MÉTABOLISME DE LA THYMIDINE
DANS LA GLANDE SÉRICIGÈNE DU VER A SOIE
III. — INCORPORATION DE LA THYMIDINE RADIOACTIVE DANS LA GLANDE
SÉRICIGÈNE PRÉLEVÉE
AU 6e JOURDU 5 e
AGEET INCUBÉE « IN VITRO »
J.
DAILLIESection de
Biologie générale et appliquée,
Faculté des Sciences de
Lyon,
69 - Villeurbanne Laboratoire associé au Centre national de la Recherchescientifique
SOMMAIRE
Bien que la
synthèse
de l’ADN soit réduite dans laglande séricigène
au 6ejour du g e âge
lar- vaire, lathymidine
fournie àl’organe
incubé in vitropénètre
avec facilité par diffusion.Mais l’activité des kinases
qui
assurent laphosphorylation
du nucléoside se trouve affaiblie par rapport à cequ’on
a observé avec desglandes jeunes.
Laproduction
des nucléotidesdépasse
toutefoisles
possibilités
de leur utilisation par l’ADN. Ce dernierincorpore
leprécurseur
à un taux très faible.Lorsqu’on
fait varier la concentration du milieu enthymidine,
on atteint trèsvite,
dansl’ADN, l’incorporation
maximum duprécurseur.
Celle-cireprésente,
auplus,
unesynthèse
d’acidenucléique
de o, p. i ooo à l’heure.
On n’a pu évaluer avec
précision
laquantité
deprécurseurs thymidyliques endogènes disponible
en permanence : cette réserve,
qui
neparaît
paspouvoir
assurerplus
de 15minutes desynthèse, représente
environ 0,1p. i o0o de laquantité
dethymine
contenue dans l’ADN desglandes.
L’intervention éventuelle des kinases de la
thymidine
ou de laproduction
desprécurseurs
endo-gènes
dans larégulation
de lasynthèse
d’ADN est discutée.I NTRODUCTION
Deux
publications
antérieures(DAILLIE, 19 6 7
a,b)
traitent du métabolisme de lathymidine
radioactive dans laglande séricigène (tube sécréteur) explantée
audébut
du q. e jour
du5 e âge.
A cettepériode, l’organe
est encore lesiège
d’unesynthèse
d’ADN
importante.
Dans cesconditions,
lathymidine pénètre
facilement dans lescellules;
les nucléotidesradioactifs, qui
se forment enabondance,
serépartissent
demanière
compliquée
entre le milieu d’incubation et deuxcompartiments
cellulaires dont l’un seulement(compartiment actif)
est accessible à lasynthèse
d’ADN.L’uti-
lisation des nucléotides
marqués
pourproduire
l’ADNdépend
de laquantité
dethy- midine ajoutée
au milieud’incubation ;
elle est toutefoislimitée,
cequi
traduit soitun processus de dilution du
pool endogène
- dontl’importance
nepeut
êtrenégligée
- par les
précurseurs exogènes,
soit une limitation de natureenzymatique.
Au
6ejour
du5 e âge,
lasynthèse
de l’ADN se ralentit fortement dans laglande séricigène (D AILLIE , ig65).
Avec cematériel,
il m’a paru intéressant deprocéder
àdes
expériences identiques
à cellesque j’ ai
réalisées sur laglande
en voie decroissance.
Les
résultats obtenus sontexposés
dans cet article. Il s’avère que les processus de base del’incorporation
du nucléoside seprésentent
au 6ejour de
manière trèssemblable
à cequ’ils
sontau 4 e jour. Les principales
modifications sont d’ordrequantitatif.
Lasynthèse
d’ADN étant trèsfaible,
l’utilisation duprécurseur
estrapidement saturée.
Les
répercussions
sont moinsmarquées
au niveau du métabolisme intermédiaire.La discussion
portera
surtout sur la nature des facteursqui
contrôlent lasynthèse
d’ADN.
1 -
RÉSULTATS
Les
techniques
mises enjeu
ont été décrites dans despublications
antérieures(DA ILL
IE, r 9 6 7
a eth). J’ai
constamment utilisé pour ce travail lathymidine méthyle-
tritiée de New
England
NuclearCorp. (6 7 00 mCi/mM).
A ―
Étude cinétique
I
.
Cinétique en !hase
decharge (fig. 1 ).
La
comparaison
avec lesrésultats
obtenus dans les mêmesconditions
dans lecas où les
glandes
sontprélevées au4ejour (D AILL IE, r 9 67 a et b)
conduit aux remarquessuivantes : ’
a)
laradioactivité spécifique
del’ADN
croîtlentement (fig. i). L’accumulation
desnucléotides marqués persiste
à un taux élevépendant
toute la durée del’expérience (i heure).
