FACULTE DE MEDECINE
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/9FJT THESE PRESENTEEA L'ECOLE DES GRADUES DE L ' UNIVERSITE LAVAL
POUR L'OBTENTION
DU GRADE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.) PAR
RAYNALD ROY MAITRE ES SCIENCES DE L ' UNIVERSITE LAVAL
ETUDE DU POTENTIEL IMMUNOSUPPRESSEUR DES TRANSFUSIONS SANGUINES ET DE SON IMPORTANCE DANS LE DEVENIR DE LA GREFFE RENALE.
RESUME
La transfusion de sang d'un individu à un autre peut s'avérer vitale dans plus d'une situation. Cette pratique est particulièrement fréquente chez les patients urémiques soumis à la dialyse. Toutefois, les conséquences des transfusions sanguines par rapport à 1 ' augmentation des chances de survie d'une greffe de rein, demeurent encore un phénomène étrange. L'objet de cette thèse est d'étudier le mode d'action de ce nouveau moyen d'améliorer la survie de la greffe rénale.
Dans un premier temps, nous avons montré que cet effet bénéfique des transfusions sanguines dans le devenir de la greffe rénale pouvait être observable suite à un petit nombre de transfusions (< 5), minimisant ainsi le risque de présensibilisation contre les antigènes sanguins résultant en une formation d'anticorps qualifiés de néfastes pour le greffon. Toutefois, la présence d'autres types d ' anticorps (anti-B IgM), semble potentialiser l'effet bénéfique des transfusions. En se basant sur ces premières observations, 1'administration délibérée et à intervalles réguliers d'un petit nombre (1-5) de transfusions sanguines à des patients nous a permis de mettre en évidence chez ceux-ci, certaines altérations de la réponse immune. Ces altérations sont particulièrement évidentes au niveau de la réponse cellulaire et se caractérisent par 1'apparition d'une activité suppressive. La présence de cette immunosuppression induite par les transfusions se révèle
1'élément majeur pouvant expliquer la prolongation de la survie des greffes.
Nous avons étudié les mécanismes immunologiques par lesquels cette immunosuppression peut engendrer cet effet bénéfique, ce qui nous a permis de mettre en évidence des phénomènes jamais rapportés jusqu'à maintenant. En effet, cette capacité immunosuppressive semble être reliée au pouvoir régulateur de certaines cellules (monocytes/macrophages) généralement impliquées dans les processus d'initiation de la réponse immune de type cellulaire et humoral. Cette régulation serait médiée par l'intermédiaire d'un ou de plusieurs produits de sécrétion de ces cellules sensibles à 1'indométhacine, et qui peuvent être forts importants dans la régulation de la réponse immune.
Les résultats décrits dans cette thèse nous permettent de conclure que le recours aux transfusions sanguines dans la préparation des patients en vue d'une transplantation rénale est vraiment une approche indispensable si nous voulons optimiser les chances de réussite des greffes de rein. Cette méthode peut être qualifiée d'immunosuppressive et s'avère peu risquée pour le patient en autant que les effets sur la réponse immune sont évalués et suivis par des méthodes appropriées.
TABLE DES MATIERES
PAGE
AVANT-PROPOS ... iii
LISTE DES ABREVIATIONS ... v
LISTE DES FIGURES ... vi
LISTE DES TABLEAUX ... vii
INTRODUCTION ... 1
A- Historique ... 1
B- Nombre de transfusions requises ... 4
C- Mécanisme(s) probable(s) ... 5
D- Intérêt et originalité du sujet ... 9
CHAPITRE I - MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET BENEFIQUE DES TRANSFUSIONS SANGUINES DANS LA GREFFE RENALE. 1. Démonstration de ce phénomène par une étude retro spective ... 11
2. Détermination du nombre minimum de transfusions sanguines requises ... 15
3. Publication "Kidney graft survival : role of blood transfusions and lymphocytotoxic antibodies" ... 17
CHAPITRE II - EFFET BENEFIQUE DES TRANSFUSIONS SANGUINES ET REPONSE IMMUNE... 22
1. Effet sur la réponse immune de type cellulaire .... 23
2. Publication "Blood transfusions in renal dialysis patients. Effect on cellular immune response" ... 27
3. Effet sur la réponse immune de type humoral ... 34
3.1 Matériels et méthodes ... 34
3.1.1 Détermination du nombre de cellules sécrétrices d 1 IgG ... 34
3.1.2 Détermination de la capacité de pro duction d 1 IgG ... 35
3.2 Résultats et discussion ... 36
4. Risques de sensibilisation suite à l'utilisation de transfusions administrées de façon délibérée .... 39
4.1 Détermination de la présence d'anticorps anti-B et anti-PBL sériques ... 39
4.1.1 Purification des lymphocytes B ... 39
4.1.2 Recherche des anticorps anti-B et anti-PBL ... 40
ii.
CHAPITRE III - ETUDE DES MECANISMES IMMUNOLOGIQUES IMPLI QUES ET DE LEUR IMPORTANCE DANS LE DEVENIR
DE LA GREFFE RENALE... 43
1. Activité suppressive induite versus devenir de la greffe rénale ... 44
2. Mécanismes immunologiques ... 45
3. Publications "Improved renal allograft function and survival following non-specific blood trans fusions. I. Induction of soluble suppressor fac tors inhibiting the mitogenic response"... 51
"Prostaglandin-dependent suppressor factor induced following 1-5 blood transfusions : Role in kidney graft outcome"... 78
DISCUSSION GENERALE ... 88
A- Les trans fusions sanguines comme moyen d'immuno suppression ... 88
B- Les transfusions sanguines face aux autres méthodes d'immunosuppression ... 91
C- Mécanisme(s) pouvant expliquer cette immunosup pression ... 94
CONCLUSION ... 98
BIBLIOGRAPHIE ... 100
ANNEXES ... 117
Publications : 1. "Les lymphocytotoxines froides chez les receveurs de greffe rénale"... 118 2. "Characterization of lymphocytotoxic antibodies in
AVANT-PROPOS
3e tiens à remercier, mon directeur de thèse, le Docteur William Waithe du Centre de Recherche de l'Hôpital Hôtel-Dieu de Québec qui a bien voulu m'accorder sa confiance en m'acceptant comme étudiant. De plus, je veux remercier le Docteur Guy Pelletier qui a su comme co-directeur de cette thèse me fournir la critique et les conseils requis me permettant de mener à bien cette recherche.
Aux Docteurs Jean-Guy Lachance, Réal Noel néphrologues, et Dr Yves Fradet urologue de l'Hôpital Hôtel-Dieu de Québec, ainsi qu'à toute l'équipe rattachée à la greffe rénale de cet hôpital, j'adresse mes remerciements pour leur participation organisationnelle et scientifique à ce projet. Egalement je tiens à remercier le Docteur John H. Grose du Centre de Recherche de 1'Hôtel-Dieu de Québec pour sa participation au dosage des prostaglandines.
Je veux remercier tout particulièrement M. Roger Beaudoin, biochimiste et assistant de recherche à l'Unité de Recherche en Immunologie du CHUL pour ses précieuses suggestions concernant la mise au point des protocoles expérimentaux ainsi que dans l'interprétation des résultats. Je remercie aussi Mme
IV .
Lilliane Bérubé pour sa remarquable compétance technique ainsi que son esprit d1 initiative qui a rendu possible la cueillette d'échantillons sanguins chez des patients demeurant aussi loin que le Nouveau-Brunswick et les Iles-de-la-Madeleine.
De même, j 1 exprime ma gratitude au Docteur André Beaulieu, responsable de l'Unité de Recherche en Immunologie et Rhumatologie du CHUL et au Docteur Jacques Hébert, chef du Service d ' Immunologie et d'Allergie du CHUL pour m'avoir fourni 1 ' opportunité d ' effectuer ce travail de recherche .
Pour terminer, je remercie sincèrement mes deux enfants, Marie-Christine et Jean-François de leur patience dans 1 ' attente des nombreux moments que je n'ai pu leur accorder. Ils sont pour moi une source constante de motivation dans le travail. De tout coeur, j'exprime ma reconnaissance à mon épouse, Brigitte, pour sa tolérance et son encouragement soutenu.
Le support financier a été fourni par des subventions de recherche obtenues de la Fondation Canadienne des Maladies du Rein. Toute l'expérimentation a été effectuée dans les laboratoires de l'Unité de Recherche en Immunologie et Rhumatologie du Centre Hospitalier de 1 'Université Laval.
