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Rôle des gènes homologues à terD dans le cycle vital de Streptomyces coelicolor

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(1)

ROLE DES GENES HOMOLOGUES A terO DANS LE CYCLE VITAL DE STREPTOAdYCES COELICOLOR

Par Edith Sanssouci

thèse présentée au Département de biologie en vue de l'obtention du grade de docteur es sciences (Ph. D.)

FACULTE DES SCIENCES

UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE

(2)

?F?

Library and Archives Canada Published Heritage Branch 395 Wellington Street Ottawa ON K1A 0N4 Canada Bibliothèque et Archives Canada Direction du Patrimoine de l'édition 395, rue Wellington Ottawa ON K1A 0N4 Canada

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1+1

(3)

Le 11 août 2010

lejury a accepté la thèse de Madame Edith Sanssouci

dans sa versionfinale.

Membres du jury Professeure Carole Beaulieu

Directrice de recherche

Département de biologie Professeur Ryszard Brzezinski

Membre

Département de biologie

Monsieur Hani Antoun Membre externe Université Laval Professeur Claude Déry

Président rapporteur

(4)

SOMMAIRE

Les streptomycètes, des bactéries au développement morphologique complexe, sont étudiés

depuis des décennies en raison de leurs caractéristiques particulières incluant leur capacité à

produire une grande diversité d'enzymes hydrolytiques et de molécules complexes telle que

des centaines d'antibiotiques. Streptomyces coelicolor est l'organisme modèle pour l'étude des

streptomycètes et le séquençage de son génome a ouvert la voie à l'étude de centaines de

gènes dont la fonction est jusqu'à présent inconnue.

La protéine TerD du Serratia marcescens joue un rôle dans la résistance au tellurite chez cet

organisme. Plusieurs orthologues de cette protéine ont été identifiés chez le S. coelicolor. Sur

la base de la similarité de leurs séquences avec la protéine TerD, ces protéines du S. coelicolor

ont été désignées comme des protéines de résistance au tellurite. Ces mêmes protéines ont été

identifiées comme étant induites ou réprimées dans de nombreuses conditions exemptes de

tellurite, laissant croire qu'elles participent à d'autres voies métaboliques.

Au cours de ce travail de doctorat, des souches mutantes du S. coelicolor ont été produites

pour les gènes SC02367, SC02368 et SC04277, trois gènes homologues à ierO, afin

d'évaluer les répercussions de la perte de ces gènes chez la bactérie. Les souches ont été

caractérisées morphologiquement et nous avons démontré que la deletion de ces gènes nuit

sérieusement au développement de la bactérie, à la production de spores et à la vitesse de

croissance.

(5)

Parallèlement, une approche protéomique a été utilisée afin de caractériser les effets de la

deletion ou de la surexpression du gène SC02368 sur la biosynthèse des protéines intracellulaires et extracellulaires de la bactérie. Ceci a permis de démontrer qu'une grande

quantité de protéines reliées au stress sont induites chez les deux souches mutantes, laissant

présumer qu'un déséquilibre dans le taux de cette protéine induit un stress physiologique

important. Par ailleurs, différentes isoformes de la protéine SC02368 ont été identifiées tant

au niveau intracellulaire que dans le milieu extracellulaire. Par l'analyse des modifications

post-traductionnelles de ces isoformes, nous avons prouvé que celles-ci étaient méthylées sur

plusieurs acides aminés.

De plus, nous avons démontré que la transcription du gène SC02368 n'est pas induite par la

présence de tellurite. Ces résultats démontrent que les gènes homologues à terD ont une autre

fonction que la résistance au tellurite et qu'ils jouent vraisemblablement un rôle dans la

morphogénèse.

Streptomycète, différenciation, morphologie, sporulation, stress, tellurite, protéomique,

(6)

REMERCIEMENTS

La deuxième décennie du 21e siècle débute au moment où j'écris ces lignes. Avant de passer à

une autre étape de ma vie, j'aimerais prendre le temps de remercier toutes les personnes qui

m'ont soutenue et encouragée durant mes années d'études doctorales. D'abord, je remercie

grandement ma directrice de recherche, Carole Beaulieu, pour la confiance qu'elle m'a

accordée, pour son positivisme et sa précieuse aide. Elle a toujours cru en moi et en mon projet de recherche, et ce, jusqu'à la fin.

Je remercie également mes conseillers, Ryszard Brzezinski et Claude Déry pour leurs conseils

ainsi que leur pensée critique. Ils m'ont aidée à percevoir mon projet sous différents angles

afin de mieux le développer. Merci également à François Shareck avec qui j'ai collaboré pour la création des souches mutantes du S. coelicolor et qui a été membre externe sur mon comité

d'examen prédoctoral. Je suis également reconnaissante aux organismes subventionnaires qui

ont financé mon projet et desquels j'ai obtenu des bourses, soient le CRSNG et le FQRNT.

J'ai passé de très beaux moments dans le laboratoire de Carole Beaulieu et c'est en grande

partie grâce à toutes les personnes géniales qui y sont passées au cours des années. Pour leur

amitié, leurs conseils, leur écoute, leur aide, je remercie particulièrement Marie-Pierre, Gabriella, Nathalie, Isabelle, Véronique, Sandra, Geneviève, Sylvain et Anne-Marie. Merci également aux stagiaires qui m'ont aidée dans certaines étapes du projet, spécialement Véronique Barrés. Je remercie également mes parents et ma famille pour leur soutien et leurs encouragements, et ce, depuis toujours. Merci à mon conjoint Chandi pour son support

(7)

TABLE DES MATIÈRES

SOMMAIRE ?

REMERCIEMENTS · iv

TABLE DES MATIÈRES v

LISTEDESTABLEAUX vii

LISTE DES FIGURES ix

INTRODUCTION : J

CHAPITRE 1

1.0 Les gènes codant pour des protéines ayant un domaine TerD : une classe de

gènes impliqués dans la différenciation chez le Streptomyces coelicolor ....35

1.1 Sanssouci, E., Lerat, S., Grondin, G., Shareck, F. et Beaulieu, C. The TerD domain-encoding genes: a class of genes involved in Streptomyces coelicolor differentiation (soumis pour publication dans J. Bacteriol.) 37

CHAPITRE 2

2.0 Profils protéomiques des souches du S. coelicolor ayant une deletion ou

surexprimant le gène tdcfà codant pour une protéine ayant un domaine

(8)

2.1 Sanssouci, E. et Beaulieu, C. Proteomic profiles of Streptomyces coelicolor strains lacking or overexpressing the TerD domain encoding gene tddS (soumis pour publication dans J. Bacteriol.) 74

CONCLUSION 104

(9)

LISTE DES TABLEAUX

INTRODUCTION

1. Informations relatives aux protéines du S.coelicolor possédant un ou deux domaines

TerD 26

2. Résumé des publications portant sur des études protéomiques ou transcriptomiques chez

le S. coelicolor et faisant mention de l'un ou l'autre des gènes codant pour des protéines

homologues à TerD 33

CHAPITRE 1

1. Bacterial strains andplasmids used in this study 47

2. Oligonucleotide primers used in this study 48

3. S. coelicolor TerD domain-containing proteins 49

4. K2Te03 Minimal inhibitory concentration (MIC) for bacterial species carrying ter

genes 51

5. Main characteristics of S. coelicolor strains differentially expressing tdc/8 53

(10)

S2. Expression of complementation genes and minimal inhibitory concentration (MIC) for

K2TeO3 in strains ESC2367, ESC2368 and ESC 4277 compared to wild-type strain M145.

