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Introduction___________________________________________________________
___Erreur ! Signet non défini.
1.1 Le trypanosome : présentation du modèle d'étude--- Erreur ! Signet non défini.
1.1.1 Le trypanosome, kinetoplastidé responsable de la maladie du sommeilErreur ! Signet non défini.
1.1.2 Intérêt du modèle trypanosome--- Erreur ! Signet non défini.
1.1.3 Le trypanosome et son cycle de vie--- Erreur ! Signet non défini.
1.1.4 Mécanismes utilisés par le trypanosome pour échapper au système immunitaire de son hôte mammifère --- Erreur ! Signet non défini.
1.1.4.1 L'immunodépression et l’activation polyclonale des lymphocytes --- Erreur ! Signet non défini.
1.1.4.2 La résistance au sérum humain --- Erreur ! Signet non défini.
1.1.4.3 La variation antigénique --- Erreur ! Signet non défini.
1.1.5 Les gènes codant pour les antigènes de surface --- Erreur ! Signet non défini.
1.2 La transcription chez les eucaryotes --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.1 Les étapes de la transcription et la régulation de l'expression des gènes : généralités - Erreur ! Signet non défini.
1.2.2 Les différentes ARN polymérases --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.2.1 Leurs fonctions --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.2.2 Leur composition--- Erreur ! Signet non défini.
1.2.3 Les facteurs de transcription --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.3.1 L'initiation et la libération du promoteur --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.3.2 Passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation : rôle de la phosphorylationErreur ! Signet non défini.
1.2.3.3 L'élongation et la terminaison --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.3.4 La maturation des transcrits --- Erreur ! Signet non défini.
1.2.4 Le nucléole --- Erreur ! Signet non défini.
1.3 La transcription chez les trypanosomes --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.1 Particularités transcriptionnelles des trypanosomatidés --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.1.1 Organisation génomique et transcription polycistronique --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.1.2 L'épissage en trans --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.1.3 La régulation post-transcriptionnelle --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.2 Les ARN polymérases du trypanosome --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.2.1 Leurs fonctions --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.2.2 Leur composition--- Erreur ! Signet non défini.
1.3.3 Les étapes de la transcription et les facteurs associés --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.3.1 L'initiation et la libération du promoteur --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.3.2 Passage de la phase d'initiation à la phase d'élongation : rôle de la phosphorylationErreur ! Signet non défini.
1.3.3.3 L'élongation et la terminaison --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.3.4 La maturation des transcrits --- Erreur ! Signet non défini.
1.3.4 Le nucléole des trypanosomes --- Erreur ! Signet non défini.
1.4 Contrôle des gènes codant pour les antigènes de surface chez le trypanosome --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.1 Les gènes de PROCYCLINE et de VSG sont transcrits par une ARN polymérase de type I Erreur ! Signet non défini.
1.4.1.1 Sensibilité à l’α –amanitine--- Erreur ! Signet non défini.
1.4.1.2 Promoteurs interchangeables --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.1.3 Existence d’un compartiment nucléaire distinct --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.1.4 Invalidation de la sous-unité majeure --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.2 Les gènes de PROCYCLINE et de VSG sont transcrits à partir d'unités polycistroniques Erreur ! Signet non défini.
1.4.2.1 Environnement génomique et gènes associés aux VSG --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.2.2 Environnement génomique des gènes codant pour la PROCYCLINE --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.3 PROCYCLINE et VSG : transcription constitutive --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.4 Transcription constitutive et expression monoallélique du VSG--- Erreur ! Signet non défini.
1.4.4.1 Régulation par extinction télomérique--- Erreur ! Signet non défini.
1.4.4.2 Régulation de l'élongation transcriptionnelle --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.5 L’expression de la PROCYCLINE et du VSG est mutuellement exclusiveErreur ! Signet non défini.