LISTE DES ABREVIATIONS BT Con A GRM
11-2
PBL PBS PFC POE SRBC FCS "Blood transfusions" Concanavaline AGlobules rouges de mouton Interleukine-2
"Peripheral Blood Lymphocytes" "Phosphate-Buffered Saline" "Plaque Forming Cells"
Prostaglandine de la série E "Sheep Red Blood Cells"
VI .
LISTE DES FIGURES
Actuarial graft survival in all recipients and male patients only according to the number of pre-transplant blood transfusions... ... . Relationship between the length of time on dialysis and the number of blood transfusions... Cumulative graft survival rates in transfused and non transfused patients according to the type of post-transplant antibodies... ... Signification du rapport t48/tU défini par le test "ConA enhancement method"... A48/AG ratio determined in 37 untransfused normal controls and in 12 uremic patients who received up to four transfusions... Capacité de production d'IgG in vitro chez les patients dialysés ayant reçu 1 à 4 transfusions... Pourcentage des patients sur un total de 22 ayant formé des anticorps anti-PBL et anti-B froid suite à 11 administration délibérée de 1-5 transfusions... Suppression of ^H-Thymidine incorporation in normal cells by supernatants obtained with cells from normal volunteers or with different preparations from transfused patients... Kidney graft function and survival observed in patients who received up to 5 blood transfusions and showed a Con A ratio < 5 or > 5... Correlation between the increase of ConA ratio and quantity of PGE 2 secreted in vitro ...
Suppression of proliferative response in normal lymphocytes by supernatants obtained from transfered patients with a ConA ratio > 5... Importance de la "ConA enhancement method" dans la préparation transfusionnelle
greffe de rein
des patients en vue d'une
Effet des transfusions sanguines sur la survie de la greffe rénale chez les patients traités avec ou sans Cyclosporine A... Principaux événements d'autorégulation de la réponse immune impliqués dans le devenir de la greffe rénale ... .
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86
87 91) 9397
Vil .
LISTE DES TABLEAUX
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Pretransplant blood transfusions and time on dialysis. . . 19 Incidence and characteristics of post-transplant
antibodies in transfused and not transfused recipients. . 19 "^H-Thymidine incorporation by peripheral blood
lymphocytes after ConA stimulation at 0 or at 48 hr.... 29 Evaluation of T cell subsets by the ratio (OKT 4/OKT 8)... 30 Correlation between the ConA ratio observed after 1-5
blood transfusions and the kidney graft function and
outcome up to 1 year post-transplantation... 73 Correlation between the percentage of
monocytes/macrophages and the number of transfusions
administered... 74 Absence of correlation between ConA ratio and quantity
of PGE 2 secreted in vitro . Results shown for 5
INTRODUCTION
A- Historique
Le recours aux transfusions sanguines remonte aux origines de la médecine. Leur rôle vital comme moyen de renouveler les divers constituants du sang d'un malade a été et est toujours indispensable. Mais cette forme d'intervention entraîna chez certains de ces derniers 1 ' apparition d'un phénomène encore inconnu jusque là: la réaction transfusionnelle (Krevans 1957 ). Ce phénomène est caractérisé par 1 ' apparition chez le patient de symptômes particuliers tels le tremblement et la fièvre que l'on surnomma la "réaction transfusionnelle fébrile". Les conséquences, tragiques pour le patient, de cette réaction, obligèrent le milieu scientifique à se pencher sur l'étude des phénomènes immunologiques provoqués par la transfusion de produits sanguins étrangers.
La connaissance des antigènes de surface des globules rouges (système ABO) mis en évidence par Landsteiner (1926) a permis d'éliminer en partie les réactions transfusionnelles. Ceci a en effet été rendu possible grâce à la mise au point de tests de compatibilité, réduisant les risques de sensibilisation (formation d ' anticorps) contre les antigènes présents à la surface des globules rouges. Cependant, la présence d'autres
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types cellulaires comme les globules blancs pouvait provoquer la formation de nouveaux anticorps. Ce sont Dausset (1954) et Payne (1957) qui furent les premiers à montrer que les transfusions sanguines pouvaient non seulement provoquer chez les receveurs la formation d'anticorps contre les antigènes des globules rouges mais aussi contre les leucocytes. Ces anticorps, déterminés par un test de cytotoxicité contre les leucocytes, étaient similaires par leur spécificité à ceux retrouvés dans le sérum des femmes multipares; c'est-à-dire des anticorps dirigés contre les antigènes étrangers du foetus (Payne et Rolfs, 1958; van Rood et al 1958). C'est à l'aide de ces anticorps que Dausset, en 1958, identifia le premier antigène leucocytaire. Par la suite, ces antigènes, étant présents sur d'autres tissus et organes, ont été appelés antigènes de transplantation et constituent maintenant les antigènes du système HLA (Human Leucocyte Antigens). Ce sont eux qui, après une greffe, provoquent une réponse immunitaire et de ce fait entraînent le phénomène de rejet du greffon. Cette réponse immunitaire dépend de la disparité génétique entre le donneur et le receveur
(Festenstein et al 1971; van Hooff et al 1972; Dausset et al 1974; Opelz et al 1974).
Medawar (1946) fut le premier à montrer que la transfusion sanguine pouvait immuniser le receveur, via la formation d'anticorps, contre une subséquente transplantation d'organe et devenait de ce fait un facteur de risque. Cette crainte de transfuser les patients en dialyse s'est imposée et
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est demeurée la croyance universelle pour les 25 années qui suivirent. Cette restriction a été particulièrement observée dans le cas des patients les plus susceptibles de recevoir une greffe. Le bien fondé de cette hypothèse a particulièrement paru évident suite à la parution de nombreux travaux, entre les années 1966 et 1972, montrant une diminution du taux de survie de la greffe du rein particulièrement chez les patients ayant préalablement préformé des anticorps anti-HLA (Kissmeyer-Nielson et al, 1966 ; Rapaport et al, 1967; Morris et al, 1969 ; Patel et T erasaki, 1969 ; Terasaki et al, 1971 ; Ope 1z et Terasaki, 1972 ; van Hooff et al, 1972).
Entre temps, notre connaissance des antigènes du système HLA et des phénomènes de rejet progressait d'année en année. En 1973, Opelz et collaborateurs démontrèrent que la survie de la greffe rénale n'était nullement diminuée chez certains patients dialysés ayant reçu des transfusions sanguines en comparaison avec ceux qui n'en avaient pas reçues. Phénomène encore plus étrange, la survie de la greffe pour ces patients transfusés était, au contraire, nettement améliorée. La parution de ces résultats a été accueillie avec septicisme et a soulevé de multiples interrogations. Par la suite, de nombreuses études menées chez l'homme sont venues supporter le fait que les transfusions sanguines pouvaient améliorer la survie de la greffe du rein. De même, cet effet bénéfique des transfusions était observé chez l'animal, comme en témoignent des études faites chez le singe rhesus (van Es et al, 1977 ; Borleffs et al,
1981) et le chien (Obertop et al, 1981).
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Cependant, plusieurs points encore obscurs rendaient l'administration systématique de transfusions sanguines aux patients en vue d'une transplantation, une procédure audacieuse. En effet, le danger d'infection virale transmissible (Feinstone et al 1974) et le risque de sensibilisation avec production d'anticorps cytotoxiques (Bollinger et al 1982 ) étaient redoutés. Une première étape de notre travail consistait donc à déterminer dans quelles conditions de risques minimuns, les transfusions sanguines pourraient être utilisables.
B-Nombre de transfusions requises
Le nombre de transfusions requises pour induire cet effet bénéfique ne semble pas encore faire 1 ' unanimité entre les auteurs. En effet, même à 1 ' intérieur d'un même Centre, on arrive difficilement à un concensus (Opelz et al, 1977, 1979, 1981). Certains auteurs ont montré qu'une seule transfusion de sang était aussi efficace qu'un grand nombre de transfusions (Buy-Quang et al 1977, Persijn et al 1977, Opelz et Terasaki 1980). Par contre, d'autres ont observé qu'un effet bénéfique pouvait être obtenu suite à 1 'administration de deux ou trois unités de sang (Hourmant et al 1979 ; Oei et al 1979, Williams et al 1979, Betuel et al 1981, Frisk et al 1981). Cependant,
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d'autres ont démontré un effet maximum avec un nombre supérieur à 5 unités de sang (Opelz et Terasaki 1976, Vincenti et al 1978, Alexandre et Van Cangh 1978, Feduska et al 1979). Les résultats de la première étude internationale à laquelle nous participions, ont été présentés au 8e "International Histocompatibility Workshop" en 1981. Le détail de ces résultats, publié par Opelz et Terasaki (1982), n'a pas permis de trancher la question concernant le nombre idéal de transfusions. Cette étude a donc été poursuivie dans une première partie de nos travaux.