The expression of tddl and tdd\2> was restored at approximately 30% in the

complementation strains ESC2367 and ESC4277, respectively. ESC4277 has an

intermediate phenotype between the wild strain and deletion strain regarding the MIC

for K2TeO3

70

CHAPITRE 2

1. Strains and plasmids used in this study

84

2. Function of intracellular and extracellular proteins differentially expressed within

(11)

LISTE DES FIGURES

INTRODUCTION

1. Représentation schématique du développement vertical chez les Streptomyces

(Manteca et al, 2007) 5

2. Réorganisation des processus biologiques durant la différenciation des hyphes

aériennes en chaînes de spores (Flärdh et Butiner, 2009) 8 3. Fonctions extracellulaires , dépendantes de MdA chez le S. coelicolor

(Chater et Chandra, 2008) 10

4. Modèle du rôle de certaines enzymes (et de certains de leurs produits) de la voie métabolique de la cysteine en réponse à la présence de K^TeOs

(Chasteen et al, 2009) 18

5. Comparaison des gènes de résistance au tellurite ter selon les différentes sources

(Taylor et al, 2002) 23

6. Arbre phylogénétique des protéines du S. coelicolor ayant un domaine TerD et des

(12)

CHAPITRE 1

1. Deletion effect of iddi, tddS and tdd\3 on the morphology of Streptomyces coelicolor colonies. M145, ESD2367 (Atddl), ESO236S{AtddS) and ESD4277 (Atddl3) colonies

after 3, 5, 7, 10 and 17 days of growth on SLM-3 medium and corresponding transversal

cuts of the colonies observed under 50x magnification. Bars: 1 mm, nd: not

determined 52

2. Growth of (A) S. coelicolor M145 and ESD2368 (AtddS) and (B) ESM145 (carrying the

pFDES empty vector) and the over-expression strain ESS2368 in TSB. Vertical bars

indicate SD 53

3. Spores production by S. coelicolor M145, ESD2368 (AtddS), ESM145 (carrying the

pFDES empty vector), the over-expression strain ESS2368 after 6 days of growth on

SLM-3 medium, the complementation strain ESC2368 and the control strain ESCM145

(carrying the pSET152m empty vector) after 8 days of growth on SLM-3 medium. The

same strain was streaked twice at opposite positions. The gray pigmentation is associated

with the presence of spores. ESD2368 appears to produce more spores than the wild strain

whereas ESS2368 produces few spores. The complementation strain ESÇ2368 exhibits a

normal phenotype

54

4. Phase contrast microscopy of spore chains of M145, ESD2368 (AtddS), ESM145

(carrying the pFDES empty vector) and the over-expression strain ESS2368 after 4 days

of growth on SLM-3 medium. Bars: 10 µ??. ESD2368 produces very long chains of spores

compared to M145 whereas ESS2368 produces few spores of various size and shape

compared to ESM145. Complementation of ESD2368 (strain ESC2368) restores the

original phenotype as shown in the insert ofthe up left section ofthe figure

56

(13)

5. (A) Scanning electron micrographs of S. coelicolor strains M145, ESD2368 (AtddS), ESM145 (carrying the pFDES empty vector) and the over-expression strain ESS2368; bars: 1 µ??. (B) Transmission electron microscopy of S. coelicolor strains M145,

ESD2368, ESC2368, ESM145 and ESS2368; bars: 100 nm. ESD2368 spores tend to be shorter than those of M145 and exhibit a cubic shape. ESS2368 produces few spores of

variable sizes compared to ESM145. Spores of the complementation strain ESC2368

show a normal shape 57

Sl. Morphological characteristics (isolated colonies and 50x-transversal cuts) of the complementation strains ESC2367 and ESC4277 grown for 10 days on SLM-3. ESC2367

colonies were less wrinkled than in the deletion strain ESD2367 (Fig. Sl). The folding in

the mycelium appeared at 7 days instead of 5 days of growth. The diameter of 4277 is intermediary between those ofmutant sauvage. Bars: 1mm 70

CHAPITRE 2

1. Protein concentration and catechol 2,3-dioxygenase activity associated with J medium culture ofS. coelicolor strains carrying the promotorless reporter gene xylTE (strain ES-I) or the same gene coupled to the promoter of tdd% (ES-2) 85 2. Effect of exposure to 50 µ? of K2TeO3. on the 2,3-dioxygenase specific activity of

S. coelicolor strains carrying the promotorless reporter gene xy/TE (strain ES-I) or the

same gene coupled to the promoter oftddS (ES-2) 86

3. Intracellular proteome of S. coelicolor strains M145 (A), ESD2368 (B) and ESS2368 (C)

(14)

4. Extracellular proteome of S. coelicolor strains M145 (A), ESD2368 (B) and ESS2368 (C)

obtained from 48 h cultures in MG medium 89

5. Separation of intracellular (A) and extracellular proteins (B) of of S. coelicolor strains

M145 (upper gels) and ESD2368 (lower gels) by two-dimensional gel electrophoresis in a

4 to 5 pH range. (C) Post-translational modifications of Tdd8 isoforms shown in panels A

(15)

INTRODUCTION

Le sol constitue un environnement de choix pour les micro-organismes qui y trouvent les éléments nutritifs nécessaires à leur croissance tels que le carbone, l'azote, le phosphate et les différents minéraux. Les milliards de bactéries, champignons, protozoaires, virus, nematodes

et microarthropodes qui peuplent le sol participent au recyclage de la matière organique et la

rendent ainsi disponible pour les plantes. Ces êtres vivent en communautés intimement liées et

entrent en compétition pour les ressources du milieu. L'écologie microbienne étudie le

comportement et les activités des micro-organismes dans leurs environnements naturels ce qui

inclut les interactions entre eux et avec leur milieu. Au sein de cet environnement changeant,

les micro-organismes sont sujets à de nombreux stress biotiques et abiotiques qui influencent

continuellement leur physiologie. Parmi ces stress, on retrouve les variations de température et

de pH, les stress oxydatifs et osmotiques, la disponibilité des minéraux, etc. Pour réussir à

occuper une niche écologique donnée, les micro-organismes mettent en branle de nombreux

processus physiologiques. Ils possèdent diverses classes de gènes leur permettant d'acquérir

les nutriments dont ils ont besoin et de se défendre contre la présence de molécules toxiques

de l'environnement. Parmi ces gènes, certains codent pour des enzymes hydrolytiques

participants à dégradation de divers polymères tels que la cellulose, le xylane, l'amidon et la

chitine; d'autres permettent la synthèse de metabolites tels que les antibiotiques. Par ailleurs,

de nombreux échanges génétiques ont cours entre les micro-organismes. Ainsi, des gènes de

résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds et à certains composés organiques sont, entre

autres, ainsi disséminés entre les espèces en réponse aux pressions de sélection de

l'environnement. Ces gènes évoluent dans le temps et les protéines codées s'en trouvent ainsi

modifiées.

Des séquences de protéines ou de gènes sont dites homologues quand elles découlent d'un

ancêtre commun. Plus la similarité entre deux séquences est grande, plus la probabilité que

(16)

leur origine soit indépendante et leur similarité due à la chance est basse. La similarité peut être au niveau de la séquence ou de la structure, et cette dernière est d'ailleurs bien mieux conservée durant l'évolution. L'évolution de séquences est dite convergente quand plusieurs séquences sont présumées avoir évolué de façon indépendante vers une séquence similaire. Elle est dite divergente quand une séquence est présumée être l'ancêtre commun de plusieurs séquences similaires. L'analyse de séquences d'ADN et de protéines est utilisée pour identifier des homologies et ainsi prédire la fonction biologique des gènes ou des protéines. Elle peut également servir à reconstruire l'historique de l'évolution (Koonin et Galperin, 2002). Il existe deux types fondamentalement différents de gènes homologues : les orthologues qui ont évolué de façon verticale à partir d'un ancêtre commun, et les paralogues qui découlent d'une duplication de gène (Koonin, 2005). L'étude des gènes homologues peut se révéler des plus complexe suivant les multiples événements de spéciation, de duplication, de transfert horizontal, de perte de gènes et de réarrangements génétiques pouvant avoir eu lieu au cours

de l'évolution.

Au cours des dernières années, le séquençage exhaustif de nombreux génomes a révélé une panoplie de nouvelles séquences. Des fonctions putatives ont été assignées à ces nouveaux gènes selon leur taux de similarité avec des gènes aux fonctions préalablement connues. Mais qu'en est-il des gènes qui n'ont pas de similarité avec des gènes de fonction connue? Et les fonctions assignées en raison de la similarité de séquences sont-elles toujours exactes? Énormément de travail de validation devra encore être réalisé afin de s'assurer de la véracité de ces assignations.

