l'hélodermine et des PACAP (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212478/1/64d588b3-7529-4acb-af7d-7321adfa8cff.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.be).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.be).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
Année académique 1994 -1995
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECIN E
CONTRIBUTION A L’ETUDE MOLECULAIRE ET PHARMACOLOGIQUE DES RECEPTEURS DU VÎP, DE L’HELODERMINE ET DES PACAP
WBUOTHfOîîi* ■
^ 555-6 i-70
Année académique 1994 -1995
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE
CONTRIBUTION A L’ETUDE MOLECULAIRE ET PHARMACOLOGIQUE DES RECEPTEURS DU VIP, DE L’HELODERMINE ET DES PACAP
PROMOTEURS: Professeurs P. Robberecht A. Vandermeers Faculté de Médecine
Laboratoire de chimie biologique et de la nutrition
Thèse présentée en vue de
l’obtention du grade de Docteur en Biologie Médicale Appliquée
COURLET PHUIPPE
REMERCIEMENTS
Les dernières lignes que vous rédigez lors de votre thèse sont en général celles des remerciements, c'est aussi l'heure de faire le bilan sur plusieurs années d'étude, de recherche et de travail.
Ces nombreuses années ont été pour moi l'occasion de découvrir un monde fascinant, celui de la biochimie et des peptides.
C'est grâce à toute équipe que j'ai pu découvrir les méandres de la chimie, les aléas de la recherche scientifique.
Je voudrais vous témoigner ma gratitude.
J'espère n'oublier personne et je tiens avant tout à m'excuser auprès des amis que j'aurais omis de mentionner.
Mes sentiments les plus sincères vont aux Professeurs Patrick Robberecht et André Vandermeers. Vous avez à la fois été pour moi mes chefs et maîtres. C'est grâce à vous Docteur Robberecht que j'ai pu acquérir un esprit de critique et même d'autocritique, un esprit d'analyse dans le domaine scientifique. Vous m'avez aidé à comprendre le monde de la pharmacologie et des récepteurs. C'est vous qui m'avez initié au domaine de la biochimie. Merci pour ces nombreuses heures de discussion et de réflexion que vous m'avez fait partager.
Docteur Vandermeers, j'ai eu la grande chance de pouvoir travailler sous vos ordres. C'est vous qui m'avez donné mon expérience de la chimie des peptides. Nous avons eu la joie de mettre en route le séquenceur de peptides et le synthétiseur de peptides au sein du laboratoire. Ce sont des expériences que je ne saurais oublier. C'est vous qui m'avez communiqué cet enthousiasme pour la chimie et la recherche peptidique. Je vous en sais gré.
Docteur Vandermeers-Piret, vous m'avez fait connaître les techniques de
laboratoire. Votre minutie et votre patience bien connue au sein de notre laboratoire a été
pour moi d'un grand recours. Je ne sais plus compter le nombre d'heure que vous avez
passé à déchiffrer les dizaines de séquences que je vous remettais, les heures passées à
réaliser des organigrammes sur les étapes de purification. Si cette thèse comporte si peu de
fautes, c'est également grâce à vous. Je vous remercie pour tout.
Je ne puis me permettre d'oublier le Docteur Magali Waelbroeck. Vous avez été pour moi durant toutes ces années "ma référence mathématique". Vous avez passé plusieurs heures à me faire comprendre ce qu'était un récepteur d'épargne, à essayer de me faire comprendre toutes les finesses des courbes de compétition. Merci vivement.
Quant à vous Docteur Michal Svoboda, personne ne peut vous remplacer. Vous êtes le seul à toujours trouver une solution, même aux problèmes les plus ardus. Que ce soit un problème de chimie organique ou de chimie physique vous avez toujours su me donner une réponse.
Je remercie le Professeur Jacques Winand de son soutien amical pendant cette thèse et de son aide précieuse pour toutes les questions administratives que ce soit pour cette thèse ou pour les différents contrats dont j'ai pu bénéficier au sein du laboratoire.
Je dois d'accorder une mention spéciale à Monsieur Philippe De Neef, qui fut pour moi une source intarissable de conseils et d'astuces dans les manipulations de laboratoire.
Je dois également remercier tout particulièrement Monsieur Jean Rathé avec qui j'ai eu l'hoimeur de collaborer directement pendant plusieurs aimées. Vous avez été à maintes reprises, la troisième et même la quatrième main qui me manquait lorsque le travail me submergeait.
Je sais gré auprès de certaines personnes qui ne sont plus dans notre laboratoire mais qui à plusieurs reprises m'ont aidé dans la réalisation de certaines expériences et qui m'ont soutenu moralement. Il s'agit de Mesdames Annick Cauvin et Catherine Damien et de Messieurs Denis Gossen et Yassir Bounjoua.
Je tenais à séparer de ces remerciements une personne qui malheureusement n'est plus parmi nous mais qui a été pour moi tant un ami qu'une aide précieuse au laboratoire.
Monsieur Jean-Claude Camus.
Je voudrais également témoigner de ma reconnaissance envers les autres membres
du laboratoire qui m'ont soutenu pendant ces années et avec qui j'ai eu le plaisir d'avoir de
nombreuses discussions enrichissantes. Il s'agit de Mesdames ou Messieurs, Christine
Delporte, Véronique Libbrecht, Pascale Vertongen, Marie-Claire Woussen-Colle, Michèle
Tastenoy, Ngoc Diem Bui, Monique Lambert, Piotr Poloczek et Johny Cnudde.
Merci encore à Monsieur Vincent Strade qui m'a aidé à réaliser la présentation par ordinateur des articles et Madame Nora De Gendt-Peuchot ainsi que Monsieur Michel Stievenart qui ont dactylographié ces différents articles.
Je ne saurais également oublier le Professeur Jean Christophe qui a dirigé le laboratoire au début de ma thèse et qui a été le premier à m'accueillir au sein de son groupe.
Enfin, je tiens à remercier toutes celles et tous ceux qui d'une façon ou d'une autre
m'ont fait part de leur précieuse expérience ou de leur soutien amical, ainsi que messieurs
les membres du jury qui ont bien voulu juger de ce travail.