C- Mécanisme(s) probable(s)
On ne peut, en fait, que spéculer sur le(s) mécanisme(s ) par le(s)quel(s) les transfusions peuvent accroître les chances de survie d'une greffe de rein . Plusieurs hypothèses ont été proposées mais aucune n'a été clairement démontrée. Les deux plus importantes hypothèses qui sont actuellement retenues, sont celle de la sélection et celle de la facilitation.
L'hypothèse de la sélection telle que proposée par Opelz, Mickey et Terasaki (1974) fait référence au degré de susceptibilité d'un patient à développer des anticorps cytotoxiques après transfusions. Ce phénomène a pour effet de partager les patients en répondeurs et en non-répondeurs selon
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qu'ils produisent ou non des anticorps. Ainsi, les patients qualifiés de répondeurs sont plus souvent sujet à un cross-match positif, ce qui les exclut le plus souvent comme candidats à la greffe. Cependant, 1'hypothèse de la sélection ne peut, en soi, tout expliquer. Celle-ci est particulièrement contestée dans le cas d'un effet bénéfique induit suite à une seule transfusion (Persijn et al 1979) ou à une transfusion donnée le jour de la chirurgie (Stiller et al 19 78; Hunsicker et al 1980 ; Williams et al 1980), du fait que les probabilités de sensibilisation sont alors pratiquement inexistantes. En conclusion, cette hypothèse pourrait s'appliquer dans certains cas mais ne saurait être le seul mécanisme en cause (Mickey et al 1983 ; Fehrman et al 1983).
L'hypothèse de la facilitation, d'autre part, est basée sur l'idée que des antigènes présents sur les cellules transfusées pourraient induire des anticorps facilitants. Ce phénomène a été décrit dans le modèle animal suite à un grand nombre de transfusions (Abouna et al 1977 ; Zimmerman 1977 ). De nombreux types d'anticorps ont été décrits chez l'homme comme pouvant avoir des effets facilitants : anticorps bloquant la réaction de culture mixte des lymphocytes, anticorps anti-B froid, anti-la ou anti HLA-Dr et anti-idiotype (van Rood et al 1973; Davies et Alkins 1974 ; Binz et Wigzell 1976; Ettenger et al 19 76; Soulillou et al 1976; Roy et al 1977, 1981a ; Park et al 1977; Buhlmann et al 1978 ; Iwaki et al 197 8 ; Conker et al 1979; Werner-F avre et al 1979; Jeannet et al 1980 ; 5 ingai et al 19 8 2;
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Sucio-Foca et al 1983). La caractérisation de ces anticorps facilitants et particulièrement d'un type d1 anticorps cytotoxiques pour les lymphocytes B et révélés sérologiquement à basse température (anticorps anti-B froids) a fait le sujet de travaux de recherche en regard du devenir des greffes du rein, dans notre laboratoire (Annexe I et II).
Ces anticorps sont dirigés contre des structures antigéniques exprimées à la surface des lymphocytes B, différentes des antigènes HLA, A, B, C et Dr. Ces anticorps sont de la classe d'immunoglobuline IgM et sont révélés par un test de cytotoxicité nécessitant la présence du complément. De plus, ces anticorps anti-B révélés à basse température (4C ou 15C) peuvent inhiber les cellules stimulantes dans une culture mixte des lymphocytes. Le rôle de ces anticorps dans le mécanisme de facilitation de la greffe est encore obscur .
Mais cette facilitation peut aussi refléter une suppression active de la réponse immunitaire par 1 ' induction de cellules suppressives suite aux transfusions sanguines (Van Rood et Balner 1978). Une augmentation de la fonction suppressive reliée à la présence de cellules suppressives a été notée chez des patients dialysés, trois semaines après 1'administration de deux unités de globules rouges concentrés (Smith et al 1981) ou de globules rouges lavés (Fisher et al 1980; Lenhard et al 1982). Mais cet effet semble être noté, à condition que le sang ne soit pas appauvri en leucocytes (Diepenhorst et al 1972).
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Toutefois, la caractérisation des cellules suppressives impliquées dans ce phénomène n'est pas encore clairement établie. Ainsi, le recours à la réaction de culture mixte des lymphocytes pour déterminer la spécificité de ces cellules suppressives (Jeffery et al, 1984 ) de même que la détermination du nombre de ces cellules par des marqueurs spécifiques (anticorps monoclonaux) au niveau du sang périphérique des patients transfusés (Kerman et al, 1982; Guttman et al, 1982) n'ont pas été très concluants. Cependant, l'existence des cellules dites suppressives semble être confirmée, comme le montre une étude récente, où il a été possible de transférer de telles cellules induites par des transfusions, d'un animal à un autre (Martin et al, 1984). Nous avons donc voulu aborder cet aspect dans cette thèse.
Cet état de non-réponse immunologique induit par les transfusions peut être sous le contrôle de certains mécanismes régulateurs de la réponse immune. Ainsi, la fonction accessoire de la réponse immune, c'est-à-dire l'ensemble des phénomènes permettant d'initier et d'orienter la réponse immunologique face à une stimulation antigénique peut être un élément pertinent. Les monocytes/macrophages sont les cellules essentielles à cette fonction accessoire. De récentes études ont montré que les transfusions pouvaient induire un bloquage de la fonction du macrophage (Keown et Descamps 1979 ; Van Der Linden et al 1981). Malgré la complexité et le grand nombre de composantes de la fonction accessoire (monocytes/macrophages, interleukines et de
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nombreux facteurs régulateurs comme les prostaglandines) , nous avons voulu étudier l'effet des transfusions sur cet aspect particulier de la réponse immune.
Enfin, d'autres constituants du sang (fibrinogène, protéines aggrégées, fibronectine, etc...) peuvent avoir un effet sur la réponse immune. C'est le cas de la ferritine qui a été proposée comme élément important dans le mécanisme d'action des transfusions sanguines (Gokal et al, 1979; Dupont et al,
1983 ) .
D- Intérêt et originalité du sujet
L'étude des mécanismes par lesquels les transfusions sanguines ont un effet bénéfique dans le devenir de la greffe rénale et l'implication probable de phénomènes immunorégulateurs nous apparaissaient comme un sujet original pour des études doctorales. D'autant plus que ce nouveau moyen d'améliorer la survie de la greffe semblait être prometteur.
Dans un premier temps, nous avons voulu établir le rôle bénéfique des transfusions sanguines dans le devenir de la greffe rénale en précisant sous quelles conditions (nombre de transfusions, présence d'anticorps cytotoxiques, etc...) celles-ci pouvaient avoir un effet bénéfique optimal.
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Deuxièmement, nous avons déterminé si cet effet des transfusions est médié par des phénomènes associés à la régulation de la réponse immune. Et finalement, nous avons investigué par quel(s) mécanisme(s) immunologique(s), ces phénomènes se manifestent. Le but ultime étant d'utiliser plus adéquatement ce nouveau moyen de prolonger la survie de la greffe du rein tout en limitant les risques secondaires. Ce moyen s'avère un immunosuppresseur efficace en autant que l'ampleur de même que les limites des différentes altérations de la réponse immune peuvent être évaluées.
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CHAPITRE I
MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET BENEFIQUE DES TRANSFUSIONS SANGUINES DANS LA GREFFE RENALE.
1. Démonstration de ce phénomène par une étude rétrospective.
Cette étude a été effectuée à partir de 121 receveurs d'une première greffe rénale cadavérique, greffés à 1'Hôtel-Dieu de Québec entre juin 1973 et janvier 1980. La majorité des patients (93) avait reçu un certain nombre de transfusions sanguines selon les besoins thérapeutiques durant leur séjour en dialyse, tandis que les 28 autres n'en avaient pas reçue. La sélection des receveurs, les techniques opératoires et la médication immunosuppressive post-opératoire, ont été similaires dans chaque cas.