1.4.5.1 Les niveaux de régulation--- Erreur ! Signet non défini.
1.4.5.2 L’inhibition de la transcription Pol II et la perte du contrôle de l'expression spécifique de stade --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.5.3 L'hypothèse d'un facteur commun --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.6 Liens entre élongation transcriptionnelle et maturation des transcrits : de la Pol I à la Pol II.
Hypothèse de travail --- Erreur ! Signet non défini.
1.4.7 TFIIH, lien entre la machinerie Pol I et la machinerie Pol II du parasite ?Erreur ! Signet non défini.
2. Objectifs ---Erreur ! Signet non défini.
3. Résultats ---Erreur ! Signet non défini.
3.1 Les techniques utilisées --- Erreur ! Signet non défini.
3.2 Conventions de langage --- Erreur ! Signet non défini.
3.3 Invalidation du facteur de transcription TFIIH chez Trypanosoma brucei et effet sur la transcription --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.1 Pourquoi TFIIH ? --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.2 Identification d'un complexe TFIIH au sein du trypanosome --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.2.1 Identification des différentes sous-unités dans les banques de données --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.2.2 Expression de ces sous-unités au cours du cycle de différenciation du parasiteErreur ! Signet non défini.
3.3.2.3 Purification du complexe via étiquetage des sous-unités TbXPD et Tbp44Erreur ! Signet non défini.
3.3.2.4 Recherche d'une kinase CDK7 --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.3 Invalidation de différentes sous-unités par ARNi et effet sur la transcriptionErreur ! Signet non défini.
3.3.3.1 Constructions --- Erreur ! Signet non défini.
3.3.3.2 Effet de l’ARNi sur la croissance--- Erreur ! Signet non défini.
3.3.3.3 Effet de l’ARNi de TbTFIIH sur la transcription Pol I, II et III --- Erreur ! Signet non défini.
3.4 Caractérisation de l’ARN polymérase II de Trypanosoma brucei brucei --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.1 Invalidation d’un gène codant pour une sous-unité Pol II et effet sur la transcription des gènes "standard" --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.1.1 Identification de TbRPB9--- Erreur ! Signet non défini.
3.4.1.2 Construction des vecteurs d'invalidation du gène TbRPB9--- Erreur ! Signet non défini.
3.4.1.3 Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la croissance des parasites --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.1.4 Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la transcription --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.2 Purification du complexe ARN Polymerase II --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.2.1 Construction et expression--- Erreur ! Signet non défini.
3.4.2.2 Résultat de la Purification --- Erreur ! Signet non défini.
3.4.2.3 Comparaison avec le complexe Pol I, identification de deux isoformes RPB5 et de deux isoformes RPB6 --- Erreur ! Signet non défini.
3.5 Les deux isoformes des sous-unités RPB5 et RPB6 sont associées à une polymérase spécifique. --- Erreur ! Signet non défini.
3.5.1 Identification de chaque isoforme dans les banques de données et comparaison de séquences Erreur ! Signet non défini.
3.5.2 Purification par affinité des complexes interagissant avec chaque isoformeErreur ! Signet non défini.
3.5.2.1 Constructions, expression et localisation subcellulaire --- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.2 Résultat de la purification--- Erreur ! Signet non défini.
3.5.3 Invalidation par ARNi de chaque isoforme RPB5 --- Erreur ! Signet non défini.
3.5.3.1 Constructions --- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.1 Induction de l'ARNi et phénotype de croissance--- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.2 Tentative de Knock-out de la sous-unité TbRPB5z --- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.3 Effet de l'ARNi sur la transcription Pol II.--- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.4 Effet de l'ARNi sur la transcription Pol III--- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.5 Effet de l'ARNi sur la transcription Pol I--- Erreur ! Signet non défini.
3.5.2.6 Effet de l'ARNi TBRPB5z sur la structure du nucléole--- Erreur ! Signet non défini.
3.6 Régulations transcriptionnelles des gènes "atypiques" ---- Erreur ! Signet non défini.
3.6.1 Transcription des SL RNA --- Erreur ! Signet non défini.
3.6.1.1 L'invalidation de gènes impliqués dans la transcription Pol II modifie la maturation du SL RNA --- Erreur ! Signet non défini.