La fraction « alcool o contient unepart importante
de radio- activité cellulaire.b) L’utilisation
dupool
acido-soluble pour lasynthèse
d’ADN s’effectue dansce cas aussi avec un rendement
plus
élevé dans lespremières
minutes que par la suite.c)
Levieillissement
deschenilles
détermine un affaiblissementmarqué
de l’in-corporation
duprécurseur
dansl’ADN.
La réductionqui s’opère
sur laradioactivité
accumulée dansl’acido-soluble, bien
quesensible,
est moins accentuée(tabl. i).
2
.
Cinétique
en!hase
dedécharge.
a) Marquage
de courte durée(fig. z).
;’
Comme
dans le cas deglandes prélevées au 4 e jour (D AILLI E, 19 6 7 b)
unepartie
de la radioactivité regagne le milieu. Cette
perte
s’effectue à la même vitessequ’au 4
e
jour ( 21
p. 100de la radioactivité initiale sontperdus
en 15minutes).
Mais elle seprolonge plus longtemps.
C’est seulementpendant
la seconde demi-heure que la sortie s’atténue(courbe 4).
Elle est donc au totalbeaucoup plus
élevéequ’au q. e jour.
Il
s’avère,
en outre, que lathymidine
contenue dans la fraction «alcool », est,
pourune
part
assezgrande, phosphorylée
au début de lapost-incubation.
Eneffet,
laradioactivité de l’acido-soluble est
plus
élevéeaprès
15 minutesqu’au temps
zéro del’expérience,
de sorte que,pendant
lepremier quart d’heure,
elle doit passer par une valeur maximale.La perte
deproduits marqués porterait donc,
au cours de cettepériode,
non seulement sur lathymidine
maisaussi,
comme auq. e jour,
sur lesnucléotides.
Le
marquage de l’ADN croît defaçon lente,
sans être affecté de manière trèsmarquée
par la diminution des nucléotides acido-solubles,b) Marquage
delong2se
durée(fig. 3 ).
Ces résultats confirment les
précédents :
laperte
de radioactivité cellulaire est très élevée et le marquage de l’ADN reste linéairependant
3 heures.Ainsi, l’analyse
descinétiques
encharge
et endécharge
révèle que, dans laglande séricigène prélevée
sur des chenillesâgées,
les diversaspects
du métabolisme de lathymidine (notamment
l’accumulation des nucléotides radioactifs etplus
encoreleur
incorporation
dansl’ADN),
sont affaiblis parrapport
aux observations faitesait
4 e jour.
Enoutre,
la fraction des nucléotides directement accessible pour la syn- thèse d’ADN(= compartiment actif) paraît plus
réduite.B ―
E f et de la
concentration du milieu enthymidine (tabl. 2 )
I,es chenilles utilisées dans cette
expérience,
bien quesacrifiées
au début du 6e
jour,
devaient êtreplus
«jeunes
» dupoint
de vuephysiologique (retard
de déve-loppement
dû à des causes nondéfinies).
On constate, eneffet,
que pour la dose dethymidine
laplus
faible(tabl. 2 ),
larépartition
duprécurseur exogène dans les
diverses fractionscellulaires
estdifférente
de celleobservée
dansl’expérience
decharge,
pour unequantité
dethymidine
fournieéquivalente (fig. z). Cette
remarquesouligne l’influence de l’état physiologique de
laglande
sur l’utilisation duprécurseur exogène.
Notons quel’estimation
de cettedernière,
àpartir
des résultats de cetteexpérience,
nous fournira uneapproximation
maximum de l’activité desglandes
au6e j jour.
TABLEAU 2
Influence
de la concentration du milieu enthymidine
au 6ejour (Résultats
moyensaccompagnés
de l’erreurstandard)
Quatre
lots,préparés
àpartir
de 6paires
de tubes sécréteurs(en
moyenne, 318 (Lg d’ADN parlot)
sont incubés avec 2,5
( L Ci
dethymidine
tritiéependant
30minutes. Pour trois des lots, on apporteen même temps que le tracreur, io-3, io-sou io-1
( L M
dethymidine
froide defaçon
à obtenir dansle milieu les concentrations désirées.
L’expérience
estrépétée
4fois.I,a discordance signalée n’empêche
pas de tirer de cetteexpérience
des indica-tions précieuses.
Comme au
4 e jour (D AILLIE , 19 6 7 b), l’incorporation
duprécurseur
dans l’ADNaugmente
avec la dose fournie.Mais,
au 6ejour,
dès la troisième concentrationessayée (
5
! io-syM/ml) ,
on atteintl’incorporation
maximum dans l’acidenucléique.