L ' influence des transfusions sanguines sur la survie de la greffe, ne pouvait toutefois pas être démontrée sans prendre
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en considération le rôle primordial de certains autres facteurs spécialement acceptés dans le milieu scientifique comme pouvant affecter la survie du rein. Quelques-uns ont fait le sujet d'études antérieures dans notre laboratoire. C'est le cas du rôle prépondérant de certains types d'anticorps cytotoxiques (Roy et al 1977-81a, annexes) et du degré de compatibilité des antigènes HLA-A et B entre donneur et receveur de rein (Roy et al 1981b). D'autres facteurs comme le sexe du patient et la durée du séjour en dialyse ont aussi été retenus dans l'interprétation des données. L'importance de ces facteurs est basée sur le fait qu'une forte probabilité de sensibilisation (formation d'anticorps contre les antigènes étrangers du foetus) peut être occasionnée à la suite de multiples grossesses pour les patientes de sexe féminin. Ainsi, la présence de ces anticorps préformés suite à ces grossesses peut être dans certains cas bénéfique ou néfaste pour la survie du rein. De même,l'état d'urémie dépendant du temps passé en dialyse peut avoir un effet immunosuppresseur tel que démontré par Guttman et al (1978).
Aucune différence au niveau de la compatibilité, receveur/donneur, des antigènes HLA-A et B entre les groupes (transfusés, non transfusés) n'a été observée. L'influence de la compatibilité des antigènes HLA du locus C n'a pas été considérée pour la simple raison que leur importance n'a jamais été démontrée (Albrechtsen et al, 1981). De plus, l'effet de la compatibilité pour les antigènes HLA-Dr n'a pu être analysé
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parce que nous ne pouvions identifier sérologiquement ceux-ci à cette époque (1973-80). Nous devons admettre que l'appariement des antigènes Dr aurait pu influencer nos résultats, d'autant plus que de récentes études soutiennent l'importance prioritaire de la compatibilité entre ces antigènes dans le devenir de la greffe rénale (Persijn et al, 1978; Ting et Morris, 1980; Opelz et Terasaki, 1982). Enfin, nous ne pouvons pas exclure que des facteurs autres que ceux énumérés auraient pu avoir une influence quelconque.
L'évaluation de la survie de la greffe est représentée sous forme de courbes actuarielles, montrant le pourcentage de survie sur une période de 4 ans. Dans la figure 1 de la publication, le groupe de patients transfusés pour causes thérapeutiques montre une survie de leur greffe significativement meilleure que le groupe des non-transfusés. De plus, cet effet bénéfique des transfusions sanguines ne semble pas être influencé selon le sexe du patient (comme le montrent les courbes de survie pour les patients de sexe mâle), ou par le temps passé en dialyse (Tableau I).
Enfin, le facteur le plus susceptible d'influencer cette étude était la présence des anticorps cytotoxiques dans le sérum des patients. Certains de ces anticorps, caractérisés par leur spécificité dirigée contre les antigènes HLA-A et B, sont reconnus comme pouvant être la cause directe du rejet (Kissmeyer-Nielsen et al, 1966; Patel et Terasaki, 1969; Roy et
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al, 1981a).
Des études antérieures nous avaient montré que d'autres types d 1 anticorps, particulièrement des anticorps de classe IgM, révélés sérologiquement dans des conditions de basse température ( 4C ) et reconnaissant des antigènes membranaires propres aux lymphocytes B, pouvaient influencer positivement la survie de la greffe rénale (Roy et al, 1977 ; 1981a ; Iwaki et al, 1978 ; Jeannet et al, 1980). Ces anticorps (anti-B IgM) de même que d'autres types d ' anticorps reconnus comme étant néfastes pour la reffe (anti-PBL et anti-lymphocytes T) n'ont pas été retrouvés en proportions significativement différentes dans les deux groupes étudiés (Tableau 2). Ainsi, la présence de ces différents types d ' anticorps n'a probablement pas été un facteur prépondérant dans cette étude.
La survie des greffes est particulièrement meilleure (95% de survie à 4 ans) pour les patients transfusés possédant uniquement des anticorps de type anti-B IgM (Figure 3). Cependant, l'effet des transfusions n'est aucunement observable dans le groupe de patients où l'on retrouve uniquement les autres types d'anticorps. Ainsi, ces résultats peuvent nous suggérer un effet synergique entre les transfusions et les anticorps anti-B IgM.
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2. Détermination du nombre minimum de transfusions sanguines requises .
Comme nous l'avons déjà mentionné, la sensibilisation des patients, suivie de formation d'anticorps cytotoxiques (anticorps anti-HLA, A, B, C ou Dr) et le danger d'infection virale (hépatite, Cytomégalovirus, virus d'Epstein-Barr) sont les principaux risques auxquels sont exposés les dialysés contraints à recevoir des transfusions de sang pour des fins thérapeutiques. La présence d'anticorps cytotoxiques est souvent une cause fréquente d'incompatibilité entre donneur et receveur , ce qui peut entraîner une contre-indication à la greffe suite à un test "Cross-Match" positif, d'où sélection des receveurs.
On a toujours recherché un moyen de réduire les risques de sensibilisation. C'est pourquoi l'utilisation d'une (Persijn et al, 1979) ou de plusieurs transfusions administrées le jour même de la transplantation (Stiller et al, 1978) a semblé une façon fort alléchante de profiter de cet effet bénéfique tout en étant peu propice à la formation d ' anticorps. Malheureusement, d ' autres études ont démontré que cet effet des transfusions ne pouvait être induit que par des unités de sang données les semaines ou les mois précédant la chirurgie (Briggs et al, 1978; Hourmant et al, 1979; Werner-Favre et al, 1979). Ainsi, le recours à un petit nombre de transfusions reste le seul moyen de moins sensibiliser les patients.
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.
Par cette étude rétrospective menée chez nos greffés, nous voulions déterminer si un petit nombre de transfusions pouvait permettre d'induire cet effet facilitant pour la greffe. Pour ce faire, nous avons comparé la survie des greffes chez 48 patients qui avaient reçu entre 1 à 5 transfusions durant leur séjour en dialyse, à celle de 45 patients multitransfusés, c'est-à-dire ayant reçu plus de 5 transfusions et à celle de 28 patients non-transfusés (Figure 1).
Les conclusions tirées de cette étude sont en accord avec les résultats de Briggs et al. 1978, Hourmant et al. 197 9, Werner-F avre et al. 1979 et Sirchia et al. 1981. Une amélioration significative de la survie de la greffe a été notée chez les patients peu transfusés par rapport aux non-transfusés (Figure 1). D'autre part, cet effet n'est pas plus important dans le groupe des patients multitransfusés. Il semble donc qu'il ne soit pas nécessaire d ' administrer un grand nombre de transfusions pour profiter de leur effet bénéfique.
Clinical Nephrology, Vol. 18, No. 2-1982 (pp. 69-73)
Kidney graft survival: role of blood transfusions
and lymphocytotoxic antibodies
Y. Fradet1, R. Roy2, J.-G. Lachance1 and R. Noel1
‘Service d’urologie et de néphrologie, Hôpital Hôtel-Dieu de Québec, 11, Côte du Palais, Québec, Canada, GIR 2N6,
2Unité de Recherches en Immunologie et Rhumatologie, Centre Hospitalier de l’Université Laval, 2705, Boulevard Laurier, Ste-Foy, Québec, Canada, G1V 4G2
Abstract. In 121 primary cadaver kidney grafts, a significant increase in graft survival has been observed in recipients transfused prior to transplantation, whatever the number of units received or the time of administration. This beneficial effect of blood transfusions was shown to be independent of the recipient’s sex, blood group, HLA-A, B match grade and dialysis time. In longitudinal screenings, the incidence of post-transplant antibodies did not differ according to transfusion status of recipient. However, the graft survival was significantly improved in transfused patients without antibody or with an IgM anti-B (cold) antibody (95% survival at 4 years) as compared to nontransfused with the same characteristics. Patients with IgG anti-B (warm), anti-T or anti-PBL antibodies IgG/IgM shared a uniformly poor graft prognosis whether or not they
Introduction
Cadaver kidney graft survival has not been improved much in recent years even with an increased understanding of transplantation immunology. In some centers, graft survival is even worse than that of the early days of transplantation, probably because of a more restrictive policy of blood transfusion in hemodialyzed patients. Indeed, since recently, there is growing evidence that blood transfusion before trans plantation has a strong beneficial effect on kidney graft survival, although the mechanism involved is still poorly defined [Briggs et al. 1978, Persijn et al. 1979, Opelz and Terasaki 1980, Solheim et al. 1980, Sirchia et al. 1981].