3.6.1.2 L'invalidation de gènes impliqués dans la synthèse des ARNm (transcrits par la Pol II) n'inhibe pas systématiquement la transcription du SL RNA --- Erreur ! Signet non défini.
3.6.2 L’invalidation de gènes impliqués dans la transcription Pol II perturbe la régulation des gènes codant pour les antigènes de surface --- Erreur ! Signet non défini.
3.6.2.1 L'invalidation des gènes impliqués dans la transcription Pol II perturbe le contrôle mutuellement exclusif des gènes codant pour les antigènes de surface--- Erreur ! Signet non défini.
3.6.2.2 La transcription des gènes codant pour les antigènes de surface est affectée lors de l'ARNi des différentes sous-unitésimpliquées dans la transcription Pol II. --- Erreur ! Signet non défini.
4. Discussions et perspectives ---Erreur ! Signet non défini.
4.1 Mise en évidence du facteur de transcription TFIIH chez T. bruceiErreur ! Signet non défini.
4.1.1 Plusieurs sous-unités du complexe TFIIH sont présentes chez le parasite et interagissent entre elles --- Erreur ! Signet non défini.
4.1.2 La question de savoir si un CAK existe chez le trypanosome reste poséeErreur ! Signet non défini.
4.1.3 Le complexe TFIIH de Trypanosoma brucei est impliqué dans la transcription Pol II ---- Erreur ! Signet non défini.
4.1.4 Le complexe TFIIH de Trypanosoma brucei est impliqué dans la transcription Pol I --- Erreur ! Signet non défini.
4.2 Caractérisation de l'ARN polymérase II de T. brucei--- Erreur ! Signet non défini.
4.2.1 TbRPB9 est indispensable à la survie du parasite --- Erreur ! Signet non défini.
4.2.2 La composition de la Pol II est similaire à celle des autres eucaryotes - Erreur ! Signet non défini.
4.2.3 La Pol II de Trypanosoma brucei contient deux formes de la sous-unité TbRPB1Erreur ! Signet non défini.
4.2.4 En dehors des sous-unités spécifiques du complexe, d'autres protéines ont été identifiéesErreur ! Signet non défini.
4.2.5 Les sous-unité RPB5 et RPB6 sont dupliquées chez le parasite et chaque isoforme est associée une polymérase particulière --- Erreur ! Signet non défini.
4.3 Etude de la fonction de chacune des deux isoformes RPB5 Erreur ! Signet non défini.
4.3.1 Chaque isoforme est indispensable à la survie du parasite --- Erreur ! Signet non défini.
4.3.2 Chaque isoforme a une fonction spécifique --- Erreur ! Signet non défini.
4.3.3 La présence des sous-unités Pol I est nécessaire pour maintenir la structure du nucléole chez T.
brucei --- Erreur ! Signet non défini.
4.3.4 Création de deux isoformes pour les sous-unités RPB5 et RPB6 et particularités transcriptionnelles de T. brucei.--- Erreur ! Signet non défini.
4.3.4.1 La sous-unité TbRPB5 semble jouer un rôle particulier au niveau de la transcription des gènes
"atypiques" --- Erreur ! Signet non défini.
4.3.4.2 La création de deux isoformes des sous-unités RPB5 et RPB6 pourrait être liée à la capacité, pour les trypanosomatidés, d'utiliser une Pol I pour transcrire des ARNm --- Erreur ! Signet non défini.
4.3.4 Investigation de la fonction des insertions présentes dans les variants 5z et 6zErreur ! Signet non défini.
4.4 Régulation des gènes "atypiques"--- Erreur ! Signet non défini.
4.4.1 Transcription des gènes de SL RNA--- Erreur ! Signet non défini.
4.4.1.1 L'inhibition de la transcription Pol II perturbe la maturation du SL RNA- Erreur ! Signet non défini.
4.4.1.2 La Pol II qui transcrit les gènes de SL RNA semble être différente de celle qui transcrit les autres gènes Pol II --- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2 Transcription des gènes ESAG7 et PROCYCLINE au stade procycliqueErreur ! Signet non défini.
