Dosage de l'acide orotique urinaire par CPG-SM avec dilution isotopique

HAL Id: dumas-01787238

https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-01787238 Submitted on 7 May 2018

HAL is a multi-disciplinary open access

archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Dosage de l’acide orotique urinaire par CPG-SM avec

dilution isotopique

Mireille Boutin

To cite this version:

Mireille Boutin. Dosage de l’acide orotique urinaire par CPG-SM avec dilution isotopique. Sciences pharmaceutiques. 1996. �dumas-01787238�

AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le

jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la

communauté universitaire élargie.

Il n’a pas été réévalué depuis la date de soutenance.

Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci

implique une obligation de citation et de référencement

lors de l’utilisation de ce document.

D’autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite

encourt une poursuite pénale.

Contact au SID de Grenoble :

bump-theses@univ-grenoble-alpes.fr

LIENS

LIENS

Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4

11111111111111111111111111111

D 115 018174 7

Année 1996

 {._

,IJ--L

~1~

versité Joseph FOURIER - GRENOBLE 1 U.F.R. DE PHARMACIE

Domaine de la Merci - La Tronche

Mémoire n°1o

Lo

DOSAGE DE L'ACIDE OROTIQUE URINAIRE

PARCPG-SM

AVEC DILUTION ISOTOPIQUE

MEMOIRE

du Diplôme d'Etudes Spécialisées de Biologie Médicale

Conformément aux dispositions de l'Arrêté du 4 Octobre 1988, tenant lieu de

THESE

pour le Diplôme d'Etat de Docteur en Pharmacie

Soutenu publiquement le 24 Juin 1996 par Mireille BOUTIN

Président: Membres:

JURY

Monsieur le Professeur A. FA VIER Monsieur le Professeur E. CHAMBAZ Monsieur le Docteur A. JOANNARD Monsieur le Docteur C. BOUJET

Année 1996

Université Joseph FOURIER - GRENOBLE 1 U.F.R. DE PHARMACIE

Domaine de la Merci - La Tronche

Mémoiren°

DOSAGE DE L'ACIDE OROTIQUE URINAIRE

PARCPG-SM

AVEC DILUTION ISOTOPIQUE

MEMOIRE

du Diplôme d'Etudes Spécialisées de Biologie Médicale

Conformément aux dispositions de !'Arrêté du 4 Octobre 1988, tenant lieu de

THESE

pour le Diplôme d'Etat de Docteur en Pharmacie

Soutenu publiquement le 24 Juin 1996 par Mireille BOUTIN

JURY

Président:

Membres: Monsieur le Professeur Monsieur le Professeur A. FAVIER E.CHAMBAZ

Monsieur le Professeur A. Favier

C'est un grand honneur que vous me faites en acceptant la présidence de ce jury. Je vous remercie de m'avoir permis de réaliser ce travail. Je tiens à vous exprimer ma reconnaissance et mon profond respect.

Monsieur le Professeur E. Chambaz

Je vous remercie de l'intérêt que vous avez porté à ce travail, et d'avoir accepté spontanément de faire partie de ce jury. Veuillez trouver ici l'expression de ma gratitude.

Monsieur le Docteur A. Joannard

Vous avez bien voulu témoigner de l'intérêt de ce travail en acceptant de faire partie de ce jury, je vous en remercie sincèrement. Je tiens à vous exprimer ma reconnaissance pour la grande disponibilité que vous m'avez toujours accordée, afin de discuter des différents problèmes métaboliques que nous avons rencontrés.

Je tiens tout particulièrement à expnmer ma reconnaissance à Monsieur le Docteur Boujet, qui a été l'instigateur de ce travail. Je le remercie pour les connaissances qu'il a su me faire partager dès mon premier semestre d'internat, pour sa grande disponibilité et pour son soutien constant. Je tiens à lui exprimer ici toute mon amitié.

Je remercie Nicole Monnier pour les connaissances qu'elles nous a apportées sur le déficit en OCT.

Je remercie les cadres du laboratoire de Biochimie C qui m'ont conseillé tout au long de ce travail :

Véronique Ducros pour ses conseils en matière de dilution isotopique, Josiane Arnaud pour ses conseils en matière de statistiques.

Un grand merci à toutes les techniciennes de l'Unité Fonctionnelle des Maladies Métaboliques pour leur soutien et leurs encouragements.

Je remercie particulièrement Evelyne Cardet, Mylène Barguès et Yvonne Prévot, pour leur généreuse contribution à mes innombrables extractions ...

Merci à Monique Bellier qm, par sa bonne humeur, m'a facilité la consultation des dossiers cliniques.

A Gaby,

A mes parents,

pour leur soutien Outre-Atlantique infaillible,

A Jean-Eric et Xavier,

pour leur grande présence ces dernières années,

A ma famille,

A mes amis biologistes, parapentistes, et tous les autres ...

_____74'k ~

TABLE DES MATIERES 4

LEXIQUE 7

1.Abréviations.____________________________~

2. Symboles chimiques 9

3. Grandeurs et unités 9

4. Figures et tableaux 9

INTRODUCTION 10

REVUE GENERALE

12

1. Origine et devenir de l'acideorotique ___________________13

1.1. Origine de l'acideorotique 13 1.2. Devenir de l'acideorotique 14

1.3. Régulation 15

2. Le cycle de l'uréeet sespathologies 17

2.1. Biochimie du cycle de l'urée 17

2.1.1. Les trois étapes mitochondriales 17 2.1.2. Les troisétapes cytoplasmiques 18 2.1.3. Bilan énergétique 19

2.2. Les pathologies du cycle de l'urée 21

2.2.1. Génétique 21 2.2.2. Signes cliniques 21 2.2.3. Diagnostic biologique 22

3. Intérêts du dosage de l'acideorotique 26

3.1. Dans les troublesdu cycle de l'urée 26

3.1.l. Déficits en OCT, ASS, ASL et arginase 26 3.1.2. Déficits en CPS et NAGS 31

3.2. Dans d'autres pathologies 31

3.2.1. L'acidurie orotique héréditaire 31 3.2.2. L'intolérance aux protéines avec lysinurie(LPI) 32 3.2.3. Le syndrome IIlIH 33 3.2.4. Les troublesdu métabolisme des folates 34 3.2.5. Les troublesdu métabolisme des purines 34 3. 2. 6. Les traumatismessévères 35 3.2. 7. Les médicaments 35 3.2.8. La grossesse 38 3.2.9. L'état de jeûne 38

MATERIEL ET METHODE

39

1.La CPG-SM avec dilution isotopique _________________41

1.1. Qu'est ce que laCPG-SM? 41 1.2. Qu'est ce que ladilution isotopique? 43

1.2.1. Qu'est ce qu'un marquage isotopique? 43 1.2.2. Comment différencier les 2 formes? 44

_____7a&e, deâ ~

1.2.3. Comment quantifier laforme naturelle? _________________46

2. La théoriede Pickup et McPherson ___________________47

3. Matériel 49

3.1. Sujets 49

3.1.l. Valeurs normales 49 3.1.2. Malades ayant un troubledu cycle de l'urée 49

3.2. Appareillage 49

3.3. Réactifs 50

4.Méthode 51

4.1. Préparation des échantillons ---51

4.1.1.Oximation 51 4.1.2. Extraction 52 4.1.3. Silylation 52

4.2. Injection 53

RESULTATS 54

1.Comment reconnaître l'acideorotique ?_________________55 2. Coefficients de Pickup et McPherson 57

2.1. Analyse des spectres de masses des formes naturelles et marquées pures 57 2.2. Détermination des pourcentages relatifs des ions de l'amasisotopique 58 2.3. Détermination des formules de Pickup et McPherson 60

2.3.1. Pour lecouple 357 -359 60 2.3.2. Pour lecouple 254 -256 60

3. Validation de la ~~ 1

3.1. Domaine de mesure 61

3.1.1. Limite de détection (Ld) 61 3.1.2. Limites de linéarité 62

3.2. Précision et exactitude 65

3.2.1.Laprécision 67 3.2.2. L'exactitude 68

4. Dosages chez les sujets normaux et les malades ______________70

4.1. Dosage chez les sujets normaux 70 4.2. Dosage chez les malades ayant un troubledu cycle de l'urée 70

DISCUSSION 71

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 79

ANNEXES 81

Annexe 1 : Observations cliniques____________________82 Annexe 2 : Fiche techniquedu dosage de l'acide orotique par CPG-SM 90

1. Abréviations

A ADN ADP AMP ARN ASL ASS ATC ATP BSTFA CPG CPG-SM CPSI CPSII CTP dCTP DHO DHODH dUMP HGPRT HHH HPLC LPI m/z NAGS OCT ODC OMP OPRT PDAB PM PRPP SM TMCS UMP UTP XO Nombre de masse Acide désoxyribonucléique Adénosine 5'-diphosphate Adénosine 5'-monophosphate Acide ribonucléique