A retrospective study of our primary cadaver kidney graft survival demonstrates a beneficial effect of blood transfusion before transplantation whatever the number given or the time of administration. This work evaluates the incidence and characteristics of antibodies according to pre-graft transfusion status in order to verify a possible antibody-mediated mechan ism that could explain this beneficial effect of transfu sions.
Received September 9, 1981, in revised form December 2, 1981.
Reprint requests to Dr. R. Roy.
had been transfused.
Patients and methods
Patients. Between June 1973 and January 1980,
123 patients received a first cadaver kidney allograft. Two grafts were excluded because of preservation failure. Of the remaining 121 patients, there were 77 males and 44 females with a mean age at the time of transplantation of 35.2 years (range 16 to 63 years). Bilateral nephrectomy was performed pre-graft in 26 patients and splenectomy in four. The immunosup pressive regimen used was as previously described [Roy et al. 1981 a]. The patients were transfused only according to therapeutic necessity, using whole blood or packed red cells exclusively. The number of pre transplant blood transfusions was cumulated retro spectively according to the blood bank registry. Graft failure was defined by either: return to chronic hemodialysis, performance of a graft nephrectomy or death of the patient regardless of kidney function at the time of death.
HLA typing. HLA-A and B antigen typing of
donor and recipient was performed by the standard complement dependent microcytotoxicity test. There were 11 grafts with no HLA antigen match between donor and recipient, 53 with 1 match, 50 with 2 matches and 7 with 3 or 4 matches.
Pre- and post-transplant antibodies. Pre- and
post-transplant antibody screening was performed as previously described [Roy et al. 1981 a]. Briefly, serum
18
.
Fradet, Roy, Lachance and Noël
I -ALL RECIPIENTS II - MALES ONLY
100
-,
> 5 Tf(19) ■■--- 1-5 Tf(48) 1-3Tf(34)* CC 50-No Tf(28) No Tf(24) YEARS POST-TRANSPLANTFig. 1 Actuarial graft survival in
(I) all recipients and (II) male patients only according to the number of pre-transplant blood transfusions.
samples collected approximately every month before and after transplantation were screened for lymphocy- totoxic antibodies. The target cell panel consisted of peripheral blood lymphocytes and enriched subpopu lations of T and B lymphocytes from 50 normal volunteers. T lymphocytes forming rosettes with neuraminidase-treated sheep erythrocytes (SRBC)
r - 0.391 p<0.001 o 30-E 20-0 10' 20 30 40 50 80 70 MONTHS ON DIALYSIS
Fig. 2 Relationship between the length of time on dialysis and the
number of blood transfusions (men X ; women O). The extremes of 70 transfusions and 70 months have been excluded (n = 4).
were separated from unrosetted B lymphocytes by centrifugation over a Ficoll-Hypaque density gra dient.
Anti-B cell, anti-T cell or anti-peripheral blood lymphocyte (PBL) antibodies were also characterized according to thermal sensitivity, immunoglobulin class and reactivity after platelet absorption which removes activity against HLA-A, B and C antigens. The cytotoxic assay used was the NIH technique with incubation at 4° C and 22° C and killing 20% above background was considered a positive reaction. Anti body class (IgM or IgG) was determined by sensitivity to treatment with dithiothreitol (1 mmol/1). Platelet absorption was achieved by incubating serum for 2 hours at 20° C on a platelet pool from 200 donors.
Statistical analysis. Actuarial survival rates were
calculated and curves were compared using an overall significance test (y2) as described by Mantel [1966]. Other results were statistically analyzed by the Stu dent t test and correlation coefficients.
Results
Effect of pre-transplant blood transfusions. Pre
transplant blood transfusion had a beneficial effect on graft survival regardless of the number of units received (Fig. 1). No graft failure was seen in the 7 patients who received only one transfusion prior to transplantation. Transfusions given at the time of surgery did not improve graft survival of recipients not transfused before transplantation. There was also
Kidney graft survival: role of blood transfusions and lymphocytotoxic antibodies
19
.
I-NO ANTIBODY II - Anti -B IgM •OTHERS
IgG, anti-T or anti-PBL IgG/IgM. YEARS POST-TRANSPLANT
no difference in survival between recipients transfused more than 3 months or in the last 3 months before grafting (data not shown).
HLA-A, B matching had a beneficial effect on graft survival in this series [Roy et al. 1981 b], but match grades were equally distributed between trans fused and not transfused recipients. Recipients of blood group B, who have a poorer graft prognosis (3 months survival of 37%), were found mostly (7/8) in the group of transfused patients.
Effect of sex. The beneficial effect of transfusions
on the graft survival was not different in the group of males and in the whole group of patients (Fig. 1).
Dialysis time and transfusions. The beneficial
effect of blood transfusions appears to be the same on all transfused patients regardless to their time of dialysis-dependent uremia even though the number of transfusions tends then to increase significantly (Fig. 2). Indeed, there is no difference in the time on dialysis between patients not transfused and those transfused from 1 to 5 units while their graft survival is significantly different (Table 1). The graft survival of patients who received from 1 to 5 units did not differ from those who received more than 5 transfusions pregraft even though in the former group the dialysis time was significantly lower (P <0.001).
Lymphocytotoxic antibodies. Lymphocytotoxic
antibodies were studied sequentially before and after transplantation and were characterized as described [Roy et al. 1981 a]. After transplantation no significant difference in the incidence of various types of anti
bodies could be seen between transfused and non- transfused patients (Table 2).
When no antibody was detected after graft or when IgM anti-B antibody was present, the graft survival was significantly improved in transfused recipients as compared to non transfused (Fig. 3). Furthermore, in transfused patients, the presence of
Table 1 Pretransplant blood transfusions and time on dialysis.
Number of transfusions Number of patients Months on dialysis (mean ± SEM) None 28 15.59±2.51 1 to 5 48 17.16±2.15* >5 45 36.42 ±4.4** * = NS, ** = p <0.001
Table 2 Incidence and characteristics of post-transplant antibodies
in transfused and not transfused recipients.
Type of Transfused Not transfused antibodies No. of patients (%) No. of patients (%) No antibody 46 (50) 12 (42) Anti-B-IgM Post-TX 18 (19) 8(29) Other antibodies Post-TX 29 (31) 8(29) TX = Transplantation.
20.
Fradet, Roy, Lachance and Noël
IgM anti-B was associated with a very high graft survival (95% at 4 years). On the other hand, the presence of other types of cytotoxic antibodies was associated with a uniformely poor graft outcome whether or not the patients had been transfused prior to transplantation (Fig. 3).
Discussion
This retrospective study confirms the beneficial effect of pretransplant blood transfusions on cadaveric kidney graft survival. This effect is unrelated to the recipient’s sex. Even though an improved graft survi val is seen with higher HLA-A, B match grades [Roy et al. 1981b], the latter does not explain the results reported herein since good matches were equally distributed between transfused and nontransfused recipients.
Guttman [1978] has suggested that an immunosuppressive effect of long lasting uremia might be the actual reason for this better graft survival. It is clear, however, that the number of transfusions increases with the length of time on dialysis, but as suggested recently by Opelz and Terasaki [1980], the improved graft survival was not related to dialysis duration. Because of the small number of nontrans fused patients, we could not verify a possible additive effect of blood transfusion and dialysis treatment on graft survival as suggested by Fehrman et al. [1980] and Solheim et al. [1980].
Pre-graft blood transfusion appears to be one of the most powerful beneficial factors identified hitherto in renal transplantation [Opelz et al. 1973, Briggs et al. 1978, Opelz and Terasaki 1980, Sirchia et al. 1981]. However, the issue of the ideal number of units of blood is far from being settled. According to many reports, a single transfusion is beneficial [Persijn et al. 1979, Opelz and Terasaki 1980, Sirchia et al. 1981], and it is striking to observe that all grafts succeeded in our 7 such recipients. If few transfusions do increase graft survival, it is not determined, how ever, if more transfusions will add further benefit as suggested by Opelz and Terasaki [1980] and others. Our findings suggest a maximum beneficial effect in recipients of 1 to 5 units of blood, without further improvement with increasing number of transfusions. This is in agreement with many other reports [Briggs et al. 1978, Hourmant et al. 1979, Werner-Favre et al. 1979, Sirchia et ai. 1981].