Au-delà de cette
concentration,
seule s’accroît laquantité
deprécurseur extraite
avec les fractions solubles
(tableau 2 ).
Ainsi que
je
l’aidéjà signalé (D A I LLI E, ig67 6), la
croissance dela fraction « alcool
»(
_ [A T] )
en fonction de la concentration( _ [C])
esttelle
queCette relation
indique
que lapénétration
du nucléoside s’effectue au 6ejour
comme
au 4 e jour,
selon un processus dediffusion simple,
etrépond
à une loiidentique.
II. -
INTERPRÉTATION
ET DISCUSSIONCes résultats ne remettent pas en cause les conclusions tirées
précédemment
del’étude
plus complète
du métabolisme de lathymidine
et des modalités de saparti- cipation
à lasynthèse d’ADN,
àlaquelle j’ai procédé
avec desglandes séricigènes prélevées au 4 e jour. Je
discuterai seulement certainesquestions
touchant à la syn- thèse d’ADN et à son contrôle.i. Des résultats antérieurs
(D AILLIE , 19 6 5 )
ont montréqu’à partir
du 6ejour
la
synthèse
d’ADN dans laglande
enplace
se réduit nettement et n’estplus
accessibleà
l’analyse
directe.Pourtant,
nous venons de montrer que laglande, explantée
à cettepériode,
laisse
pénétrer
lathymidine
et se montrecapable
- certes à un taux réduit maisqui
reste
appréciable
- dephosphoryler
lenucléoside
et del’incorporer
dans l’ADN.Aucun
argument
décisif nepermet
évidemment d’affirmerqu’une incorporation
faible ne
corresponde
pas à deséchanges
de tritium labile.Je
croispourtant qu’il
estplus logique
de la considérer commereprésentative
d’unesynthèse
résiduellequi
nepeut qu’échapper
àl’analyse
directe.2
.
L’augmentation
de laquantité
dethymidine ajoutée
au milieu d’incubation aboutit - contrairement à ceque j’ai
observé avec desglandes prélevées
au4 8 jour
- à un
plafond
pourl’incorporation
dans l’acidenucléique (tableau 2 ). La production d’ADN,
calculée sur cettebase,
doitreprésenter
de trèsprès
lasynthèse
totale d’ADN.Elle
est voisine de o,5p. i ooo à l’heureet,
pour les raisonsindiquées précédemment, je
considérerai ce chiffre comme une évaluation maximum de lasynthèse qui
se pro- duit au 6ejour. Au 4 e jour,
cettesynthèse
est, auminimum,
de o,2 p. 100(D AII .LI E , 19
6 7 b).
Le
tableau i montre, parailleurs,
que, pour une faible concentration dethymidine, l’incorporation
dans l’ADN est douze foisplus
faible au 6equ’au 4 e jour.
Il
apparaît
donc que lasynthèse
d’ADN se réduit de 4 à 12 fois dans laglande séricigène,
entre le4 e
et le 6ejour.
Ces observations
posent
leproblème
des mécanismesqui
contrôlent lasynthèse
de l’acide
nucléique.
_3
. La
quantité
de nucléotidesmarqués
accumulée estplus
faible que dans lesglandes prélevées au 4 e jour (tabl. i).
Cephénomène peut
avoir deux causes :.
- une sortie accrue des nucléotides formés au sein des
cellules,
- une réduction de l’activité ou de la
quantité
des enzymesqui
assurent laphosphorylation
de lathymidine.
La sortie des nucléotides est effectivement
plus importante,
mais elle s’effectueà la même vitesse
qu’au 4 e jour.
Le fait essentiel estqu’au
6ejour
elle seprolonge plus longtemps.
Cette situationpourrait simplement
traduirel’existence,
corrélative du ralentissement de lasynthèse d’ADN,
d’uncompartiment
actif de faiblecapacité.
Cette remarque
n’implique
pas que l’activitékinasique
ne soit pas affaiblie.Il est même évident que la
phosphorylation
est moinsrapide qu’au 4 e jour
commele montre notamment
l’expérience
dedécharge (fig. 2 ).
Quelques
auteurs(cf. L n x g , 19 6 3 ) suggèrent
quel’activité
des kinases de lathymidine pourrait
être un des facteursqui
contrôlentla synthèse
de l’ADN. Nousconstatons,
à cesujet :
,- que la réduction
qui s’opère
au niveau de laphosphorylation
dans lesglandes âgées
est moins sévère que cellequi
touche lasynthèse
d’ADN(tabl. i).
- que l’accumulation des nucléotides
marqués
sepoursuit
mêmelorsque
lesystème
desynthèse
de l’acidenucléique
est saturé(tabl. 2 ).
