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Submitted on 21 Nov 2013
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Charles-Henri Hage
To cite this version:
Charles-Henri Hage. Sources optiques fibrées pour applications biomédicales. Médecine humaine et pathologie. Université de Bourgogne, 2013. Français. �NNT : 2013DIJOS001�. �tel-00907642�
Thèse bénéficiant du dispositif Jeunes Chercheurs Entrepreneurs (JCE), financé par la Région Bourgogne.
Université de Bourgogne
Laboratoire Interdisciplinaire Carnot de Bourgogne
UMR 6303 CNRS - Université de Bourgogne
THESE
Pour obtenir le grade de
Docteur en Physique de l'Université de Bourgogne
par
Charles-Henri HAGE
Sources optiques fibrées pour applications biomédicales
Directeur de thèse : Guy MILLOT
Encadrants : Christophe FINOT, Bertrand KIBLER
Thèse soutenue le 23 janvier 2013 devant le jury composé de
Antoine COURJAUD Docteur, Business Development Manager, société Amplitude Systèmes
Examinateur Christophe FINOT Professeur, Université de Bourgogne Encadrant Bertrand KIBLER Chargé de Recherche, Laboratoire Interdisciplinaire
Carnot de Bourgogne
Encadrant Alexandre KUDLINSKI Maître de Conférences, Université des Sciences et
Technologies de Lille
Rapporteur Frédéric LOURADOUR Professeur, Université de Limoges Rapporteur Guy MILLOT Professeur, Université de Bourgogne Directeur de thèse Hervé RIGNEAULT Directeur de Recherche, Institut Fresnel Examinateur
Thèse bénéficiant du dispositif Jeunes Chercheurs Entrepreneurs (JCE), financé par la Région Bourgogne.
Université de Bourgogne
Laboratoire Interdisciplinaire Carnot de Bourgogne
UMR 6303 CNRS - Université de Bourgogne
THESE
Pour obtenir le grade de
Docteur en Physique de l'Université de Bourgogne
par
Charles-Henri HAGE
Sources optiques fibrées pour applications biomédicales
Directeur de thèse : Guy MILLOT
Encadrants : Christophe FINOT, Bertrand KIBLER
Thèse soutenue le 23 janvier 2013 devant le jury composé de
Antoine COURJAUD Docteur, Business Development Manager, société Amplitude Systèmes
Examinateur Christophe FINOT Professeur, Université de Bourgogne Encadrant Bertrand KIBLER Chargé de Recherche, Laboratoire Interdisciplinaire
Carnot de Bourgogne
Encadrant Alexandre KUDLINSKI Maître de Conférences, Université des Sciences et
Technologies de Lille
Rapporteur Frédéric LOURADOUR Professeur, Université de Limoges Rapporteur Guy MILLOT Professeur, Université de Bourgogne Directeur de thèse Hervé RIGNEAULT Directeur de Recherche, Institut Fresnel Examinateur
Les jou s do t pa lait Musashi… effectivement, ils permettent d’a oi un ape çu d’u sujet ! Cela dit, celui-ci parlait également de 10000 autres jours pour parvenir à une certaine maîtrise, un certain recul… l’e e i e de la i lio pe et de s’e e d e là-aussi ie o pte… Bref.
Passons à la chose que l’o it généralement à la fin, et qui très logiquement se trouve au tout début du manuscrit. Sig alo s toutefois ue l’ ha tillo p opos i i ’est ue ep se tatif, afin de ne pas offenser les personnes non-citées.
Tout d’a o d, e sont généralement les personnes d'un certain âge (ou d'un âge certain ?) qui peu e t di e ela, ais j’ai tout de même eu l’oppo tu it de oi se su de di e teu s et u os d’UMR pou u e la o atoi e. Je tie s ai si à e e ie MM. Gilles Bertrand et Alain De eu , di e teu s su essifs du La o atoi e I te dis ipli ai e Ca ot de Bou gog e, pou ’a oi a ueilli lo s de ette th se. Ce la o atoi e ta t li à l’U i e sit de Bou gog e, je e e ie également les deux présidents successifs : Mme Sophie Béjean et M. Alain Bonin.
Cette th se s’est de plus d oul e da s le ad e du dispositif JCE Jeu es Che heu s Entrepreneurs) qui vise à stimuler le tissu économique local par la sensibilisation de doctorants au o de de l’e t ep ise et de l’i o atio . Il s’est t aduit pa le sui i des ou s du Maste
« Administration des Entreprises », répartis sur les 3 ans de thèse, le suivi de la formation à l’e t ep eu a iat « 12 jours pour Entreprendre » dispe s e pa l’i u ateu PREMICE et pa le finan e e t pa la R gio Bou gog e de la ou se de th se do t j’ai fi i . A e tit e, je e e ie les institutions et personnes qui font vivre ce dispositif : la Région Bourgogne, le Master Administration des Entreprises (particulièrment M. Fabrice Hervé et Mme Dominique China, responsable et secrétaire du Master, pour piloter efficacement la mise en place de ce dispositif) et l’i u ateu PREMICE.
Une thèse d'origine contrôlée étant soumise à analyse et dissection avant appellation, je remercie MM Frédéric Louradour et Alexandre Kudli ski d’a oi a ept d’ t e appo teu s pou e travail de thèse et notamment pour les échanges enrichissants et extrêmement pertinents que nous avons pu avoir. Je remercie pour les mêmes raisons MM. Hervé Rigneault et Antoine Courjaud pour a oi a ept d’e a i e e t a ail.
Je ’aurais de plus pu parvenir aux résultats présentés sans un encadrement adéquat. Je tiens ainsi à remercier Guy Millot pour avoir accepté de diriger cette thèse et pour les conversations et points de ue toujou s pe ti e ts et tou s e s l’a e i . De e, je remercie Christophe Finot do t l’e ad e e t ’a pe is d’e app e d e ta t su les millieux de la recherche et de l’u i e sit … e fi , le daill de o ze à la sista e ps hologi ue sa s faille il e a fallu pou
’e ad e da s tous les se s du te e, j’e suis tout à fait conscient) et à la conduite nitroglycériméthanolée de karts Bertrand Kibler, dont les prouesses expérimentales et la rigeur resteront des modèles permanents (mais comment fait-il pour injecter rapidement … ?)