Table des matières i
A. Liste des abréviations ... 1
B. Chapitre I: Objectifs ... 3
C. Chapitre II: Introduction...7
n.l.LeVIP 9 IL 1.1. Découverte-Localisation... 9
II. 1.2. Effets biologiques du VIP... 13
II.2. L'hélodermine ...15
11.2.1. Découverte... 15
n.2.2. Effets biologiques de l'hélodermine...18
11.2.3. L'hélodermine de mammifère...18
n.3. Le PACAP ...20
n.4. Les séquences VIP, Hd, Hs et PACAP... 22
n.5. Les récepteurs du VIP... 24
11.5.1. Localisation...24
IL5.2. Les masses moléculaires des récepteurs du VLP... 24
11.5.3. Le clonage des récepteurs du VIP... 25
D. Chapitre III; Matériel et Méthodes...29
III. 1. Matériel 31 ni. 1.1. Appareillages... 31
LU. 1.1 .a. Synthèse peptidique... 31
LU. 1.1 .b. Séquence des peptides... 31
III. 1.1 .c. Système HPLC... 31
ni. 1.2. Produits...32
ni. 1.2.a. Généraux...32
in. 1.2.b. Relatifs à IUPLC...32
ni. 1.2.C. Relatifs à la culture cellulaire...32
in. 1.2.d. Relatifs à la séquence des peptides...32
ni. 1.2.e. Relatifs à la synthèse peptidique... 32
m. 1.2.f Relatifs aux études de pontage covalent et de déglycosylation du récepteur de l'hélodermine...33
ni. 1.2.g. Les peptides... 33
IIL2. Méthodes ...34
in.2.1. Méthodes courantes...34
Table des matières ii
ni.2.1. Méthodes courantes... 34
in.2.2. La synthèse peptidique... 35
in.2.3. La séquence d'un peptide...39
E. Chapitre IV: Résultats ... 42
IV. 1. Partie; Le récepteur de l'hélodermine... 44
IV. 1.1. La découverte du récepteur de l'hélodermine... 44
rv.1.2. Caractérisation moléculaire du récepteur de l'hélodermine... 58
IV. 1.2.a. Introduction... 58
IV. 1.2.b. Résultats...59
IV. 1.3. Caractérisation pharmacologique du récepteur de l'hélodermine... 80
IV. 1.3.1. Effets biologiques des analogues du VIP/PHI /sécrétine/GRF sur le récepteur de l'hélodermine... 80
IV. 1.3.2. Approche du récepteur de l'hélodermine avec les analogues du PACAP... 92
IV. 1.3.2.a. Synthèse des analogues - un exemple : le [Gly21]PAGAP-27*...^2
IV.I.3.2.b. Résultats... 98
IV. 1.4. Conclusions de la première partie... 110
IV.2. 2®^^ Partie: Les récepteurs des PACAP... 112
IV.2.1. La découverte du récepteur des PACAP sur AR 4-2J et sa caractérisation moléculaire... 112
IV.2.2. Mise en évidence de récepteurs des PACAP dans d'autres cellules et d'autres tissus... 119
IV.2.3. Caractérisation pharmacologique des différents récepteurs des PACAP...149
IV.2.4. Conclusions de la deuxième partie... 185
F. Chapitre V: Conclusions générales... 189
G. Bibliographie 200
Liste des abréviations 1
iLiSte des abréVIàti6ns
. AA Ac-His ADNc AMPc ARNm Boc Bsocoes ATZ CCK DCCI DCU DMA DMF DMPTU DPTU DPU EGTA Fmoc FPLC GIP
Gpp(NH)p GRF GRP GTP Hd HPLC Hs HOBT Kact
Kd Ki LH
Acide aminé Acétyl-histidine
Acide désoxyribonucléique complémentaire Adénosine monophosphate cyclique
Acide ribonucléique messager tertio Butyloxycarbonyl-
Bis [2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl] sulfone Anilinothiazolinone
Cholécystokinine
Dicyclohexylcarbodiimide Dicyclohexylurée
Diméthylamine Diméthylformamide Diméthylphénylthiourée Diphénylthiourée Diphénylurée
Ethylene glycol bis (P-aminoethyl ether)-N-N'-tetraacetic acid 9-fluorenylmethoxycarbonyl-
Fast pressure liquid chromatography Glucose-dependent-insulinotropic peptide Guanylyl-imidodiphosphate
Growth hormone releasing peptide Gastrin releasing peptide
Guanosine triphosphate Hélodermine
High performance liquid chromatography Hélospectine
1 -Hydroxybenzotriazole
Concentration de peptide requise pour observer une réponse équivalente à 50% de l'effet maximum du peptide.
Concentration de peptide requise pour occuper 50% de récepteurs.
Constante d'inhibition
Hormone lutéotrope
Liste des abréviations 2
• NMP
• NPY
• PACAP
• PAGE
• PHI
• PHM
• PITC
• Pmc
• PTC
• PTU
• PTH
• SDS
• Sn
• tBu
• TFA
• TFMSA
• TMA
• Tmob
• Trt
• VIP
N-Méthylpyrrolidone Neuropeptide Y
Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide Polyacrylamide gel electrophoresis
Peptide histidine isoleucine amide Peptide histidine méthionine amide Phénylisothiocyanate
2, 2 , 5, 7, 8 - Pentamethylchroman - 6 - sulphonyl- Phénylthiocarbamate
Phénylthiourée Phénylthiohydantoïne Sodium dodecylsulfate Sécrétine
tertio Butyl-
Acide trifluoroacétique
Acide trifluorométhanesulfonique Triméthylamine
2,4, 6 - Trimethoxybenzyl- Trityl-
Vasoactive intestinal peptide
Notation des acides aminés:
A Ala Alanine L Leu Leucine
C Cys Cystéine M Met Méthionine
D Asp Acide aspartique N Asn Asparagine
E Glu Acide glutamique P Pro Proline
F Phe Phénylalanine Q Gin Glutamine
G Gly Glycine R Arg Arginine
H His Histidine S Ser Sérine
I Ile Isoleucine V Val Valine
K Lys Lysine T Thr Thréonine
Y Tyr Tyrosine W Trp Tryptophane
Chapitre I
OBJECTIFS
Objectifs 4
Au moment où nous avons commencé notre travail de thèse on avait caractérisé par des études de liaison de ligands et des études fonctionnelles les récepteurs du VIP, de la Sn, du GRF, du glucagon et de peptides apparentés.
La sélectivité de ces récepteurs n'est pas absolue: en effet, le VIP peut se lier au récepteur de la Sn, la Sn peut se lier au récepteur du VIP. LUd, un peptide apparenté au VIP peut se lier avec une affinité comparable aux récepteurs du VIP et de la Sn. Le GRF peut aussi agir sur les récepteurs du VIP, mais pas le contraire. Aujourd'hui, on ne connaît pas pour le PHI de récepteurs spécifiques, celui-ci agissant via les récepteurs du VIP.
On suspectait également une hétérogénéité des récepteurs du VIP entre les espèces.
Les récepteurs du VIP de cobaye discriminent mieux le VIP, le PHI et la Sn que ceux du rat par exemple. On soupçonnait aussi une hétérogénéité entre récepteurs du VIP de différents tissus au sein d'une même espèce et l'existence de plusieurs états d'un même récepteur: les récepteurs à haute et basse affinité ( 1 ).
Pour déterminer si la diversité des récepteurs du VTP a un retentissement fonctionnel, et pour comprendre l'origine de l'hétérogénéité des récepteurs, de nombreuses études ont été menées. Des études pharmacologiques au moyen d'analogues synthétiques ont été réalisées et ont permis de faire une première classification des récepteurs du VIP, des études biochimiques ont tenté d'apprécier cette hétérogénéité sur le plan structurel (voir introduction sur les récepteurs du VIP).
Aujourd'hui, le clonage de plusieurs récepteurs de la famille VTP a apporté des précisions et imposé des révisions dans la classification de ces récepteurs (voir introduction sur les récepteurs du VIP).
Lors de la découverte de la séquence de l'Hd et la preuve de son analogie avec les séquences du VIP et du PHI, nous avons abordé 2 problèmes:
- 1) L'Hd est-elle le prototype d'une nouvelle classe d'hormone que l'on peut retrouver également chez les mammifères?
- 2) L'Hd reconnaît-elle un récepteur sélectif?
Le premier volet a fait l'objet de nombreuses recherches ainsi que d'une thèse de
doctorat dans notre laboratoire (voir introduction sur l'Hd); nous nous sommes consacrés
lors de ces travaux à étudier les récepteurs de l'Hd aboutissant à la définition d'une
nouvelle classe de récepteurs du VIP que nous avons appelé "le récepteur du VIP préférant
l'hélodermine" et dont le clonage moléculaire vient d'être réalisé.
Objectifs 5
Cinq ans plus tard le même problème s'est posé pour le PACAP, nouveau peptide de la famille VIP découvert par Miyata. On ne savait pas si ce peptide agissait par interaction avec des récepteurs du VIP ou avec un récepteur propre ou bien encore par le récepteur préférant l'Hd. Nos travaux ont montré qu'il existe un récepteur très sélectif pour le PACAP et qu'en plus le PACAP se lie avec une haute affinité sur tous les récepteurs du VIP.