Ces observations semblent
indiquer
que la vitesse dephosphorylation
est liéeau taux de la
synthèse
d’ADN sans êtrecependant
déterminante dans le contrôle de cette dernière.4
. On
pourrait
alors supposer que c’est laproduction
de l’ensemble desprécur-
seurs
endogènes qui
subit une réduction. Il va de soi que, dans ce cas, lasynthèse
d’ADN sera limitée et que les
précurseurs thymidyliques exogènes
nepourront
être utilisés au-delà d’une certaine limite. Le faitqu’au
6ejour,
lecompartiment
actifsoit réduit et
qu’on atteigne
la saturation de lasynthèse
d’ADN pour des doses dethymidine
relativementfaibles,
est favorable à cettehypothèse.
L’évaluation
dupool
desprécurseurs thymidyliques endogènes,
bien quedélicate, peut
être tentée enposant :
expression
danslaquelle : P
a
=compartiment
actifP
e
=pool endogène S
r
= ADNproduit
àpartir
desprécurseurs exogènes S,
=synthèse
totale d’ADNsi
il vient
La valeur maximum de
l’incorporation représente S t .
Onpeut
donc calculerP
e/
k
pour les faibles concentrations dethymidine (tabl. 2 ).
On trouve
ke
= igo(x
10-&dquo;( iM
dethymidine).
L’estimation
de k est délicate en raison de lacinétique complexe
observée enphase
dedécharge (fig. 2 ) :
lecompartiment
actif estfaible,
et on considérera que la valeur maximum de k est 0,2, d’oùPe !
30 - io-6!.M
dethymidine.
D’après
cetteapproximation,
lepool endogène contiendrait
unequantité
deprécurseur assurant,
auplus
i5minutes desynthèse
d’ADN etreprésentant
o,i p. i ooo de lathymidine
contenue dans l’acidenucléique.
Parrapport
aux résultats obtenusau
4
e jour (D A n<M E , 19 6 7 b),
la réserveendogène
au 6ejour
se trouve io à 20foisplus
faible,
tandis que lasynthèse
d’ADN n’est réduite quede 4
à i2 fois.Bien
entendu,
on nepeut
excluretotalement
l’éventualité d’un contrôle s’exer-çant
au niveau même de lasynthèse
del’ADN (modification
de la structure chroma-tinienne altérant son
aptitude
àfonctionner
comme amorce ournatrice ; réduction
de
l’activité
dusystème polymérasique).
Ilfaut
constatercependant
que laréduction
dupool
desprécurseurs endogènes
est suffisante pour rendrecompte
de la diminutionsubie
par lasynthèse d’ADN.
Dans cettehypothèse,
il faudrait se demanderquels
sont les facteurs
qui
déterminent cette réduction. De cepoint
de vue, on nepeut
manquer derapprocher
la situation observée dans laglande séricigène
de celle querévèlent
de nombreuses études concernant la différenciation cellulaire etqui
montrent l’existence d’une certaine antinomie entre la division cellulaire et lesopérations
dedifférenciation. Peut-être faut-il
simplement
considérer que les moyens desynthèse
dontdispose
la cellule sont àpartir
du 6ejour, accaparés
par laproduction
de la soie.L’arrêt
de lasynthèse
d’ADNpourrait
n’être alorsqu’une expression, parmi d’autres,
de ce détournement.
Reçu pour
publication
en mars 1967.SUMMARY
THYMIDINE METABOLISM ON THE SILKGLAND OF BOMBYX MORI
III. - INCORPORATION OF RADIOACTIVE THYMIDINE INTO THE «IN VITRO» INCUBATED GLAND AT DAY 6 OF
THE 5 TH
STAGEThough
the DNAsynthesis
in thesilkgland
atday
6 of the5 th
stage is slowed down,thymidine easily
penetrates into the in vitro incubatedgland.
The
activity
of thephosphorylating
kinases is lower than in youngerglands.
However, the rateof
production
of the nucleotides ishigher
than their rates of utilizationby
DNA, whichincorporates
the precursor at very low
speed.
When the
thymidine
concentration of the medium is increased, theincorporation
of the precur-sor into DNA soon reaches a maximum which is at its
highest
a o.05per
cent nucleicsynthesis
per hour.The amount of
endogenous thymidilic
precursors available could not beaccurately
estimated ;it is
roughly 0 . 01
per cent of thethymidine
contents of thegland
DNA and does not seem to be capa- ble ofensuring
more than a 15minutssynthesis.
The
possible
partsplayed by thymidine
kinases andendogenous
precursors in theregulation
of DNAsynthesis
are discussed.RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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