L’e tou age du labo est si i po ta t u’il a t e diffi ile de tous les ite … je remercie notamment les membres des équipes Solitons, Lasers et Communications Optiques (SLCO, mon
uipe d’a ueil , P o essus Fe tose o de et Lase s i te ses PFL et Opti ue de Cha p P o he OCP pou ette a ia e si pa ti uli e u’ils o t su fai e g e au la o et à l’e t ieu …). A ce sujet, je tie s tout pa ti uli e e t à e e ie les e es de l’IBL B u o, Bernard, Stéphane, Aurélien et Vincent notamment, collègues et amis appréciés. Une pensée toute particulière pour le dernier mais non le moindre de ses membres, Franck, le bourreau du 52/42/32 et couteau Suisse de l’ uipe PFL et collègue du bureau D223, dont les connaissances et savoirs faire en CARS ont en g a de pa tie pe is l’o te tio des sultats p se t s, et do t la pe so alit , l’hu ou loi d’ t e tout lisse ( o e Be a d et l’ou e tu e d’esp it a e du es t ois a es u i ues. De e, u e pensée particulière pour M. Kamel « the P.A.P. » Hammani je sais u’au fo d de toi tu app ies ette juste e o aissa e…) et M. Philippe « the BdV » Morin pour leur accueil et leur support permanent. Une pensée également pour les premiers partis et les derniers arrivés (dans une app o he h o o galo e t e j’e te ds : Anne, Coraline, Thomas, Pierre-Yves, Benoît, Jérémy, qui ont contribué ou o t i ue t à l’a ia e du labo. Egalement M. Benoît "initials BB" Barivau pour nos échanges et tes relectures éclair et pertinentes !
Je remercie également les membres du service Administratif et Financier (SAF) pour leur disponibilité et leur dynamisme, notamment Mmes Sandra Klein et Claire Priou et Mlle Claire Millot, do t je peu atteste de l’e t e solidit ps hologi ue au u de o do i pou la hose ad i ist ati e… De plus, u e a ip ui fo tio e essite pa fois la alisatio de pi es de compétition. A ce titre, un grand merci aux membres des ateliers de mécanique et d'électronique.
Ces ateliers d'appui sont autant de chances qui se font rares dans un labo de recherche, et j'appelle de tous mes voeux les directeurs actuel et futurs à travailller à leur conservation.
Je citerai plus ou moins péle- le d’aut es o t i uteu s à e su s. Tout d’a o d les e es de l’ATCPB, sou e d’ ha ges et de e o t es. Notamment Kamel "the P.A.P." Hammani et Michael Claudon pour ces passages de flambeaux de webmaster réussis ! Mes compagnons do to a ts JCE et gale e t o JCE a e ui j’ai pu pa tage ta t de ou s de aste , de rédaction de dossiers et de stress de partiels ! Je remercie une fois encore Hervé Rigneault ainsi que les e es de l’ uipe MOSAIC de l’I stitut Fresnel de Marseille (Esben, Sophie et Pascal notamment) pou leu a ueil et les ha ges ue l’o a pu a oi su le CARS. Merci également aux personnes cotoyées durant mes activités physiques extra-thèse, qui ont également contribué à me dé/re-mettre la tête sur les épaules et les idées en place.
De manière plus personnelle, les amis de Baggio, toujours là, et un compagnon de route et de galère particulier, Florent « AsiAnO » ui sait e ue ’est ue… eau oup de hoses. Me i également à nombre de membres d’asso iatio s, notamment brésiliennes, au uelles j’ai adhéré et ui ’o t ouvert les portes de cette cultrure riche en ouverture et en enseignements. Muito o igado Ca ’, a a ilha de ulhe ! Les derniers remerciements mais non les moindres, mes pa e ts et a sœu . Leu soutie i o ditio el ’a g a de e t pe is de te i du a t es t ois années de thèse et de transformer une candidateure un peu improbable et folle en ce
« compuscript » qui atteste du travail effectué.
Merci à tous ! Charles-Henri Hage
Table des matières
Remerciements
Table des matières
Introduction ... 1
1 Contexte et théorie ... 7
1.1 Les techniques d'imagerie avancées ... 8
1.1.1 Les techniques multi-photons... 8
1.1.1.1 Origine physique et avantages de ces techniques... 8
1.1.1.2 Les sommes de fréquences ... 11
1.1.1.3 Les techniques de diffusion Raman cohérente (ou DRC) ... 12
1.1.1.4 Les techniques de fluorescence ... 13
1.1.2 Autres techniques récentes ... 14
1.1.2.1 Imagerie par tomographie optique cohérente ... 14
1.1.2.2 Imagerie photoacoustique ... 15
1.1.2.3 Imagerie Terahertz ... 16
1.2 La diffusion Raman cohérente : une imagerie non-linéaire "chapeau" ... 18
1.2.1 L’alpha et l’o ga de la DRC ... 18
1.2.1.1 Le mélange à quatre ondes ... 18
1.2.1.2 La diffusion Raman spontanée ... 19
1.2.2 La diffusion Raman anti-Stokes cohérente : le CARS ... 21
1.2.2.1 Généralités ... 21
1.2.2.2 Historique ... 23
1.2.2.3 Te h i ues ises e œu e pou le CARS ... 24
1.2.3 Le SRS, ou comment exploiter autrement le χ(3) ... 30
1.2.3.1 L'observation d'un autre effet du χ(3) résonnant ... 30
1.2.3.2 Le dispositif expérimental SRS ... 30
1.2.4 La cuisson ? A point, merci ! ... 32
1.2.4.1 Le brulé, c'est mauvais (ou : photoendommagement des échantillons) ... 32
1.2.4.2 Temps de cuisson (ou : ordres de grandeur communs en imagerie non-linéaire) ... 33
1.2.5 Les verrous technologiques ... 33
1.3 Les sources optiques fibrées pour la microscopie CARS ... 34
1.3.1 Les solutions existantes ... 34
1.3.1.1 Principe général et historique des solutions ... 34
1.3.1.2 Utilisation d'un supercontinuum ... 36
1.3.1.3 Utilisation du SSFS ... 36
1.3.1.4 Utilisation du mélange à quatre ondes ... 37
1.3.1.5 Sources "exotiques" ... 38
1.3.2 Eléments de théorie sur les fibres ... 39
1.3.2.1 Principes de guidage ... 39
1.3.2.2 Différents « types » de fibres à guidage par RTI ... 41
1.3.2.3 Effets d'atténuation du signal ... 42
1.3.2.4 La dispersion chromatique ... 44
1.3.2.5 Les effets non-linéaires... 46
1.3.2.6 Importance relative des effets linéaires et non-linéaires ... 48
Conclusion du chapitre ... 49
2 L'effet Raman intra-impulsion : la longueur d'onde à la demande ... 51
2.1 Principe et théorie ... 51
2.1.1 Equation de propagation ... 51
2.1.1.1 Equation de Schrödinger non-linéaire "classique" ... 52
2.1.1.2 Impulsion indéformable ... 53
2.1.1.3 Equation de Schrödinger non-linéaire généralisée ... 54
2.1.1.4 Résolution numérique ... 56
2.1.2 L'effet Raman intra-impulsion ... 57
2.1.2.1 Introduction de cet effet ... 57
2.1.3 Démonstrations ... 60
2.2 Test de différentes fibres ... 63
2.2.1 Considérations qualitatives préalables ... 63
2.2.2 Montage expérimental ... 65
2.2.2.1 Description du montage ... 65
2.2.2.2 Quelques mots sur la lame de phase... 66
2.2.3 Résultats expérimentaux ... 67
2.2.3.1 Fibres NKT Photonics ... 67
2.2.3.2 Fibres produites par PERFOS ... 71
2.2.3.3 Augmentation de la DSE ... 73
2.3 Etude de la stabilité ... 74
2.3.1 Stabilité court-terme ... 74