Nous avons traité de trois aspects distincts:
-La recherche de nouveaux récepteurs -L'étude pharmacologique de ces derniers -Leur étude moléculaire
Les études pharmacologiques ont consisté en:
• r étude de ces récepteurs au moyen d'analogues peptidiques
• la recherche de super agonistes
• la recherche d'antagonistes
• l'étude des mécanismes de reconnaissance du récepteur, l'étude de la relation structure-activité grâce à la synthèse d'analogues modifiés de façon ponctuelle au niveau de la structure primaire, l'étude de la structure minimale pour la reconnaissance du récepteur et celle nécessaire pour l'effet biologique.
Les études moléculaires ont consisté en:
• l'étude par pontage covalent du poids moléculaire apparent de ces récepteurs
• l'étude, grâce à des inhibiteurs de la synthèse glucidique, de la contribution
de la copule glucidique à la masse du récepteur et à son activité biologique.
Objectifs 6
Nous avons utilisé des modèles expérimentaux simples et couramment utilisés dans notre laboratoire: l'étude de la liaison peptide-récepteur se fait sur préparation membranaire et l'activité biologique consiste en la mesure de la stimulation de l'adénylate cyclase.
• Le chapitre II présente le VIP, l'hélodermine et le P AC AP. Cette introduction reprend ce que l'on connaît de leur structure, leur localisation, leurs activités physiologiques.
Elle est suivie par une description des principales connaissances sur les récepteurs du VIP avant le début de ce travail.
• Le chapitre suivant concerne le matériel et les méthodes: n'y sont reprises que les méthodologies nécessaires à l'ensemble des recherches. Les expériences nécessitant des techniques particulières seront décrites dans les chapitres y correspondants.
• Le chapitre IV reprend les résultats.
Le dernier chapitre est consacré à une conclusion.
INTRODUCTION
Introduction 8
Table des m atières
II.l. Le VIP IL 2. L'hélodermine n.3. Le PACAP
n.4. Les séquences VIP, Hd, Hs et PACAP
n.5. Les récepteurs du VIP
Introduction - Le VIP 9
11.1. Le VIP
n.1.1. Découverte - Localisation
Le peptide vasoactif intestinal (VIP) fut isolé et purifié par Said et Mutt en 1970 à partir d'extraits duodénaux de porc (2). C'est un peptide de 28 acides aminés avec un résidu C-terminal asparagine amide (3) (voir séquence tableau I).
La séquence en acides aminés est particulièrement bien conservée d'une espèce animale à l'autre. Ainsi les VIP de boeuf, de chien, de porc, de rat, de lapin, de mouton et le VIP humain ont tous la même séquence (4-8) (tableau I).
En 1985, l'équipe de Nishizawa a publié la séquence complète en nucléotides de l'ARNjn du VIP de rat. Cette séquence est en accord avec celle trouvée par purification et microséquençage du peptide. Dans le même travail il est montré également que le précurseur contient aussi la séquence du PHI, un autre pieptide de 27 acides aminés de la famille du VIP cosécrété avec le VIP (9) et purifié à partir d'intestin de porc par l'équipe de Tatemoto en 1981 (10).
Ultérieurement Yamagami et ses collaborateurs publièrent la séquence en nucléotides du
gène du VIP humain ( 11 ). Celle-ci confirmait les travaux de Carlquist en 1982 sur la
séquence du peptide. Ce groupe démontrait que comme dans le cas du rat le gène du VIP
humain contient également la séquence de l'équivalent humain du PHI: le PHM (Peptide
histidine méthionine amide). (Séquences PHI et PHM: Tableau I).
Introduction - Le VIP 10
Représentation schématique du sène de l'ARNm codant pour le VIP et les peptides apparentés: ( 12 )
exon 1 exon 2 exon 3 exon 4 exon 5 exon 6 exon 7 I Kb
gene
ARNm
prépro-VIP
r kr kr krI I I I
VIP processé
\y7///A s
peptide signal
prépro-VIP 22-79
PHM 111-122
PHV
10 AA
CIZI
VIP 156-170
- Quoique chez la plupart des mammifères la séquence du VIP soit très conservée
(Tableau I) le VIP de cobaye présente des différences (13). De même, les VIP d'oiseau et
de poissons ont également des séquences primaires différentes (Tableau I) (14 et 15).
Tableau I
Espèces Peptides 1 10 15 20 25 28
b/do/h/p/r/rab/m VIP H-S-D-A-V-F-T-D-N-Y-T-R-L-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-N-S-I- L-N-
gP VIP M V
VIP S F V T-
rous VIP S I I L A--
PHI H-A-D-G-V-F- T-S-D-Y-S-R-L-L-G-Q-L- S-A-K-K-Y- L-E-S-L-I-
PHI Y
PHM H-A-D-G-V-F-T-S-D-F- S-K-L-L-G-Q-L-S-A-K-K-Y- L-E-S-L-M -'
Espèces: b: boeuf; do: chien; h: homme; p: porc; r: rat; rab: lapin; m: mouton; rous: roussette; c: poulet; gp: cobaye
Introduction - Le VIP 12
En 1988, l'équipe de Viktor Mutt (16) purifia à partir d'intestin de porc une forme allongée du VIP non amidée qui reconnaît également des récepteurs du VIP et qui reproduit les effets biologiques du VIP. Cette forme présente une extrémité C-terminale allongée par les acides aminés Gly-Lys-Arg. Il s'agit d'une forme incomplètement clivée qui pourrait coexister avec le VIP, en tout cas dans le tractus intestinal de porc.
La séquence du VIP étant connue, des anticorps contre le VIP et des fragments de VIP ont été produits et des études de localisation tissulaire, cellulaire et subcellulaire ont pu ainsi être réalisées.
Assimilé à une hormone digestive lors de sa découverte, le VIP est plutôt considéré aujourd'hui comme un neurotransmetteur ou un neuromodulateur agissant au niveau du système nerveux central et du système nerveux végétatif (17). La première démonstration histochimique d'une immunoréactivité VIP dans les neurones date de 1976 et a été réalisée par l'équipe de Buyant (18) et par l'équipe de Larsson (19). En 1979, S.I. Said propose également le VIP comme neurotransmetteur (20).
La littérature concernant la localisation cellulaire du VIP est abondante et donne une topographie très précise de sa distribution dans différentes espèces animales ( 21 , 22 ).
Si les observations initiales ont été faites sur le système nerveux central, par la suite des fibres nerveuses vipergiques ainsi que des cellules contenant du matériel VIP- immunoréactif ont été montrées dans la plupart des tissus et organes périphériques.
Le système cardio-vasculaire (vaisseaux, coeur), le système respiratoire (poumons, bronches), le tractus gastro-intestinal (tube digestif, sphincters), les muscles lisses et sphincters du tractus génito-urinaire sont parcourus par des fibres nerveuses contenant du VIP. Les glandes endocrines (adénohypophyse, thyroïde, ilôts pancréatiques) ainsi que les glandes exocrines (glandes salivaires, pancréas, parotides, ...) sont également très richement innervées.
Plusieurs auteurs ont montré la présence dans les fibres nerveuses vipergiques d'autres neurotransmetteurs et neuropeptides qui sont cosécrétés avec le VIP. L'exemple le plus souvent cité est celui du PHI, ce qui n'est pas étonnant puisque le VIP et le PHI ont le même précurseur (23,24).
D'autres neurotransmetteurs (CCK, enképhaline, GRP, NPY) n'ayant pas de relation avec
le précurseur du VIP peuvent également être associés au VIP (25).
Introduction - Le VIP 13
Ces études montrent que le VIP est un neurotransmetteur largement répandu à travers les espèces animales, qu'on le retrouve à tous les niveaux d'organisation des systèmes biologiques de l'être vivant. Le VTP est responsable de nombreux effets biologiques et physiologiques.
n.1.2. Effets biologiques du VIP
Le VIP possède un large spectre d'activité (26). Parmi ses principaux effets retenons une relaxation des muscles lisses qui se traduit sur le système cardio-vasculaire par des effets vasodilatateurs, sur le système respiratoire par une relaxation trachéale et bronchique. Sur le tractus digestif on note principalement des relaxations au niveau des sphincters (relaxation des muscles circulaires), et une relaxation des muscles intestinaux (modifications de la motilité intestinale).