Argininosuccinate lyase ou arginosuccinase Arginosuccinate synthétase

Aspartate transcarbamylase Adénosine 5'-triphosphate

Bis-triméthylsilyl-trifluoro-acétamide Chromatographie en phase gazeuse

CPG couplée à la spectrométrie de masse Carbamylphosphate synthétase cytoplasmique Carbamylphosphate synthétase mitochondriale Cytidine 5'-triphosphate

Désoxycytidine 5'-triphosphate Dihydroorotase

Dihydroorotate déshydrogénase Désoxy-uridine 5'-monophosphate

Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase

Hyperornithinémie - hyperammoniémie - homocitrullinémie Chromatographie liquide haute performance

Intolérance aux protéines avec lysinurie

Rapport de la masse ionique sur la charge ionique N-acétylglutamate synthétase

Ornithine carbamyl transférase

Orotidine 5'-monophosphate décarboxylase Orotidine 5'-monophosphate

Orotate phosphoribosyl transférase para-diméthylaminobenzaldéhyde Poids moléculaire Phosphoribosyl pyrophosphate Spectrométrie de masse Triméthylchlorosylane Uridine 5'-monophosphate Uridine 5'-triphosphate Xanthine oxydase

2. Symboles chimiques

H+ HC03-Mg2+

Nl14+

Pi ion hydrogène ion bicarbonate ion magnésium . . 1onammomum Phosphate inorganique

3. Grandeurs et unités

eV Electronvolt Torr = 1mmHg=133,3 Pa

4. Figures et tableaux

Figure 1 : La synthèse des bases pyrimidiques 16 Figure 2 : Le cycle de l'urée 20 Figure 3: Acide orotique et cycle de l'urée 27 Figure 4: Mécanisme d'action de l'allopurinol sur la synthèse des bases pyrimidiques _37 Figure 5: Formule et spectre de l'acide orotique naturel 45 Figure 6: Formule et spectre de l'acide orotique marqué 45 Figure 7 : Tracé chromatographique obtenu avec une urine normale 56 Figure 8 : Amas isotopique de l'acide orotique naturel autour de l'ion 254 57 Figure 9: Amas isotopique de l'acide orotique naturel autour de l'ion 357 57 Figure 10: Amas isotopique de l'acide orotique marqué autour de l'ion 256 58 Figure 11 : Amas isotopique de l'acide orotique marqué autour de l'ion 359 58 Figure 12 : Tracé chromatographique obtenu avec 5 000 nmol d'acide orotique extrait _ 64

Tableau I: Diagnostic biologique des troubles du cycle de l'urée 25 Tableau 11: Pourcentages relatifs des ions de l'amas isotopique du couple (357-359) __ 59 Tableau III: Pourcentages relatifs des ions de l'amas isotopique du couple (254-256) 59 Tableau IV: Limite de linéarité pour le couple 3571359 63 Tableau V: Limite de linéarité pour le couple 2541256 63 Tableau VI: Ajouts dosés pour le couple 3571359 66 Tableau VII : Ajouts dosés pour le couple 2541256 66 Tableau VIII : Acidurie orotique chez des sujets normaux 70 Tableau IX: Acidurie orotique chez des malades ayant un déficit du cycle de l'urée 70

1~

L'acide orotique, ou acide 2,6-dihydroxypyrimidine 4-carboxylique, est un intermédiaire de la biosynthèsede novades pyrimidines. Il dérive de la carbamylation, dans lecytoplasme, de l'acide aspartique en carbamylaspartate. Le carbamylphosphate est également synthétisé dans lamitochondrie, oùil constitue l'un des premiers intermédiaires du cycle de l'urée. L'acide orotique est donc relié au cycle de l'urée, via lecarbamylphosphate.

Cet acide est normalement excrétéà l'état de traces dans les urines. Son excrétion augmente considérablement dans l'acidurie orotique héréditaire, résultant d'un blocage enzymatique en aval sur la voie de synthèse des pyrimidines. Son excrétion augmente également chez les sujets présentant un trouble du cycle de l'urée, par déficit enzymatique ou par défaut de transport d'un intermédiaireindispensableau cycle.

La méthode de dosage de l'acide orotique la plus simple et la plus rapide est une méthode colorimétrique. Toutefois, elle est peu sensible et peu spécifique. Nous recherchions une méthode ayant une sensibilité suffisante, pour doser les faibles quantités d'acide.orotique excrétées par les sujets normaux. D'autre part, il est intéressant de pouvoir réaliser ce dosage au cours de la même manipulation que l'analyse qualitative des acides organiques : en effet, le dosage de 1' acide orotique urinaire est essentiellement demandé dans les troubles de l'uréogénèse, pour lesquels une analyse qualitative des acides organiques est toujours réalisée, dans un but d'orientation diagnostique. La technique par chromatographie en phase gazeuse coupléeà la spectrométrie de masse, avec dilution isotopique, réunissait alors ces 2 critères.

L'objectif de notre travail était de mettre au point cette technique de dosage. La revue générale, en première partie, fait le point sur l'intérêt du dosage de l'acide orotique dans différentes pathologies. La partie expérimentale décrit la technique et sa validation. Le dosage a été réalisé chez des sujets normauxafin

d'établir les valeurs normales. Il a également été réalisé chez des enfants présentant des troubles du cycle de l'urée, afin d'en illustrer son intérêt dans ces pathologies.

----~ ~

1

.

Or

ig

ine

e

t

deven

ir

de

l

'ac

ide

orot

igue

L'acide orotique est un intermédiaire de la biosynthèsede novo des bases pyrimidiques. (cf. figure 1)

Les 6 activités enzymatiques nécessairesà lasynthèse des pyrimidines sont codées par 3 gènes(WEBSTER1995;FERRY1974) :

Le premier gène code pour une protéine cytosolique multifonctionnelle, comportant 3 sites enzymatiques distincts :

-lacarbamylphosphate synthétase II (CPS II), -l'aspartatetranscarbamylase(ATC),

-ladihydroorotase (DHO).

Le deuxième gène code pour ladihydroorotate déshydrogénase (DHODH).

Le troisième gène code pour une protéine multifonctionnelle (l'UMP synthétase ou UMPS) comportant 2 sites enzymatiques distincts:

-l'orotatephosphoribosyl transférase(OPRT),

-l'orotidine5'-monophosphate décarboxylase (ODC). 1.1. Origine de lacideorotique

Dans le cytoplasme, la CPS II (N-acétylglutamate indépendante) en présence de bicarbonate, de glutamine (apport d'ammoniac) et de 2 molécules d'ATP, permet lasynthèse irréversiblede carbamylphosphate.

Remarque : dans les mitochondries, la CPS I (N-acétylglutamate dépendante) condense les ions ammonium et bicarbonate en carbamylphosphate ; ce carbamylphosphate reste dans lamitochondrie et entre dans le cycle de l'urée. S'il est produit en large excès,ilpeut passer dans le cytoplasme et participerà la synthèse des pyrimidines.

HCO)+Glutamine+2 ATP

CPSII

~

CarbamyH₂N-C-O-P0lphospha₃Hte₂

Il 0

2 ADP+Pi+Glutamate

L'ATC catalyse la formation irréversible de carbamylaspartateà partir de carbamylphosphate et d'aspartate.

----~ ~ NH2 COOH COOH 1 1 1 C=O CH₂

HiN

CH₂ 1

+

1 ATC 1 1 0 CH

l

...

O=C CH 1 /

'

'

/

'

H1N COOH N COOH POJ!i Pi ₁ H

Carbamyl Aspartate Carbamylaspartate phosphate

La DHO catalyse la cyclisation du carbamylaspartate en acide dihydroorotique, par perte d'une molécule d'eau. Cette réaction est irréversible.

COOH 1 H₂N CH₂ 1 1 O=C CH

'

_N,/

'

_COOH 1 H Carbamylaspartate DHO 0 Il

/

c

,

HN CH2 1 1 O=C CH

'

_{N COOH}/' 1 H

Acide dihydroorotique

Enfin, la DHODH catalyse l'oxydation de l'acide dihydroorotique en acide orotique en présence de NAD. La réaction est réversible.

0 Il

/

c

,

HN CH₂ 1 1 O=C CH

'

_{N COOH}/' 1 H

Acide dihydroorotique

NAD NADH

..

\

DHODH

.

)

_...

1.2. Devenir de l'acideorotique

0 Il

/

c

,

HN CH 1 Il O=C C

'

_{N COOH}/' 1 H

Acide orotique

L'UMP synthétase convertit l'acide orotique en uridine 5'-monophosphate (UMP) par 2 réactions enzymatiques successives :

L'OPRT transfère le groupement ribose 5-phosphate du phosphoribosy l-pyrophosphate (PRPP) sur l'acide orotique, pour former de l'orotidine 5'

-0 Il

/

c

,

HN CH 1 Il O=C C

'

_N/'_COOH 1 H

Acide orotique

PRPP PPi

..