4.4.2.1 A propos du couplage entre la machinerie de maturation et la machinerie de transcription---- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2.2 La Pol I qui transcrit les gènes d'antigènes de surface du parasite semble être de nature différente de celle qui transcrit les gènes d'ADNr--- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2.3 L'inhibition de la transcription Pol II perturbe l'expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface --- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2.4 Le facteur labile qui régulerait l'expression de la PROCYCLINE agirait au niveau de la stabilisation des messagers --- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2.5 Le facteur labile qui régulerait l'expression d'ESAG7 agirait au niveau de la transcription ---- Erreur ! Signet non défini.
4.4.2.6 Les variations spécifiques de stade observées lors de l'inhibition de la Pol II pourraient avoir une signification biologique --- Erreur ! Signet non défini.
4.5 Les techniques utilisées, leurs avantages et leurs limites --- Erreur ! Signet non défini.
5. Conclusions ---Erreur ! Signet non défini.
6. Matériels et méthodes ---Erreur ! Signet non défini.
6.1 Constructions --- Erreur ! Signet non défini.
6.1.1 Constructions pour l’expression des protéines étiquetées par le TAP tagErreur ! Signet non défini.
6.1.1.1 Expression inductible--- Erreur ! Signet non défini.
6.1.1.2 Expression constitutive--- Erreur ! Signet non défini.
6.1.2 Constructions pour l’ARNi--- Erreur ! Signet non défini.
6.1.3 Constructions pour l’invalidation de TbRPB5z par recombinaison ---- Erreur ! Signet non défini.
6.2 Culture cellulaire --- Erreur ! Signet non défini.
6.2.1 Culture en conditions standard--- Erreur ! Signet non défini.
6.2.2 Transfections et sélections --- Erreur ! Signet non défini.
6.2.3 Induction--- Erreur ! Signet non défini.
6.2.3.1 Induction de l’ARNi --- Erreur ! Signet non défini.
6.2.3.2 Induction des protéines étiquetées par le TAP tag --- Erreur ! Signet non défini.
6.3 Analyse des complexes protéiques --- Erreur ! Signet non défini.
6.3.1 Purification TAP tag --- Erreur ! Signet non défini.
6.3.2 Microséquençage --- Erreur ! Signet non défini.
6.3.3 Test d’activité kinase --- Erreur ! Signet non défini.
6.4 Production des anticorps anti-Tbp44, anti-TbXPD et anti-TbXPBErreur ! Signet non défini.
6.5 Analyse de l’effet de l’ARNi sur la transcription --- Erreur ! Signet non défini.
6.5.1 Extraction d’ARN--- Erreur ! Signet non défini.
6.5.2 Analyse de la quantité d’ARN au sein des cellules invalidées --- Erreur ! Signet non défini.
6.5.3 Analyse de la variation du taux de transcription --- Erreur ! Signet non défini.
6.5.3.1 Marquages métaboliques visualisés par Dot blot --- Erreur ! Signet non défini.
6.5.3.2 “Run-on” in situ visualisés par immunofluorescence --- Erreur ! Signet non défini.
6.5.3.3 “Run-on”--- Erreur ! Signet non défini.
6.5.3.4 Analyse des ARNr par incorporation in vivo-"Pulse et chase labeling" --- Erreur ! Signet non défini.
6.6 Immunofluorescence --- Erreur ! Signet non défini.
6.6.1 Localisation des protéines étiquetées --- Erreur ! Signet non défini.
6.6.2 Localisation de l’anticorps nucléolaire L1C6 --- Erreur ! Signet non défini.
6.7 Microscopie électronique --- Erreur ! Signet non défini.
7. Références ---Erreur ! Signet non défini.