Les streptomycètes

Les streptomycètes font partie de l'ordre des actinomycétales et sont des bactéries aérobies, à Gram positif. Ils sont caractérisés par un génome riche en guanine et cytosine ainsi qu'un

(17)

chromosome linéaire de plus de 8 M de paires de bases. Ces bactéries au cycle de vie

complexe colonisent divers milieux de vie, tels les sols, l'air et l'eau (Kieser et al, 2000;

Peltola et al, 2001; Pathom-Aree et al, 2006). Ils comptent pour environ 10 % de la flore

microbienne du sol (Janssen, 2006). La plupart des streptomycètes sont saprophytes et ils sont

fréquemment retrouvés dans la rhizosphère où ils colonisent les racines des plantes. Bien que

la plupart des actinomycètes soient non pathogènes, certaines espèces comme Streptomyces

scabiei, l'agent causal de la gale commune de la pomme de terre, causent des maladies.

Plusieurs actinomycètes non pathogènes sont, par ailleurs, de bons agents de lutte biologique

(You et al, 2007; Aanen et al, 2009; El-Tarabily et al, 2009)

L'intérêt de l'étude de ces bactéries vient en grande partie de leur capacité à produire une

grande variété de metabolites secondaires aux activités biologiques diverses. Parmi ceux-ci, on

retrouve des immunosuppresseurs comme la rapamycine produite par Streptomyces

hygroscopicus utilisée comme agent antirejet lors de greffe d'organes, des agents

antitumoraux (ex : bléomycine, daunorubicine, mitomycine C) et de très nombreux

antibiotiques (ex : chloramphenicol, erythromycin, gentamicine, kanamycine, streptomycine)

(Kieser et al, 2000). De 5000 à 10000 antibiotiques ont été découverts chez les bactéries et les

champignons à ce jour et le seul genre bactérien Streptomyces serait responsable de plus de

50 % de cette production (Challis et Hopwood, 2003). Les streptomycètes sont par ailleurs de

grands producteurs d'enzymes hydrolytiques (ex. : cellulase, ligninase, xylanase, chitinase)

leur permettant de dégrader des polymères biologiques complexes. Streptomyces coelicolor et son cycle de vie

En 2002, le Streptomyces coelicolor A3(2) a été la première espèce de streptomycètes dont le

génome a été complètement séquence (Bentley et al, 2002). Celui-ci comporte 8 667 507

paires de bases avec 72 % de G+C. Ce flot d'informations nouvelles a propulsé les

(18)

connaissances sur cet organisme modèle pourtant étudié depuis des décennies. En effet, des gènes peuvent à présent être amplifiés par PCR très rapidement, des ARNm peuvent être quantifiés aisément grâce à la PCR quantitative en temps réel, des techniques d'interruption génique ciblées peuvent être utilisées pour la création de souches mutantes en remplacement des techniques de mutagenèse aléatoire', etc. Cependant, des 7825 cadres de lecture ouverts du S. coelicolor, seuls 5492 se sont fait assigner une fonction, alors que 2333 sont toujours de

fonction inconnue (Borodina et ai, 2005).

Le cycle de vie du S. coelicolor est étudié scrupuleusement depuis plusieurs années. Les données actuelles permettent de déduire les événements séquentiels suivants. Lorsque les

conditions environnementales sont favorables, le processus de germination des spores se met

en branle. Un ou plusieurs tubes germinatifs émergent d'une spore et s'allongent par extension des hyphes au niveau apical. Les hyphes coenocytiques forment des branchements et s'enchevêtrent pour donner naissance au mycélium basai. Celui-ci poursuit sa croissance en se

ramifiant dans toutes les directions afin d'atteindre les ressources du milieu (Kieser et al,

2000). Récemment, il a été démontré qu'en début de croissance, une portion du mycélium basai subit une mort cellulaire programmée. Ceci provoque une mosaïque de segments viables et non viables. Un second mycélium se développe alors, à partir des segments viables, sous forme d'îlots et s'étend progressivement (Manteca et al, 2007). Lorsque les ressources du milieu deviennent limitées, le processus de différenciation cellulaire débute. Le mycélium basai donne alors naissance au mycélium aérien qui quitte le milieu aqueux et émerge dans les airs. Ce nouveau mycélium est caractérisé par une couleur blanchâtre, un aspect duveteux et des hyphes non branchées. L'érection du mycélium dans les airs est rendue possible grâce à certaines molécules particulières. Premièrement, SapB (spore-associated protein B) est sécrétée durant la phase de développement végétative, en milieu riche seulement, et agirait en tant que surfactant en recouvrant les hyphes aériennes émergentes et l'interface eau-air afin de faciliter l'érection des hyphes dans l'atmosphère. Deuxièmement, des protéines nommées « long chaplin » sont exportées et viennent s'attacher de façon covalente à la paroi cellulaire des hyphes aériennes. Elles sont ensuite hétérodimérisées par les « shorts chaplins » afin de

(19)

former des filaments de chaplins très hydrophobes. Finalement, ces filaments sont organisés à

un niveau supérieur par les rodlins afin de former des paires de « rodlets ». Cette ultrastructure enveloppant les hyphes aériennes vient aussi faciliter l'érection dans les airs, et ce, en milieu

riche comme en milieu pauvre (Elliot et al., 2008; Flärdh et Butiner, 2009). Le second

mycélium basai se distingue par des hyphes recouvertes ou non de « rodlets » et les hyphes

avec « rodlets » sont considérées comme étant précurseures du mycélium aérien caractérisé

par la présence de ces ultrastructures (Manteca et al., 2007). La figure 1 illustre les différentes

étapes du développement des streptomycètes démontrées chez le S. coelicolor et le Streptomyces lividans. Sporulated mycelium/ ¡XL. Jl _*_ * (with rodlets)

*?3µ??

(a b

EeBBsII BMBH S

e) Bi Developmental cycle of Streptomyces h (d Second mycelium

Agar limit (without rodlets)

M

<e

(9) ffl

Figure 1: Représentation schématique du développement vertical chez les Streptomyces. Le rouge représente des cellules mortes alors que le vert représente des cellules vivantes. Les lignes grises symbolisent les protéines de type rodlet. Les formes circulaires en phase (g)

correspondent au second mycélium coenocytique où les nucleoides amorcent leur division. Les lignes pointillées jaunes représentent la limite de Gagar. Les zones noires en (g) et (h) indiquent une absence complète de fluorescence sous le mycélium présporulant et sporulant due à la désintégration des hyphes et à la dégradation des acides nucléiques. Cette figure est

(20)

La dernière étape du cycle de vie des streptomycètes est la réorganisation de plusieurs processus cellulaires menant à la différenciation des cellules apicales en chaînes de spores. Durant les étapes initiales du développement des hyphes aériennes, un long compartiment apical coenocytique nommé cellule sporogénique se développe. Cinquante copies ou plus du chromosome peuyent être produites dans chaque cellule sporogénique. La croissance par extension apicale s'arrête et une multiple division synchronisée est initiée. Celle-ci est dirigée par la protéine FtsZ, un homologue bactérien de la tubuline, qui s'assemble en filaments hélicaux ensuite remodelés en anneaux régulièrement espacés, nommés « Z ring », qui définissent les sites de division. D'autres protéines de division sont également mobilisées pour

participer à ce processus. À la suite de la formation des septa, une épaisse paroi cellulaire est

synthétisée autour des préspores (Fig. 2 A). (Flärdh et Buttner, 2009). La ségrégation des

chromosomes se fait de façon concomitante à l'aide de diverses protéines qui séparent les chromosomes de façon à ce qu'il y en ait qu'un seul par préspore. Les nucleoides se condensent dans les spores en maturation et finalement, les chaînes de spores unigénomiques sont formées (Fig. 2 B). (Flärdh et Buttner, 2009). Les spores sont caractérisées par une coloration grise due à la présence d'un composé aromatique de type polycétide (Kieser et al., 2000). Ces spores de reproduction, résistantes à la dessiccation, fournissent un mécanisme de dissémination efficace vers de nouveaux environnements pour ces bactéries non mobiles et sans capacité de chimiotactisme (Elliot et al., 2008).