~

OPRT

J

..

----~ ~ 0 Il

/

c

,

HN CH 1 Il O=C C

'

_N/'_COOH 1 Ribose 5-phosphate Orotidine 5'-monophosphate

L'ODC décarboxyle alors l'OMPen UMP. La réaction est irréversible. L'OMP peut être également déphosphorylée, pour donner l'orotidine.

0 Il

/

c

,

HN CH 1 Il O=C C

'

_N/'_COOH 1 Ribose 5-phosphate Orotidine 5'-monophosphate

ODC 0 Il

/

c

,

HN CH 1 Il O=C CH

'

_N/ 1 Ribose 5-phosphate Uridine 5'-monophosphate

Par lasuite, l'UMPest transformé en uridine 5'-diphosphate puis en uridine 5'-triphosphate (UTP), par 2 phosphorylations successives en présence d'ATP. L'UTP est transformé par la cytidine triphosphate synthétase en cytidine triphosphate (CTP). Les ribonucléotides sont réduits en désoxyribonucléotides, dUMP et dCTP, par une ribonucléoside diphosphate réductase. Le dUMP permet lasynthèse de thymidinemonophosphate, qui est ensuite phosphorylé.

Tous ces nucléotides triphosphates participent à la synthèse de l'ADN et de l'ARNsous l'actiondes nucléotidyl transférases.

1.3. Régulation

La CPS II est l'enzyme limitante de la synthèse des pyrimidines, dans les conditions physiologiques normales. Par contre, si les quantités d'ATP disponibles sont importantes, et si, simultanément, les quantités de PRPP sont faibles, alors c'est l'OPRT qui devient l'enzyme limitante, et l'acide orotique s'accumule.(WEBSTER!995)

Bicarbonate

+

Glutamine ~~~ Carbamylphosphate synthétase II 2ATP Carbamylphosphate Aspartate transcarbamylase Carbamylaspartate Dihydroorotase

t----

H2ü Dihydroorotate déshydrogénase Orotate PRPP transférase Dihydroorotate Orotate

Orotidine 5'-monophosphate OMP décarboxylase

~ ~

ADN...._ - - -Uridine 5'-monophosphate UMP

~

dUMP UTP dCTP CTP ---... ~ Orotidine - ~

---~ ~

2

.

Le

cyc

le

de

l

'urée

et

ses

pa

tho

log

ies

Le cycle de l'urée joue 2 grands rôles : l'élimination de l'ammoniac et la synthèse de novo de l'arginine.

L'ammoniac, terme ultime du catabolisme des protéines, est éliminé au niveau hépatique :ce composé, toxique, entre dans le cycle de l'uréogénèsequi conduit à lasynthèse de l'urée, substance non toxique, très soluble dans l'eau et facilement éliminée par voie urinaire.

Remarque : la majeure partie de l'ammoniac est ainsi éliminée. Toutefois, une petite partie, libérée de laglutamine par la glutaminase rénale, est éliminée dans les urines, sous forme de sels d'ammonium.

Le cycle de l'urée fait intervenir 6 enzymes : les 3 premières sont situées dans lesmitochondries ;les 3 suivantes sont situées dans le cytoplasme (cf. figure 2).(FARRIAUX1978; BATSHAW1984; BRUSILOW1995)

2.1. Biochimie du cycle de l'urée

2

.1

.1

.

Les

tro

is

é

tapes

m

i

tochondr

ia

les

• La N-acétylglutamate synthétase (NAGS)

La N-acétylglutamate synthétase condense l'acétyl-CoA et le glutamate en N-acétylglutamate, activateur de l'étape suivànte. La réaction est irréversible. • La carbamylphosphate synthétase (CPS 1)

La forme mitochondriale de laCPS (CPS type I) est présente au niveau du foie, età un tauxmoindre au niveau de l'intestin et du rein. C'est une enzyme qui nécessite laprésence de deux cofacteurs :

-lesionsmagnésium: stabilisant laconformation de l'enzyme. -leN-acétylglutamate: jouantlerôle d'activateur allostérique.

Elle catalyse la formation irréversible de carbamylphosphateà partir d'ions ammonium et bicarbonate :

Mg2+

N-acétylglutarnate

HCOj +NJ4+ + 2ATP + H20 •

CPSI

17

H2N-C-O-PO_{jI2 +} 2ADP+ Pi

Il 0

~~~

• L'ornithine carbamyl transférase(OCT)ou omithine transcarbamylase

L'OCT est une enzyme mitochondriale, pluritissulaire. Elle transfère le groupement carbamyl du carbamylphosphate sur l'omithine pour donner la citrulline, avec libérationde phosphate :

H2N-C-O-P0:#2 Il 0

₊

H2N-(CH2):rCH-COOH 1 NH2 Ornithine

....

Pi

)

OCT H2N-CO-NH-(CH.i)3""CH_NH21-COOH

Citrulline

La réaction est réversible. Une fois formée, lacitrulline est transportéehors de la mitochondrie par un mécanisme encore inconnu.

2

.1

.2

.

Les

tro

is

é

tapes

cy

top

lasm

iques

Les trois enzymes suivantes, de localisation cytoplasmique, possèdent une distribution pluritissulaire.

• L'arginosuccinate synthétase (ASS)

En présence d'ATP et d'ions magnésium, l'ASS condense l'acide aspartique et lacitrulline en acide arginosuccinique :

H2N-CO-NH-(CH:z):;CH-COOH ₁

Citrulline NH ASS HN=C-NH-(CH2)3-CH-COOH

+

.... 0

ig

i$

\

...

F

1 _NH21

f

f

HOOC-CH-CH2-COOH NH2₁

ATP AMP+2Pi

HOOC-CH-CH2-COOH

Acide aspartique Acide arginosuccinique

Les produits de la réaction, acide arginosuccinique et AMP, réalisent une régulation allostérique par inhibitioncompétitive.

Cette réaction, réversible, représente l'étapelimitante pour laproduction d'urée. • L'argininosuccinate lyase(ASL) ou arginosuccinase

HN=C-NH-(CH _2h-CH-COOH

1 1 _ASL

NH NH2 ... ____....~ ..

1

HOOC-CH-CH2-COOH

Acide arginosuccinique

• L'arginase ----~ ~ Arginine HN=C-NH-(CH 2,)3-CH-COOH 1 1 NH2 NH2

+

HOOC-CH=CH-COOH

Acide fumarique

L'arginase est une enzyme tétramérique : les 4 monomères sont liés entre eux par des ions magnésium. Son substrat spécifique est l'arginine, qu'elle hydrolyse en urée et ornithine (réactionirréversible) :

HN=C-NH-(CH2)3-CH-COOH 1 1 NH2 NH2 Arginine Arginase Urée H2N-(CH2):;CH-COOH ₁ Ornithine NH2

L'ornithine pénètre dans la mitochondrie. La membrane externe mitochondriale est perméable aux acides aminés. Par contre, lamembrane interne est imperméable :le transport de l'ornithineàtravers cette membrane est réalisé par un transporteur spécifique, qui échangerait l'ornithine contre un ion H+, sans nécessité d'énergie (transport électroneutre).(VALLE1995)

L'ornithine peut alors entrer dans un nouveau cycle. 2.1.3. Bilan énergétique

L'urée est formée de 2 groupes azotés provenant : -l'unde l'ammoniac,par le carbamylphosphate,

-l'autre de l'acide aspartique, par l'acidearginosuccinique.

Il y a globalement utilisation de 3 molécules d'ATP (synthèse de carbamylphosphate et d'arginosuccinate). Mais il y a également consommation d'énergie lors du passage de l'ATPmitochondrial vers le cytoplasme.

La production d'une molécule d'urée est donc fortement endergonique.

Remarque :le cycle de l'urée serait fonctionnel dans le foie fœtal dès lahuitième semaine de gestation. A partir de la vingtième semaine de gestatiûn les activités enzymatiques sont similaires à celles observées à la naissance approximativement 50% des valeurs adultes.(RÂIHÂJ968)

Glutamate

+

Acétyl CoA

NAGS

----~ ~ Mitochondrie

NB+

₄ HC03 N-Acétylglutamate •••••-

1

CPS

1

1

2ATP 2ADP+Pi Carbamylphosphate

OCT

Ornithine Cytoplasme Aspartate Ci ATP

ASS

j

Arg

inase

Argininosuccinate

----~ ~

2.2. Les pathologies du cycle de l'urée 2. 2.1. Génétique

Des déficits affectant les6 enzymes de l'uréogénèseont été décrits.

La plupart de ces déficits (CPS, ASS, ASL, arginase) se transmettentselon un mode autosomique récessif : ils ne se manifestent cliniquement qu'à l'état homozygote, et peuvent atteindre plusieurs membres d'une même fratrie, mais pas lesparents.

-Le gène de l'ASS se situe sur le chromosome 9 (q34). Il existe de nombreux pseudogènes (gènes non exprimés) répartis sur plusieurs chromosomes.

-Le gène de l'ASLse situe sur le chromosome 7.

-Le gène de l'arginase se situe sur le chromosome 6 (q23).

L'étude des mutations concernant ces 3 déficits montre, pour un même déficit, une grande hétérogénéité quant au site de lamutation.

Le déficit en OCT se transmet sur le mode gonosomique lié au chromosome X. Le gène se situe au niveau de larégion X (p2l.l). Les mutations responsables du déficit en OCT sont multiples :

-délétions complètes ou incomplètesdu gène, -mutations ponctuelles dans lesexons,

-mutations des sites Taq,

-mutations affectant lasynthèse d'ARN.

Ainsi, les déficits des enzymes de l'uréogénèse présentent une grande hétérogénéité génétique.

2. 2. 2. Signes cliniques

Mis à part le déficit en arginase, tous ces déficits se manifestent cliniquement de façon sensiblement identique (BRUSILOWI995) les

manifestations peuvent apparaître :

-en période néonatale et être rapidementmortelles,

-ou plus tard, chez l'enfantou l'adulte, et être plus ou moins sévères.

Le déficit en arginase se manifeste pendant la première année de vie, et est caractérisée par une encéphalopathie évolutive.

----~ ~

Les manifestations cliniques résultent de l'hyperammoniémie, commune à tous ces déficits.

• Les formes néonatales :

Les signes cliniques apparaissent dès les premières heures, ou les premiers jours de vie, chez un nouveau-né toutà fait normal à lanaissance. Ils associent :

-des troublesdigestifs :vomissements, refus du biberon.

-des troubles neurologiques : installation progressive d'un état léthargique, puis comateux. Possibilité de crises convulsives.

-des troublesrespiratoires, s'aggravant avec l'intensitédu coma.

L'ensemble réalise un tableau de détresse neurologique et respiratoire grave. L'évolution fatale est de règle.

• Les formes tardives :

On observe une très grande variabilité quant à :

-l'âge d'apparition : les premiers signes cliniques pouvant apparaître dès la première année, ou à l'âgeadulte.

-la sévérité de la maladie : la clinique peut se limiteràde simples troubles digestifs (vomissements chroniques ou épisodiques) ; mais elle peut comporter également des troubles neurologiques (irritabilité, somnolence, retard psychomoteur). Des troubles de la conscience, des convulsions, un coma parfois fatal, peuvent survenir au cours d'une décompensation métabolique aiguë, à l'occasion:

-d'une surcharge protéique,

-ou d'une agression traumatique,chirurgicale ou infectieuse.

La forme tardive du déficit en ASL est classiquement associée à une hépatomégalie, ainsi qu'à une anomalie des cheveux (trichorrhexie noueuse).

2

.2

.3

.

D

iagnos

t

ic

b

io

log

ique

Le diagnostic d'un déficit d'une enzyme du cycle de l'urée, fortement soupçonné devant une hyperammoniémie majeure sans ictère, sans hépatite, et sans acidocétose, sera confirmé par l'étude des acides aminés sanguins et urinaires, et le dosage de l'acide orotique urinaire. Le diagnostic biologique des différents déficits est résumé dans letableauI.(BRUSILOW1995; BATSHAW1984)