La relaxation des muscles lisses se manifeste sur le tractus génito-urinaire (27). Le VIP joue également sur ce système un rôle dans l'excitation mâle et femelle.
Le VIP exerce une action sur les sécrétions exocrines. On observe une augmentation des sécrétions salivaires, biliaires et pancréatiques. On remarque au niveau du pancréas une augmentation de l'AMP^, une libération d'amylase (dans certaines espèces animales), ainsi qu'une augmentation des sécrétions alcalines.
Le VIP module le transport de certains ions. Il agit sur le transport d'ions CP dans l'estomac (28); dans les cellules HT-29 il active le transport de K"*" et le cotransport de Na+-K'^-Cl* (29), tandis qu'il stimule la sécrétion alcaline (HC 03 )" dans la vessie de tortue (30).
Le système endocrinien est également affecté par le VIP. Par exemple dans le cas du pancréas endocrine, le VIP stimule la sécrétion de l'insuline, du glucagon, de la somatostatine chez le chien, le porc et le rat (28,31).
Des effets métaboliques du VIP ont été rapportés. Au niveau du système nerveux
central et périphérique, le VIP joue un rôle de neurotransmetteur et de neuromodulateur
rendant compte d'effets thermorégulateurs, d'un rôle dans la stimulation du réveil, d'action
sur la mitose et sur la survie neuronale (32). On observe aussi une augmentation de la
glycogénolyse de la cellule hépatique et dans certaines tumeurs hypophysaires (33).
Introduction - Le VIP 14
Enfin, certains auteurs parlent d'un effet sur la réponse immune (34). Le VIP, comme d'autres neurotransmetteurs, serait capable d'inhiber la prolifération des lymphocytes et jouerait un rôle déterminant dans la migration des lymphocytes T au niveau de l'intestin.
A l'heure actuelle, le VIP a été impliqué dans plusieurs pathologies dont la plus documentée est certainement le syndrome de Vemer-Morisson (tumeurs endocrines sécrétant du VIP) "WDHA syndrom" (35-36).
Citons également le rôle du VIP comme facteur de croissance sur le neuroblastome (37), l'association du VIP à la maladie de Crohn (38) et l'élévation du taux sanguin de VIP (39) dans l'insuffisance hépatique.
Un des exemples les plus intéressant est l'association VIP - asthme. De plus en plus on
parle du VIP comme moyen thérapeutique dans les affections asthmatiques. Ollerenshaw
et ses collaborateurs ont démontré une absenee totale de fibres nerveuses vipergiques dans
l'arbre bronchique de patients atteints d'asthme sévère sans que l'on ne puisse établir une
relation causale univoque, l'absence de système vipergique pourrait être un facteur de la
bronchoconstriction (40).
Introduction
-L'hélodermine 15
II.2. L'hélodermine
n.2.1. Découverte
En 1982, Raufinan et ses collaborateurs ont montré que le venin sécrété par les glandes venimeuses sublinguales des lézards hélodermes (Heloderma Suspectum et Heloderma Horridum) augmentait la sécrétion d'amylase des acini pancréatiques de cobaye (41). Ces effets ont été attribués à la présence d'un matériel peptidique thermostable agissant via les récepteurs du VIP. Comme le VIP, il provoque une augmentation du taux d'AMPc intracellulaire, inhibe la liaison d'iodo-Vff aux récepteurs; enfin sa propre action est inhibée par le dérivé [Gln^]-Sécrétine-(5-27)* un antagoniste des récepteurs de la Sn et du VIP. Il ne s'agissait cependant pas de VIP: en effet il n'y a pas d'interaction avec im antisérum spécifique du VIP. La présence dans le venin des lézards hélodermes d'un matériel peptidique analogue aux hormones de la famille VIP a été confirmée en 1983 par Amiranoff et al. (42). Ces auteurs ont montré que le venin inhibe la liaison de l^Sj.vip aux membranes des cellules épithéliales intestinales de rat et d'homme et active l'adénylate cyclase en présence de GTP.
En 1984, Gillet et al. ont décrit, dans notre laboratoire, l'activation de l'adénylate cyclase dans la membrane plasmique de pancréas de rat par les deux venins et ont démontré que cet effet est médié par interaction préférentielle avec les récepteurs de la Sn (43).
En 1984, notre laboratoire purifia l'agent responsable de ces activités à partir du venin d'Heloderma Suspectum. Il s'agit d'un peptide de poids moléculaire apparent en SDS-PAGE de 5900, baptisé "Hélodermine" (44). Des études de liaison sur les récepteurs du VIP et d'activité biologique par Robberecht et al. (45) montraient qu'il s'agissait d'un membre de la famille Sn, VIP, PHI. Ce peptide active l'adénylate cyclase de plusieurs types de membranes (pancréas de rat [récepteur de la Sn], coeur humain, coeur de rat), et inhibe la liaison de 125i_Yjp
Hoshino et al. en décembre 1984 publiaient la structure primaire de l'Hd, structure
obtenue à partir d'une forme purifiée par notre laboratoire. C'est un peptide de 35 acides
aminés avec, du côté N-terminal, une histidine et du côté C-terminal une proline amide
(Tableau II) (46). Deux corrections furent apportées ultérieurement à cette séquence par
notre laboratoire: en positions 8 et 9, il y a 2 acides glutamiques et non 2 glutamines
comme rapporté initialement (47).
Introduction - L'hélodermine 16
Dans un même temps, le groupe de Parker qui travaillait également sur les venins d'hélodermes faisait mention d'un peptide aux propriétés similaires à celles de lUd ; l'Hélospectine (48). Ils réussirent à purifier et à séquencer 2 formes de ce peptide, ms I (38 AA) et ms II (37 AA) (Tableau II).
Si les séquences en acides aminés de lUd et IHs sont forts semblables, les différences sont néanmoins suffisantes pour affirmer que Hd et Hs sont 2 molécules distinctes.
En 1987 (47), nous avons montré que lUs est en fait caractéristique du venin du lézard Heloderma Horridum, alors que lUd se trouve dans le venin du lézard Heloderma Suspectum. Nous avons purifié 6 formes d*Hs à partir du venin dUeloderma Horridum; les Hs I et Hs n de Parker, 2 variants d'Hs I et 2 variants dHs II différant probablement par des modifications secondaires (glycosylation, phosphorylation, amidation ou désamination du groupement - COOH terminal ?).
Dans le venin du lézard Heloderma Susfiectum (49) nous avons trouvé en plus de
l'Hd majeure, plusieurs formes d'Hd et également 4 formes proches de l'Hs.
Tableau II
Espèces Peptides 1 5 10 15 20 25 30
H. SUSP Hd H-S-D-A-I-F-T-E-E-Y-S-K-L-L-A-K-L-A-L-Q-K-Y-L-A-S-I-L-G-S-R-T-S-
H. horr Hs I TA ES
Hs II
Espèces: H. susp; Heloderma Suspectum H. horr: Heloderma Horridum
Peptides: Hd: Hélodermine Hs: Hélospectine
35
P-P-P-*
P-S-S-*
S-*
Introduction - L'hélodermine 18
H.2.2. Effets biologiques de l'hélodermine
LUd présente de nombreux effets biologiques comparables à ceux du VIP, car interagissant avec les mêmes récepteurs: sur des préparations de membranes de foie de rat, de poumon de rat et de coeur humain, la liaison de £ 5 ^ inhibée par de l'Hd froide et les courbes de déplacement font apparaître une liaison sur les récepteurs du VIP à haute affinité (Kd = 0.8 nM). Ces récepteurs sont couplés positivement à l'adénylate cyclase et l’Hd est un agoniste (50, 51). Sur des membranes pancréatiques de rat, l'inhibition de l'activation de l'adénylate cyclase par de la Sn (7-27) et de la Sn (4-27), deux marqueurs spécifiques des récepteurs de la Sn, montre que IHd agit préférentiellement en se liant aux récepteurs de la Sn (45). Sur les acini pancréatiques, l'hélodermine provoque une hypersécrétion d'amylase, une augmentation de l'AMPc et la phosphorylation de 3 protéines (21, 23 et 25 KDa) (52). LHd peut également stimuler l'adénylate cyclase de cellules en culture telles que des cellules de mélanome de souris dont l'enzyme est stimulée environ 3 fois en présence dHd 0.1 pM et de GTP 10 pM (53).