2.3.1.1 Types de techniques de mesure ... 74
2.3.1.2 Mesure des gigues d'un laser par analyse de son spectre radio-fréquences ... 75
2.3.1.3 Estimations préalables... 77
2.3.1.4 Mesure de gigues ... 78
2.3.2 Stabilité long-terme ... 81
Conclusion du chapitre ... 82
3 Appli atio s de l’effet Ra a i t a-impulsion ... 83
3.1 L'a plifi atio de fai les flu tuatio s elati es d’a plitude ... 83
3.1.1 Mise e œu e e p i e tale ... 84
3.1.1.1 Principe ... 84
3.1.1.2 Dispositif is e œu e ... 85
3.1.1.3 Fonctions de transfert du système ... 87
3.1.2 Caractérisation des fluctuations relatives amplifiées ... 88
3.1.2.1 Amplification des fluctuations relatives ... 88
3.1.2.2 Conservation de la distribution statistique des fluctuations ... 89
3.1.2.3 Importance de la puissance de travail ... 90
3.2 Le quasi-supercontinuum ... 92
3.2.1 Introduction, dispositif expérimental ... 92
3.2.2 Démonstration expérimentale ... 94
3.2.3 Amélioration de la qualité du spectre a priori et a posteriori ... 96
3.2.3.1 Amélioration a priori ... 96
3.2.3.2 Amélioration a posteriori... 97
Conclusion du chapitre ... 101
4 Compression spectrale non-linéaire des impulsions pompe ... 103
4.1 Principe et dispositif expérimental ... 103
4.1.1 Principe ... 103
4.1.2 Elément dispersif ... 107
4.1.3 Dispositif expérimental retenu ... 112
4.2 Dimensionnement du montage ... 113
4.2.1 Réglage du chirp initial ... 113
4.2.2 Optimisation du couple puissance-longueur de fibre ... 116
4.3 Expériences ... 117
4.4 Configuration finale ... 118
4.4.1 Fibre choisie ... 118
4.4.2 Mesures et comparaison au design ... 120
4.4.3 Mesures de gigues ... 121
4.5 Améliorations possibles ... 122
4.5.1 Evolution vers un dispositif entièrement fibré ... 122
4.5.2 Augmentation de la puissance de sortie : ... 123
4.5.3 Amélioration de la qualité des impulsions : mise en forme parabolique ... 124
Conclusion du chapitre ... 126
5 Validation du dispositif ... 127
5.1 Dispositif expérimental ... 128
5.1.1 Configuration CARS adoptée... 128
5.1.2 Choix matériels ... 128
5.1.2.1 Faisceau pompe ... 129
5.1.2.2 Faisceau Stokes ... 129
5.1.2.3 Recombinaison et dispositif de spectroscopie ... 129
5.2 Synchronisation des impulsions ... 134
5.2.1 Présentation des techniques possibles ... 134
5.2.2 Mesures de synchronisation ... 136
5.2.2.1 Mesures préliminaires ... 136
5.2.2.2 Premières mesures de synchronisation... 138
5.2.2.3 Influence de la longueur d'onde des impulsions Stokes ... 138
5.2.3 Reconstruction temporelle des impulsions pompe ... 140
5.2.4 Stabilité du signal synchronisé ... 143
5.2.4.1 Utilisation d'une photodiode non-linéaire ... 143
5.2.4.2 Utilisation de deux photodiodes linéaires ... 143
5.3 Mesure de spectres CARS ... 145
5.3.1 Considérations théoriques et expérimentales ... 145
5.3.2 Mesure de spectres ... 147
5.3.2.1 Mise en place des mesures et première vérification ... 147
5.3.2.2 Spectres de l'éthanol ... 149
5.3.2.3 Spectres de l'acétone ... 150
5.3.2.4 Spectres du polystyrène ... 151
5.3.2.5 Spectres d'un mélange éthanol/acétone ... 152
5.3.2.6 Possibilités de la source pour l'imagerie en microscopie ... 153
5.4 Prototypage : une vision utilisateur... 154
5.4.1 Problématique et méthode de traitement ... 154
5.4.2 Mise en place du cahier des charges fonctionnel ... 154
5.4.3 Mise e œu e des fo tio s : a hite tu e logi ielle ... 156
5.5 Améliorations et extensions ... 157
5.5.1 Améliorations possibles ... 157
5.5.2 Vers une imagerie multimodale ... 158
5.5.2.1 Autres configurations d'imagerie CARS ... 159
5.5.2.2 Imagerie par SRS ... 160
5.5.2.3 Autres types d'imageries ... 161
5.6 Extension du système général : une source entièrement fibrée ... 162
Conclusion du chapitre ... 164
Conclusion ... 165
Liste des abréviations ... 169
Annexes ... 173
A1. Tableau de correspondance entre les grandeurs Stokes et CARS ... 174
A2. Caractéristiques du spectromètre d'analyse du signal CARS... 175
A3. Calcul du courant généré par absorption à deux photons ... 176
A4. Caractéristiques de la photodiode de synchronisation "fine" ... 178
A5. Spectres Raman spontané des échantillons analysés... 180
Bibliographie ... 183
Communications... 199
Résumé ... 202
Summary ... 202
Au sein de la recherche scientifique, une activité importante repose dans la compréhension du fonctionnement du vivant. Cette compréhension peut par exemple permettre d'étudier la réaction d'une cellule vivante à la présence d'un produit étranger. Cette thématique est d'actualité pour les entreprises productrices de produits cosmétiques ou sanitaires, pour lesquelles l'efficacité et la non- toxicité de leur production constitue un enjeu médiatique et donc économique fort. Elle a
gale e t, pa le pass et e o e aujou d'hui, a outi à la ise au poi t d’u o e i po ta t de traitements médicaux. Da s e ad e, le p e ie outil d'o se atio a t l'œil, sui i de la loupe et du microscope en lumière diffuse. Puis il a été possible de décrire la structure des cellules par le spectre d'absorption de certaines molécules. Ainsi, on constate que l'emploi d’ondes en tant que "véhicule de l'information cellulaire" constitue un outil de choix car ces ondes permettent une imagerie sans contact, à l'image du schéma décrit par la figure ci-dessous
Figure 0-1 : Principe d'un système d'imagerie
Le Tableau 0-1 résume les différents types de "médias" d'imagerie (ondes acoustiques, ondes électromagnétiques, électrons...), avec leur précision, forces, faiblesses et applications. Il permet de remarquer que toutes ces techniques sont complémentaires et qu'il n'existe pas de technique idéale, chacune présentant des avantages et limites. O peut o state u’u e g a de pa tie de ces
« médias » est constituée par le spectre électromagnétique.
Dans ce spectre, la gamme visible-moyen infrarouge est intéressante car elle permet d'obtenir des informations sur les liaisons moléculaires qui composent les cellules biologiques. C'est ainsi que les techniques utilisant les processus d'émission de fluorescence, d'absorption infrarouge et de diffusion inélastique Raman sont d'une importance primordiale. Cependant, l'utilisation du visible et du processus de fluorescence aboutit à une absorption linéaire et donc à un échauffement important et à l'emploi forcé de molécules spéciales, appelées fluorophores, qui posent des problèmes de temps de vie et de compatibilité biologique. D'un autre côté, la diffusion Raman souffre d'une probabilité très faible et requiert des puissances lumineuses incompatibles avec les cellules vivantes.