~~~

L'hyperammoniémie est le signe biologique d'appel, quel que soit le déficit. Elle est variable en fonction de l'apport protéique. L'urée sanguine est généralement diminuée par rapport aux valeurs normales.

Certains acides aminés sont perturbés dans tousles déficits :

-glutamine et alanine sont fréquemment augmentées (accumulation non spécifique d'ammoniac).

-arginine et ornithine sont diminuées (blocage de la synthèsede nova d'arginine). L'arginine est un acide aminé essentiel chez les sujets ayant un trouble du cycle de l'urée, alors qu'elle ne l'estpas chez les sujets normaux.

(BRUSILOWl984a)

Souvent, dans les formes tardives, les signes biologiques ne se retrouvent qu'après un repas riche en protéines.

Le diagnostic de certitude repose sur le dosage de l'activité enzymatique dans différents tissus (cf. tableau 1). En France, ces dosages sont réalisésà !'HôpitalNecker-Enfants Malades, à Paris.(DURAND1991)

Le diagnostic prénatal est possible(MATHIEU1993):

-pour le déficit en CPS et en OCT, par le dosage de l'activité enzymatique sur biopsie de foie fœtal. Pour le déficit en OCT, lediagnostic est également possible par étude de l'ADNdans lesvillosités choriales, si lafamille est informative. -pour lacitrullinémie et l'acidurie arginosuccinique, par le dosage dans le liquide amniotique de lacitrulline et de l'acide arginosuccinique respectivement, ou par le dosage de l'activitéenzymatique dans lesvillosités choriales.

Remarque : la répartition des hépatocytes normaux et déficients n'est pas forcément homogène dans le foie. Ceci implique de réaliser, lors de la biopsie hépatique, 3 prélèvements de localisation différente, pour le dosage de l'activité des enzymes de l'uréogénèse. C'est également pour cette raison que le dosage de l'activité hépatique de l'OCT ne peut permettre le dépistage des conductrices :le risque de faux-négatifs est tropimportant.

Le traitement repose sur un régime suffisamment riche en protéines, arginine et calories, pour permettre la croissance et le développement de l'enfant. Afin de prévenir l'hyperammoniémie et l'hyperglutaminémie, on associeraà ce régime(BRUSILOWl984b) :

-du benzoate de sodium, qui conjugué à laglycine donne de l'acidehippurique ; 23

----~ ~

-du phénylacétate de sodium , qm conjuguéà la glutamine donne de la phénylacétylglutamine.

Ces deux métabolites sont éliminés par voie rénale. Ils permettent d'éliminer, respectivement, 1 et 2 atomes d'azote.

Le suivi du traitement fait appel aux dosages de l'ammoniémie, de la glutamine plasmatique et de l'acide orotique urinaire. Une élévation de ces marqueurs traduitun déséquilibre entre lerégime et l'uréogénèserésiduelle.

ACTIVITE _{SANG URINES} ENZYMATIQUE

Déficit en NAGS -Foie -Hyperammoniémie -Acide orotique normal

-Citrulline diminuée

Déficit en CPS -Foie -Hyperammoniémie -Acide orotique normal

-Jéjunum -Citrulline diminuée

Déficit en OCT -Foie _-Jéjunum -Hyperammoniémie _{-Citrulline diminuée} -Acide Orotique +++ Déficit en ASS -Foie _{-Fibroblastes} -Citrulline très élevée _{> 1000 µM} -Citrulline très élevée

-Acide Orotique ++

CITRULLINEMIE -Villosités _choriales -Hyperammoniémie (pas dans tous les cas)

Déficit en ASL -Foie -Arginosuccinate très -Arginosuccinate très

-Fibroblastes élevé > 100 µM élevé

A CID URIE -Villosités -Présence d'anhydrides -Présence d'anhydrides AR GINO- choriales -Hyperammoniémie -Acide orotique ± SUCCINIQUE -Citrulline élevée : (pas dans tous les cas)

100-300 µM

Déficit en -Foie -Arginine très élevé -Arginine très élevée arginase -Hématies _{-Hyperammoniémie} >500µM -Présence de dérivés _guanidiques

ARGININEMIE _{-Citrulline normale} parfois inconstante -Acide orotique _{(pas dans tous les cas)} ++

-Arginosuccinate normal -Transaminases élevées

Tableau 1 : Diagnostic biologique des troubles du cycle de l'urée

~~

3

.

Intérêts

du

dosage

de

l

'ac

ide

orot

igue

3.1. Dans les troublesdu cycle de l'urée

3.1.1. Déficits en OCT, ASS, ASL et arginase 3.1.1.1.Dépistage des homozygotes

On observe chez les homozygotes pour le déficit en OCT une élévation de l'excrétion de l'acide orotique et des pyrimidines (uridine et uracile). Chez les hétérozygotes, cette excrétion est variable, fonction de l'apport protéique.