Tout comme le VIP, IHd est capable de stimuler la sécrétion de certaines hormones. Chez le rat, on a montré une élévation du taux plasmatique de prolactine après injection dHd. Pour une même concentration d'hormone injectée, IHd est plus puissante que le VIP qui lui-même est plus puissant que le PHI (54). Chez la souris, c'est la sécrétion de glucagon qui est stimulée. Contrairement au VTP et au PHI, IHd ne provoque pas, dans ce cas, de stimulation de la sécrétion d'insuline (55).
L'Hd agit sur le transport et la sécrétion d'ions. Elle induit une modification du potentiel de membrane sur le jéjunum de rat, ce qui a pour conséquence d'augmenter la sécrétion d'anions. Dans ces expériences, IHd est 8 fois moins efficace que le VIP et le PHI (Kact 100 nM versus 12 nM) (56).
Sur les acini pancréatiques de chien, l'Hd est l'agent le plus puissant pour stimuler la sécrétion de (HC 03 )". Elle stimule la sécrétion d'amylase et, comme le VEP, présente des effets vasodilatateurs (57). L'injection intra-artérielle d'Hd à un chien anesthésié cause une augmentation dose-dépendante du débit sanguin fémoral. Cette vasodilatation est accompagnée de tachycardie (58).
H.2.3. L'hélodermine de mammifère
Pour déterminer si l'Hd est un membre d'une nouvelle classe d'hormones, plusieurs
groupes ont recherché ce peptide chez des espèces animales différentes des reptiles.
Introduction - L'hélodermine 19
En 1985, Robberecht et al. (59) ont décrit la présence de matériels Hd- immunoréactifs chez le chien, le rat et l'homme dans les glandes sous-maxillaires, et dans la salive du chien après stimulation par de la pilocarpine. Des techniques d'immunohistochimie ont permis de démontrer la présence de peptides Hd-immunoréactifs dans les cellules de la médullosurrénale de la souris, du rat et du porc (60). Mais, c'est au niveau des cellules C de la thyroïde de patients sains et de patients souffrant d'un carcinome médullaire que l'on a retrouvé les plus fortes concentrations en matériel Hd- immunoréactif (61, 62).
Aujourd'hui le sujet reste très controversé. En effet, plusieurs groupes dont le nôtre se sont aperçus que le matériel Hd-immunoréactif détecté dans certains tissus était dû à un artefact lors du dosage radioimmunologique. Le traceur radioactif était artificiellement épuisé par une protéine liante et dans d'autres cas l'anticorps utilisé manquait de spécificité. Yanaihara et al. ont ainsi montré que dans leur système lUd détectée dans les cellules C de la thyroïde était en fait une substance semblable à la calcitonine de saumon (63). Bounjoua dont les travaux sur ffid de mammifère ont fait l'objet d'une thèse de doctorat au sein de notre laboratoire a démontré que dans ses expériences ce qu'il pensait être de IHd de boeuf était en réalité de la calmoduline, une protéine qui lie le Ca^^ et qui liait le traceur utilisé: l'iodo-Hd. L'utilisation dEGTA dans les dosages immunologiques avait pour conséquence de faire disparaître quasi totalement le pic dTid-immunoréactive.
La quantité de matériel-immunoréactif résiduelle, s'il s'agit dUd, serait 1000 fois moins importante que celle du VIP ou du PHI (64).
L'équipe de Sundler toutefois a présenté récemment des évidences
immunohistochimiques de la présence d'hélodermine dans divers tissus (65).
Introduction - Le PAC AP 20
11.3. Le PACAP
Le PACAP (Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide) est le peptide apparenté au VIP découvert le plus récemment.
Il a été purifié et séquencé en 1989 à partir d'hypothalamus de mouton sur base de sa capacité à activer l'adénylate cyclase des cellules hypophysaires, d'où son nom ( 66 ).
C'est un peptide de 38 acides aminés de séquence:
H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L-G-K-R-Y-K-Q-R-V-K-N- K-NH2
La séquence des 27 premiers acides aminés montre 68 % d'homologie avec celle du VIP (voir point H.4.).
Sur des cellules hypophysaires de rat en culture, le PACAP stimule la sécrétion d'hormone de croissance, de prolactine, de corticotropine, de LH et active l'adénylate cyclase ( 66 ).
En 1990, l'équipe de Kimura isole l'ADNc de l'ARNm codant pour le PACAP chez le mouton et chez l'homme (67). L'ADN^ de mouton code pour une protéine de 176 acides aminés. Le PACAP est précédé par une séquence signal et par une région de 107 acides aminés et est suivi de la séquence Gly-Arg-Arg, signal d'un processing protéolytique et d'amidation. La séquence déduite de cet ADN^ confirme les travaux antérieurs de Miyata.
La séquence en acides aminés déduite de l'ADNc humain donne une séquence identique à celle du mouton.
En 1992, le groupe de Fujino publie la structure du gène du PACAP humain.
Représentation schématique du sène et de l'ARNm codant pour le PACAP et le PACAP Related Peptide (PRP): ( 68 )
exon 1 exon 2 exon 3 exon 4 exon 5
1 Kb
200 bases
PRP PACAP
Introduction - Le PACAP 21
L'organisation du gène est fort semblable à celle du gène du VIP. Les deux exons codant pour le VIP et le PHM sont séparés au niveau du gène et se retrouvent juxtaposés dans l'ARNm. Une configuration semblable est trouvée pour le PACAP et le PRP. Le gène du PACAP contient également d'autres motifs homologues à des CRE ("cAMP responsive élément"), TRE ("TPA responsive élément") et GHF-1 (GHF-1 est un membre de la famille des protéines liant l'ADN), un rôle biologique du PRP (PACAP related peptide) a été évoqué mais non clairement démontré (69).
En décembre 1990 Ogi et al. publient la séquence de l'ADNc du précurseur du PACAP de rat qui code pour une protéine de 175 acides aminés et en déduisent la séquence du PACAP de rat, qui est identique à celle du mouton (69).
La même année, le groupe de Arimura qui avait purifié le PACAP-38, montre qu'il existe une forme raccourcie de PACAP dans l'hypothalamus de mouton; le PACAP-27 (70). La séquence correspond aux 27 premiers acides aminés du PACAP-38 et l'extrémité C-terminale est amidée. L'existence de cette forme s'explique par le fait qu'après l'acide aminé 27 dans le PACAP-38, on a la séquence Gly-Lys-Arg qui peut donner lieu à un clivage avec amidation. L'activité biologique du PACAP-27 est comparable à celle du PACAP-38. L'homologie de séquence avec le VIP est importante, de ce fait le PACAP présente des effets biologiques communs avec le VIP, notamment des effets vasodilatateurs.
Cependant et contrairement avec le fait que le PHI et l'Hd agissent essentiellement par
interaction avec les récepteurs du VIP, il existe des récepteurs spécifiques des PACAP
différents des récepteurs du VIP (voir plus loin).