L'emploi de faisceaux dans le moyen infrarouge pour la spectroscopie d'absorption infrarouge résout ce problème, mais souffre d'une résolution limitée (≈ 15 µm) qui empêche une imagerie cellulaire précise. Il existe cependant un socle de techniques qui permet d'exploiter efficacement le domaine du proche infrarouge, avec une bonne résolution spatiale (300-500 nm) et des puissances requises compatibles avec l'étude du vivant. Il s'agit des techniques exploitant l'optique non-linéaire, dont le développement important est conséquent à l'invention du laser en 1960 et à la mise au point
Int rodu cti on
2
Echographie de divers organes
Spectroscopie des composés organiques : identification de composés en médecine légale
Observation de cellules en mouvement
Analyse de médicaments ou de substances naturelles en milieux biologiques
Observation de processus biologiques par effet Raman
Techniques de fluorescence (ex: auto-fluorescence de la coenzyme NADH)
Radiographies (os, organes ayant fixé des produits absorbants)
Imagerie fonctionnelle : analyse du métabolisme glucidique de sites tumoraux
Imagerie d'échantillons déshydratés et métallisés
Etude de l'oxygénation du cerveau.
Faible résolution
Pas d'information de nature chimique
Faible résolution (15 µm)
Sources actuelles peu puissantes
Peut être toxique pour les milieux biologiques
Peut être toxique pour les milieux biologiques
Rayonnement ionisant
Faible résolution spatiale
Coût élevé (> million d'euros)
Manipulation d'éléments radioactifs
Non adapté aux échantillons biologiques
Che ≈ 1.5 million d'euros)
Encombrant (1 pièce, 10 à 30 tonnes)
Non-ionisant
Bonne pénétration
Profondeur de pénétration
Signal caractéristique des liaisons moléculaires
Bonne résolution spatiale
Signal caractéristique de liaisons moléculaires
Précision
Suivi de processus biologiques
Faible absorption de certains tissus
Imagerie
"fonctionnelle" (ex. : sur-représentation de glucides)
Grande précision
Précision acceptable
Tout plan de coupe possible
≈ mm
≈ 15 µm
0.3-1 µm
≈ 150 nm
≈ nm
mm-cm
≈ nm
≈ mm Mécanique,
compression / détente d'un volume
Vibrations moléculaires 0,05-0,5 eV1
Orbitales électroniques moléculaires
(absorption, diffusion inélastique)
1,55-3 eV
Orbitales moléculaires moléculaires
3-6 eV
Orbitales électroniques atomiques
124-124000 eV Noyaux atomiques
≈ 150 keV2
Electrons/noyaux
Moment magnétique du proton de l'atome d'hydrogène Ondes
acoustiques IR
Visible
UV
X
Rayons Υ
Electrons
Ondes magnétiques
Tableau 0-1 : Récapitulatif des médias employés en imagerie biologique et médicale
1 électron-Volt = 1,6.10 -19 C de grandeur couramment employé en imagerie médicale. En effet l'intervalle énergétique s'étend des keV (10 3 eV) à plusieurs centaines GeV (10 9 eV).
de lasers délivrant des impulsions ultracourtes (10-11 - 10-15 seconde) qui fournissent ainsi une puissance crête importante pour une puissance moyenne faible. Ces techniques reposent sur le fait ue lo s u’u at iau est sou is à u ha p le t i ue fo t, la po se des le t o s de e matériau, qui conditionne par e e ple ses p op i t s opti ues, ’est plus o sta te et d pe d de l’i te sit de e ha p. Ai si, e o po te e t pa ti ulie a outit pa e e ple à la d pe da e e i te sit de l’i di e de f a tio ou e o e à la o positio de f ue es so es, diff e es… .
Parmi celles-ci, on peut imaginer une composition employant trois champs, dont deux présentent une différence de fréquence optique égale à la fréquence de résonance d’u e liaiso moléculaire. Ce type de composition permet de provoquer le processus de diffusion Raman avec une probabilité environ 105 fois plus élevée que celle des techniques de diffusion Raman spontanée. Elle a donné naissance aux techniques de diffusion Raman cohérente et notamment à la technique diffusion cohérente Raman anti-Stokes appel e CARS e a glais , do t l’appli atio à l’i age ie vibrationnelle des milieux biologiques connaît, depuis 1999, un développement important. En effet, cette technique intéresse pour les raisons suivantes :
puissance moyenne faible et compatible avec les cellules vivantes
signal émis fortement exalté par les vibrations moléculaires, donc pertinente pour une imagerie cellulaire
longueurs d'onde pertinentes appartenant au proche infrarouge, qui correspond à la gamme spectrale d'absorption minimale des tissus.
longueur d'onde du signal émis inférieure aux longueurs d'onde des faisceaux excitateurs, donc simplement isolable de ces derniers et des signaux annexes (génération de seconde harmonique, fluorescence émise par excitation non-li ai e…
signal pertinent émis uniquement au point de focalisation : résolution intrinsèque.
Ainsi, le suivi des mitose3 ou apoptose4 cellulaires ou encore le suivi du développement intra- cellulaire du virus de l'hépatite C ont pu être démontrées par une imagerie de la liaison C-H.
Cependant, le principe même de cette technique constitue sa plus grande faiblesse et empêche actuellement sa diffusion aux utilisateurs cible, c'est à dire aux biologistes et aux médecins.
E effet, sa ise e œu e essite deu lase s impulsionnels, synchronisés, et dont la différence de fréquence optique peut être ajustée sur plusieurs centaines de nanomètres. Les dispositifs les plus pa dus po da t à e ahie des ha ges so t o pos s de deu lase s ou d’u ouple lase -OPO (Oscillateu Pa a t i ue Opti ue , d’u dispositif de s h o isatio et d’u e pa tie opti ue d’a he i e e t e s le i os ope. Ce t pe de dispositif est g ale e t e o a t ta le optique de 3 m² et dispositif de synchronisation), cher (environ 300 000 €) et nécessite des compétences spécifiques pour son fonctionnement et sa ai te a e. Il ’est ai si lai e e t pas adapté aux utilisateurs finaux de ces techniques que seraient les biologistes ou les médecins.
Ce verrou technologique important semble néanmoins pouvoir être surmonté par le développement important de l'optique fibrée en général, et depuis la fin des années 90, par le développement des fibres optiques microstruturées en particulier. En effet, de nombreuses démonstrations ont remplacé un des deux lasers par une fibre optique, menant à un dispositif plus simple, meilleur marché et moins encombrant.
