ETUDE DE LRP6. Youmna GHALEB PharmD, PhD. Réunion Chopin 6 Décembre INSERM LVTS U1148, Paris PTS, Faculté de Pharmacie, USJ, Beyrouth,

(1)

ETUDE DE LRP6

Youmna GHALEB

PharmD, PhD

INSERM LVTS U1148, Paris PTS , Faculté de Pharmacie, USJ, Beyrouth, Liban Réunion Chopin

6 Décembre 2018

(2)

LRP6 : Définition et Structure

Go and Mani, Yale J Biol Med. 2012

 Endocytose des ligands extracellulaires avec un rôle crucial dans l’endocytose des lipoprotéines

 Structure unique et particulière

 co-récepteur dans la voie de signalisation Wnt/β-caténine

 implication dans une grande variété de processus biologiques

Organisation des différents domaines unique à LRP5 et LRP6 :

 présence uniquement de 3 domaines de liaisons aux ligands

 agencement des domaines EGF-like et des domaines de liaison aux ligands inversé par rapport aux autres LRP

(3)

LRP6 : Fonction

LRP6 co-récepteur dans la voie Wnt

Différentiation, Prolifération et Migration cellulaire lors du développement embryonnaire

Croissance cellulaire en augmentant la traduction des protéines mais aussi en diminuant leur dégradation

LRP6 et Métabolisme des lipides

(4)

Variations étudiées

(5)

Position des Variations

p.Tyr972Cys p.Val1382Phe

p.Tyr1584Asn

p.Ser1612Phe p.Thr1479Ile

p.Asn251Ser p.Thr83Ile

(6)

Variation de l’Exome : V1382F (VF)

(7)

(8)

Autres Variations

Séquençage de Sanger chez 84 proposants

YC (p.Tyr972Cys) (Michel FARNIER, Dijon)

CT : 2.89 g/l LDL-C : 2.05 g/l HDL-C : 0.52 g/l TG : 1.62 g/l

SF (p.Ser1612Phe) (Gérard LUC, Lille)

Pas de bilan lipidique

YN (p.Tyr1584Asn) (Gérard LUC, Lille)

Pas de bilan lipidique

Variations de Lyon

(Mathilde DI FILIPPO)

T1479I (p.Thr1479Ile)

Retrouvée chez un patient hyperchol.

NS (p.Asn251Ser)

Retrouvée chez un patient hypochol.

T83I (p.Thr83Ile)

Retrouvée chez un patient normochol. avec une mutation délétère dans le LDLR

(9)

Etudes Fonctionnelles des Variations dans les cellules

HEK293T

(10)

Méthode de Transfection et Taux moyen

Lipofectamine LTX

(11)

Expression de LRP6 à la membrane cellulaire

N = 4

Diminution significative de LRP6 à la surface cellulaire avec les variations :

 YC (p.Tyr972Cys)  P = 0.0010

 T1479I (p.Thr1479Ile)  P = 0.0034

(12)

Expression du LDLR à la membrane cellulaire

N = 4

Pas d’effets sur l’expression du récepteur des LDLs à la membrane cellulaire

(13)

Internalisation des LDLs

N = 4

Augmentation significative de l’Internalisation des LDL avec les deux variations qui diminuent l’expression de LRP6 :

 YC (p.Tyr972Cys)  P = 0.0142

 T1479I (p.Thr1479Ile)  P = 0.0273

(14)

WP5 CHOPIN – Familles Triple Neg

06/12/2018

(15)

Familles Triple neg avec DLCN > / = 8

Total :

- 20 Cas index

- 5 pvmts en banque avec consentements de recherche signés.

- 4 familles pour lesquelles l’EF sera très compliquée.

nom n° famille score DATE PRVT Labo banque rs rendu

AIR*** 1891 9 2016 lille pas la 2ème ligne

BAU*** 10 9 2013 Lille oui

BOD** 22 17 2014 Lille oui oui

BONN*** 29 9 2010 saint antoine oui

BOU*** 1409 8 2016 Lille oui oui

BOY** 34 11 2009 saint antoine oui

CHAT***** 222 11 avr-05 Lille oui

CHED*** 583 8 2016 Lille ??