The risks of sensitization or hepatitis in dialyzed patients after blood transfusion remain a major con cern, and Stiller et al. [1978] and Williams et al. [1980] have suggested that blood transfusions given only at the time of surgery might be effective in improving graft survival. This seems unlikely, however, as many
series [Opelz and Terasaki 1981, Sirchia et al. 1981], including our own, indicate that transfusions have to be given prior to transplantation in order to be effective.
The exact mechanism whereby transfusions improve graft survival still remains elusive (induction of unresponsiveness, selection of nonresponders, acti vation of suppressor cells, or production of enhancing antibodies). This mechanism could explain the con tradictory opinions on the importance of transfusion timing. In this study, the time interval from the last transfusion to transplantation appeared to have no effect on graft survival.
One of the most attractive hypotheses at the present time relies on a possible enhancement effect by cold anti B cell antibodies. We recently reported that at least two classes of anti-B cell antibodies could be distinguished on the basis of thermal sensitivity and immunoglobulin class [Roy et al. 1981 a], IgG anti-B cell antibodies were found mostly after graft and associated with a very poor graft prognosis, compar able to that of patients with anti-T or anti-PBL antibodies. IgM anti-B (cold) antibodies were not associated with graft failure, and their presence after transplantation is possibly enhancing [Iwaki et al. 1978, Jeannet et al. 1980, Roy et al. 1981 a].
In our transfused patients, the only low success rate was observed in recipients who developped IgG anti-B or anti-PBL/T antibodies after graft. The incidence of these antibodies was the same in trans fused and nontransfused patients. Thus, the IgG anti- B, anti-T or anti-PBL antibodies (IgG/IgM) might be deleterious and have been shown to be directed against donor HLA-A, B, C or Dr antigens.
In the transfused patients with IgM anti-B anti bodies, the survival was strikingly high (95% at 4 years). Their survival trend was even better than the group of patients without antibodies although non statistically significant. Cicciarelli et al. [1980] have suggested that transfusions might produce a non specific immunoregulatory anti-IgM antibody that depresses the normal immune response to subsequent transplants. However, the survival in nontransfused patients who developed IgM anti-B antibodies after graft remained very poor as in patients with other types of antibodies. These observations suggest that IgM anti-B antibodies might be directed toward different antigens according to the initiating stimulus.
There is now broad evidence thus suggesting that pre-transplant blood transfusions have a favorable effect on kidney graft survival. The exact mechan- ism(s) explaining this effect is (are), however, not yet clear; so further work on this is in progress.
Kidney graft survival: role of blood transfusions and lymphocytotoxic antibodies
21.
Acknowledgements
We are grateful for the excellent technical assistance of Ms Liliane Bérubé. This work was supported by a grant from the Kidney Foundation of Canada.
REFERENCES
Briggs J. D., Canavan J. S. F., Dick H. H., Hamilton D. N. H., Kyle K. F., Macpherson S. G., Paton A. M., Titterington M. D.:
Influence of HLA matching and blood transfusion on renal allograft survival Transplantation 25, 80, 1978.
Cicciarelli J. C., Chia D., Terasaki P. /., Barnett E. V., Shirabama S.: Human IgM anti-IgM cytotoxin for B lymphocytes.
Tissue Antigens 15, 275, 1980.
Fehrman /., Groth C. G., Lundgren G., Moller E.: Improved renal
graft survival in transfused urémies. Transplantation 30, 324, 1980.
Gunman R. D.: Interrelationship of time of dialysis-dependent
uremia and pretransplant blood transfusions. Nephron 22, 196, 1978.
Hourmant M., Soulillou J. P., Bui-Quang D.: Beneficial effect of
blood transfusion. Transplantation 28, 40, 1979.
Iwaki Y., Terasaki P. /., Park M. S., Billing R.: Enhancement of
human kidney allografts by cold B-lymphocyte cytotoxins. Lancet 1, 1228, 1978.
Jeannet M., Vassali P., Hufschmid M. F.: Enhancement of human
kidney allografts by cold B lymphocyte cytotoxins. Trans plantation 29, 174, 1980.
Mantel N.: Evaluation of survival data and two new rank order
statistic arising in its consideration. Cancer Chemother. Rep. 50, 163, 1966.
Opelz G., Mickey M. R., Sengar D. P. S., Terasaki P. I.: Effect of
blood transfusions on subsequent kidney transplants. Trans plantation Proc. 5, 253, 1973.
Opelz G., Terasaki P. I.: International histocompatibility work
shop study on renal transplantation. In: Histocompatibility Testing 1980, edited by Terasaki P. /., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, California, 1980, p. 592.
Opelz G., Terasaki P. I.: Importance of preoperative (not peropera
tive) transfusions for cadaver kidney transplants. Transplan tation 31, 106, 1981.
Persijn G. C., Cohen B., Lansbergen Q., Van Rood J. ].: Retrospec
tive and prospective studies on the effect of blood transfu sions in renal transplantation in the Netherlands. Transplan tation 28, 396, 1979.
Roy R., Lachance J. G., Fradet Y., Hébert J.: Characterization of
lymphocytotoxic antibodies in renal transplantation. Trans plantation 31, 31, 1981 a.
Roy R., Fradet Y., Lachance J. G.: Influence of HLA-A and HLA-
B cross-reactive antigen matching on kidney graft survival. Tissue Antigens 1981 b, in press.
Sirchia G., Mercuriali F., Sealamogna M., Pizzi C., Poli F., Rosso di san Secondo V. E. M., Fortis C., Tedesco F.: Evaluation of the
blood transfusion policy of the north Italy transplant pro gram. Transplantation 31, 388, 1981.
Solheim B. G., Flatmark A., Halvorsen S., Jervell ]., Pape ]., Thorsby E.: Effect of blood transfusions on renal transplanta
tion. Transplantation 30, 281, 1980.
Stiller C. R., Lockwood B. L., Sinclair N. R., Ulan R. A., Sheppard R. R., Sharpe J. A., Hayman P.: Beneficial effect of opera
tion-day blood-transfusions on human renal-allograft survi val. Lancet 1, 169, 1978.
Werner-Favre C., Jeannet M., Harder F., Montandon A.: Blood
transfusions, cytotoxic antibodies and kidney graft survival. Transplantation 28, 343, 1979.
Williams K. A., Ting A., French M. £., Oliver D., Morris P. J.:
Peroperative blood-transfusions improve cadaveric renal allograft survival in non-transfused recipients. Lancet 1,1104, 1980.
22
.
CHAPITRE II
EFFET BENEFIQUE DES TRANSFUSIONS SANGUINES ET REPONSE IMMUNE.
Même si la théorie de la "sélection" n'est pas encore totalement abandonnée, 1 'hypothèse de 1 ' induction d'un état de "facilitation immunologique" se devait d'être étudiée. En effet, cette explication correspondait mieux à nos observations voulant qu'un petit nombre de transfusions (<5) soit suffisant pour engendrer cet effet bénéfique pour la greffe. Nous avons donc voulu étudier si des altérations de la réponse immune pouvaient expliquer l'effet bénéfique des transfusions dans le devenir de la gref fe rénale .
Des patients en dialyse n'ayant jamais reçu de transfusions auparavant ont été sélectionnés pour cette étude. Avec le consentement de ces derniers, de 1 à 5 unités de culot globulaire leur ont été administrées à intervalle d'un mois ou jusqu'au jour de la transplantation . Des prélèvements sanguins
23
.
ont été effectués le jour de chacune des transfusions afin de rechercher la(les) composante(s) de la réponse immune susceptible(s) d'être modifiée(s ) par les transfusions.
1. Effet sur la réponse immune de type cellulaire.
Pour mesurer cet effet, nous avons choisi une méthode simple, faisant appel à une stimulation non-spécifique, la "ConA enhancement method" décrite pour la première fois par Bresnihan et Oasin en 1977. Celle-ci consiste en deux cultures cellulaires parallèles (37C. 5% CO ^. air humide) où dans la première,
une dose suboptimale (3 ug/ml) de Concanavaline A (ConA ) est ajoutée aux lymphocytes (témoins et patients) au temps 0 (tO ) alors que dans la seconde culture, la même concentration de mitogène est ajoutée après une incubation de 48 hres (t48 ) des lymphocytes. Les deux cultures sont incubées en présence du mitogène pour 72 heures à 37C. L1 intensité de la stimulation mitogénique est évaluée par un radiomarquage avec la ^H-thymidine (0.2 uCi/puits) pendant les 16 dernières heures de la culture (Figure a). L'incubation des cellules en absence de mitogène a pour but, selon ces auteurs (Bresnihan et Oasin, 1977), de favoriser la perte de cellules suppressives à courte vie. En se basant sur cette hypothèse, la disparition de ces cellules résulterait donc en une augmentation (enhancement) de la réponse mitogénique au t48 par rapport au tO. Ainsi, une
élé va tio n sig nificati ve du rapport t48/t0, par rapport au gr oupe té mo i n peut signi fi er la présence d’une activité suppress i ve . Cette mé thode a comme avant age de pouvoir mettre en évidence non seule men t d es cel Iules suppressives mais ausisi d'au très phéno mèn es, c omme la présen ce de facteurs régulateui:s solubl es.