3 Division d'une cellule mère en deux cellules filles.
4 Mort programmée d'une cellule en réponse à un signal.
Dans le même temps, d'autres techniques utilisant l'optique non-linéaire ont été appliquées à l'imagerie cellulaire, comme les techniques de fluorescence par absorption à deux photons ou encore la génération de seconde harmonique (ou SHG). Ces techniques, complémentaires de la microscopie CARS, ne nécessitent qu'un seul laser, qui peut par exemple correspondre à un des deux lasers employés pour cette dernière. Ainsi, un dispositif de microscopie CARS devient non seulement la base d'une technique prometteuse, mais également celle d'autres techniques. Cette démarche intellectuelle a abouti aux sources dites "multimodales", promises à un grand avenir. Leur importance scientifique et économique a par ailleurs été illustrée par un dépôt de brevet [J.- X. Cheng, 2010].
De plus, ces techniques non-linéaires ne sont pas les seules à s'être développées au cours des vingt dernières années. D'autres techniques, longtemps limitées par la complexité de leur mise en œu e, o t gale e t pu fi ie des a a es des sou es lase ult a es et des semi- conducteurs. On peut citer l'imagerie photoacoustique ou encore l'imagerie aux fréquences térahertz. Ces techniques sont également complémentaires de la microscopie CARS car elles peuvent apporter des informations morphologiques.
On peut ainsi se servir de cette réflexion pour mettre en place une boucle de rétroaction qui part d'une veille technologique des différents systèmes d'imagerie pour arriver, si cela s'avère possible, à une évolution de la source multimodale développée. Cette progression est illustrée en Figure 0-2, qui la représente sous une forme inspirée, à dessein, de la fameuse roue de Deming illustrant la célèbre formule "Plan, Do, Check, Act" chère aux stratégies de développement continu.
Figure 0-2 : Principe de la "boucle de rétroaction de veille technologique".
Au vu de tout cela, le développement d'une source optique fibrée pour la microscopie CARS, constituant une plateforme de base pour d'autres méthodes d'imagerie, prend une importance particulière. C'est ainsi que le projet ANR SOFICARS (Sources Optiques FIbrées pour la microscopie CARS, code ANR-07-RIB-013-03) a vu le jour au cours de l'année 2007, fruit d'une réflexion entre les laboratoires Interdisciplinaire Carnot de Bourgogne (LICB) de Dijon, Fresnel de Marseille, FEMTO-ST de Besançon, la société Amplitude Systèmes de Bordeaux et la di isio Re he he de l’O al. Cette thèse, débutée au mois de décembre 2009, s'inscrit donc dans la continuité de ce projet qui proposait à l'origine deux approches pour la génération des faisceaux nécessaires : l'auto-décalage en fréquence optique d'une impulsion, approche suivie à Dijon, et le contrôle de la phase spectrale
d'un signal spectralement large appelé supercontinuum. De plus, le cadre très appliqué de ce projet, ainsi que son important potentiel économique et innovant, concorde avec l'orientation du Plan d'Action Régional pour l'Innovation (PARI) mis en place en Région Bourgogne. Ce PARI prévoit notamment, dans le cadre du dispositif JCE (Jeunes Chercheurs Entrepreneurs) la sensibilisation à l'entreprise et à l'innovation de doctorants afin de stimuler le tissu économique local. Cette sensibilisation est effectuée par le suivi du Master Administration des Entreprises et d'une formation courte par l'incubateur d'entreprises PREMICE. Cette thèse a pu se dérouler grâce à ce dispositif et a été pleinement influencés par les méthodes de gestion et de veille technologique abordées au cours de ces formations.
En accord avec l'approche décrite par la boucle de rétroaction, le premier chapitre de cette thèse effectue une veille technologique des techniques existantes, puis pose les bases théoriques et pratiques de la microscopie CARS, qui permettent d'aboutir à un cahier des charges des impulsions requises. Il présente ensuite les dispositifs fibrés existants qui répondent pour tout ou partie à ce cahier des charges, et des éléments de théorie des fibres optiques utilisées au cours de ce travail de thèse.
Le deuxième chapitre présente les travaux effectués sur l'auto-décalage en fréquence optique d'un soliton, qui permettra, au sein du dispositif entier, de créer les impulsions Stokes nécessaires à l'imagerie CARS. Ces travaux aboutiront à des règles simples à respecter pour concevoir une fibre optique adéquate. Ces règles seront confirmées par des mesures de spectres de solitons décalés.
Cet effet de décalage en fréquence optique permettant donc de produire "de la longueur d'onde à la demande", deux applications annexes de cet effet sont présentées dans le chapitre 3. Il s'agit pour la première de l'amplification de faibles fluctuations relatives d'énergie d'un train d'impulsions qui a permis notamment d'appuyer des mesures de stabilité de ces impulsions décalées.
La seconde application est tournée vers la tomographie en cohérence optique (ou OCT : Optical Coherence Tomography) avec la production, par balayage rapide de la longueur d'onde centrale des impulsions, de signaux spectralement larges qui sont une voie d'amélioration de la résolution spatiale de ce type d'imagerie.
Le quatrième chapitre traite de l'obtention d'une bonne résolution spectrale en imagerie CARS par le processus de compression spectrale des impulsions de l'oscillateur utilisé. Ce processus de
"regroupement spectral sans pertes" permettra d'aboutir à des impulsions de largeur spectrale d'environ 10 cm-1, pour des impulsions initiales d'environ 70 cm-1.
Enfin, le cinquième chapitre présentera l'aboutissement du travail effectué dans les chapitres précédents avec l'utilisation des impulsions produites pour la génération de signaux CARS d'échantillons de référence. Cette génération nécessitant la synchronisation des impulsions pompe et Stokes, ce chapitre présentera également le contrôle de cette synchronisation par processus d'absorption à deux photons dans une photodiode, qui mènera à d'intéressants résultats annexes sur les caractéristiques des fibres et des impulsions employées. Ce chapitre présentera également, en accord avec la réflexion générale de ce travail de thèse, les possibilités d'évolution du dispositif existant vers une source d'imagerie multimodale. Enfin, les thématiques développées au cours de cette thèse, associées aux savoirs faire du laboratoire, permettront de proposer une source alternative à partir des longueurs d'onde des télécommunications optiques, soit 1550 nm.
1 Contexte et théorie
L’i t odu tio a p se t u e te h i ue d’i age ie o -linéaire, le CARS, comme technique pouvant palier aux limitations des techniques conventionnelles. Elle a également introduit d'autres te h i ues pou a t s'a e o pl e tai es. Ai si, a a t d’a o de la i os opie CARS da s ses aspects physiques et technologiques, ce chapitre présente les techniques d'imagerie non-linéaires et d'autres techniques émergentes ou en plein essor. Cette bibliographie permet non-seulement d’ide tifie des te h i ues o pl e tai es, ais gale e t de placer cette technique dans son
"environnement concurrentiel".
La p e i e pa tie s’i t esse au ph o es ph si ues sous-tendant les différentes te h i ues d’i age ie. Ai si, elle ’a o de pas les te h i ues o e :
les techniques et dispositifs d'endoscopie [M. Merman, 2011]
les techniques de microscopie de polarisation, qui reposent sur l'analyse de la polarisation d'un signal issu d'une technique mono ou multi-photon [Brasselet, 2011]
les techniques de mise en forme de front d'onde [I.M. Vellekoop, 2007]
Ensuite, la deuxième partie présente la microscopie CARS sur le plan théorique et des configurations expérimentales courantes. La troisième partie présente les sources optiques fibrés susceptibles de lever le verrou technologique limitant actuellement sa diffusion aux milieux de la biologie et de la médecine et présente également des éléments de théorie d'optique fibrée nécessaires à la compréhension du fonctionnement de ces systèmes et aux chapitres suivants.