En plus de sa différenciation morphologique qui réfère strictement à la production de chaînes de spores, le S. coelicolor se différencie physiologiquement, c'est-à-dire qu'elle produit des metabolites secondaires tels des antibiotiques. En culture liquide, la production d'antibiotiques débute avec l'entrée de la culture en phase stationnaire alors qu'en culture sur agar, elle coïncide avec la différenciation morphologique. Le S. coelicolor produit plusieurs antibiotiques dont le plus connu est l'actinorhodine, un pigment rouge-bleu indicateur de l'acidité du milieu. Une forme modifiée, la ?-actinorhodine de couleur bleue, est sécrétée dans le milieu extracellulaire. Le S. coelicolor produit également l'undecylprodigiosine, un pigment rouge, qui est en fait un mélange d'au moins quatre prodiginines dont l'undecylprodigiosine et

(21)

la butylcycloheptylprodiginine forment les composantes principales. Le «calcium-dependent

lipopeptide antibiotic» (CDA) est, comme son nom l'indique, produit en présence de calcium

et inhibe la croissance de Bacillus mycoides. Finalement, la methylenomycine est produite

grâce à des gènes portés sur le plasmide SCPl (Kieser et al, 2000).

Les étapes de la différenciation cellulaire sont finement régulées au niveau génétique. Un

grand nombre de gènes requis pour la formation du mycélium aérien a été identifié. Ces gènes

incluent MdA, MdQ, MdC, MdD, MdG, MdH, MdJ, MdK, MdL, MdM, MdN, ramR, ramCSAB,

chpA-H, citA, acoA, cya, clp?\, catB, dasR et MgA. Plusieurs de ces gènes ont été désignés

Md (pour « bald ») en référence à l'absence d'hyphes aériennes chez les souches mutantes

pour ces gènes. La majorité des gènes identifiés comme étant importants pour la formation du

mycélium aérien code pour des protéines de régulation. Cependant, certains gènes codent aussi

pour des molécules de structure. Ainsi, les gènes du cluster ram permettent la synthèse du

peptide SapB alors que les gènes chpA-H codent pour les chaplins (Elliot et al, 2008).

D'autres gènes impliqués dans le développement, souvent désignés whi, ont été identifiés. Ces

gènes, lorsqu'ils sont mutés, permettent la formation du mycélium aérien par la souche, mais

non la différenciation morphologique en spores grises, d'où l'appellation whi en référence à la

couleur blanche (« white ») des colonies. Ces gènes incluent whiA, whiB, whiO, whiE, whiG,

whiH, whil, whii, sigVJtsZ, ssgA, ssgB, ssgC-F, ssgR et samR (Elliot et al, 2008).

Fait intéressant, des mutations des gènes MdA, MdB, MdC, MdD, MdG, MdH et MdS, abaissent

la production d'antibiotiques par la souche, reflétant le lien possible entre la régulation du

métabolisme secondaire et celle de la différenciation morphologique (Elliot et al, 2008). La

mutation du gène MdA constitue un exemple concret et bien étudié de ce lien. En effet, MdA

code pour le seul ARN de transfert (ARNt) permettant la traduction du codon rare UUA

codant pour une leucine (Lawlor et al, 1987). Typiquement, 2-3 % des gènes de

(22)

Sporogonie cell·· Qdna O DivlVA = FtsZ Era MreB Cell wall Vegetative cross-wall· D dna O ParB O FtiK O ParA ìM°*% r4 e ' 0 I ?? ? i 1-4 M Sporulation septum ?; ?? i ¦SO? (öj ?' (oí Il Subapical

Figure 2: Réorganisation des processus biologiques durant la différenciation des hyphes

aériennes en chaînes de spores, a. Orchestration de l'assemblage de la paroi cellulaire et de la

division cellulaire. L'hyphe aérienne croît par extension apicale et accumule la protéine

DivlVA à son extrémité. La formation d'une cellule sporogénique apicale (qui est souvent

enroulée et est généralement plus longue que celle indiquée dans le présent schéma simplifié)

implique l'arrêt de la croissance. FtsZ s'assemble en filaments hélicoïdaux, qui sont remodelés

en anneaux Z régulièrement espacés, qui dirigent la septation en spores. Après l'achèvement des septa, les préspores forment une épaisse paroi à l'aide de l'actine bactérienne MreB.

Initialement, MreB se localise au niveau des septa se refermant, mais ensuite se répand tout

autour des spores en développement, b. ségrégation des chromosomes. L'ATPase ParA est

d'abord retrouvée à l'extrémité des jeunes hyphes aériennes, puis formes des filaments

hélicoïdaux le long de la cellule sporogénique. Les protéines ParB s'assemblent en complexes

nucléoprotéiques au niveau des régions chromosomiques oriC. La répartition des foyers

ParB-oriC le long de la cellule sporogénique semble être dirigée par ParA. La croissance des septa

débute alors que la ségrégation du matériel génétique n'est pas encore terminée et la

translocase FtsK est dirigée vers les sites de division et aide à débarrasser l'ADN des septa se

refermant. Finalement, les nucleoides se condensent à l'intérieur des spores en maturation.

(23)

Un des gènes de régulation du cluster act permettant la synthèse de l'actinorhodine, le gène

actII-ORF4, contient un codon TTA et est un activateur clé de la plupart, sinon de tous les

gènes de la voie métabolique de l'actinorhodine. Ainsi, l'incapacité à produire cet antibiotique

chez la souche mutante pour le gène bldA s'explique par l'incapacité à traduire le codon TTA.

Le gène adpA, originalement identifié bldH, contient également un codon TTA et est donc

dépendant de BIdA pour sa traduction. AdpA est un régulateur de type AraC requis pour la

formation du mycélium aérien (Bentley et al, 2002). Les cibles de ce régulateur incluent des

gènes codant pour des proteases, des inhibiteurs de proteases, un facteur sigma et plusieurs

autres protéines impliquées dans le développement (Chater et Chandra, 2008). Il a été

démontré que le phénotype « bald » de la souche mutante pour bldA est largement causé par la

présence du codon TTA dans le gène adpA, puisqu'en changeant ce codon, la capacité de

produire un mycélium aérien et des spores est restaurée (Nguyen et al., 2003; Takano et al,

2003). Ainsi, l'effet de bldA sur le développement implique probablement, du moins chez le

S. coelicolor, une perte d'expression d'une partie du régulon du régulateur AdpA.

Il a été démontré, chez d'autres streptomycètes que des inhibiteurs de proteases, régulés par

AdpA, sont impliqués dans une cascade de proteases extracellulaires. Des évidences indiquent

que cette cascade joue un rôle significatif dans le développement, apparemment dans un

processus d'autolyse par lequel la biomasse végétative est convertie en spores (Kim et Lee,

1995; Chater, 2006; Hirano et al, 2006; Manteca et al, 2006a). La figure 3 résume les

implications connues de bldA dans ces processus extracellulaires. Par ailleurs, des études

transcriptomiques ont démontré que l'expression de 147 gènes est modulée chez une souche

mutante pour le gène bldA. Ces gènes ne contiennent, pour la grande majorité, aucun codon

TTA. De plus, des études protéomiques ont également démontré que plusieurs protéines sont modulées chez la même souche mutante (Chater et Chandra, 2008). Il reste encore une grande quantité de travail à accomplir afin d'élucider les liens possibles entre tous ces interactants et

l'exemple du gène bldA démontre toute la complexité de la régulation génétique chez les

(24)

Bioactive small molecules

TTA-containing regulatory genes for secondary metabolism

AdpA.^ Species-specific ecological adaptations Transcription, processing, modification, charging NdA *Leu-tRNA„ ¦* RamR

Wide AdpA regulon

SCO0762

Sti protease inhibitor

Control of extracellular proteases Activation of Diverse containing genes ramCSAB Morphogenese peptide extracellular proteins?

Autolysis \Growth of aerial mycelium

Figure 3: Fonctions extracellulaires dépendantes de bidA chez le S. coelicolor. Les flèches

pointillées indiquent une étape démontrée chez S. griseus. Tous les autres liens sont répandus

au sein des streptomycètes. Chez S. griseus, les orthologues des gènes du cluster ram sont

connus sous le nom de gènes amfet ils mènent à la synthèse du peptide extracellulaire AmfS

(Ueda et al, 2002) alors que le produit des gènes ram est SapB (Kodani et al, 2004). Cette

figure est tirée de Chater et Chandra (2008).