(VANGENNIP1980; WEBSTER1981)

Dans les déficits en ASS et arginase, l'acide orotique urinaire est généralement augmenté. Dans les déficits en ASL, l'acide orotique urinaire est normal ou peu augmenté.(VANGENNIP1980; BACHMAN1980b)

Le blocage du cycle de l'urée résultant de ces déficits provoque une accumulation d'ammoniac et de carbamylphosphate. Ce dernier, produit en excès dans la mitochondrie par rapportàl'uréogénèse existante, peut diffuser dans le cytoplasme, où il stimule lasynthèse des bases pyrimidiques. Cette synthèse n'est alors plus limitée par la CPS de type II, qui, en temps normal, est l'enzyme limitantede lasynthèsede novodes pyrimidines. (cf. figure 3)

On observe donc une augmentation de synthèse de l'acide orotique et de l'UMP, avec:

-un rétrocontrôle négatif de l'UMP sur l'ODC et sur l'OPRT, entraînant une accumulation d'acide orotique.(GOLDSTEIN1974)

-une consommation du PRPP par l'acide orotique, pour former de l'orotidine 5' -monophosphate. La diminution de laconcentration de ce cofacteur limite l'action de l'OPRT, et accentue l'accumulationd'acide orotique.(BRUSILOW1995)

La quantité d'acide orotique accumulée est liée à la quantité de carbamyl phosphate accumulée. Or l'accumulationde ce dernier est elle-même fonction: -de sa production, vraisemblablement liée à l'hyperammoniémie etàla ration protéique,

Bicarbonate Glutamine Carbamylphosphate synthétase II Carbamylphosphate ...,,., Aspartate

~

Aspartate transcarbamylase

t

Carbamylaspartate

Dihydroorotase

i

Dihydroorotate Dihydroorotate déshydrogénase Oro tate Orotate PRPP

t

...---

PRPP transférase

+

Anunonium Bicarbonate CPSI

i

,6'_..______Carbamyl phosphate

~

Citrulline Ornithine Citrulline

~

ATP ASS

AMP

Arginosuccinate

Ornithine

~

ArginasJ Arginine Fumarate Orotidine

5'-phosphate .... Orotidine OMP

décarboxylase

Uridine 5'-monophosphate

UMP

Figure 3 : Acide orotique et cycle de l'urée

----~ ~

L'acide orotique est éliminé par voie rénale. Son dosage, dans les urines, est un bon indice de fonctionnement du cycle de l'urée, plus sensible que l'ammoniémie. Son excrétion peut atteindre(BACHMANl980b) :

-300 à 1 000 mmol/mol de créatinine chez les homozygotes pour le déficit en OCT ; 11 à 800 mmol/mol de créatinine chez leshétérozygotes.

-500à600 mmol/mol de créatinine dans lescitrullinémies.

-0,6à8 mmol/mol de créatinine dans les aciduries arginosucciniques. -600à800 mmol/mol de créatinine dans les argininémies.

L'excrétion d'acide orotique est très importante lors d'un déficit en OCT ; elle l'estmoins dans les déficits situés en aval de l'OCT. Ceci s'explique par une accumulation moindre de carbamylphosphate, celui-ci pouvant pénétrer dans le cycle de l'uréepour donner:

-de lacitrulline (déficit en ASS),

-de lacitrulline et de l'arginosuccinate(déficit en ASL ).

Ces intermédiaires,métabolisés ou excrétés tels quels dans les urines, permettent l'élimination d'atomes d'azote (3 pour la citrulline, 4 pour l'arginosuccinate).

(VANGENNIPl 980)

Selon cette théorie, l'excrétion d'acide orotique devrait être très faible lors de déficit en arginase : la citrulline, l'arginosuccinate et l'arginine permettant l'élimination d'azote. Toutefois, dans ces déficits, on observe des taux très élevés d'acide orotique, comparables aux taux observés lors de déficit en OCT, soit jusqu'à 800 mmol/mol de créatinine(BACHMAN1980b).Par contre, l'ammoniémie

n'est pas aussi élevée que lorsde déficit en OCT.

L'arginine est un puissant activateur de la NAGS chez le rat(SHIGESADA1971).

Dans les déficits en arginase, l'arginine activerait la synthèse de N-acétylglutamate, entraînant alors une activation de laCPS, d'où une augmentation de la conversion de l'ammoniac en carbamylphosphate. Mais ce dernier ne peut alors entrer dans le cycle de l'urée, du fait de la déplétion en omithine, résultant directement du déficit en arginase. Le carbamylphosphate s'accumule donc, et diffuse dans le cytoplasme, où il stimule la synthèse des pyrimidines. On observe alors une accumulation d'acide orotique, semblable à l'accumulationobservée lors d'un déficit en OCT.

----~ ~

3.1.1.2.Dépistage des conductrices du déficit en OCT

La transmission du déficit en OCT se fait sur le mode gonosomique lié au chromosome X(PLAUCHUl986) :

-L'homme qui porte le gène du déficit sur son chromosome X unique est dit hémizygote: lamaladie est leplus souvent létaleen période néonatale.

S'il ne porte pas le gène du déficit sur son chromosome X, il est sain, non conducteur.

-La femme qui porte le gène du déficit sur l'un de ses chromosomes X est dite conductrice ou hétérozygote.

Le phénomène de lyonisation explique l'existence de manifestations cliniques chez ces femmes. En effet, au début de la gestation, il y a dans les cellules initiales une inactivation au hasard d'un des chromosomes X. Au cours du développement fœtal, le même X sera inactivé dans touteslescellules issuesde la même cellule initiale.(ROBERT1983)

Toute femme est donc une mosaïque, avec statistiquement : 50% de cellules dans lesquellesl'Xmaternel est inactivé, 50% de cellules dans lesquellesl'Xpaternel est inactivé.

Une quantité variable non négligeable de cellules vont donc exprimer le caractère pathologique.Ilen résulte une grande variation de l'activité résiduelle de l'OCT (cette activité dépend de la proportion d'hépatocytes exprimant l'allèle mutant et exprimant l'allèle normal), et donc une grande variation des manifestations cliniques.

Le dépistage des conductrices du déficit en OCT est intéressant pour essentiellement deux raisons :

-le conseil génétique et le dépistage anténatal : dépister un hétérozygote méconnu, même s'il ne doit jamais réellement être malade, reste toujours une démarche utile pour éclaircir l'analysegénéalogique.

-la possibilité de survenue d'épisodes graves d'hyperammoniémie chez ces· femmes :l'état clinique des conductrices est très variable, pouvant aller de l'état asymptomatique aux épisodes chroniques de coma hyperammoniémique (BATSHAW1986). Les conductrices cliniquement asymptomatiques peuvent présenterdes déficits intellectuels, en relation avecdes hyperanm1oniémies épisodiques (BATSHAW1980).

----~ ~

Enfin, ces femmes ont une tolérancevariable aux protéines. Certaines restreignent volontairement leur ration protéique, compte tenu de l'apparition de symptômes tels que : nausées, vomissements, vertiges, migraines après un excès protéique

(HOKANSONl978).Ces symptômes pourraient également survenir lors d'un stress,

telqu'une infectionou une opération chirurgicale(HAAN1982).

Tous les tests biochimiques pour détecter les conductrices reposent sur l'existence d'une uréogénèse anormale dans un certain nombre d'hépatocytes. Ils se traduisentpar l'augmentationde l'excrétionde l'acide orotique :

• soit lors de la stimulation de l'uréogénèse anormale par les tests de charge en protéines :laplupart des conductrices excrètent des quantités normales d'acide orotique sous un régime normoprotéique. Par contre, après une charge en protéines, on observe une augmentation de l'excrétion d'acide orotique et une élévation de l'ammoniémie, fonction de l'activité résiduelle de l'OCT.

(GOLDSTEIN1974; DHONDT1975; NG1981 ;HOKANSON1978; HAAN1982)

Toutefois, plusieurs inconvénientslimitentlapratique de ce test:

-le risque non négligeable de déclenchement d'épisodes graves d'hyperammoniémie,

-l'existencede faux négatifs(BECROFT1984; BRUSILOW1995),

-et une standardisation difficile du test (variations en fonction de la composition en acides aminés, de ladigestion et de l'absorption). • soit lors du blocage de la dégradation de l'acide orotique par le testà

l'allopurinol : lors d'un déficit en OCT, on observe une élévation de la concentration de l'acide orotique, par une augmentation de la biosynthèse des pyrimidines. Lorsque cette voie est inhibée par l'allopurinol (le mécanisme d'inhibition est décrit plus loin), cela conduit à une accumulation encore plus importante d'acide orotique et d'orotidine : l'excrétion de ces métabolites est alors supérieureàcelle de sujets normaux, également traités par l'allopurinol.

(BRUSILOW1987 ; HAUSER1990 ; MACKENSIE1989 ; BURLINA1992 ; SEBESTA1994)

3.1.1.3.Dépistage néonatal du déficit en OCT

----~ ~

lefœtus, un déficit en OCT pourrait se traduire par une élévation de l'excrétionde l'acide orotique par lefœtus dans leliquideamniotique.

Toutefois, ce dosage réalisé sur le liquide amniotique de 4 femmes conductrices, portant un fœtus mâle atteint, était normal pour3de ces femmes. D'autre part, une élévation de l'acide orotique amniotique peut être le reflet de la synthèse fœtale, mais également le reflet du statut de conductrice de lamère.(JAKOBS1984)

Le dépistage anténatal du déficit en OCT n'est donc pas possible par le dosage de l'acideorotique amniotique.