DI** 138 9 2013 Lille oui

EUG*** 235 13 2014 Lille oui

GIA** 76 10 2010 Lille oui

GRO** 3720 9 2018 Lyon oui non

JALL*** 87 8 2010 Lille oui

MAG*** 36 9 nov-11 Lille oui

MA** 99 10 juin-05 Lille oui

ROND*** 235 14 2016 Lille pas la 2ème ligne

R** 231 15 janv-04 saint antoine oui

SAMZUN 2919 8 2017 LYON oui oui

TROUVE 2634 9 2018 Ambroise Paré oui oui

WALTER 182 14 août-11 Lille oui

(16)

Familles Triple neg avec DLCN = 6 ou 7

Total :

- 27 Cas index

- * 15 avec DLCN = 7 - * 12 avec DLCN = 6 - 6 pvmts en banque avec

consentements de recherche signés.

nom n° famille score DATE PRLT Labo banque rs rendu

ANNO*** 4 6 2013 Lille ?

BAR** 319 7 2013 Lille ?

BI** 1452 7 2016 Lyon oui oui

BRUN**** 262 7 févr-13 ambroise paré ?

BURG*** 193 7 2013 Lille ?

CAILL*** 270 7 2011 Lille oui

CHAUV**** 217 6 2013 Lille oui

CHEVA**** 1606 7 2016 Lille oui 2ème ligne non rendu

DELA***** 3020 7 2017 LYON oui oui

DOU**** 213 7 2013 Lille oui

DR*** 247 6 2006 SAINT ANTOINE oui

FELLIA*** 68 6 2008 St-antoine oui

GOURI**** 149 6 2015 Lille non

GUE*** 82 6 2010 Lille ?

LEA*** 2989 6 2018 Lyon oui oui

LE BE*** 287 6 2014 Lille oui

LE BIH** 359 6 2015 Lille ?

MEH*** 102 7 2014 Lille oui

MIN*** 306 7 2014 Lille ?

MOL** 2292 7 2017 Lille oui oui

PAP** 194 7 oct-14 Lille ?

PE*** 189 6 févr-14 Lille oui

RIGO**** 1618 7 2016 Lille

SADR*** 3314 6 2017 Lyon oui

TESS*** 1635 6 2016 Lyon non

VAILL*** 127 7 déc-10 Lille ?

WEB** 299 7 2014 lille non

(17)

Hypochol :

état des lieux décembre 2018

Mathilde Di Filippo et Marie Marrec

(18)

Quelques chiffres

• 61 propositus

• 129 apparentés :

- 32 avec un LDL< 0,6g/L - 19 entre 0,6 et 0,8g/L

(19)

Les familles non mutées

• 11 familles avec au moins 1 apparenté Hypochol avec ADN

Les familles mutées

• 8 familles avec au moins 1 apparenté Hypochol avec ADN - 6 ApoB

- 1 VSI ApoB

- 1 PCSK9

(20)

Intégralis 52072

MAR MA 6558

(21)

Famille 52072/6558 : absence de mutation

?

suicide

?

DCD à 68 ans k sein

?

peu de contact mais possible

?

30/11/1952 fâché

LDL 0.9 puis 1.65 HDL 0.56 TG 1.92 CT 2.59

?

57136 4/4/1955

LDL 0.94 HDL 0.89 Trigly 0.57 CT 2.1

57137 8/3/1979 LDL 0.7 HDL 0.62 TG 0.59

CT 1.43 ApoB 0.7 pas d'enfant

57150 11/7/1983 resté handicapé suite pendaison LDL 1.47 HDL 0.44 Trigly 0.96

CT 2.1 ADN à envoyer

52072/6558 17/4/1976 ARFRP1

LDL 0.64 HDL 0.93 Trigly 0.32 CT 1.64 ApoB 0.5

? 29/1/1975

?