En effet, malgré l'abondance d'informations accumulées au cours des années sur la

différenciation morphologique chez les streptomycètes, il est encore impossible de tracer un

portrait clair expliquant comment les voies de signalisation et de régulation génétique sont

(25)

La réponse aux stress chez les streptomycètes

La capacité de percevoir et de répondre aux changements environnementaux est cruciale pour

la survie des bactéries. Afin d'arriver à capter les signaux de l'environnement et à mettre en

place une réponse adaptative à ceux-ci, les bactéries utilisent différents mécanismes de

signalisation cellulaire. Ces trois mécanismes fondamentaux sont la régulation génétique à une

composante, à deux composantes et l'utilisation de facteurs sigma alternatifs. (Staron et al,

2009)

La régulation génétique à deux composantes implique deux protéines, une protéine senseur,

l'histidine kinase et une protéine de réponse agissant au niveau de la transcription.

Typiquement, la protéine senseur est liée à la membrane plasmique et possède un domaine

extracellulaire lui permettant de percevoir le stimulus, le domaine senseur ou «input domain».

L'activation de la protéine senseur induit une autophosphorylation d'un résidu histidine

spécifique du domaine histidine kinase. Le groupe phosphate est ensuite transféré à un résidu

aspartate spécifique du domaine receveur de la protéine régulatrice se trouvant dans le cytosol

de la bactérie. Ceci active le domaine effecteur ou «output domain» du régulateur qui instaure

alors la réponse cellulaire adéquate. La majorité des systèmes de régulations génétiques à deux

composantes caractérisée expérimentalement régulent l'expression génétique au niveau de la

transcription à l'aide d'un domaine HTH pour «helix-turn-helix» qui se lie à l'ADN et activent

les gènes cibles (Ulrich et al, 2005). D'autres régulateurs contiennent des domaines

enzymatiques comme des di-guanylate cyclase (Paul et al, 2004). Dans le cas des systèmes de

régulation à une composante, le «input domain» et le «output domain» sont contenus dans une

seule et même protéine, il n'y a ni domaine histidine kinase ni domaine receveur et les signaux

perçus ne sont qu'intracellulaires. Ce mode de régulation génétique serait précurseur du mode

à deux composantes permettant de capter les signaux extracellulaires et ainsi de mieux

(26)

Le S. coelicolor possède 84 gènes codant pour des senseurs kinases dont 67 sont adjacents à

des gènes codant pour des régulateurs de réponse, au nombre de 80 au total (Hurchings et al,

2004). Jusqu'à présent, les fonctions et les cibles de ces 67 paires de gènes sont très peu

connues. On sait cependant que plusieurs sont impliqués dans la régulation de divers processus

cellulaires tels que !'osmoregulation, la croissance et la différenciation cellulaire (Hurchings et

al, 2004). Quelques exemples de systèmes de régulation génétique à 2 composantes bien

étudiés chez le S. coelicolor incluent le système PhoP-R qui régule la réponse au manque de

phosphate (Sola-Landa et al, 2003; Rodroguez-Garcia et al, 2007) et les systèmes CseB-C et

Van R-S qui activent des gènes impliqués dans l'intégrité de la paroi cellulaire lors de

l'exposition à la vancomycine et à d'autres antibiotiques spécifiques à la paroi cellulaire

(Paget et al, 1999; Hong et al, 2002; Hutching et al, 2006).

L'utilisation de facteurs sigma alternatifs constitue un autre moyen d'agir au niveau

transcriptionnel en réponse à des conditions changeantes. En effet, le facteur sigma est une·

composante essentielle de TARN polymerase et est responsable de la spécificité de celle-ci

(Helmann et Chamberlin, 1988). Le facteur sigma principal, qui est essentiel pour la

transcription dans la phase de croissance exponentielle, est associé de manière réversible à

GARN polymerase et peut être remplacé par un facteur sigma alternatif. Toutes les bactéries

ne possèdent qu'un seul facteur sigma principal responsable du niveau d'expression basai de

la plupart des gènes. Par contre, la plupart des génomes bactériens, spécialement ceux des

espèces au développement morphologique complexe, possèdent plusieurs facteurs sigma

alternatifs. Ceux-ci coordonnent l'expression de gènes impliqués dans diverses fonctions telles

que la réponse aux stress, le développement morphologique et l'acquisition du fer (Paget et

Helmann, 2003) en redirigeant l'ARN polymerase vers un promoteur alternatif, changeant

ainsi le type de gènes réprimés (Helmann et Chamberlin, 1988). En l'absence de stimulus, la

plupart des facteurs sigma sont séquestrés par un facteur antisigma (Brown et Hughes, 1995;

(27)

Les facteurs sigma sont divisés en deux grandes familles dont les séquences ont peu de

similarité, la famille deo 70 et celle de s54. La famille de s™ est subdivisée en quatre groupes

phylogénétiques. Le groupe 1 regroupe les facteurs sigma primaires essentiels, chacun étant

fortement relié au facteur principal chez le E. coli, s70. Les facteurs du groupe 2 sont fortement

reliés au facteur primaire, mais ne sont pas essentiels pour la croissance bactérienne. Les

facteurs du groupe 3 sont moins similaires à s70 et activent habituellement des régulons en

réponse à des signaux spécifiques tels qu'un choc thermique ou un changement dans la phase

du développement. Finalement, les facteurs du groupe 4 sont les facteurs ECF pour

«extracytoplasmic function». Ces facteurs répondent à des signaux de l'environnement tels

que la présence de protéines mal repliées dans l'espace périplasmique.

Le nombre de membres des groupes 2, 3 et 4 varie selon l'espèce bactérienne, reflétant en

partie les caractéristiques physiologiques et développementales des différents organismes

(Paget et Helmann, 2003). Le séquençage du génome du S. coelicolor a révélé l'existence de 66 (Hahn et al, 2003) facteurs sigma putatifs dont 51 ECF (Paget et al, 2002). Ces facteurs jouent donc un rôle majeur dans la régulation de la transcription chez le S. coelicolor. Le facteur sigma principal du S. coelicolor est HrdB, un homologue de RpoD du E. coli. Parmi

les facteurs ECF du S. coelicolor on retrouve, entre autres, s? impliqué dans la détection et la

réponse au stress relié à la paroi,s R impliqué dans la détection et la réponse au stress oxydatif

et aBldN impliqué la différenciation morphologique (Paget et al, 2002).

Le tellurite, la résistance au tellurite, TerD et le domaine TerD

Le tellurium ou tellure (Te) est un élément semi-métallique rare de couleur blanc-argent

présentant des caractéristiques à la fois métalliques et non métalliques et donc qualifié de

métalloïde. Son numéro atomique est 52 et il fait partie du même groupe que l'oxygène, le souffre, le sélénium et le polonium. Ces éléments du groupe 16 réfèrent collectivement aux

(28)

chalcogènes, signifiant formeurs de minerai et se rapportant à l'abondance des oxydes,

sulfides, sélénides et tellurides parmi les minerais (Jensen, 1997; Fischer, 2001). La quantité

de Te dans la croûte terrestre est de 0,005 ppm. Il est retrouvé dans divers minerais, le plus souvent sous forme de tellurures (du cuivre, de l'or, du plomb et de l'argent, par exemple) et

parfois sous forme d'impuretés dans certains sulfures métalliques. Il est notamment obtenu

comme sous-produit lors de l'affinage électrolytique du cuivre. Le tellure est utilisé en

métallurgie, en chimie et en électronique (Taylor, 1999).

Les oxyanions de tellurium (tellurite, TeO32", et tellurate, TeO42") ont des effets toxiques chez

plusieurs organismes, et ce, même à de très faibles concentrations. En 1932, Alexander

Fleming a rapporté les propriétés antibactériennes de la pénicilline et du tellurite de potassium

(K2TeO3). À partir de cette date, le tellurite a été utilisé dans la composition de milieux

sélectifs pour l'isolement d'agents pathogènes tels que le Corynebacterium diphteriae, le

Staphylococcus aureus, le Vibrio cholerea et le Shigella sp. (Taylor, 1999). Aujourd'hui, il est

surtout utilisé pour l'isolement sélectif de souches Escherichia, coli STEC (Shiga

toxin-producing E. coli) 0157 :H7 responsables de colites hémorragiques et du syndrome urémique

hémolytique (De Boer et Heuvelink, 2000). Le milieu le plus utilisé est le cefixime-tellurite

sorbitol; MacConkey (CT-SMAC) qui inhibe la plupart des souches E. coli de la flore normale

intestinale alors qu'il permet la croissance des souches STEC 0157 :H7. La résistance de ces

souches au tellurite est due à la présence de sept gènes, terZ, terA, terC, terD, terE et ter?.