3.1. 2. Déficits en CPS etNA GS

Dans les déficits en NAGS ou en CPS de type1, la synthèse de carbamylphosphate est diminuée : la synthèse des pyrimidines n'est donc pas perturbée. Il n'y a pas d'élévation de l'excrétion de l'acide orotique.

(VANGENNIP1980; BACHMANN1980b)

3.2. Dans d'autres pathologies

3.2.1. L 'acidurieorotique héréditaire

Il s'agit d'une maladie autosomique récessive, résultant d'un déficit en UMP synthétase. Quinze cas sont rapportés dans lemonde(WEBSTER!995).

Les principaux signes cliniques sont la conséquence du déficit en pyrimidines:

-un retard staturo-pondéral et mental dès lapremière année de vie, -une anémie mégaloblastique,

-une importante acidurie orotique : chez les homozygotes, cette excrétion peut atteindre1 000fois les valeurs normales, soit quelquesmol/molde créatinine

(FERRY1974).A ces concentrations, une cristallisation de l'acide orotique dans les voies urinaires est possible, avec des risques d'accidents urinaires d'obstruction. Chez les hétérozygotes cette excrétion est moindre, environ4fois les valeurs normales(LOTZ1963).

A la différence des troubles du cycle de l'urée, on n'observe pas d'hyperammoniémie, nid'augmentation de l'orotidine, de l'uridine ou del'uracile.

----~ ~

Le diagnostic de certitude est apporté par le dosage spécifique de l'activité de l'UMP synthétase, dans les hématies et /oulesfibroblastes.(WEBSTER1995)

Le traitement repose sur des doses massives d'uridine per os. En effet, !'uridine est transformé en UMP par !'uridine kinase, ce qui permet de shunter l'UMP synthétase. On observe alors une rémission hématologique et une diminution significative de l'acidurieorotique.(MILLS1988)

Le dosage de l'acide orotique dans le liquide amniotique, réalisé en parallèle avec lamesure de l'activité de l'ODC dans les villosités choriales ou les amniocytes, permet le dépistage anténatal de l'acidurie orotique héréditaire.

(OHBA1993)

3

.2

.

2. L

'

in

to

lérance

aux

pro

té

ines

avec

lys

inur

ie

(LP

I

)

Il s'agit d'une maladie autosomique récessive, résultant d'une anomalie du transport transmembranaire des acides aminés dibasiques (arginine, omithine, lysine et histidine). Une centaine de cas a été publiée ; lamoitié environ de ces cas est recensée en Finlande, où la prévalence de la maladie est de 1/60 000.

(SIMELL1995)

Cette -anomalie a été mise en évidence au niveau des hépatocytes, des entérocytes, des cellules tubulairesrénales et des fibroblastes(DE P ARSCAUl 988).

Elle se traduitpar :

-une malabsorption intestinaledes acides aminés basiques ;

-une faible réabsorption tubulaire, et donc une excrétion urinaire très importante de ces acides aminés, essentiellement de lalysine ;

-de faibles concentrations plasmatique, et sans doute hépatique, d'arginine et d'ornithine : le cycle de l'urée ne peut donc plus fonctionner, ce qui expliquerait l'hyperammoniémie et l'acidurie orotique observées. D'autres hypothèses ont été émises pour expliquer cette hyperammoniémie, et notamment l'inhibition des enzymes du cycle de l'urée par l'accumulation intracellulaire de lysine.

(RAJANTIE1981)

Les signes cliniques résultent du déficit en lysine, acide aminé essentiel (retard de croissance, ostéoporose), et de l'hyperammoniémie (vomissements, céphalées, aversion pour lesprotéines).

----~ ~

8 à 11)(RAJANTIE1981).Lors d'une charge en alanine ou en protéines, on observe

une augmentation de l'ammoniémie et de l'acidurie orotique. Cet effet est prévenu par lasupplémentation orale en citrulline :en effet, lacitrulline ne partageant pas le même système de transport que les acides aminés dibasiques, est absorbée normalement par l'intestin, et pénètre dans l'hépatocyte où elle peut relancer le cycle de l'urée.(DEpARSCAUl 988)

Le traitement repose donc sur une restriction en protéines et sur une supplémentation en citrulline. L'acide orotique urinaire est un élément de surveillance intéressant, plus sensible que l'ammoniémie, permettant d'apprécier la tolérance biologique à l'apport protéique sous citrulline.(RAJANTIE1981 ; DE P ARSCAUl 988)

Chez les hétérozygotes, ammoniémie et acidurie orotique sont dans la fourchette des valeurs normales, même après un test de charge en alanine. Les acides aminés intermédiaires du cycle de l'urée sont donc présents à des taux suffisants.(RAJANTIE1981)

3.2.3. Le syndromeHHH

Il s'agit d'un trouble du transport de l'ornithine dans la mitochondrie, transmis selon un mode autosomique récessif. Plus de quarante cas ont été décrits

(VALLE 1995).La clinique, essentiellement due à l'hyperammoniémie, ressemble à

celle des troubles du cycle de l'urée, avec une forme néonatale et une forme tardive.

Trois signes biologiques majeurs caractérisent cette maladie : • l'Hyperammoniémie : le déficit intramitochondrial en

cycle de l'urée, entraînant une accumulation carbamylphosphate et d'acide orotique.

ornithine bloque le d'ammoniac, de • l'Hyperornithinémie : de 200 à 1 020 µmol/l (normales 4 à 120)

(VALLE1995).L'ornithine est catabolisée dans lamitochondrie :

-soit par le cycle de l'urée,

-soit par une transamination, conduisant à l'acide glutamique ou à la praline.

Dans le syndrome HHH, l'ornithine ne pénétrant pas dans lamitochondrie, elle n'est plus catabolisée : elle s'accumule dans le cytoplasme et les liquides cellulaires.

----~ ~

• l'Homocitrullinémie :l'homocitrulline résulte de la condensation de la lysine et du carbamylphosphate. Dans ce syndrome, le transport de la lysine dans la mitochondrie est normal ; le ratio lysine/ornithine dans la matrice mitochondriale est donc plus élevé que la normale, ce qui pourrait activer la conversion, par l'OCT, de lalysine en homocitrulline.(VALLE1995)

L'hyperammoniémie est intermittente, alors que l'acidurie orotique est généralement toujours élevée : 17 sujets étudiés, dans différentes publications, présentaient une acidurie orotique comprise entre 6 et 172 mmol/mol de créatinine (moyenne des contrôles : 2,5). L'acide orotique est donc vraisemblablement un meilleur indicateur de l'uréogénèse anormale, que l'ammoniémie.(VALLE1995)

D'autre part ce marqueur s'élève lors d'une charge en protéines ou en alanine.

(SIMELL1985)

Le traitementrepose sur une restriction en protéines. Une supplémentation en omithine peut être bénéfique pour les malades ayant un transport transmitochondrial de l'ornithine résiduel. Les malades ayant un transport très diminué ne répondent pas à l'ornithine.(SIMELL1985)

3

.2

.4

.

Les

troub

les

du

mé

tabo

l

isme

des

fo

la

tes

Une acidurie orotique modérée (6 à 21 mmol/mol de créatinine) a été décrit lorsde déficit en formiminotransférase /cyclodéaminase.(SHINI986)

3

.2

.

5. ·Les

troub

les

du

mé

tabo

l

isme

des

pur

ines

Dans le déficit en purine nucléoside phosphorylase, 2 cas ont été décrits avec une élévation de l'excrétion de l'acide orotique : 19 et 25 mmol/mol de créatinine (HPLC avec dilution isotopique ; normales

<

3 mmol/mol).

(COHEN!977)

Mais cette acidurie orotique n'a pas été retrouvée dans d'autre cas.

(SIMMONDS1978)

D'autre part, Webster et coll.(WEBSTER!995)citent un cas de déficit en

----~ ~

3. 2. 6. Les

trauma

t

ismes

sévères

Chez les traumatisés sévères, on observe une augmentation de l'excrétion de l'acide orotique : 1,6±0,1 mmol/mol de créatinine (colorimétrie ; normales< 0,6).(JEEVANANDAM1991)

En effet, ces malades ont un besoin accru en acides aminés pour la néoglucogénèse, et pour la synthèse des protéines nécessairesàlaréparation des tissusendommagés.

Ce besoin provoquerait une protéolyse, responsable d'une accumulation d'ammoniac, éliminé par le cycle de l'urée,mais aussi par l'intermédiairede l'acide orotique via le carbamylphosphate.

Chez ces malades un apport exogène de glucose, sans protéines, permettrait de diminuer cette protéolyse, ainsi que l'excrétiond'acide orotique.

3. 2.

7.

Les

méd

icamen

ts

3.2. 7.1.L'allopurinol

L'allopurinol, ou 4-hydroxypyrazolo (3,4-d) pyrimidine, est un inhibiteurde l'uricosynthèse, utilisé dans le traitement des hyperuricémies. Il modifie le métabolisme des purines, mais aussi celui des pyrimidines(LUSSIER1988 ; WEBSTERl 995).