22/3/2009 10/6/2012 LDL 0.69 HDL 0.58 TG 0.68

CT 1.41

?

? - 2017 DCD à 99 ans

?

pas intéressé

?

pas d'enfant vit en Espagne

? ?

? 4/6/1929

?

? - 10/2018 DCD à 95 ans

17 ans

? ? ?

(22)

Panels 1 et 2

Gène Variant Statut GnomAD all %

1000G Europe

1000 G Afrique APOB p.Val730Ile Hétéro 2.5 5.37

MTTP p.Glu98Asp Hétéro 6.0 1.6 20.5

p.Asn166Ser Hétéro 5.9 1.6 19.2

p.Cys174Cys Hétéro 9.3 5.0 16.5

SLC10A2 p.Val98Ile Hétéro 2.8 4.1 0.3

SLC10A2 :

- in vitro contradictoire uptake taurocholate

- Diminué de 50% dans les cellule HeLa Ho 2011 - Normal dans les cellules Cos Love 2001

- 1 sujet homozygote normochol Love 2001 Occurrence ≤ 3

Famille 52072/6558 : absence de mutation

(23)

Panels suivants

• Variants rares avec fréquence <0.1% :

– Gènes : ASAP3, SCAP, MET, WRN, ARFRP1

– Type de variant : faux sens (sauf SCAP : promoteur)

ASAP3, SCAP (promoteur), MET, WRN, ARFRP1

Famille 52072/6558 : absence de mutation

(24)

Intégralis 59937

GRE NA 7331

(25)

Famille 59937 / 7331 VSI ApoB prob non responsable

59937/ 7331 15/10/2000

LDL 0.37 à 0.59 HDL 0.72 CT 1.5 TG 0.96 ApoB 0.6

VSI ApoB 62344 19/6/1966

LDL 0.74 HDL 0.41 CT 1.32 TG 0.85

62352 22/8/1972

LDL 0.25 HDL 1.04 CT 1.44 TG 0.77 ApoB 0.29

?

10/12/1997 80 ans LDL bas ?

?

fille unique

62375 28/1/1969

LDL 0.45 HDL 0.83 CT 1.39 TG 0.57

? ?

LDL bas ?

?

(26)

APOB c.3337G>C p.(Asp1113His)

 Faux sens : Acide aminé moyennement conservé, écart physico-chimique important

 In silico contradictoire : délétère (PolyPhen, SIFT);

polymorphisme (Mutation Taster)

 gnomAD All : 0.68%

 Rapportée



FHBL avec stéatose + 1 donneur de sang hypochol

Tarugi 2007



1 patient considéré comme hétéro compo (+troncature) CT 0.97g/L (2.5 mmol/L); TG 0.32 g/L (0.36 mmol/L) intolérance aux graisses, diarrhées, aucune étude familiale

Zeissig JCI 2010



1 FH

^Johansen ^{JLR 2014}



Labo : 6 FH dont 2 avec variant causal + 1 FHBL sans variant causal identifié

10

(27)

Panels 1 et 2

1000G Europe

1000 G Afrique APOB p. Asp1113His Hétéro 0.7 0.7 0.08 MTTP p.Glu98Asp Hétéro 6.0 1.6 20.5

p.Asn166Ser Hétéro 5.9 1.6 19.2

Occurrence ≤ 3

Famille 59937 / 7331

VSI ApoB prob non responsable

Panels suivants

Fréquence <0.1%, effet : CYP4Z1,CPT2, CELSR2, UGT1A1, KEAP1, TM6SF2, LSR, ACOT8

(28)

Intégralis 56139

GIL BA 6845

(29)

Famille 56139/ 6845 : absence de mutation

56139/ 6845 29/12/1995 LDL 0,42 HDL 0,84 Trigly 0,39

CT 1,34 ApoB 0,5

56611 29/11/1963

LDL 0.8 et 0.61, HDL 0.67, trigly 0.49 CT 1.57, ApoB 0.69

59637 26/11/1984

LDL 0.93 HDL 0.44 Trigly 1.10 CT1.59 ApoB 0.78

59638 23/10/1987

LDL 0,58 HDL 0,74 Trigly 0,6 CT 1,44 ApoB 0,54

? ? ? ?