Une étude récente, portant sur la variabilité dans la résistance au tellurite et la présence de

l'opéron ter chez des souches STEC isolées d'humains, d'animaux et de nourriture, a

démontré que ce milieu est souhaitable pour la détection et l'isolement de souches NSF

(non-sorbitol-fermenting) STEC 0157 :H7/NM (non-mobile), mais non pour les souches

émergentes SF STEC 0157 :NM et la majorité des STEC non-0157, ces dernières ne

(29)

Les effets toxiques du tellurite se font ressentir à des concentrations 100 fois plus faibles que

dans le cas d'autres métaux et métalloïdes comme le sélénium, le chrome, le fer, le mercure, le

cadmium et le cuivre (Nies, 1999). Le mécanisme précis régissant la toxicité du tellurite n'est

pas connu et aucun consensus n'a pu être établi sur le mécanisme exact de résistance au

tellurite sur la base des séquences des gènes qui y sont associés en raison de la grande diversité au sein de celles-ci. Quelques mécanismes ont été proposés, mais ils ne sont pas

soutenus par des évidences expérimentales. Ceux-ci incluent l'exclusion directe du tellurite, la

conversion en des formes volatiles ou alkylées et la réduction enzymatique ou non

enzymatique en tellurium élémentaire (Te0) provoquant une accumulation de dépôts noirs à

l'intérieur de la cellule. Il a longtemps été considéré que la toxicité du tellurium était due à ses

propriétés oxydantes puissantes. L'observation de dépôts de Te0 à l'intérieur de cellules hôtes

de plasmides de résistance au tellurite, en présence de tellurite, a mené à l'hypothèse que la

réduction du K2TeO3 en Te0 était le mécanisme de detoxification (Taylor et al, 1988).

Cependant, les cellules du E. coli, dépourvues de tels plasmides réduisent quand même le

tellurite grâce à leur nitrate reductase, mais meurent au cours du processus (Avazari et al,

1997). Ce mécanisme de réduction, partagé par la plupart des micro-organismes, serait ainsi

seulement responsable d'un niveau basai de résistance. Par ailleurs, des études utilisant du tellurite radiomarqué ont démontré qu'il n'y avait pas de différence dans l'entrée ou la sortie de tellurite entre des souches E. coli sans plasmide de résistance et celles contenant un ou

l'autre des plasmides de résistance au tellurite (Lloyd-Jones et al, 1991). L'exclusion directe

du tellurite ne semble donc pas expliquer la résistance de ces souches. Un autre mode de résistance est la transformation du composé toxique en une forme moins toxique. La méthylation du tellurite donne des produits volatils comme le diméthyltelluride (Basnayake et al, 2001). Le gène tmp de Pseudomonas syringae pathovar pisi code pour une thiopurine méthyltransférase. Les cellules du E. coli hôtes d'un plasmide contenant le gène tmp ont une

concentration minimale inhibitrice (CMI) au tellurite entre 128 et 256 µg ml"1. Il a donc été

proposé que la résistance au tellurite passe par une volatilisation du tellurite en

diméthyltelluride (Cournoyer et al, 1998). Cette piste n'est pas à négliger, mais reste encore à

(30)

Jusqu'à présent, les études scientifiques ont démontré qu'une trentaine de gènes ou de groupe

de gènes étaient reliés, de façon directe ou indirecte, à la résistance au tellurite (Chasteen et

al, 2009). Certains gènes conférant une résistance au tellurite ont été caractérisés chez les

bactéries à Gram négatif, dont plusieurs sont retrouvés sur des plasmides, vecteurs importants

de transferts horizontaux entre les espèces. Le chromosome du E. coli contient les gènes tehA

ettehB. Ces gènes confèrent une résistance au tellurite lorsqu'ils sont clones dans un vecteur à

haut nombre de copies. De plus, la protéine TehA confère une résistance aux antiseptiques et

aux désinfectants (Chasteen et al, 2009). L'opéron MlA [MaA, te/A (MaB), telB (MaQ] est

retrouvé sur le plasmide du groupe d'incompatibilité P (IncP) RK2, isolé de Klebsiella

aerogenes (Ingram et al, 1973). Une mauvaise régulation de MlA mène à la mort des E. coli

hôtes (Goncharoff et al, 1991). Ce locus a aussi été associé à la résistance au tellurite et à une

inhibition de la fertilité. La résistance au tellurite conférée par cet opéron est cryptique. Une

simple substitution de T en A dans le gène telB, changeant une serine en cysteine à la position

125, permet au plasmide de conférer une résistance. La présence des trois gènes de l'opéron

est requise pour la résistance et un niveau d'expression plus bas est associé avec des taux de

résistance plus élevés. De plus, deux résidus cysteine du gène telB sont requis pour la

résistance. La mutation de ces résidus mène à une baisse marquée du niveau de résistance qui

passe de 256 µg ml"1 à 8-16 µg ml"! (Turner et al, 1994). Chez le Rhodobacter sphaeroides,

les gènes trgA et trgB codent pour des protéines associées à la membrane qui défèrent une

résistance lorsqu'ils sont introduits chez le Paracoccus denitrificans (O'Gara et al, 1997). Les

plasmides d'incompatibilité HI2 (IncHI2) confèrent une résistance à de nombreux

antibiotiques, à des métaux lourds et à des colicines, des toxines formant des pores dans la

membrane cellulaire de souches E. coli sensibles. Les plasmides IncHI2 R478 de

S. marcescens et pMER610 de Alcaligenes spp. contiennent l'opéron ter (terZABCDEF). Cet

opéron semble, en plus de permettre la résistance au tellurite, contrôler la résistance à des

bacteriophages et à des colicines. Les séquences en acides aminés des protéines codées par ces

gènes ne présentent pas de similarité avec des séquences connues sauf celles de TerD et TerE

qui possèdent entre 43 et 51 % d'identité avec les protéines de liaison à l'AMP cyclique

(CABP-I et CABP-2) de Dictyostelium discoideum, une amibe se nourrissant de bactéries et

de champignons du sol (Grant et Tsang, 1990). Dans l'ensemble, il semble que les différentes

(31)

espèces bactériennes ont trouvé chacune un moyen unique de répondre à la toxicité du

tellurite. Néanmoins pour chacun des groupes de gènes responsables de la résistance au

tellurite, de nombreux orthologues existent chez d'autres espèces plus ou moins apparentées.

Il existe très peu de similarité entre les séquences des gènes conférant une résistance au

tellurite. Les mécanismes régissant cette résistance ne sont que spéculatifs, mis à part celui de

l'opéron asr qui permet la résistance à l'arséniate, l'arsénite, l'antimonite et au tellurite par un

mécanisme de pompe à efflux (Turner et al, 1992). Plusieurs études ont démontré que certains

gènes du métabolisme basai, lorsque surexprimés, augmentaient la tolérance au tellurite. C'est

le cas du gène çysK, codant pour une cysteine synthase, de plusieurs espèces dont le

Geobacillus stearothermophilus V, le Staphylococcus aureus, le E. coli et le Rhodobacter

sphaeroides (Vasques et al, 2001; Lithgow et al, 2004; Alonso et al, 2000; O'Gara et al,

1997) lorsqu'exprimé dans une souche hétérologue. Certaines informations indiquent que ceci

est en lien avec le mécanisme de toxicité du tellurite. En effet, il a été proposé que la toxicité

du tellurite soit due à l'oxydation des thiols cellulaires, comme le glutathion, ou à la

production d'anions superoxydes durant la réduction du tellurite, causant ainsi une instabilité

menant à un stress oxydatif intracellulaire (Fuentes et al, 2007). Chez les bactéries, le

glutathion est surtout présent chez les bactéries aérobies à Gram négatif, et très rarement

présent chez les anaerobes et les bactéries à Gram positif. En plus de son rôle clé dans le

maintien des protéines thiols dans un état oxydatif approprié, le glutathion protège contre les

baisses de pH, les composés chlorés, les stress osmotique et oxydatif et participe à la

régulation des niveaux de potassium (Masip et al, 2006).