11.4, Les séquences VIP, Hd,Hs et PACAP
Espèces Peptides
r VIP H-S-D-A-V-F-T-D-N-Y-T-R-L-R-K-O-M-A-V-K-K-Y-L-N-S-I- L-N*
H. susp Hd H-S-D-A -I-F-T-E- E-Y-S-K-L-L-A-K- L-A-L-0- K-Y-L-A-S-I- L-G- S-R-T-S-P-P- P*
H. horr Hs I H-S-D-A-T-F-T-A-E-Y- S-K-L-L-A-K- L-A-L-Q -K-Y-L-E-S-I -L-G- S- S-T-S-P-R- P-S-S*
r PACAP 38 H-S-D-G-I-F-T- D-S-Y-S-R-Y-R-K-O-M-A-V-K- K-Y-L-A-A-V-L-G-K-R-Y-K-O-R-V-K-N-K*
Espèces: r: rat; H. susp: Heloderma Suspectum; H. horr: Heloderma Horridum
K) KJ
Introduction
-Les séquences 23
Le tableau de la page 22 reprend les séquences des peptides VIP, Hd, Hs et PACAP. Il permet de mettre en évidence la grande homologie entre VIP, Hd et PACAP-27 (acides aminés soulignés). Si l'on compare PACAP et VTP, il y a 68 % d'homologie sur les 28 premiers acides aminés et entre l'Hd et le VP il y a 11 acides aminés qui sont identiques avec ceux du VP. Il est intéressant de noter que le VP et le PACAP ont la même séquence de la position 14 à la position 23.
L'histidine en position 1 est commune à tous les peptides de cette famille, et le résidu C-
terminal est amidé. Le triplet N-terminal pour le VP, l'Hd et le PACAP est identique et est
His-Ser-Asp (Il pourrait jouer un rôle important dans la liaison avec les récepteurs).
Les récepteurs du VIP 24
11.5. Les récepteurs du VIP
11.5.1. Localisation
Les effets biologiques du VIP sont médiés par l'occupation de récepteurs qui ont été identifiés dans tous les tissus cibles du peptide.
On peut ainsi trouver des récepteurs du VIP au niveau du cerveau des mammifères (71), au niveau du système respiratoire (poumons) (72), au niveau du placenta humain (73) et sur des lymphocytes (74), dans les cellules du système digestif (pancréas, foie, estomac, intestin) (75, 76) et du système urogénital (77).
On trouve des récepteurs du VP sur des cellules en culture: citons entre autres une lignée humaine dérivée d'un mélanome (cellules IGR 39) (78) et les cellules épithéliales humaines (cellules CL. 16E) (79).
Ce ne sont que quelques exemples de la diversité des cellules et tissus exprimant des récepteurs du VP. Les caractéristiques moléculaires des récepteurs permettent également de se rendre compte de la grande hétérogénéité au sein de ces récepteurs.
n.5.2. Les masses moléculaires des récepteurs du VP
Le poids moléculaire apparent des récepteurs du VP est variable.
Le tableau ci-dessous donne à titre d'exemples quelques valeurs:
Tissus PM Auteurs + n° référence
Pancréas de rat 77000 (bande majeure) 63000
Svoboda et al. (80)
Pancréas de cobaye 80000 (bande majeure) 63000
Svoboda et al. (80)
Foie de rat 77000 (bande majeure) 53000
Nguyen et al. (81)
Poumon humain 62000 Dickinson et al. (82)
Poumon de rat 53000 Dickinson et al. (82)
Poumon de lapin 61000 Dickinson et al (82)
Les récepteurs du VIP 25
Poumon de cobaye 63000
57000
Dickinson et al. (82)
Intestin de rat 73000
33000
Laburthe et al. (83)
Intestin humain 63000
30000
Couvineau et Laburthe (84)
Cellules HT-29 63000 Couvineau et al. (85)
Remarque; l'ensemble de ces travaux a été réalisé sur des préparations de membranes et dans des conditions réductrices.
L'observation de deux bandes radiomarquées pourrait résulter soit d'une dégradation du récepteur pendant le pontage covalent et/ou la préparation des membranes, soit de l'existence d'une hétérogénéité, soit de possibilité d'associations stables avec d'autres protéines (protéine G par exemple).
Grâce à des travaux comme ceux de J. Luis ( 86 ) et ceux de C. Fabre (87) et à l'analogie de la séquence en acides aminés révélée par le clonage des récepteurs (voir point suivant) nous pouvons dire que la plupart des modifications des récepteurs du VIP sont dues à des modifications au niveau des chaînes latérales oligosacharidiques. Le motif polypeptidique de base serait très semblable voire identique pour à peu près tous les récepteurs.
n.5.3. Le clonage des récepteurs du VIP
Le premier clonage de l'ADN^ du récepteur du VIP a été réalisé en 1992 par
Ishihara et ses collaborateurs ( 88 ). L'ADN^ du poumon de rat code pour une protéine de
459 acides aminés dont les 30 premiers correspondent à un peptide signal. Le peptide
mature est une protéine de 429 acides aminés. Celle-ci est caractérisée par la présence de 7
domaines hydrophobes transmembranaires et également par la présence de 4 sites
potentiels de N-glycosylation (3 dans la partie N-terminale extracellulaire). Ce récepteur a
une organisation typique d'un récepteur couplé aux protéines G. Celui-ci montre la plus
grande homologie avec un autre récepteur de la même famille, le récepteur de la Sn
séquencé en 1991 par la même équipe (89). Cette homologie est de 48% et on notera
principalement une troisième boucle intracellulaire identique et une région N-terminale
riche en résidus Cys. Ces 2 régions pourraient être impliquées étroitement dans la
reconnaissance du ligand.
Les récepteurs du VIP 26
Le récepteur du VIP humain a été cloné à partir de cellules épithéliales intestinales HT 29 par l'équipe de Sreedharan et est un polypeptide de 457 acides aminés (90) ayant une homologie de 84% avec le récepteur du VIP du rat. Ce récepteur conserve au niveau des mêmes régions que le récepteur du rat des sites de glycosylation potentiels (au nombre de 4).
Lutz et son équipe ont cloné à partir d'une librairie d'ADN^ du bulbe olfactif de rat un second récepteur du VIP (appelé récepteur VIP 2 ) (91). Sur base de la présence de l'ARNm, ce récepteur a une autre distribution cérébrale que celle du récepteur VEP], Il aurait également une spécificité pharmacologique différente quoique étudiée avec peu de détails; en effet, l'ordre des puissances des différents ligands est VIP ~ PACAP-27 ~ PACAP-38 ~Hd ~ PHI » rGHRH, ce qui le distingue du récepteur 1 sur lequel l'Hd est un agent moins actif II pourrait s'agir du récepteur du VIP préférant l'Hd du rat que nous avons décrit sur les cellules lymphoblastiques humaines en culture (cellules SUP-Tl). Le clonage du récepteur VIP 2 humain vient d'être réalisé (voir conclusion).
Le clonage du récepteur du VIP humain a également été réalisé à partir d'intestin
sain par l'équipe française de Couvineau (92) et diffère par 3 acides aminés de la séquence
rapportée par Sreedharan.
Les récepteurs du VIP 27
Ces auteurs proposent le schéma suivant pour l'organisation membranaire du récepteur du VIP: ce schéma indique les sites de glycosylation et de phosphorylation potentiels mais il n'a pas encore été établi quels étaient les sites effectivement utilisés de même, la position du pont disulfure est totalement hypothétique.
:ooH
Site de phosphorylation de la protéine kinase A
Notre recherche méthodique de récepteurs spécifiques pour les nouveaux ligands appartenant à la famille du VIP nous a permis de démontrer l'existence de différents types de récepteurs spécifiques pour le PACAP (voir chapitre résultats).
