DISTRIBUTION DU POLYMORPHISME Ala99Ala DU GENE DE LA PARAOXONASE 3 DANS LA POPULATION BENINOISE :

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI (EPAC)

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MEMOIRE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MASTER PROFESSIONNEL

FILIERE : Génie de Biologie Humaine OPTION : Analyses Biomédicales THEME :

REALISE ET SOUTENU PAR : Souraka M. D. TAPARA SOUS LA DIRECTION DE :

Directeur de mémoire : Co-directeur de mémoire : Prof. Clément AGBANGLA Dr. Julien A. G. SEGBO

JURY :

Président du Jury : Membres du Jury : Prof. Hyacinthe AHISSOU Prof. Evelyne LOZES

Dr. Julien A. G. SEGBO

Dr. Antoine Abel H. MISSIHOUN

Promotion de 2011-2012

DISTRIBUTION DU

POLYMORPHISME Ala99Ala DU GENE

DE LA PARAOXONASE 3 DANS LA

POPULATION BENINOISE : Cas des

communes d’Abomey-Calavi et Sô-Ava

REPUBLIQUE DU BENIN ---

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI (EPAC)

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DEPARTEMENT DU GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

Directeur : Professeur Félicien AVLESSI

Directeur Adjoint : Professeur Clément BONOU

Chef du Département : Docteur Julien G. SEGBO

Dédicace

Je dédie ce mémoire à mes parents, TAPARA D. Maman et IDRISSOU Mariam, qui ont toujours rêvé de me voir réussir et qui n’ont ménagé aucune de leurs ressources tant affectives que matérielles pour l’accomplissement de ce dessein. C’est le moment de vous

renouveler mon amour pour toujours.

REMERCIEMENTS

Remerciements

 Au Professeur Clément AGBANGLA, je suis très sensible de votre générosité et de votre amour du travail bien fait. Vous avez suscité en moi le goût de la recherche scientifique. Sincères reconnaissances.

 Au Docteur Julien G. SEGBO, vous avez initié et dirigé ce travail avec beaucoup d’attention et d’affection malgré vos multiples occupations. Une fois de plus, merci Docteur.

 A tous les enseignants de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) et particulièrement ceux du Département du Génies de Biologie Humaine pour le savoir que vous nous avez inculqué durant toutes ces années de formation.

 Aux autorités de l’hôpital de zone d’Abomey-Calavi/Sô-Ava.

 A tout le personnel du Laboratoire de Génétique et des Biotechnologies de l’Université d’Abomey-Calavi en particulier Dr Antoine A. MISSIHOUN, Dr Giles KAKAI, Dr Arnaud AGBIDINOUKOUN, les doctorants Réné DOSSOUKPEVI, Serge HOUEDJISSIN, Rolande DAGBA et en particulier à Paulin SEDAH pour son soutien technique inestimable au cours de mes manipulations dans ledit Laboratoire.

 A tous ceux qui ont participés de près ou de loin à la réalisation de ce travail

HOMMAGES RESPECTUEUX

A son excellence Monsieur le Président du jury, nous sommes très heureux de vous voir présider notre jury.

Aux honorables membres du jury, pour avoir accepté améliorer la qualité de ce travail par vos diverses contributions.

SOMMAIRE INTRODUCTION 1^ère Partie

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 2^ème Partie

II. CADRE, MATERIEL ET METHODOLOGIE DU TRAVAIL 3^ème Partie

III. RESULTATS ET COMMENTAIRES 4^ème Partie

IV. DISCUSSION

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

Page

Figure 1 : La structure de l’enzyme paraoxonase……… 8

Figure 2 : Le rôle du complexe HDL-PON1 dans l’oxydation des LDL…………...13

Figure 3 : Taille du gène paraoxonase 3………..14

Figure 4 : Famille du gène paraoxonase sur le chromosome 7………..14

Figure 5 : Profils électrophorétiques des différents cas possible………...25

Figure 6 : Electrophorèse des produits de digestion ………..27

Tableau I : Profil électrophorétique du produit de digestionet les génotypes correspondants……… 28

Tableau II : Distribution du polymorphisme Ala99Ala de PON3 dans la population béninoise étudiée………..28 Tableau III : Comparaison de la distribution du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 dans la population béninoise avec les autres populations étudiées….29

RESUME:

Objectif : Analyser le polymorphisme Ala99Ala du gène de la paraoxonase 3 (PON3) en vue d’évaluer le risque de survenue des maladies associées au PON3 au sein de la population Béninoise.

Méthode : La Réaction en Chaîne de la Polymérase a été réalisée suivie de l'analyse du Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction (PCR-RFLP) sur 84 sujets de nationalité Béninoise. Les fréquences génotypiques et phénotypiques ont été déterminées puis comparées aux fréquences observées dans d'autres populations.

Résultats : Il ressort que le polymorphisme Ala99Ala du gène PON3 existe au sein de la population béninoise et que les fréquences des phénotypes A et G sont respectivement 0,952 et 0,048. Ces fréquences phénotypiques du polymorphisme Ala99Ala du gène PON3 sont significativement différentes de celles des autres populations étudiées (P

<0,01).