Le modèle le plus récent de la toxicité du tellurite chez le E. coli est illustré à la figure 4. Pour

exercer sa toxicité, le K2TeO32" doit entrer dans sa cellule cible, et ceci se fait

vraisemblablement par le système de transport du phosphate. Dans le périplasme, il interagit

avec les enzymes du système de catalyse des ponts disulfure, modifiant ainsi l'intégrité de la

membrane et de la paroi cellulaire. Le tellurite n'ayant pas réagi dans le périplasme est

(32)

transporté vers le cytoplasme par des transporteurs du phosphate où la nitrate reductase, la

catalase, la dihydrolipoamide déshydrogénase, des thiols réduits (particulièrement le

glutathion) et d'autres reductases non spécifiques le réduisent en tellurium élémentaire (Te0).

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Figure 4: Modèle du rôle de certaines enzymes (et de certains de leurs produits) de la voie métabolique de la cysteine en réponse à la présence de K2Te03. Cys, cysteine; CysK, cysteine synthase; [Fe-S], noyau Fer-soufre; GSH and GSSG, glutathion réduit et oxydé, respectivement; IscS, cysteine désulfurasse; OAS, O-acetyl-L-serine; RSH and RSSR, thiols réduits et oxydés, respectivement; SOD, superoxyde dismutase; SUMT, S-adénosyl-L-méthionine uroporphirynogen III C-méthyltransférase; YqhD, aldéhyde reductase; ZWF, glucose-6-phosphate déshydrogénase; ACN, aconitase; FUM, fumarase; LpdA, E3 composante de la pyruvate déshydrogénase; YggE, protéine antioxydante; UbiE, C-méthyl transferase; SoxRS, régulon du stress oxydatif (sensible aux anions superoxydes); OxyR, régulon du stress oxydatif (sensible au peroxyde d'hydrogène). Cette figure est tirée de

(33)

Ceci génère des anions superoxydes (O2") augmentant du même coup les dérivés réactifs de

l'oxygène (DRO) déclenchant le stress oxydatif et les dommages cellulaires s'y rapportant. La présence d'anions superoxydes endommage les noyaux [Fe-S] des protéines et enzymes (acotinase et fumarase). La relâche de Fe peut générer des radicaux hydroxyles ("OH) via la

réaction de Fenton ou Habèr-Weiss et ces radicaux causent des dommages macromoléculaires,

spécialement à l'ADN. L'lscS desulfurase participe à la restauration des noyaux [Fe-S]. La

réduction du K2TeO32" abaisse également le niveau de thiols réduits, alors récupérés par

l'oxydation du NADPH en NADP. CysK contribue à la restauration du pool intracellulaire de

thiols réduits et SUMT participe à la biosynthèse du groupe sirohème de la sulfite reductase.

Le Te0 peut être subséquemment éliminé sous sa forme alkylée, produite par la

méthyltransférase UbiE. La présence d'anions superoxydes peut aussi induire la peroxydation de la membrane lipidique et l'oxydation de protéines. YqhD détoxifie la cellule des aldéhydes réactifs dérivés de la peroxydation de la. membrane lipidique et YggE abaisse le niveau d'anions superoxydes. L'augmentation de superoxyde dismutase (SOD) permet la superoxyde dismutation et le peroxyde d'hydrogène généré est ensuite décomposé par la catalase. Le stress

induit par le K2TeO32" induit l'expression du régulon SoxRS. Zwf est induit par ce régulon et

permet la restauration du pool de NADPH. En somme, l'intégrité des ribosomes, des protéines et la synthèse de l'ADN sont affectées et la membrane plasmique subit des dommages. Le résultat final est la mort rapide de la cellule dans les 15 min suivant l'exposition au tellurite (Turner, 2001; Chasteen et al, 2009). Une vision émergente concernant la toxicité du tellurite stipule que les bactéries font face à la toxicité de ce composé par un mécanisme d'adaptation générale semblable à celui en réponse aux radiations UV et aux chocs thermiques (Chasteen et

al, 2009).

Summers et Jacoby (1977) ont été les premiers à corréler la résistance au tellurite de certaines souches bactériennes à Gram négatif à la présence de plasmides transférables. Tous les

Plasmides du groupe IncHI2 testés chez le Pseudomonas aeruginosa et quatre plasmides du

(34)

tellurite de potassium. L'appellation ter a alors été donnée au phénotype de résistance au

tellurite associé avec ces plasmides. Des années plus tard, Jobling et Ritchie (1987) ont pour la

première fois associé une région précise du plasmide conjugatif pMER610 de Alcaligenes au

phénotype de résistance au tellurite. Cette même équipe a ensuite publié la séquence

nucléotidique de la région complète permettant la résistance, qui s'est avérée contenir cinq

cadres de lecture ouverts, nommés ORF 1-5 (Jobling et Ritchie, 1988). Ces gènes ont par la

suite été désignés terA, terB, terC, terO et terE. Ils codent pour des polypeptides d'une masse

moléculaire prédite de 37, 14, 38, 20 et 20 kDa respectivement (Hill et al., 1993). Une région

du plasmide IncHI2 R478, isolé originellement de S. marcescens, permet une résistance au

tellurite (Ter), de même qu'une résistance à la colicine B (PacB) et une inhibition de la

propagation du phage T5 (PhiT5) chez IeE. coli (Whelan et al., 1995). Cette région contient

sept cadres de lecture ouverts dont les gènes ont été désignés terZ, -A, -B, -C, -E, et -F. Les

séquences des protéines TerA, B, C, D et E du plasmide R478 sont très similaires à celles du

plasmide pMERólO et les séquences de terZ et terF sont également présente dans pMERólO

(Whelan et al., 1995). L'insertion de transposon dans terO, terC et terZ réduit ou abolit

l'ensemble des phénotypes, alors que celles dans terE et ter? n'ont pas d'effet. L'insertion

dans terA réduit l'inhibition de la propagation de phage seulement (Whelan et al., 1995). Les

séquences de terO et terE étant très similaires, et il a été proposé qu'elles résultent d'une

duplication de gène. La portion N-terminale de la protéine TerA possède également certaines

similarités avec celles de TerD et TerE. Ces deux dernières seraient par ailleurs

interchangeables et il a été proposé que ces deux protéines forment un hétérodimère (Hill et

al., 1993; Whelan et al., 1995).

Les protéines codées par les gènes ter ne présentent pas de similarité avec des protéines

connues, mis à part TerD et TerE qui possèdent entre 43 et 51 % d'identité avec des protéines

liant l'AMPc de Dictyostelium discoideum, présentes chacune sous deux isoformes (CABP-IA, CABP-IB, CABP-2A, CABP-2B). Les protéines TerA, TerF, TerX et TerZ présentent

aussi une similarité, mais beaucoup plus faible. D. discoideum est un organisme eucaryote qui

croît d'abord de manière végétative sous forme d'amibes unicellulaires. Un manque de

(35)

nutriments induit subséquemment un processus de développement et de différenciation menant

ultimement à la formation d'un organe de fructification multicellulaire formé de spores et de

cellules porteuses « stalk cells ». L'AMPc joue un rôle de premier plan dans ce processus de

développement. Il agit comme chimioattractant pour diriger l'agrégation des amibes

individuelles lorsque le développement s'amorce, il régule la différenciation des spores et des

cellules porteuses et il contrôle l'expression de nombreux gènes impliqués dans le

développement (Bain et al, 1991). Des souches mutantes de D. discoideum ont été générées

par Bain et Tsang (1991). L'interruption d'un gène codant pour deux polypetides (p34 et p31)

reliés à CABP-I, car reconnu par des anticorps dirigés contre CABP-I, altère la vitesse de

croissance et le profil de développement de D. discoideum, mais seulement lorsque des

bactéries servent de nourriture (Bain et Tsang, 1991). CABP-I formée de deux sous-unités

(CABP-IA et CABP-IB) ainsi que p31 et p34 sont induites durant le développement (Kay et

al, 1987). Aucune étude récente n'a cependant poussé plus loin ni l'étude de CABP, ni celles

des polypeptides p34 et p31. L'implication de ces protéines dans le développement de