Depuis, plusieurs groupes de chercheurs (dont le groupe de Michal Svoboda dans notre laboratoire) sont parvenus à cloner le récepteur pour le PACAP de type I (93-96). A partir d'une librairie d'ADNc de bulbe olfactif de rat, de cerveaux de rat ou de cellules AR 4-2J, ces équipes ont cloné et séquencé une protéine de 495 acides aminés qui a 51%
d'homologie avec le récepteur du VIP et 47% avec le récepteur de la Sn. Ce récepteur est caractérisé par une architecture comparable à celle d'un récepteur couplé à une protéine G.
Il a 7 domaines transmembranaires (ce sont les séquences les plus conservées par rapport
aux autres récepteurs de la famille VIP). Le côté N-terminal extracellulaire et le côté C-
terminal intracellulaire sont les plus divergents, mais on retrouve du côté N-terminal
Les récepteurs du VIP 28
l'environnement riche en Cys (au nombre de 5), 3 sites potentiels de N-glycosylation et, dans la troisième boucle intracellulaire 2 sites possibles de phosphorylation.
Ces récentes informations obtenues par le clonage des récepteurs et les résultats des études pharmacologiques (voir chapitre résultats) permettent, aujourd’hui, une classification aisée des récepteurs du VIP et des peptides apparentés.
Sur cette base, nous avons:
- un récepteur du VIP, le récepteur commun qui reconnaît tout aussi bien le VIP que les PACAP. Il correspond sans doute au récepteur des PACAP de type II d'après les dotmées pharmacologiques.
- le récepteur des cellules SUP-Tl, le récepteur du VIP "Helodermin-preferring".
- et le troisième récepteur: le récepteur des PACAP, le récepteur de type I d'après les
doimées pharmacologiques (ex. le récepteur des cellules AR 4-2J).
29
gr..
METHODES
Chapitre III 30
in. 1. Matériel
III. 1.1. Appareillages ni. 1.2. Produits
in.2. Méthodes
ni.2.1. Méthodes courantes
in.2.2. La synthèse peptidique
III.2.3. La séquence d'un peptide
Matériel 31
III.1. Matériel
in.1.1. Appareillages
III. 1 ■ 1 .a. Synthèse peptidique
- Synthétiseur automatique de peptides en phase solide: modèle 431 A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
- Synthétiseur semi-automatique à flux continu: Novasyn (Novabiochem, Cambridge, Angleterre).
III. 1.1 .b. Séquence des peptides
- Séquenceur automatique de peptides selon la dégradation d'Edman: modèle 477 A, couplé avec un analyseur automatique de PTH-AA: modèle 120 A (connexion entre les 2 systèmes par un interface Nelson, type: PE Nelson 900) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
III. 1.1 .c. Système HPLC
- Contrôleur 2152,
- Uvicord SD 2158 (226 nm et 280 nm), - Pompe 2150,
- Collecteur Redirac 2112,
- Valve magnétique pour gradient basse pression, Rhéodyne 7125 (LKB, Bromma, Suède).
- Enregistreur Omniscribe (Houston Instrument, Texas, USA).
- Intégrateur Chromatopac C-R5A (Shimadzu Benelux, Anvers, Belgique).
Colonnes HPLC utilisées:
1) Nucleosil Cl 8 300 A° (porosité) 10 pm (granulométrie) 250x10 mm Macherey-Nagel (Durën, Allemagne)
2) Vydac HPLC Technology lO-C-18 300 A° (porosité) 10 pm (granulométrie) 250x4.6 mm The Séparations Group (Hisperia, CA, USA)
3) Vydac HPLC Technology C-18 300 A° (porosité) 15-20 pm (granulométrie) 250x22 mm The Séparations Group (Hisperia, CA, USA)
3) MonoS HR 5/5 (50x5 mm) FPLC Pharmacia (Uppsala, Suède)
4) Hiload 26/10 S Sépharose High Performance Pharmacia (Uppsala, Suède)
Matériel 32
in.1.2. Produits
111.1.2. a. Généraux
Les produits usuels proviennent de Sigma Chemical Company (St-Louis, MO, USA) ou de Janssen Pharmaceutica (Beerse, Belgique) et sont de grade analytique.
111.1.2. b. Relatifs à IHPLC
- Acétonitrile (CH 3 CN) 99.8% Analyticals Carlo Erba (Milan, Italie).
- Acide trifluoroacétique (TFA) HPLC/Spectrograde Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois, USA).
- H 2 O (HPLC); H 2 O distillée filtrée sur le système Milli-Q Millipore Waters associâtes (Molsheim, France).
in.l.2.c. Relatifs à la culture cellulaire
Les produits (milieux, sérum foetal de veau, additifs) nécessaires à la culture de cellules provietment tous de chez GIBCO Europe (Gand, Belgique).
m. 1.2.d. Relatifs à la séquence des peptides
Tous les réactifs et solvants nécessaires au fonctionnement du séquenceur proviennent de chez Applied Biosystems (Foster City, CA, USA).
IU.1.2.e. Relatifs à la synthèse peptidique
Les solvants et réactifs utilisés dans la synthèse des peptides provietment de chez Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), sauf
- les Fmoc-AA,
- et la 4-(2', 4'-diméthoxyphényl fluorène-9-ylméthoxycarbonylaminométhyl) phénoxy résine (substitution; 0.45 mmol/g résine) fournis par Novabiochem (Laüfelfingen, Suisse).
Liste des Fmoc-AA utilisés:
- Fmoc-Ile-OH
- Fmoc-Phe-OH
- Fmoc-Met-OH
Matériel 33
- Fmoc-Ala-OH - Fmoc-Gly-OH - Fmoc-Val-OH - Fmoc-Leu-OH - Fmoc-His(Trt)-OH - Fmoc-Gln(Tmob)-OH - Fmoc-Asn(Tmob)-OH - Fmoc-Asp(OtBu)-OH - Fmoc-Ser(tBu)-OH - Fmoc-Thr(tBu)-OH - Fmoc-Tyr(tBu)-OH - Fmoc-Lys(Boc)-OH - Fmoc-Arg(Pmc)-OH
m.l.2.f. Relatifs aux études de pontage covalent et de déelvcosvlation du récepteur de l'hélodermine
- Tunicamycine Boehinger (Mannheim, Allemagne).
- Bsocoes Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois, USA).
- Prostaglandin Ej Sigma Chemical Co (St-Louis, MO, USA).
III. 1.2.g. Les peptides
Le VIP et analogues du VIP, le PFIl, et le GRF nous ont été donnés par le Dr D.H. Coy (Tulane University, School of Medicine, New Orléans, LA, USA); la sécrétine par le Dr W. Kônig (Hoechst, Frankfurt am Main, Allemagne) et les fragments d'hélodermine par le Dr N. Yanaihara (Shizuoka College of Pharmacy, Shizuoka, Japan).
Le VIP (10-28) provient de Peninsula Laboratories (St-Helens, Angleterre) et le [D-Ala^]peptide T de Bachem (Budendorf, Suisse).
L'hélodermine et l'hélospectine ont été préparées au laboratoire par
A. Vandermeers et al. suivant une méthode précédemment décrite (47).
Méthodes 34
III.2. Méthodes
Les techniques courantes sont décrites dans les articles repris au § III.2.1 ci- dessous. La synthèse et la séquence des peptides sont décrites aux paragraphes III.2.2 et m.2.3.
in.2.1. Méthodes courantes
- La culture des cellules lymphoblastes humaines (cellules SUP-Tl) ainsi que la préparation des membranes à partir de ces cellules sont décrits dans l'article:
"/? V
'teœpim kai. an ajJ|^nii^f~ j/M. kelxtd&inUn in luunan Ê^P- 'If LfntpJioklaAii}'Patrick Robberecht, Magali Waelbroeck, Philippe De Neef, Michèle Tastenoy, Philippe Gourlet, Jacqueline Cogniaux and Jean Christophe. 1988, FEBS Letters 228; 351-355.
chapitre IV (IV. LL).