1.1 Les techniques d'imagerie avancées
1.1.1 Les techniques multi-photons
1.1.1.1 Origine physique et avantages de ces techniques
De manière simplifiée, on peut considérer le milieu de propagation des ondes comme un e se le de pa ti ules ha g es io s et le t o s . Lo s de la p opagatio d’u ha p le t i ue dans ce milieu, les ions se déplacent dans le sens du champ et les électrons dans le sens opposé. Il se créé donc un moment dipolaire, défini au niveau atomique par avec α la polarisabilité et au niveau macroscopique par , avec la susceptibilité du milieu, N le nombre d’ l e ts et 0 la permittivité diélectrique.
L’app o i atio de Bo n-Oppenheimer permet de découpler le mouvement des électrons de celui des atomes, et de ne considérer que le mouvement des électrons dans un réseau fixe de noyaux atomiques. Le champ électrique appliqué étant un champ oscillant, les électrons vont également os ille . Leu ou e e t peut t e d it, e a i ue lassi ue, pa u od le d’os illateu amorti de Lorentz :
(1.1)
avec x la positio d’u électron, u oeffi ie t d’a o tisse e t et la fréquence de résonance de l’os illateu (k étant une constante de rappel et m la masse de l'électron). Sans les te es e t e o hets, les le t o s o t u ou e e t d’os illateu ha o i ue a o ti lassi ue.
Pour des intensités inférieures au seuil d'endommagement, on peut résoudre cette équation par la méthode des perturbations, en développant la solution x(t) en puissances du champ électrique. Ceci amène à développer la polarisation de la même manière et de calculer les susceptibilités des différents ordres :
(1.2) O oit ai si appa aît e des sus epti ilit s d’o d es sup ieu s ui so t à l’o igi e des effets non-linéaires étudiés, à savoir les effets de composition de fréquences. Les compositions de fréquences classiques sont représentées en Figure 1-1 et seront détaillées par la suite. Cette expression de la polarisation suppose des susceptibilités
indépendantes de la fréquence (approximation valable loin des résonances électroniques),
instantanées (approximation valable en comparant le temps de réponse du nuage électronique, inférieur à la femtoseconde, aux durées des impulsions employées, supérieures à la dizaine de femtosecondes),
localisées dans l'espace.
Elle est alors p ise e o pte à l'aide des uatio s de Ma ell pou a outi à l’ uatio d’o de, ase de tout p o l e d’opti ue o -linéaire :
(1.3) Ai si, la solutio de tout p o l e d’opti ue non-linéaire revient, en premier lieu, à déterminer PNL. On rappelle également que les effets non-li ai es d’o d e pai e peu e t se p odui e u’au sei de ilieu o -centrosymétriques. Ils apparaissent ainsi au sein de certains cristaux inorganiques ou à l’i te fa e e t e u e ellule iologi ue et so ilieu, ais pas pa exemple au sein de la silice amorphe qui constitue le verre des fibres optiques courantes. En revanche, les effets non-li ai es d’o d e i pai peu e t a oi lieu da s tout ilieu.
Figure 1-1 : Diagrammes d'énergie de différents processus non-linéaires, résonnants ou non. (a) SHG : Génération de seconde harmonique. (b) THG : Génération de troisième harmonique. (c) SFG : Génération de fréquence somme. (d) S-CARS : Diffusion Cohérente Raman anti-Stokes "Simplex". (e) M- CARS : Diffusion Cohérente Raman anti-Stokes "Multiplex". (f) SRS : Diffusion Raman Stimulée. On distingue les modes de fonctionnement en SRG (Stimulated Raman Gain) et SRL : Stimulated Raman Loss).
Enfin, l'équation 1.3 permet de faire apparaître assez simplement, au travers de l'exemple de la somme de fréquence (Figure 1-1 (c)) dans un milieu non-linéaire d'ordre 2 de longueur L, la notion d'accord de phase. En effet, dans ce milieu, la polarisation non-linéaire s'exprime comme avec Ai, ki et ωi les amplitude, vecteur d'onde et fréquence des différentes ondes. L'injection dans l'équation 1.3 amène
(1.4)
avec k = k1 + k2 - k3. Une méthode répandue, pour maximiser l'intensité de la composante de fréquence somme, est de maximiser le sinus cardinal, en "faisant correspondre" les vecteurs d'onde (satisfaction de l'accord de phase) ou en rapprochant le plus possible la longueur d'interaction de la longueur de cohérence du processus, définie comme | / k|. La première stratégie a donné naissance aux configurations spatiales de faisceaux de type "BOXCARS" (partie 1.2.2). La seconde correspond à la configuration "tight focusing" employée en microscopie CARS.
En termes d'ordres de grandeur, (1)≈ 1, (2)≈ 10-12 m/V, et (3)≈ 10-24 m²/V², pour les ordres les plus fréquemment abordés. Ainsi, les termes d'ordres supérieurs ne deviennent importants que pour des champs électriques importants, typiquement fournis par les lasers. Cet état de fait est intéressant car le signal non-linéaire peut ainsi être uniquement généré au point de focalisation du laser utilisé, aboutissant à une résolution spatiale intrinsèque. Cet avantage est clairement illustré par la Figure 1-2, qui représente la comparaison entre un signal de fluorescence linéaire (trainée en haut de la cuve) et non-linéaire (point en bas de la cuve).
Le second avantage, également parfaitement illustré par les techniques de fluorescence, réside dans les longueurs d'onde utilisées. En effet, au lieu d'éclairer l'échantillon biologique avec des longueurs d'ondes visibles et donc sujettes à absorption linéaire et produisant un échauffement, des longueurs d'onde du proche infrarouge (≈ 700-1000 nm) sont utilisées et résultent en un échauffement limité et une profondeur de pénétration accrue.
Enfin, l'utilisation d'impulsions ultra-courtes (picoseconde à femtoseconde) permet de bénéficier de puissances crête importantes, nécessaires à la génération d'un signal analysable, pour des puissances moyennes faibles et donc une fois encore compatibles avec les milieux biologiques.
Figure 1-2 : Illustration de la résolution spatiale intrinsèque aux techniques d'analyse non-linéaires.
L'échantillon est une solution de fluorescéine excitée linéairement par une lampe à vapeur de mercure (≈ 436 nm) et non-linéairement par un laser titane:saphir (≈ 800 nm). Illustration adaptée de [Guiot, 2001].
Les notions générales d'optique non-linéaire étant posées, il est maintenant possible de s'intéresser aux techniques utilisant cette optique, comme les techniques de sommes de fréquences.