? - 1/1/2003 DCD pb cardiovasc

59639 20/7/1930 sous statines

LDL 0.82, HDL 0.59, Trigly 1.29 CT 1.67

hyperchol avec l'âge, diabète

? ?

59869 18/1/1958

LDL 0.83, HDL 0.84, Trigly 0.85 CT 1.84, ApoB 0.76

59640 5/6/1965 LDL 1.08, HDL 0.48, Trigly 0.91

CT 1.74, ApoB 0.76

? ?

Trigly élevées 5965 Hyperchol, athérome carotidien LDL 1,88 HDL 0,48 Trigly 2,15 CT 2,79 ApoB 1,59

5964 LDL 1.15 HDL 0.72 Trigly 0.87

CT 2.04

?

kit envoyé

? 59652 21/8/1977 kit envoyé

59646 17/8/1987 LDL 0.79, HDL 0.76, Trigly 0.56

CT 1.66, ApoB 0.65

?

27/7/1975 kit envoyé 59645

28/5/1986 LDL 0,81 HDL 0,62 Trigly 0,77

CT 1,58 ApoB 0,79 60511

24/7/1978 LDL 1.26 HDL 0.42 Trigly 1.02

CT 1.88

? 60512 1/7/1981 kit envoyé

? 60514 15/7/1983 kit envoyé

26/2/2003

(30)

Panels 1 et 2

1000G Europe

1000 G Afrique MTTP p.Arg46Gly Hétéro 1.83 2.2 1.2

ANGPTL4 p.Glu40Lys Hétéro 1.34 2.59 0.3

MTTP p.Arg46Gly Sanger en cours

Famille 56139/ 6845

ANGPTL4 p.Glu40Lys

- Associé à des taux de TG significativement plus bas chez porteurs vs non porteurs Romeo Nat Genet 2007

- In vitro : empêche oliomérisation et diminue inhibition de la LPL induite par ANGPTL4 Yin JBC 2009

(31)

MTTP p.R46G

Liu Cell Reports 2017 15

 Faux sens



c.136C>G p.R46G



gnomAD



All : 1.83%



NFE : 1.95%

 Acide aminé faiblement conservé, écart physico- chimique important

 Rapporté dans ClinVar comme Bénin (n=1) et

probablement bénin (n=1) dans ABL

(32)

MTTP p.R46G

 Stéatorrhée, stéatose microvésiculaire,

dégénérescence spinocérébrale et rétinopathie

 Patient homozygote



CT 0.52 g/L

(1.34 mmol/L)



TG 0.10 g/L

(0.11 mmol/L)



LDLc 0.13 g/L

(0.33 mmol/L)



ApoB 0.10 g/L

(33)

MTTP p.R46G

Pas d’activité MTTP Absence de sécrétion d’ApoB

Dégradation par le protéasome

Hepatocytes

(34)

MTTP p.R46G

Gouttelettes

lipidiques Accumulation de TG Accumulation de CT

Hepatocytes

(35)

MTTP p.R46

Secretion d’ApoB

Augmentation de l’apoB intracellulaire

Diminution de l’accumulation de

lipides

Hepatocytes « réparés »

p.R46 p.R46G

p.R46G

(36)

Panels 1 et 2

1000G Europe

ANGPTL4 p.Glu40Lys Hétéro 1.34 2.59 0.3

MTTP p.Arg46Gly Sanger en cours

- 1 homoZ décrit avec bilan lipidique ABL/FHBL Ho ^{Liu 2017}

- IPS  cellules hépatiques : absence d’activité MTTP et de sécrétion d’apoB - Restauration par Crispr/cas9 : restaure sécrétion d’apoB Liu 2017

