Purification de protéines associées à la gestation (PAG) chez le porc
Dethier M.
1, Sousa N.M.
2, Balci S.
2, Beckers J.F.
21Haute Ecole de la Province de Liège, Rennequin Sualem
2Laboratoire d’Endocrinologie et de Reproduction Animale, Université de Liège
Introduction
Les glycoprotéines associées à la gestation (PAG)
constituent une grande famille de protéines
placentaires.
Plusieurs membres de la famille des PAG sont exprimés dans les cellules du trophoblaste dès le stade d’élongation du blastocyste éclos. Dans l’espèce porcine, cette expression précoce a été montrée à partir du 4e jour suivant la fécondation (Do et coll.,
2001).
Jusqu’à présent, au moins 8 ADN codant pour des PAG porcines différentes ont été identifiés chez la truie (Szafranska et coll., 2006).
En ce que concerne leur isolement par des techniques biochimiques, les PAG ont été purifiées chez la vache, la brebis, la chèvre, la bufflesse et la bisonne. Cependant, hormis une étude réalisée par Doré et coll. (1996), lesquels ont réussi à isoler un fragment correspondant à la séquence interne d’une PAG
porcine (poPAG), aucune équipe n’a réalisé la
purification de ces molécules chez l’espèce porcine. La présente étude décrit nos résultats préliminaires sur l’isolement des PAG porcines.
Résultats
Figure 1. Chromatographie sur Sephadex G75 des fractions DEAE 0,08 M et 0,16 M. L’immunoréactivité de type PAG a été détectée par les système RIA-438 (PAG bovine), RIA-707 (PAG caprine) et RIA-805 (PAG ovine).
Sephadex G-75 DEAE 0,08 M Sephadex G-75 DEAE 0,16 M
64 56 59 57 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 1020 3040 506070 80 90100 110 120 130 140 Fractions (20 m l) D .O . (2 8 0 n m ) 0 20 40 60 80 100 120 P A G (n g /m l) D.O RIA-438 59 65 56 56 64 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 102030 40 506070 8090100 110 120 130 140 Fraction s (20 ml) D .O . (2 8 0 n m ) 0 20 40 60 80 100 120 P A G (n g /m l) D.O RIA-707 59 65 56 58 65 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 10 2030 4050 6070 8090100 110 120 130 140 Fractio ns (20 ml) D .O . (2 8 0 n m ) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 P A G (ng /m l) D .O R IA-805 55 61 67 55 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0 10 20 30 40 50 6 070 80 90100 110 12 0 130 F raction s (20 m l) D .O . (2 8 0 n m ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 P A G (n g /m l) D.O RIA-438 55 61 67 56 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100 110 120 130 Fractions (20 m l) D .O . (2 8 0 n m ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 P A G (n g /m l) D.O RIA-707 55 61 67 56 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100 110 120 130 Fractions (20 m l) D .O . (2 8 0 n m ) 0 100 200 300 400 500 600 P A G (n g /m l) D.O RIA-805 Sephadex G-75 DEAE 0,08 M Std 1 2 3 4 5 6 7 Std 97 66 45 Std 1 2 3 4 5 6 7 Std 97 66 45 Std 1 2 3 4 5 6 7 Std 97 66 45 Std 1 2 3 4 5 6 7 Std 97 66 45 kDa Sephadex G-75 DEAE 0,16 M Std 1 2 3 4 5 6 Std 97 66 45 Std 1 2 3 4 5 6 Std 97 66 45 kDa
Matériel et Méthodes
1
1
1
1
Procédure :
2
2
2
2
Suivi de la purification :
Dosage des protéines totales (Methode Lowry)
Dosage des PAG (RIA hétérologues avec 5 antisérums différents)
Conclusion
Les résultats préliminaires démontrent l’existence d’une immunoréactivité de type PAG (observée par RIA hétérologue et par Western blot) dans différentes fractions obtenues après chromatographie sur Sephadex G-75. Des chromatographies
complémentaires sont en cours en vue de purifier les PAG porcines.
Bibliographie
• Do HJ, Kim JH, Abeydeera LR, Han YM, Matteri RL, Green JA,
Roberts RM, Day BN, Prather RS (2001) Zygote, 9, 245-50.
• Szafranska B, Panasiewicz G, Majewska M (2006). Reprod Biol, 6
(Suppl. 1), 105-11.
• Doré JJE, Kattesh HG, Godkin JD (1996) Int J Biochem Cell Biol, 28,
1249-55.
Projet financé par le Ministère de la Région Wallonne (Direction Génerale de l’Agriculture, Ressources naturelles et Environnement, n. D31-1184) et par le FNRS (CC 1.5.059.08). Figure 2. Analyse par électrophorèse (coloration au bleu de Coomassie) et par Western blot (AS#438) des protéines placentaires porcines issues des chromatographies sur Sephadex G-75. DEAE 0,08 M : Pistes: 1) Tubes 56+57, 2) Tubes 58+59, 3) Tubes 60+61, 4) Tubes 62+63, 5) Tubes 64+65, 6) Tubes 66+67, 7) Tubes 68+69. DEAE 0,16 M : Pistes: 1) Tubes 53+54, 2) Tubes 55+56+57, 3) Tubes 58+59, 4) Tubes 60+61, 5) Tubes 62+63, 6) Tubes 64+65.
97 66 45 30 Std 1 2 3 4 5 6 7 AS#438 – boPAG-2 97 66 45 30 Std 1 2 3 4 5 6 7 97 66 45 30 Std 1 2 3 4 5 6 7 AS#438 – boPAG-2 kDa 30 14,4 20,1 30 14,4 20,1 30 14,4 20,1 30 14,4 20,1 97 66 45 30 1 2 3 4 5 6 Std AS#438 – boPAG-2 97 66 45 30 1 2 3 4 5 6 Std 97 66 45 30 1 2 3 4 5 6 Std AS#438 – boPAG-2 kDa 30 14,4 20,1 30 14,4 20,1 Placenta (6 kg) Extraction (Tp phosphate pH 7,6) Précipitation Sulfate d’ammonium (40-80 %)
DEAE cellulose 0,16 M NaCl Sephadex G-75 0,08 M NaCl Sephadex G-75 Electrophorèse
Western blot Electrophorèse
Western blot
Séquençage N-terminal CM cellulose
DEAE