D. discoideum reste nébuleuse.

Quelques études ont été réalisées sur la régulation de l'opéron ter. Celui-ci semble être

exprimé de manière constitutive, mais aussi parfois de manière inductible selon la souche ou

l'espèce (Zannoni et al, 2008). En plus d'être présents sur tous les plasmides de type IncH12

(sauf R476b) et tous les plasmides IncHII isolés de différentes bactéries hôtes (Hou et Taylor,

1994; Taylor, 1999), des gènes hautement similaires à /erZABCDEF sont présents dans le

chromosome de plusieurs espèces dont le E. coli 0157:H7, le Yersinia pestis et le genre

Proteus (Taylor et al, 2002; Toptchieva et al, 2003). Le séquençage du génome de la souche

E. coli 0157 :H7 EDL933 (Perna et al, 2001) a révélé la présence de plusieurs grands îlots de

gènes (O-islands ou OI) absents chez la souche de référence E. coli K12. Parmi ceux-ci, deux

îlots identiques (OI#43 et OI#48) de 87 547 pb contiennent 96 cadres de lecture ouverts

codant entre autres pour une intégrase, des protéines phagiques, des protéines de résistance au

tellurite, une urease et une adhésine. Il existe une grande plasticité dans la présence, la

localisation et l'expression des ter OI chez le E. coli 0157 :H7 et il ne semble pas avoir de

(36)

relation entre la CMI du Te et la présence d'une ou deux copies des gènes ter (Taylor et al, 2002). La figure 5 compare les regroupements de gènes de résistance au tellurite ter provenant

de différentes espèces.

Plusieurs protéines de résistance au tellurite possèdent un ou deux domaines TerD dont le numéro d'accession pfam est le PF02342 (voir les informations disponibles sur le site http://pfam.sanger.ac.uk/family/terD). C'est le cas des protéines TerA, TerD, TerE, TerF, TerX et TerZ. Ce domaine est plus souvent retrouvé dans la portion C-terminale de la protéine et comporte 128 acides aminés. Il a été jusqu'à présent retrouvé dans 999 séquences de protéines provenant de 97 espèces, la plupart étant des bactéries. Dans plusieurs de ces espèces, plus d'une séquence de protéines possède le domaine TerD. Ce nombre atteint 17 séquences chez le S. coelicolor, mais dans l'ensemble il se situe plutôt autour de 4 à 5 séquences par génome. Des agents pathogènes comme le Yersinia pestis et le E. coli Ol57 :H7, des bactéries interagissant avec les plantes comme le Pseudomonas syringae et le Frankia de même que des bactéries sporulantes comme le Bacillus, le Clostridium et le Streptomyces comptent à elles seules pour 565 des séquences comportant un domaine TerD séquencées à ce jour. La plupart de ces protéines n'ont pas de fonction connue et sont présumées être des protéines de résistance au tellurite sur la base de leur similarité avec la protéine TerD des plasmides IncHI2. Dans plusieurs cas, les gènes codant pour ces protéines sont chromosomiques et ne sont pas organisés en opéron comme c'est le cas sur les plasmides

(37)

CMI EDL933 R 478 E.coli 0157:H7 (Strain 86-24""') pMJ606 PTE53 Proteus Deínococajs mdiadtimns TerZ Í>C TerZ 96.6%D€ TerZ

TerA TerB TerC TerD TerE TerF

192aa 191aa 103aa

TerA TerB

z>tzx --->rTerC TerD>cTerE TerF >

99.8% 994%

TerB

TipO TIrC TIrB TIrA

97.2%* 99.8% 99.5% 99.0%

TerC TerD TerE

75.2% 75.9% 3,2% J^-H J^L >

TerC TerA TerB

Dl X.

98,4%* 99.1% 99.4·»

TerA TerB TerC

=>l XZ3. 61,7% ?d.3% 80.9% 874% 82.9% 86.5% TerD TerE >c=x > 96.4% 969% TerD TerE >CZ>[ > ?d.3% TerA TerB <S00oc >j > 37% 32% 73,2% 67,5% TerD > 67»;

64-128 µ§ ml"1

(Taylor e/ al., 2002)

1024 µ§ ml"'

(Taylor, 1999)

1024 µ£ ml'1

(Hou et Taylor, 1994)

64-1024 µd ml"1

(Taylor étal, 2002)

> 250 µg ml"1

(Toptchieva et al., 2003)

1024 µd ml"1

(Taylor et al, 2002)

Figure 5: Comparaison des regroupements de gènes de résistance au tellurite ter selon les

différentes sources. Les cadres de lecture ouverts déduits sont montrés ainsi que le nombre

d'acides aminés pour les protéines prédites du E coli 0157 :H7 EDL933 sous les flèches

noires (Perna et al., 2001). Les protéines prédites du plasmide R478 du Serratia marscescens

sont les plus étroitement reliées à celles d'EDL933. Le pourcentage d'identité de chacun des

cadres de lecture ouverts prédits avec celui correspondant chez EDL933 est mentionné. TIpD,

TIrC, -B et A du £ coli 0157 : H7 souche 86-24NalR ont été nommés ainsi par Tarr et al

(2000). Le plasmide pMJ606 contient les gènes de résistance au tellurite clones à partir du

plasmide pMER610 isolé d'Alcaligenes sp. (Jobling et Ritchie, 1988), Le plasmide pTE53 provient d'une souche clinique du E. coli (Burian et al., 1998). Les deux dernières séquences

proviennent des bases de données du séquençage des génomes de Proteus sp. et de

(38)

Le tellurite étant retrouvé rarement dans l'environnement, la probabilité pour un organisme

d'y être en contact est plutôt faible.. Par contre, la découverte de nouvelles applications

industrielles pour ce métalloïde, au cours des dernières années, a fait augmenter le risque

potentiel. L'émergence de nombreux gènes codant pour une protéine possédant un domaine

TerD et ce, chez un grand nombre d'espèces bactériennes, incluant des agents pathogènes

humains, suggère que ces gènes procurent un avantage sélectif en environnements naturels,

qui pourrait ne pas être relié au phénotype de résistance au tellurite. Découlant de ceci, il a été

proposé que la résistance au tellurite soit un effet secondaire d'une autre fonction métabolique

particulière (Taylor, 1999).

Les gènes homologues à terD du S. coelicolor

Le génome du S. coelicolor code pour 17 protéines contenant un ou deux domaines TerD.

Pour sept de ces protéines, qui ne sont composées que de 190 à 194 acides aminés, le domaine

TerD recouvre les deux tiers de la protéine et se situe dans la région C-terminale. Les autres

protéines possèdent en plus, soit un ou plusieurs autres domaines dont la fonction est

inconnue, soit un autre domaine TerD ou les deux, et ce, toujours dans la portion C-terminale

de la protéine par rapport au premier domaine TerD. Le tableau 1 résume les informations

relatives aux domaines TerD des protéines du S. coelicolor. Un alignement des séquences de

ces 17 protéines avec les protéines TerD et TerE de S. marcescens révèle que les protéines

SCO0641, SC02367, SC02368 et SC04277 sont celles ayant le plus de similarité avec les

protéines TerD et TerE. Ce qui est d'ailleurs visuellement évident en examinant un arbre

phylogénétique regroupant l'ensemble de ces séquences (Figure 6). Les protéines SCO0641,

SC02367, SC02368 et SC04277 sont par ailleurs très similaires et ont des pourcentages

d'identité allant de 72 à 83 % les unes par rapport aux autres. Dans le cadre de ce projet de

doctorat, un intérêt particulier a été porté aux gènes SC02367, SC02368 et SC04277 et aux

protéines codées par ceux-ci. Le gène SCO0641 avait aussi été sélectionné, mais la deletion de

Figure

Figure 1: Représentation schématique du développement vertical chez les Streptomyces.
Figure 2: Réorganisation des processus biologiques durant la différenciation des hyphes aériennes en chaînes de spores, a
Figure 3: Fonctions extracellulaires dépendantes de bidA chez le S. coelicolor. Les flèches pointillées indiquent une étape démontrée chez S
Figure 4: Modèle du rôle de certaines enzymes (et de certains de leurs produits) de la voie métabolique de la cysteine en réponse à la présence de K2Te03
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