- Laboratoire : fréquence 3.4% FH versus 5.4% des FHBL

Famille 56139/ 6845

ANGPTL4 p.Glu40Lys

- Associé à des taux de TG significativement plus bas chez porteurs vs non porteurs Romeo Nat Genet 2007

- In vitro : empêche oliomérisation et diminue inhibition de la LPL induite par ANGPTL4 Yin JBC 2009

(37)

Hz MTTP : 16% présentent FHBL

21

(38)

Hz MTTP : 16% présentent FHBL

22

(39)

Hz MTTP : 16% présentent FHBL

23

(40)

Intégralis 59919

DEN OC 7363

(41)

59919 ADN 7363 DE Oc

59919/ 7363 5/4/1997 LDL 0.46 HDL 0.94 TG 0.5

CT 1.5 ApoB 0.5

?

17/6/1958

?

31/10/1962

?

17/5/1994

?

DCD vers 50 ans cause inconnue hospit psy ? obésité

?

? - 1964 K gynéco obésité

?

obésité pas de contact

? ?

IDM à 25 ans

?

1933 - 2017 DCD à 84 ans K multiples

?

1940 diab II

?

1958

? ? ?

?

secret de famille

?

diab

?

(42)

Panels 1 et 2

1000G Europe

MTTP p.Arg46Gly

- 1 homoZ décrit avec bilan lipidique ABL/FHBL Ho ^{Liu 2017}

- IPS  cellules hépatiques : absence d’activité MTTP et de sécrétion d’apoB - Restauration par Crispr/cas9 : restaure sécrétion d’apoB ^{Liu 2017}

- Laboratoire : fréquence 3.4% FH versus 5.4% des FHBL

59919 ADN 7363 DE Oc

(43)

Intégralis 56419

AUN AU 6874

(44)

56419 ADN 6874 Aun Au

56419 13/11/1985 LDL 0.44g/L

? ?

28/7/1960 maladie de Gilbert chol bas ?

?

maladie de Gilbert

?

15/10/1984

? ? ? ?

?

pas de contact

?

? ?

?

DCD à 90 ans

?

DCD K foie vers 50 ans

?

? ?

(45)

56419/ 6874

• Femme de 31ans

– FHBL1 : APOB, PCSK9, ANGPTL3 : RAS – FHBL2 : MTTP

Variant MTTP p.Leu811Phe : VSI  étude in vitro ?

g/L CT TG LDL HDL ApoB

27 ans 1.35 0.98 0.59 0.56 0.50

Variant cDNA Effet Statut In silico ^GnomAD Décrite littérature ^Source

c.1990-20A>G p.? HétéroZ Pas d’ effet splicing

0.0024% non ^NA

c.2433G>C p.Leu811Phe HétéroZ Contradictoire 0.15% Non ^NA

c.1151A>C p.Asp384Ala Homo Bénin 4.6% 1 hétéro LDL 1.10g/L

Pas d’effet in vitro Activité de transfert des TG mais < au WT, sécrète apoB48

Di leo 2005 Rehberg 1996

Khatun JLR 2013

c.891C>G p.His297Gln Homo Bénin 40.2% LDLC p=0.047

Homo 1.185+/-0.29 vs 1.241+/-0.34 g/L 1 hétéro LDL 1.10g/L

Hsiao 2015

Di leo 2005

!

(46)

MTTP p.Leu811Phe

Khatun JLR 2013

(47)

MTTP p.Asp384Ala

Activité MTTP Sécrétion ApoB48

Khatun JLR 2013

(48)

6874

• Femme de 31ans

– FHBL1 : APOB, PCSK9, ANGPTL3 : RAS – FHBL2 : MTTP

– Poursuivre ?

• Duplication hétérozygote HBS1L (SNP associé cholestérol total) suspectée en NGS (QPCR de confirmation non réalisée)

• 2 variants rares sur COL4A3BP (LDL réseau de gènes)

– Attendre les explorations familiales ?

• Récessif ?