"Con A ENHANCEMENT METHOD
11
CPM
t48
’H-THYM
CPM
to
3H-THYM
72 H RES
72HRES
Con A
STIMULATION
Con A
STIMULATION
SUSPENSION________ 1
CELLULAIRE
48HRES
t48/to
Figure a. Signification du rapport t48/t0 défini par le test "ConA enhancement method".
25
.
Les résultats décrits dans la figure 1 nous montrent une augmentation significative du rapport t48/t0 chez les patients transfusés par rapport au groupe témoin. Cette augmentation témoigne d'une activité suppressive induite après 1, 2 ou 3 transfusions sanguines selon le patient. De plus, cette activité suppressive semble persister un certain temps au delà de la troisième transfusion car elle est présente le jour de la quatrième. La tableau 1 montre que cette suppression est caractérisée par une faible réponse mitogénique à 10 qui redevient normale (comparable aux patients non-transfusés et au groupe témoin ) après 48 heures d'incubation. Cependant, un rapport t48/t0 significativement élevé comparé au groupe témoin a été observé chez 4 patients avant transfusion. Nous tenterons d'expliquer le cas particulier de ces 4 patients dans le prochain chapitre .
Cette étude nous montre également que cette activité suppressive induite par les transfusions sanguines, n'est pas associée à une variation du nombre de cellules immunorégulatrices telles que les cellules "helper" (marqueurs monoclonaux OKT 4) ou les cellules suppressives (marqueurs monoclonaux OKT 8 ) (Tableau 2).
Cette étude nous a permis de montrer qu'un nombre restreint de transfusions suffit pour induire une activité suppressive pouvant être mise en évidence par le test "ConA enhancement method". Cette activité suppressive ne semble pas
26
.
reliée à 1 1 augmentation d'une population de cellules T suppressives 0KT8 positives. Toutefois, nous ne pouvons exclure que d'autres types de cellules suppressives non définis par ces marqueurs puissent être en cause. Dans le prochain chapitre, nous essayerons de déterminer quelles cellules sont responsables et par quel(s) mécanisme(s) cette activité suppressive induite par les transfusions peut exercer un effet bénéfique pour la greffe rénale.
Tissue Antigens(1984) 23, 203-209
Blood transfusions in renal dialysis patients
Effect on cellular immune response
R. Roy', R. Beaudoin1, F. Roberge1, J. G. Lachance2and G, Pelletier1
'Unite de Recherche en Immunologie et Rhumatologie, Centre Hospitalier de l'Université Laval, and -Service de Néphrologie, Hôpital Hotel-Dieu de Quebec, Quebec, Canada
The effect of blood transfusions, given in low number (<5), on the immune response of renal dialysis patients was studied. A significantly lowered response of lympho cytes to mitogen stimulation was observed in patients after as few as one, two or three transfusions, depending on the patient. This led to an increased A48/A0 ratio re flected by the enhanced response of the cells following delayed addition of sub- optimal dose of mitogen. There was no modification of the ratio of helper/inducer to suppressor/cytotoxic T cells subsets (OKT4/OKT8). The use of such simple in vitro tests in a strict protocol of transfusions could allow an adequate follow-up thereby limiting the risks of sensitization. These results demonstrate that important phe nomena affecting patients' immune response are turned on following even a low number of transfusions in the majority of uremic patients. This could probably be related to the beneficial effects of blood transfusions on the kidney allograft survival already described.
Received for publication 16 May, revised 11 August, accepted 16 November 1983
It is now well recognized that the HLA match grade as well as the pretransplant crossmatch influence positively the kidney graft outcome (Opelz & Terasaki 1982, Roy et al. 1981a). Moreover, blood transfusions (BT) given be fore transplantation have recently been re ported as being another factor implicated in a better graft survival. High (Opelz et al. 1973, Solheim et al. 1980) as well as low (Opelz & Terasaki 1980) number of transfusions have been reported to exert this effect. Moreover, Persijn et al. (1979) were the first ones to show.
This work was supported by a grant from the Kidney Foundation of Canada.
in a prospective study, that even a single blood transfusion improved the graft survival. Pre vious data from our group (Fradet et al. 1982) and others (Vincenti et al. 1978) suggested a beneficial effect in recipients of 1 to 5 units of blood which could not be improved further by more transfusions.
The current state of knowledge concerning the mechanisms involved in such a transplant- protecting effect is still confined to hypotheti cal approaches. Improvement has been sug gested as resulting from the presence of en hancing (Fradet et al. 1982, Iwaki et al. 1982) or anti-idiotypic antibodies (Singal & Joseph 1982). On the other hand, an inhibition of
cel-28
.
ROY ET AL.
lular immunity by suppressor cells (Fischer et al. 1980, Smith et al. 1981), or impaired pha gocytic function (Keown & Descamps 1979) has also been postulated to explain this phe nomenon. Finally, a soluble suppressor factor detected in the supernatants of cultured cells from transfused patients has also been de scribed (Sasporte et al. 1980, Bensussan et al.
1982).
The aim of the work presented herein was to study if very few (<5) blood transfusions could influence the cellular immune response of uremic patients and to evaluate if this effect was similar in all of them.
Material and methods
Patients
After informed consents were obtained, six teen hemodialysed patients (3 females, 13 males, aged between 22 and 61 years) who had not been transfused previously, received up to four units of packed red cells. Blood samples were taken by venipuncture immediately be fore each transfusion, given every 4 to 8 weeks.
Isolation of cells
Peripheral blood lymphocytes of patients and normal controls were isolated following den sity gradient separation using Ficoll-Hypaque. Cells were then washed in Hanks’ balanced salt solution (GIBCO), resuspended in RPMI 1640 medium (GIBCO) and counted. Cells were resuspended (1 x lOVml) in culture medium (RPMI) supplemented with 10% heat-inacti vated human AB-type serum, 2 mM L-glu- tamine (GIBCO) and antibiotics (Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 100 ug/ml and Gen- tamycin 100 ug/ml).
ConA enhancement method
A modification of the method of Bresnihan &
Jasin (1977) was used. Briefly, 2 x 105 cells were incubated in microculture plates (Linbro) at 37°C in a humidified atmosphere of 95% air, 5% C02. Cells were either left unstimulated (control) or stimulated with sub-optimal con centration (5 ug/ml) of Concanavalin A (ConA, Sigma). Stimulation was perfomed in two parallel cultures. In the first, the mitogen was added at the initiation of the culture (tO). In the second, cells were incubated for 48 h as described by Feighery et al. (1978), washed, counted and resuspended in fresh medium be fore the addition of ConA (t48). In all in stances, cells were kept in presence of mitogen for 72 h. Eighteen hours prior to the end of the culture, 0.5 uCi 3H-Thymidine (Sp. Act. 2 Ci/mmol, New England Nuclear) were added to each well. The cells were then collected on glass filter paper using a semi-automatic cell harvester (Skatron). Radioactivity incorpo rated into the cells was then measured with a scintillation counter (Rackbeta, LKB).
The counts per minute (cpm) were corrected by subtracting baseline values of unstimulated cultures, the difference being expressed as A cpm. The ratio A48/ A0 was calculated as Acpm of cells stimulated after 48 h to Acpm of cells stimulated at 0 h.
Quantitation of OKT-4 and OKT-8 positive cells
T-cell subsets were identified by indirect im munofluorescence using commercially avail able monoclonal antibodies OKT-4 and OKT-8 (Ortho Diagnostics). Briefly, mono nuclear cell preparations (5 x lCP/ml) were incubated for 30 min in ice-water with 5 ul of monoclonal antibody. Cells were then washed twice and labeled with 100 ul of fluorescei- nated goat anti-mouse IgG (Tago) for 30 min. After two washes with cold medium, cells were resuspended in mounting medium and exam ined with a Leitz fluorescence microscope. At least, two hundred cells were counted and the
BLOOD TRANSFUSIONS AND IMMUNE RESPONSE
results were expressed as the percentage of OKT-4 positive cells divided by the one of
OKT-8 positive cells (Ratio OKT-4/OKT-8).