- La culture des cellules pancréatiques de rat (cellules AR 4-2J) ainsi que la préparation des membranes sont décrites dans l'article:
"Pneience kûfldif. éelectwe. neoepion4- PAQAP (^Uiuda/u^ adeniflai& Ofclade acüuaiin^
pepiide.) inme4nJmane6.jjmniUie.ncdpancnecdicacman,ceU,lineAP4-^''
Louis Buscail, Philippe Gourlet, Annick Cauvin, Philippe De Neef, Denis Gossen, Akira Arimura, Atsuro Miyata, David H. Coy, Patrick Robberecht and Jean Christophe. 1990, FEBS Letters 262: 77-81.
chapitre IV (IV.2.L).
- La préparation des membranes hépatiques est détaillée dans l'article:
"PAGAP and V9P neœpia^i. in 'lai Lùm. meniknanei^
Patrick Robberecht, Philippe Gourlet, Annick Cauvin, Louis Buscail, Philippe De Neef, Akira Arimura and Jean Christophe. 1991,American Journal of Physiology 260: G97- G102.
chapitre IV (IV.2.3.).
Méthodes 35
- L’élévation de l'activité de l’adénylate cyclase est déterminée par la méthode de Salomon et al.(97), légèrement modifiée par Waelbroeck et al. (98) et Robberecht et al.
(99). Le protocole d'analyse de cette activité, la culture et la préparation des membranes de neuroblastome humain (cellules NB-OK-1), la préparation des membranes de pancréas, de cerveaux et d'hippocampe de rat ainsi que la méthodologie p>our préparer le traceur radioactif et les études de liaison sur les récepteurs sont expliqués dans l'article:
"Mutcimai necfUi^jernenU
^
Uie lù*tdi*Uf the pituUa'uf, oÂe*i.i^iai&-c4fcLaM^ac^^pepiid& io- 'teo&pion6. and adm*iiate-- OfclcUe actiuaùo*i i*i pancneatic a*ui nedi/umal
Philippe Gourlet, Marie-Claire Woussen-Colle, Patrick Robberecht, Philippe De Neef, Annick Cauvin, Marie-Claire Vandermeers-Piret, André Vandermeers and Jean Christophe. 1991, European Journal of Biochemistry 195; 535-541.
chapitre IV (IV. 2.3.).
ni.2.2. La synthèse peptidiaue
Les premières synthèses peptidiques datent de 1920 et étaient faites en phase liquide en utilisant des méthodes aux chlorures d'acide. Si depuis cette date, la synthèse en phase liquide a reçu de nombreuses améliorations et notamment l'apport de nouveaux dérivés d'acides aminés comme les dérivés benzyloxycarbonyl- (1930), ou bien encore l'introduction dans les années 50 de la chimie des anhydrides mixtes, la synthèse en phase liquide reste néanmoins délicate et longue. En effet, après chaque couplage, le peptide allongé doit être purifié. Plus le peptide grandit, plus sa solubilité peut diminuer, ce qui entrave les étapes de purification et de couplage et donc diminue le rendement final de synthèse.
En 1963, Merrifield introduit une technique de synthèse de peptides en phase solide (100). L'acide aminé C-terminal du peptide à synthétiser est fixé de manière covalente à un support polymérisé insoluble. Les avantages de cette méthode sont nombreux: le peptide étant attaché sur un support solide, on peut facilement éliminer les réactifs et les solvants en excès ainsi que les produits générés pendant la réaction par filtration et lavage. Les pertes mécaniques sont diminuées ainsi que le nombre de manipulations. Le rendement global de la synthèse est de ce fait supérieur à celui de la synthèse en phase liquide. Une seule étape est nécessaire au décrochage du peptide de la résine et à l'élimination des groupements protecteurs des chaînes latérales.
Les premiers dérivés acides aminés employés dans cette synthèse étaient des
dérivés t-Boc (ter-Butyloxycarbonyl). Aujourd'hui, ils sont petit à petit remplacés par les
Méthodes 36
dérivés Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl-) qui apportent plusieurs avantages (Carpino et Han, 1970 (101)). En effet, le groupement t-Boc nécessite un clivage par du TFA, les clivages successifs lors de l'élongation du peptide peuvent détériorer le peptide, et nécessitent l'utilisation de groupements bloqueurs des chaînes latérales des acides aminés résistant à ces traitements acides. Pour cliver le peptide de la résine et débloquer les chaînes latérales, il faut employer des acides forts comme l'acide fluorhydrique ou l'acide trifluorométhanesulfonique nécessitant l'emploi d'un matériel de laboratoire spécifique. Il est certain que les risques d'endommager le peptide lors du clivage et de la déprotection sont grands.
Le groupement Fmoc est par contre labile en milieu basique et les chaînes latérales sont protégées par des groupements plus labiles en milieu acide que ceux utilisés dans la chimie des Boc-AA (102). La chimie des Fmoc-AA est ime chimie plus douce et les risques de dégrader le peptide synthétisé sont plus faibles.
- Nous avons utilisé la chimie des Fmoc-AA, c'est cette technique qui sera décrite ci-après:
Le groupement Fmoc
On peut utiliser plusieurs stratégies lorsque l'on emploie des dérivés Fmoc; on ne décrira ici que la chimie en usage lors des synthèses sur le système automatique d'Applied Biosystems. Dans cette chimie, on forme un ester en présence de l'acide aminé, d'HOBT et de DCCI. C'est un ester actif qui va se coupler au peptide naissant.
Plusieurs types de résines existent sur le marché (résine-OH, résine-NH 2 par
exemple). Comme le PACAP naturel est amidé du côté C-terminal, nous avons synthétisé
des analogues amidés du côté C-terminal. Pour ce faire, nous sommes partis d'une résine
avec des groupements "NH 2 " susceptibles de réagir avec le premier acide aminé. Ce
groupe est protégé par un radical Fmoc comme les acides aminés et se traite de la même
manière.
Méthodes 37
La résine utilisée est la 4-(2', 4’-Dimethoxyphenyl-Fnioc-aminomethyl)-phenoxy-résine;
-1: La première étape du cycle de synthèse est la déprotection, c'est-à-dire l'élimination du groupe Fmoc, le groupe protecteur N-terminal, par de la pipéridine 20%
dans le DMF.
Remarque: Les acides aminés dont les chaînes latérales ont des groupements réactifs (exemple: OH, NH 2 ) doivent avoir ces fonctions protégées par des groupes protecteurs afin d'éviter des réactions latérales. Ces groupes seront éliminés lors de la dernière étape: le clivage du peptide (voir liste des acides aminés protégés dans la partie matériel).
-2: Parallèlement à la déprotection et dans une autre chambre réactionnelle, l'acide aminé suivant est activé sous la forme d'un ester d'HOBT en présence de DCCI. L'acide aminé est solubilisé dans le NMP. C'est une réaction équimolaire. On utilise un excès d'ester d'acide aminé par rapport à la quantité de peptide prévu (5x).
DCCI HOBT AA-N-Protégé Ester actif
d’HOBT
Pendant cette réaction se forme un précipité de DCU qui est éliminé par filtration.
Méthodes 38
-3: Dans l'étape de couplage ou acylation, l'ester actif réagit avec la fonction NH 2 libre: il y a formation d'un lien peptidique et élongation du peptide de + 1 acide aminé.
^ SJ?
-C-0, + H N-CH-C-N-CH-C-O-résin
R" H R"' HR' H R" H R"
Fmoc-N-ÇH-C-0, + H N-CH-C-N-CH-C-O-résine —> Fmoc-N-ÇH-^-N-CH- 0-résine
Il \ 2 I I I ^ I I. I. L.. I L...
HR' , N
[01 ;
n
'
Ester Fmoc AA/HOBT Peptide-résine (Peptide + 1 AA)-résine