1.1.1.2 Les sommes de fréquences
Ce terme rassemble les générations de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques (Figure 1-1 (a) et (b)) et la génération de fréquence somme (SFG, Figure 1-1 (c)). La Figure 1-3 ci- dessous donne deux exemples d'imagerie par somme de fréquences avec des images de fibres de collagène présentes sous la surface du foie par SHG (figure (a)) et de lipides (repérés par les points blancs) dans des cellules vivantes de KB (cellules cancéreuses) par THG (figure (b)).
Figure 1-3 : Exemples d'imagerie non-linéaire par somme de fréquences employant une longueur d'onde de 1290 nm (d'après [H. Chen, 2009]. (a) image de tissu de foie par SHG. (b) Image de lipides dans une cellule vivante de KB, par THG.
Comme évoqué précédemment, ces techniques nécessitent un accord de phase pour la génération d'un signal exploitable, qui est généralement respecté autour de particularités morphologiques des tissus étudiés. Par exemple, la THG nécessite une interface entre deux milieux d'indices différents et est pertinente pour l'analyse de membranes cellulaires. Comme tout effet non- linéaire d'ordre deux, la SHG nécessite un milieu non centro-symétrique, à l'image des longilignes lipides, des fibres de collagène5 ou encore des filaments de myosine6. Les données morphologiques fournies par ces techniques sont complémentaires de techniques non-linéaires vibrationnelles o e l’i age ie CARS ou SRS ou o e les te h i ues de fluo es e e. De plus, l’a o d de phase essai e à es te h i ues fait ue les adiatio s g es s’additio e t de a i e oh e te, et résultent donc en un signal fort.
Pour générer un signal exploitable, elles essite t l’e ploi d’i pulsio s ult a-courtes (picoseconde à femtoseconde), de quelques centaines de picoJoules, pour un temps d'exposition de l’o d e de la e tai e de microsecondes [J. Sun, 2004].
Dès le début des années 2000, des dispositifs d'imagerie combinant l'observation de plusieurs effets (SHG et THG, SHG et TPEF, TPEF et CARS...) sont apparus. Ce type d'imagerie est appelée imagerie multimodale et présente une piste d'évolution évidente pour la source développée. Le chapitre 5 traite de ces évolutions.
5 Famille de protéines dites structurantes, le plus souvent de forme fibrillaire et peu élastique, qui confèrent une rigidité et une forme aux organismes.
6 Constituant des fibres musculaires, responsables de la contraction de ces derniers.
1.1.1.3 Les techniques de diffusion Raman cohérente (ou DRC)
Deux techniques, mises au point dans les années 60, ont connu un développement important en biophotonique dans les années 2000. Ce sont des techniques de Diffusion Raman Cohérente (DRC, ou CRS, pour Coherent Raman Scattering), respectivement nommées
CARS : Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, ou Diffusion Raman Anti-Stokes Cohérente (DRASC, en français), dont le principe est représenté en Figure 1-1 (d) et (e).
SRS : Stimulated Raman Scattering, ou diffusion Raman stimulée, dont le principe est représenté en Figure 1-1 (f).
Ces techniques sont présentées en partie 1.2. Elles présentent l'avantage d'exploiter les vibrations moléculaires au travers du processus de diffusion inélastique Raman. Elles fournissent ainsi une information liée à la nature chimique de l'échantillon et ce sans marqueur ou modification spécifique de ce dernier. Elles ont ainsi permis, notamment, le suivi des mitose ou apoptose cellulaires [J.-X. Cheng, 2002a] ou encore le suivi du développement intra-cellulaire du virus de l’h patite C [X. Nan, 2006a].
Cet aspect est un avantage de taille par rapport aux techniques, répandues, utilisant le processus de fluorescence. Un autre avantage, cette fois sur les techniques de sommes de fréquences, est qu'elles ne requièrent pas de spécificités morphologiques et permettent donc l'imagerie de tout type et de toute partie d'un tissu biologique. Enfin, ces techniques excitant de manière cohérente les liaisons moléculaires sondées, elles procurent un gain significatif en intensité par rapport à la microscopie Raman spontanée (105 environ). Une illustration de ces techniques est donnée en Figure 1-4 ci-dessous, qui compare des images de la liaison CH2 de cellules de stratum corneum (surface de la peau) à la fréquence de résonance de cette liaison (2845 cm-1) et en dehors (2780 cm-1), acquises en utilisant les processus CARS et SRS.
Figure 1-4 : Comparaison d'images de cellules de stratum corneum (surface de la peau) acquises par microscopies SRS (a1, a2) et CARS (b1,b2), d'après [C.W. Freudiger, 2008]. SRL : Stimulated Raman Loss, qui correspond à un "mode de fonctionnement" de l'imagerie SRS.
Deux remarques générales sont à apporter à cette figure. En premier lieu, les cellules polygonales typiques de la surface de la peau sont clairement visibles par les deux techniques ce qui
o t e leu pe ti e e pou l’i age ie ellulai e.
La seconde remarque constitue une sorte de comparaison entre les processus CARS et SRS. En effet, l'image acquise par SRS hors résonance (figure (a2)) ne contient aucun signal alors que l'image acquise par CARS en contient. De plus, un spectre acquis par SRS correspond directement au spectre Raman spo ta , e ui ’est pas le as e CARS. Cette diff e e est due à la p se e systématique, en imagerie CARS, d'un signal non-résonnant qui peut masquer le signal résonnant
o te a t g ale e t l’i fo atio e he h e. Cet aspe t est responsable de l'ascendant actuel, en recherche, de la technique de SRS sur celles exploitant l'effet CARS. Cependant, on verra plus loin ue la ise e œu e d’u e i age ie pa SRS est plus o ple e te h ologi ue e t ue la ise e œu e d’u e i age ie par CARS.
Pour acquérir des images de 256*256 pixels en un temps raisonnable (seconde), ces techniques nécessitent deux impulsions de caractéristiques similaires que celles employées dans les techniques de somme de fréquences et dont le décalage en fréquence correspond à une fréquence de vibration moléculaire. Le fait que ces deux impulsions doivent être décalées en longueur d'onde et s h o is es a outit à des sou es lu i euses o ple es de ise e œu e et d'utilisatio . Ces sources constituent ainsi, actuellement, un verrou technologique important qui freine la diffusion de ces techniques, pourtant prometteuses, dans les communautés de la biologie ou de la médecine.
1.1.1.4 Les techniques de fluorescence
Les techniques de fluorescence exploitent les résonances électroniques des molécules [Guiot,
2001], au lieu, par exemple, des résonances vibrationnelles dans le cas des techniques de diffusion Raman. Le principe est représenté en Figure 1-5 (a), au travers d'un diagramme d'énergie qui détaille quelques niveaux électroniques (S0 à S2 et T1) et leurs sous- i eau i atio els. Da s le ad e d’u e absorption non-linéaire, on constate que plusieurs photons, dont la somme des énergies correspond à u e e gie d’u tat le t o i ue e it , so t a so s. Pa la suite, des ela atio s pa the alisatio s’effe tue t et u sig al, soit de fluo es e e, soit de phospho es e e, est is. Ce ph o e de the alisatio a a t l’ issio du photo fi al est à l’o igi e de la pe te de oh e e e t e le photo is a e les photo s i ide ts, et d’u e e gie du photo is plus fai le ue l’ e gie d’e itatio . Cette diff e e d' e gie ésulte en un décalage, dit de « Stokes »,
e s les asses f ue es du spe t e d’ issio pa appo t au spe t e d’a so ptio .