• Transmission incomplète ?

g/L CT TG LDL HDL ApoB

27 ans 1.35 0.98 0.59 0.56 0.50

(49)

Intégralis 60549

THU El 7496

(50)

60549 ADN 7496 Thul El

?

DCD crise cardiaq 60 ans

?

? ? ?

26/4/1965

?

? ? ? ? ? ? ?

?

30/12/1967

23/10/2001

LDL 0.53g/L HDL 0.42g/L TG 0.54g/L CT 1.06g/L ApoB 0.5g/L

? 20/11/1999

? 23/7/2003

?

? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

? - 2017 DCD à 87 ans

?

(51)

Littérature

APOB p.As2213del Hétéro 0.5 Déjà mis en évidence chez patients FH, FHBL, HTG

Double hétéro APOB + MTTP : diminution A post prandiale par rapport aux hétéro MTTP seule A proximité site de mRNA

editing physiologique ApoB48 SLC10A2 Pro290Ser Allure

homo

0.98 In vitro n’a pas la capacité de transporter le taurocholate (Wong JBC 1995, Ho J Gastro hepatol 2011)

Intégralis 60549 7496

Confirmer le statut homozygote par l’étude des parents A confronter

- clinique : diarrhées

- Biologie : dosage de taurocholate dans le sang et dans les selles + dosage apob48 ?

(52)

Anxiété / dépression : lien avec l’hypobéta ?

Anxiété Dépression A + D

LDL < 0,6g/L 7,4 3,2 10,6

LDL 0,6 à 0,8g/L 7,6 3,8 11,4

LDL > à 0,8g/L 6,8 3,7 10,5

Tous 7,2 3,5 10,7

0-7 normal 8-10 modéré 11-14 moyen 15-21 sévère

(53)

Direction de la Recherche • Département partenariat et innovation

Immeuble Deurbroucq • 5 allée de l’île Gloriette • 44093 Nantes Cedex 01 Mail : rhu_chopin@univ-nantes.fr

www.rhuchopin.fr

Merci de votre attention

(54)

WP5

Task 1 - HYPOCHOL study

Task 2 - Genetic of Hypochol

Task 3 – 3D iPS strategy

(55)

A new differentiation protocol for a new environment

Cytokine s

Méryl Roudaut

In depth differentiation characterization by Digital Gene Expression profiling

(56)

Untreated Cells

Mevastatin Treatment

(10µM)

Insulin Treatment

(1.7µM)

DGESeq analysis

(57)

2D

3D

Day 0 D20

D28 Day 0

RNA seq analysis

(58)

(59)

(60)

Gene Ontology

Circadian cycle Cell junction Cell cycle

(61)

Gene Ontology

Liver

(62)

Gene Ontology

Fatty-acid

(63)

Gene Ontology

Lipoprotein

(64)

Gene Ontology

Cholesterol

Bile acid

(65)

Gene Ontology

Glucose metabolism

(66)

Gene Ontology

Insulin

(67)

Gene Ontology

Detoxification

(68)

Gene Ontology

Xenobiotic

(69)

- Refining gene set for analysis

- Looking at meta-analysis to compare with primary hepatocytes

- Data will be send to Inserm Transfert together with functional testing for patenting evaluation

(70)

Mid-October -> Data will be sent to Inserm Transfert for a patenting study.

(71)

Hypochol Project

(72)

Patient 1 Patient 2

Intra-familial control Extra-familial

control

(73)

Intrafamilial Control

Extrafamilial Control

Propositus Patient 1 Sister

Patient 2

DGESeq analysis

Hypochol Project: Gene expression

(74)

Patient 1 Patient 2

Intra-familial control

Extra-familial control

Clone 4 : 4 samples Clone 1 : 6 samples

Diff 1: 5 samples Diff 2: 5 samples Diff 3: 5 samples

Hypochol Project: Proteomic analysis (collaboration Kuif)

Plasma samples ?

Pick up scheduled for Tuesday December 11th.

(75)

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