Analysis of data
The Student’s t-test for paired or non-paired data was used to analyse the statistical signifi cance of our results.
Results
Cellular immune response has been assessed in purposely transfused uremic patients by meas uring the proliferative response to sub-optimal dose of mitogen of their lymphocytes, pre-in- cubated or not. All persons tested (normal controls or patients pre- or post-transfusions) showed a significant (P < 0.0005) increase of response following pre-incubation (Table 1). The response of untransfused patients, whether at tO or at t48, was not different from that observed in normal controls. After trans fusions, both responses at t48 were again simi lar. However, at tO, it was significantly (P < 0.0025) lower than that of controls or than their own pre-transfusion level resulting in a significantly (P < 0.0005) higher A48/A0 ratio.
CONTROLS O
NUMBER OF TRANSFUSIONS
Figure I. Mean ± SEM A48/A0 ratio determined in
37 untransfused normal controls (dotted column) and in 12 uremic patients who received up to four transfusions. Hatched column represents 4 patients whose A48/A0 ratio was greater than mean + 3 SD controls pre-transfusion ratio.
* = p < 0.0005.
This increased A48/A0 ratio was observed in 12/12 transfused patients whose pre-transfu sion ratio was similar to the one observed with normal controls.
In five of these 12 patients, this increase occurred after one transfusion while in five others it occurred after the second transfusion (Figure 1). After the third BT, the remaining two patients also had an increased ratio. More over, 5/5 of these patients retested after a
Table 1.
JH-Thymidine Incorporation by peripheral blood lymphocytes after ConA stimulation at 0 or at 48 h.
Time of addition of ConA
Controls (37 exp.)
Uremic patients (12 exp.)
Pre transfusion After 3 transfusions t 0 15,821 ±2,129' 15,092±2,574 5,205±1,0282 t 48 37,461 ±3,081' 30,623± 4,3343-4 33,916±5,4523-4 A48/A0 3.9±0.4 2.4±0.5 7.9±1.0 1 CPM net ± SEM 2 p < 0.0025 vs pre-transfusion or controls 3 p < 0.0005 vs t 0 4 p = NS vs controls (t 48)
30
.
ROY ET Al.
Table 2.
Evaluation of T cell subsets by the ratio (OKT4IOKT8)
Controls Number of transfusions
(28 exp.) 0 1 2 3 4
1.9+0.5 2.0+0.2* 2.0+0.2' 1.9+0.2* 1.7±0.2* 2.o±o.r Mean of 16 patients ± SEM
* P = N.S.
fourth transfusion still had a A 48/AO ratio sig nificantly higher than pre-BT (P < 0.0005) and similar to the one observed after 3 BT. Four patients had a pre-transfusion A48/A0 ratio sig nificantly higher than the other patients or nor mal controls (Figure 1), in all cases greater than their mean ratio plus 3 standard devia tions. In these patients, similar to all others referring to age or time on dialysis, blood transfusions had no effect (data not shown).
Finally, the transfusions had no effect on the ratio between helper/inducer cells (OKT4) and suppressor/cytotoxic effector cells (OKT8) which remained constant and similar to the one found with controls (Table 2).
Discussion
Modulation of the host’s immunological com petence is one of the most favored hypotheses proposed to explain the beneficial effect of blood transfusions on kidney allograft sur vival. A suppression of the cellular immunity reflected by a reduced response to mitogenic (Fischer et al. 1980), antigenic (Fischer et al. 1980, Lenhard et al. 1982b) and allogeneic stimulation (Fehrman & Ringden 1981, Lenhard et al. 1982a) has been observed in multitransfused uremic as well as nonuremic patients (Fehrman & Ringden 1982). Re cently, by the use of a similar assay, a sup pressor effect was shown to be generated in
dialyzed patients after blood transfusions (Lenhardet al. 1982a, Smithetal. 1981). In the present study we confirmed and further characterized this effect.
Twelve out of 16 patients had, prior to any transfusion, a A 48/AO ratio comparable to the one found for normal controls. However, we were able to show that after three transfusions the mean A48/A0 ratio of these 12 patients was significantly higher (P < 0.0005) than before transfusion. This increased ratio was due to a significantly lowered response at tO, the one at t48 remaining constant (Table 1). It is also noticeable that this increase did not occur si multaneously in all patients. In five (42%) of them, the increase was already observed after the first transfusion. These results are in agree ment with a recently published study (Klatz- mann et al. 1983) where a suppression of lym phocytes reactivity in mixed lymphocyte reactions was reported in 38% of the patients after only one transfusion. After the second transfusion, 83% ( 10/12) of the patients had a high ratio (P < 0.0005) but two of them still had a A48/A0 not significantly different from the one they had pre-transfusion. These two patients required a third transfusion to have a A48/A0 comparable to the others. In patients where the ratio increased after one or two transfusions, this increase remained constant thereafter. Moreover, this effect could not be improved by a 4th blood transfusion.
signifi-31
.
BLOOD TRANSFUSIONS AND IMMUNE RESPONSE
candy higher before, and could not be further increased by transfusions. Guillou et al. ( 1980) using this method, already reported that the A 48/AO was significantly higher in un transfused patients on chronic haemodialysis as compared to control subjects. However, it is evident that their population of patients in cluded some with high ratios. On the other hand, Kunori et al. (1980) showed that patients under dialysis for a long period of time had a lower reactivity in mixed lymphocyte culture than normal controls. It is thus important to note that all our patients, including the 4 with high pre-transfusion A48/A0 ratio, were on di alysis for less than one year. Thus the time in dialysis of patients could not explain the lower lymphocyte reactivity at tO following planned transfusions reported in this study.
This higher A48/AO ratio could be due to a short-lived suppressor T cell population such as described by Dutton (1972) and Bresnihan & Jasin (1977). Another possibility, proposed by Brent & Kelshaw (1970) could be that some immunogenic material being transfused could mobilize antigen-specific cells from the pa tient's central lymphoid organ to the periphery or make them tolerant and/or short-lived. This lower lymphocytes reactivity following blood transfusions was not accompanied by any vari ation in the ratio of the helper to suppressor T cell subsets defined by monoclonal markers OKT4 and OKT8, respectively. The ratio OKT4/OKT8 was calculated to rule out prob lems with monocyte contaminations or phys iological variations of total lymphocyte count (Bach & Bach 1981). Similarly. Lenhard et al. ( 1982a.b). Kerman et al. (1982) and Guttmann et al.(1982) have shown normal T cell subsets in patients after transfusions. Different results were reported by Sirchia et al. ( 1982) but only following transfusion of very small quantities of blood. However, it could not be excluded that these effects could be mediated by sub populations of T cells unrevealed by the mark ers used, or by other cell types such as mono
cytes as described by others (Fischer et al. 1980, Lenhard et al. 1982a.b). In other studies (Fehrman & Ringdcn 1981). adherent cells were shown to be at least in part responsible for the lower reactivity in mixed lymphocyte culture in transfused uremic patients. We have also observed that adherent cells were impli cated in the increase of A48/A0 ratio following transfusions (unpublished data) and work is now in progress in our laboratory to see if such cells could act through the secretion of soluble factors which, in turn, could lower the re sponse or if the presence of the cells them selves is compulsory.
In a very recently published study (Fehrman et al. 1983), no significant change was ob served in blood lymphocytes responses to mitogens, mixed lymphocyte cultures or cell- mediated lympholysis in patients who received 5 blood transfusions. These apparently discre pant results, i.e. absence of lowered response after the same number of transfusions, could probably be explained by differences in me thodology. Indeed, these authors measured cellular immune reactivity of their patients using cells that had been frozen which could have changed the cell populations. In fact, they reported a decrease in the percentage of OKM-1 positive cells (monocytes and null cells) which could explain the differences ob served. Moreover, the time-interval between each transfusion was different; their patients received 5 units of blood in the course of 2-3 weeks while ours were transfused once every 4 to 8 weeks.
The use of a low number of blood transfu sions (< 5) in such a protocol before transplan tation seems sufficient to induce a beneficial effect on the graft survival while limiting the risks of presensitization (Fradet et al. 1982). Indeed, in all transfused patients presented herein, no antibodies directed against T lym phocytes, presumably deleterious as pre viously described by us (Roy et al. 1981b). could be observed throughout the study.