•Actionsurle métabolisme des purines:

Hypoxanthine, xanthine et acide urique sont les produits terminaux du catabolisme des purines.

-L'allopurinol est un analogue structural de l'hypoxanthine (isomère par inversion des positions de N-7 et C-8 du noyau imidazole). Il inhibede façon compétitive la xanthine oxydase (XO) qui ne peut plus oxyder l'hypoxanthine en xanthine, puis en acide urique.

Bypoxanthine _{Xanthine Acide urique}

----~ ~

Ainsi, hypoxanthine et xanthine s'accumulent ;mais étant plus solubles que l'acide urique, elles sont mieux éliminées par voie urinaire.

-D'autre part, l'allopurinol est lui-même un excellent substrat pour la xanthine oxydase : il est oxydé en oxypurinol, isomère de la xanthine. L'oxypurinol est aussi un puissant inhibiteurde laxanthine oxydase.

Allopurinol

OH

XO.

NAy

,

~~~

_N Oxypurinol

Ces deux actions inhibitricess'additionnent pour diminuer l'uricémie et l'uraturie. •Actionsurle métabolisme des pyrimidines(cf. figure4):

L'oxypurinol est métabolisé en nucléotides:

-par l'HGPRT, en présence de PRPP (oxypurinol 1-N ribotide et 1-N riboside), -par l'OPRT(oxypurinol 7-N ribotide et 7-N riboside).(BEARDMORE1971)

Ces nucléotides inhibent l'UMP synthétase (OPRT et ODC), ce qui conduit à la diminution de laconversion de l'acideorotique en OMP, puis en UMP.

L'allopurinol est également métabolisé par l'HGPRT, mais ses nucléotides sont nettement moins actifs que ceux dérivant de l'oxypurinol.

D'autre part, lamétabolisation en nucléotides s'accompagne d'une déplétion en PRPP, cofacteur indispensableàl'OPRT qui catalyse la conversion de l'acide orotique en orotidine 5'-phosphate. Cette déplétion accentue l'accumulation d'acide orotique.

L'allopurinol provoque donc un blocage de la synthèse des pyrimidines en aval de l'acide orotique, d'où l'augmentation de l'excrétion de ce dernier, et de celle de l'orotidine.

Remarque : l'acide orotique abaisse légèrement l'uricémie par inhibition de la synthèsede nova,et également par une action uricosurique(LUSSIER1988).Ainsi

en augmentant les concentrations d'acide orotique, en modifiant le métabolisme des pyrimidines, l'allopurinolrenforce son action sur le métabolisme des purines. Cette action hy-po-ruicémiante de l'acide orotique a été utilisée en thérapeutique :

Bicarbonate Glutamine Carbamylphosphate synthétase II Carbamylphosphate ...~ ,,,---Aspartate Aspartate r transcarbamylase Carbamylaspartate

D

ihyd

roo

ro

tase

J

Dihydroorotate Dihydroorotate déshydrogénase Orotate Orotate PRPP transférase

Orotidine ... ~ Orotidine 5'-phosphate

Uridine 5'-monophosphate UMP ~ ~ Ammonium Bicarbonate

CPSI!

Carbamyl phosphate 1

'

Cycle de l'urée Allopurinol Xanthine oxydase Oxypurinol Orotate PRPP transférase Oxypurinol

ribonucléotide

Figure 4: Mécanisme d'action de l'allopurinolsurla synthèse des bases pyrimidiques

~~~

3.2. 7.2.La 6-azauridine

La 6-azauridine, agent anticancéreux, est convertie par l'uridine kinase en 6-azauridine 5'-monophosphate. Ce métabolite est un inhibiteur compétitif de l'ODC, ce qui explique l'élévation de l'acidurie orotique chez les patients traités par cet agent.(FALLON1961)

Cette excrétion urinaire n'est pas corréléeà l'inhibition de l'UMP synthétase, ni à l'effetantileucémique.(WEBSTER1995)

3.2. 7.3.Le valproate

On observe une diminution significative de l'excrétiond'acide orotique chez les patients traités par le valproate. Le mécanisme mis en cause n'est pas encore connu: le valproate luimême pourrait inhiberlaNAGS. D'autre part, lepropionyl CoA, qui est augmenté lors du traitement par le valproate, pourrait inhiber la CPS.(SUGIMOT01982)

3

.

2. 8. La

grossesse

L'étude de Wood et coll.(WOOD1973)met en évidence une acidurie orotique moyenne pendant la grossesse (mais utilisation d'une méthode sem i-quantitative).

L'étude de Glasgow et coll.(GLASGOW1984)montre que la grossesse ne

modifie pas l'excrétionde l'acide orotique.

3

.

2. 9. L

'é

ta

t

de

jeûne

Le jeûnes'accompagne d'une diminution trèsrapide de l'excrétionde l'acide orotique (presque de moitié). Dès le premier jour de réalimentation, cette excrétion redevient normale. En fait, l'acidurie orotique est très bien corréléeà la quantité d'azote ingéré : ce qui explique l'intérêt de son dosage lors de perturbations de l'ammoniémie, et lors des suivis de tolérance protéique au cours de ces perturbations.(JEEVANANDAM1985)

et

~ ~

La technique de dosage de l'acide orotique urinaire la plus utilisée, et choisie au laboratoirejusqu'àprésent, est laméthode colorimétrique d'Adachi et coll.(ADACID1963),modifiée par Rogers et coll.(ROGERSI968) :l'acide orotique,

en présence d'eau de brome, est décarboxylé et oxydé en acide 5,5' -dibromobarbiturique. Ce dernier est réduit par l'acide ascorbique en acide barbiturique, qui réagit avec le para-diméthylaminobenzaldéhyde (PDAB), pour former un composé orangé, dont l'absorptionest maximaleà 480 nm.

Cette méthode présente l'avantage d'être simple et rapide. Mais elle est peu spécifique : de nombreuses interférences entraînent des erreurs par excès ou par défaut. Une purification préalable par chromatographie liquide-liquide

(KESNERI975)permet de réduire ces interférences, ainsi que la réalisation d'un

blanc pour chaque urine(KAMOUNI987).D'autre part, elle est peu sensible.

Enfin, l'eaude brome est un réactifdangereuxà manipuler.

Des dosages enzymatiques, avec l'OPRT, ont été décrits

(ROSENBLOOM1964; TAX1978).Plus récemment, ont été publiées des techniques

de dosage par chromatographie d'échange d'ions (BACHMANN1980a ; SEILER1994), par fluorimétrie(ARNAUD1994),par électrophorèse capillaire (TIENSTRA1992),et par HPLC (EVANS1979; BRUSILOW1989 ; OHBA1991a ; FERRARI1989).

Le dosage de l'acide orotique par chromatographie en phase gazeuse (CPG), coupléà la spectrométrie de masse (SM), avec dilution isotopique, a été décrit pour lapremière fois en 1984 par Jakobs.et coll.(JAKOBS1984):le dosage

était réalisé dans le liquide amniotique. Cette méthode a été reprise par Rimoldi et coll.(RIMOLDI1994),et McCann et coll.(MACCANN1995),pour le dosage urinaire.

Nous avons repris et adapté la méthode de Rimoldi et coll. ; cette méthode présentait, à première vue, une sensibilité suffisante, et ne demandait qu'une seule manipulation pour l'analyse qualitative des acides organiques et l'analyse quantitative de l'acideorotique.

Remarque :un dosage par CPG-SM sans dilution isotopique, avec une gamme, est décrit(HWUI992).Des essais réalisés dans notre laboratoire étaient peu

concluants, montrant une absence de linéarité et une faible sensibilité. Ce problème vient sans doute du fait que l'extraction de l'acide orotique est difficile et peu reproductible.

~ ~

1

.

La

CPG-SM

avec

d

i

lu

t

ion

iso

top

ique

1.1. Qu'est ce que laCPG-SM?

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode d'analyse qui permet de séparer des mélanges gazeux complexes par une suite continue d'équilibres, s'établissant entre une phase mobile gazeuse et une phase stationnaire placéeà l'intérieur d'une colonne. Elle s'adresseà tous composés susceptibles d'être volatilisés par élévation de température. Un grand nombre de molécules organiques peuvent ainsi être séparées, après transformationen dérivés plus volatils. Ainsi, l'analyse des acides organiques urinaires, et de l'acide orotique, nécessite 'unepréparation préalable, en3 étapes :

-une oximation par l'hydroxylaminepour protéger lesfonctions cétones, -une extraction par des solvants organiques,

-et une sylilation afin d'améliorer la volatilité des molécules : cette opération consisteà remplacer un hydrogène labile d'un groupement hydroxyle, carboxyle, ou amine, par un groupe triméthylsilyle, (CH3_)3Si-.