Figure 1-5 : Principe des techniques de fluorescence. (a) TPF : Génération de fluorescence par absorption à deux photons (aussi appelée TPFE : Two Photon Fluorescnece Emission). (b) Imagerie par fluorescence bi- photo i ue de tissus de foie d’u e sou is e g aiss e d’ap s [H. Chen, 2009]).
Enfin, il peut être nécessaire de greffer des molécules fluorescentes, appelées fluorophores, sur les entités biologiques à imager, ou de "fusionner" une protéine d'intérêt avec une protéine fluorescente particulière [H. Rigneault, 2005]. Les processus induits étant électroniques et donc énergétiques, le fluorophore peut subir des modifications chimiques (généralement, une oxydation) et perdre sa propriété de fluorescence. Ce phénomène est appelé photoblanchiement et constitue la principale faiblesse de ces techniques.
Outre cette faiblesse, les techniques utilisant le phénomène de fluorescence constitue un ha p d’a al se e t e e t i he ui a o duit au d eloppe e t de o euses thodes. La mesure du temps de vie de la fluorescence (FLIM), la mesure du transfert d'énergie entre fluorophores (FRET), l'autocorrélation du signal de fluorescence (FCS), ou encore la mesure de fluorescence après photoblanchiement (FRAP), sont autant de techniques performantes pour étudier les dynamiques moléculaires et cellulaires.
L’ issio de fluo es e e pa a so ptio ulti-photon, abusivement appelée "fluorescence multi-photon", ou "fluorescence à deux photons" ou "à trois photons" selon le nombre de photons absorbés, présente les avantages habituels des techniques multiphotons classiques, à savoir la lo alisatio spatiale et l’e ploi d’i pulsio s ult a ou tes ui di i ue t la puissa e o e e nécessaire. Un autre avantage, inhérent au processus de fluorescence, est que le risque de photoblanchiement ’a ai si lieu u’au poi t de fo alisatio , e ui pe et, e asso iatio a e la localisation spatiale, une imagerie en trois dimensions.
Les impulsions requises sont, une fois encore, des impulsions picoseconde à femtoseconde d’u e e tai e de pi oJoules. Leu lo gueu d’o de se situe id ale e t e t e et nm (absorption biphotonique) ou entre 1000 et 1500 nm (absorption triphotonique). Cette technique permet des images du type de celles de la Figure 1-5 , ui ep se te l’i age ie de tissus de foie de souris.
Les techniques multi-photo s pe ette t u e g a de i hesse d’i age ie et o t des ava tages i d ia les. U g a d ava tage est u’elles e ui e t toutes les es
a a t isti ues d’i pulsio s.
1.1.2 Autres techniques récentes
La décennie 2001-2010 a vu le dé eloppe e t i po ta t d’aut es te h i ues. O peut ite par exemple les techniques « d’ hog aphie opti ue », ou OCT, ou encore les techniques employant les rayonnements térahertz. Il est intéressant d'étudier ces techniques afin de vérifier si elles sont d’u e pa t edo da tes ou suppl e tai es à l’i age ie CARS, et d’aut e pa t si la sou e développée peut permettre ces imageries.
1.1.2.1 Imagerie par tomographie optique cohérente
La Tomographie de Cohérence Optique (ou OCT, pour Optical Coherence Tomography) est l’ ui ale t opti ue de l’ hog aphie ui pe et d’effe tue des i ages de haute solutio ≈ 1- 15 µm), en trois dimensions et à cadence vidéo, en mesurant des « échos optiques » [D. Huang, 1991, W. Drexler, 2008, Sacchet, 2010]. De fait, ses propriétés la situent à mi-chemin entre les techniques optiques (microscopie) et ultra-sonores (échographie) en termes de profondeur de
pénétration ( uel ues et de p isio . Elle pe et u g a d o e d’appli atio s li i ues où les biopsies sont dangereuses ou sujettes à erreurs.
Figure 1-6 : Caractéristiques générales d'un système d'OCT (tirées de [Sacchet, 2010]). (a) Schéma de principe du dispositif. (b) Exemple d'imagerie de rétine par OCT, d'après [W. Drexler, 2001].
Un dispositif de tomographie classique est représenté en Figure 1-6 (a) et repose sur la structure d'un interféromètre de Michelson. La lumière incidente est divisée en un faisceau référence qui est simplement réfléchi par un miroir et un faisceau signal qui est focalisé sur l’ ha tillo . Ce de ie est t odiffus / t o-réfléchi aux changements de propriétés optiques de l’ ha tillo pa e e ple à l’i te fa e de la ti e a e le este de l’œil e ui se t aduit pa u e différence de marche variable qui est mesurée.
Deux méthodes de traitement du signal se détachent : une méthode « temporelle » et une méthode « spectrale ». La méthode temporelle (TD-OCT : Time Domain Optical Coherence To og aph utilise u d lai gla le i t oduit da s le fais eau de f e e. L’e egistrement du sig al d’i te f e e e fo tio de e d lai pe et de e o te à la p ofo deu de fle io et ai si à la o positio st u tu elle de l’ ha tillo . Cette thode essite u e sou e la ge-bande, dont la longueur de cohérence détermine la résolution spatiale. La méthode spectrale se divise en deux
« sous-méthodes » : la tomographie dans le domaine spectral (SD-OCT : Spectral Domain Optical Coherence Tomography), qui utilise également une source large bande, et la tomographie avec source à balayage spectral (SS-OCT : Swept Source Optical Coherence Tomography), qui utilise une sou e ala a le e f ue e. Elle poss de l’a a tage de e pas e plo e de pa ties o iles e ui permet un gain en sensibilité de 50 à 100 qui est nécessaire pour des mesures in-vivo dans lesquelles le patie t ouge et do d t io e le sig al d’i te f o t ie. Figure 1-6 (b) donne un exemple des performances des systèmes d'OCT via une image de rétine.
Une importante source de recherche se situe dans la mise au point de sources lumineuses ad uates. Da s e ad e, le hapit e o sa e u e pa tie à la p odu tio d’u e telle sou e.
1.1.2.2 Imagerie photoacoustique
Cette technique repose sur la création d'ondes acoustiques par échauffement thermique soudain, l'effet thermo acoustique [M. Xu, 2006]. Quand une onde électromagnétique, de préférence radiofréquence ou visible-proche infrarouge (400-900 nm) vient frapper l'échantillon, elle est partiellement absorbée et créé un échauffement local qui résulte en une onde acoustique. Cette dernière atteint la surface avec différents délais. Des détecteurs enregistrent les délais et les amplitudes et via un algorithme inverse retrouvent les positions d'échauffement et les propriétés des tissus. Placés tout autour de l'échantillon, ils permettent une imagerie en trois dimensions. Cette technique est appelée Tomographie photoaoustique, optoacoustique ou thermoacoustique.