L'appareillage de CPG comprend(BARGNOUX1988):

-une source de gaz vecteur :dans notre cas, l'hélium.

-un injecteur : permettant la vaporisation instantanée de l'échantillon, qui se mélange de façon homogène au gaz vecteur. Nous utilisons un injecteur-diviseur (Split), dans lequelle gaz vecteur est divisé en 2, flux, dont un seul pénètre dans la colonne, l'autres'échappant par un système de fuite.

-une colonne :on distingue les colonnes remplies, de diamètre intérieur de 1à 4 mm, et les colonnes capillaires, très longues (10à 50 m), et de diamètre intérieur inférieurà 0,5 mm. Ces dernières sont les plus utilisées car plus efficaces. La phase stationnaire est déposée. sous forme d'un film mince (< 1 µm), ou est greffée directement sur la paroi intérieure. Cette phase se caractérise par sa structure chimique, sa polarité, satempératureminimaleà laquelle elle est liquide et apteà dissoudre un soluté, et sa températuremaximale d'utilisation.

-un four : permettant de maintenir ou d'élever la température de la colonne de façon uniforme, sous le contrôle d'un programmateur fixant les températures initiales et finales, ladurée de chaque palier, ainsi que les taux de programmation (°C/mn).

-un détecteur : la gamme de détecteurs utilisés en CPG est très étendue (ionisation de flamme, capture d'électrons, spectromètre de masse ...).

~ ~

La spectrométrie de masse (SM) consisteà provoquer l'ionisation d'une molécule, et sa dissociation en fragments ionisés, puisà déterminer la nature et l'abondancede ces ions.

Un spectromètre de masse comprend(DE GRAEVE 1985):

-une chambre d'ionisation: dans laquelle lamoléculeàétudier est ionisée, soit sous l'impact d'un bombardement d'un faisceau d'électrons d'énergie de 70 eV (ionisation électronique), soit sous l'impactd'un flux de molécules ionisées de gaz réactant, tel que leméthane, l'ammoniacou l'isobutane(ionisation chimique). -une chambre d'accélération : où les ions sont attirés par un système d'électrodes et soumisà une tensionaccélératrice. On communique alors aux ions de même charge lamême énergie cinétique ;en revanche, leur vitesse dépend de leurmasse.

-une chambre de déviation (analyseur de masse) : où les ions sont dispersés grâceàun champ magnétique (secteur magnétique) ou électrostatique (filtre quadripolaire). La trajectoire des ions est fonction du rapport m/z, de leur masse (m)à leur charge (z). Ils sont ensuite focalisés sur la fente de sortie de l'analyseur,et entrent en contact avec lerécepteur.

Ces 3 chambres sont situées dans une enceinte où est maintenu un vide poussé (inférieurà 10-5_Torr).

-un récepteur : généralement un photomultiplicateur d'électrons. Le signal qu'il donne est fonction du nombre d'ions, de leur masse, de leur charge, de leur structure, et du facteur d'amplification (gain) du photomultiplicateur. Ce signal est transformé en spectre de masse, qui représente ladistribution des abondances ioniquesen fonction de leurrapportm/z.

-un calculateur: microprocesseur électronique gérant tousles calculs.

Le spectromètre de masse peut être utilisé selon 2 modes d'analyse différents : • en mode qualitatif ou chromatographie de masse : les spectres de masse sont enregistrés de façon répétée, très rapide. La somme des intensités des différents ions obtenus pour chaque spectre est calculée, et correspond au courant ionique total. Le tracé chromatographique qui en résulte est voisin de celui que donnerait un détecteur à ionisation de flamme. L'étude du spectre de masse de chaque composé élué permet son identification. Cette étude se fait par comparaison du spectre avec ceux contenus dans une bibliothèque, ou par l'étude des principaux processus de fragmentation de lamolécule.

~ ~

certaines masses ioniques, caractéristiques de lamoléculeà analyser. Le choix de ces ions s'effectue selon des critères de sensibilité (ion d'abondance importante : ion majeur) et de spécificité (ion de haute masse : souvent ion moléculaire). Ce mode d'analyse est nettement plus sensible que la chromatographie de masse (le picogramme peut être détecté), car la durée d'intégration du signal est plus importante. Le bruit de fond est réduit dans de largeproportion.

1.2. Qu'est ce que ladilution isotopique?

La dilution isotopique est souvent la méthode de référence choisie en biochimie par la Société Française de Biologie Clinique : cholestérol, urée, fer, glucose, phosphore, potassium, lithium, magnésium ...(VASSAULT1986)

Elle repose sur leprincipe suivant :

Une quantité inconnue d'un analyte est déterminée en ajoutant à l'échantillon une quantité connue du même analyte marqué par 1 ou plusieurs atomes isotopes, puis en mesurant le ratio des 2 formes de l'analyte par une technique permettant de les différencier : la spectrométrie de masse.

L'analyte marqué jouedonc lerôle de standard interne.

1.2.1.

Qu

'es

t

ce

qu

'un

marquage

iso

top

ique?

Les isotopesd'un même élément chimique sont des atomes dont lesnoyaux ont : -lemême nombre de protons, soit un numéro atomique Z identique,

-un nombre de neutrons différents, soit un nombre de masse A différent.

Deux isotopes ont le même nom, les mêmes propriétés chimiques, mais des propriétés physiques différentes.

Ainsi l'azote15_{N a un neutron en plus que l'azote}14_{N: son nombre de masse est}

donc 15. C'est un isotopestable, car non radioactif. Pour marquer une molécule organique, il est possible d'échanger dans lamolécule un ou plusieurs14_{N, par}

un ou plusieurs15_{N. Par exemple, pour l'acide orotique:}

L'acide orotique marqué (l,3-15_N 2) : 43 0 Il

/

c

,

H-N* CH 1 Il O=C C-COOH

"'

_N*./ 1 H

-

-

-

1

'

t

a

t

éw

d

~

- a des propriétés chimiques identiques àcelles de l'acide orotique naturel : même comportement visàvis de l'extraction, de lasilylation, de l'injection. C'est donc un excellent étalon interne. De plus,les 2 formes, naturelle et marquée, ont le même temps de rétention :la CPG permet la séparation de l'acide orotique des autres acides organiques, mais elle ne permet pas laséparation des 2 formes.

- a une masse différentede celle de l'acide orotique naturel : il comprend 2 atomes d'azote15_{N au lieu de 2 atomes d'azote}14_{N. La masse de l'acideorotique}

naturel étant de 156g/mol, lamasse de l'acideorotique marqué est donc de 156+2 =158g/mol.

Par conséquent,la forme naturelle a un spectre de masse différent de la forme marquée : la spectrométrie de masse permet l'identification et la quantification en tenant compte de l'ion le plus caractéristique, ou le plus intense, de l'acide orotique naturel, ainsi que de l'ion correspondant de la molécule marquée.

Remarque : le nombre, la position, la nature des isotopes peuvent influencer les propriétés de solvatation, les coefficients de partage ou lavitesse de dérivation de ces composés.

1

.2

.2

.

Commen

t

d

i

f

férenc

ier

les

2

formes?

L'acide orotique présente une tautomérie "cétone-énol" : il existe un équilibre chimique entre 2 isomères de structure, équilibre se déplaçant vers la forme énolique en milieu alcalin. Ceci explique l'absence d'oximation de la molécule, puisque cette réaction est réalisée en milieu alcalin.

0 OH " 1

/

c

,

~ H-N CH >Ill(

>

N CH 1 Il 1 Il O=C C-COOH ~ ~ ~ N₁ N H

Après extraction et silylation l'acide orotique, naturel ou marqué, est triméthylsilylé : 2 groupements triméthylsilyles sont greffés sur les 2 fonctions hydroxyles, et un troisième groupement est greffé sur lafonction carboxyle.

L'impact par ionisation électronique permet de retrouver certains ions caractéristiques dans le spectre de masse (cf. figures 5 et 6) :

-l'ionmoléculaire, qui correspondàlamolécule entière triméthylsylilée; -l'ionM-15, qui correspondàlaperte d'un groupement méthyle;

~ métkde

Figure 5 : Formule et spectre del'acide orotique naturel

m

/z

0-TMS₁

372

~ N' · CH ~ 1 Il 254 TMS-0-C C-COO-TMS

V

Ion moléculaire : Ion M-15: Ion majeur: 2 4 600000 500000 73 400000 300000 357 200000 147 100000 100 45 0 283 313329 372 5 133 174 197214 239 /Z -> 50 100 150 200 250 300 350

Figure 6 : Formule et spectre de l'acideorotique marqué Ion moléculaire :

Ion M-15: Ion majeur: un ance 250000 200000 150000 100000 50000 45 0 /Z -> 50 mlz 374 359 256 73 7 101 0-TMS 1 ~ N* CH 1 Il ~ /C-COO-TMS ~ 2 6 359 147 199215 284 331 374 200 300 350 45