Conclusion et implications: La distribution du polymorphisme Ala99Ala dans la population béninoise est différente de celle des populations chinoise, anglaise et américaine. Cette différence significative de la distribution du polymorphisme Ala99Ala entre la population béninoise et les autres servira d’appui pour une investigation plus approfondie des corrélations de ce polymorphisme avec le risque du développement des maladies cardiovasculaires.

Mots clefs : paraoxonase 3, polymorphisme génétique, population Béninoise, distribution

ABSTRACT:

Objective: To analyze the genetic polymorphism of paraoxonase 3 (PON3) Ala99Ala in Beninese population in order to the research of mechanisms of diseases associated with PON3.

Methods: PON3 gene polymorphism of 84 individuals of Benin nationality were studied by means of Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP), calculated genotype and phenotype frequencies and compared them with those of other populations.

Results: Polymorphism (Ala99Ala) of PON3 gene exists in Benin population and the phenotypes A and G frequencies were 0.952 and 0.048 respectively. The frequencies of the PON3 Ala99Ala phenotype were significantly different between Benin nationality and other population (P< 0.01).

Conclusion and implications: The polymorphism Ala99AlA of paraoxonase 3 distribution is different between Benin and other population. The significant difference in PON3 gene polymorphism distribution between Benin nationality and other population can be use as basis for further investigation on the risk of cardiovascular diseases related to this polymorphism.

Key words: paraoxonase 3; genetic polymorphism; Beninese population, distribution.

Liste des sigles et abréviations

ADN: Acide Desoxyribonucléique Ala99Ala : Alanine 99 Alanine Arg: Arginine

Asp: Asparagine

AVC : Acident Vasculaire Cérébral Cys : Cystéine

DMSO: Dimethyle Sulfate Oxyde

dNTP: Desoxyde Nucleoside Triphosphate Gln: Glutamine

Glu: Glutamine

HDL: High Density Lipoprotein kDakDaa : Kilo Dalton

LDL: Low Density Lipoprotein Lys: Lysine

MgCl2: Dichlorure de Magnésium OMS: Organisation Mondiale de la Santé Pb: Paire base

PCR : Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaine de la Polymérase.

PON : Paraoxonase

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism ou Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction.

ROS: Radicaux Oxygénés

RT-PCR: Real Time - Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaine de la Polymérase à Temps Réel.

SNP: Simple Nucleotide Polymorphism TBE: Tris Borate EDTA

Tyr : Tyrosine UV: Ultra Violet

INTRODUCTION

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont aujourd’hui considérées comme l’une des plus importantes causes de décès. Chaque année à travers le monde, 17,3 millions de personnes décèdent des suites d’une maladie cardiovasculaire : soit un infarctus se produit toutes les 5 secondes, un accident vasculaire cérébral (AVC) toutes les 6 secondes entraînant un décès toutes les 2 secondes. Parmi ces décès, on estime que 7,3 millions sont dus à une cardiopathie coronarienne et 6,2 millions à un Accident Vasculaire Cérébral (AVC) (Statistiques OMS 2011). Plus de 80% de ces décès interviennent dans des pays à revenu moyen ou faible (cas du Bénin) et touchent presque également hommes et femmes. Si rien n’est fait d’ici 2030, près de 23,3 millions de personnes mourront d’une maladie cardiovasculaire (cardiopathie ou AVC principalement). D’après les projections, ces maladies devraient rester les premières causes de décès dans le monde (Mathers et al., 2002). Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la moitié des décès et des cas d’invalidité découlant d’un infarctus ou d’un AVC pourrait être évitée. Si certains facteurs de risques cardiovasculaires comme l’âge ou le sexe ne sont pas modifiables, on peut agir sur d’autres paramètres, en particulier sur le taux de cholestérol, l’hypertension, le diabète sucré et le tabagisme. Ces facteurs de risques prédisposant aux maladies cardiovasculaires s’installent au fur et à mesure que l’athérosclérose qui à sont tour est régulé par la paraoxonase.

La Paraoxonase (PON) est une famille de gènes composée de trois membres à savoir PON1, PON2 et PON3. Toutes les protéines PON ont été impliquées dans la pathogenèse de plusieurs maladies inflammatoires et ont toutes en commun une capacité à protéger les cellules contre le stress oxydatif. Le gène PON3 s’exprime mieux dans le foie et il s’associe souvent avec le cholestérol HDL dans la circulation sanguine. Mais il faut noter que malgré l’intérêt particulier qu’à cette famille de gènes sur la prise en charge voire la prévention des maladies cardiovasculaires, aucune étude n’a été réalisée sur la race noire en général et sur les Béninois en particulier. Sur le gène PON3, on rencontre deux types de polymorphisme qui sont Ala99Ala et Asp107Asn. La protéine issue de ces mutations se combine avec le cholestérol HDL et inhibe l’oxydation des cholestérols LDL. Cette accumulation de cholestérol LDL oxydés entraine la formation de plaque d’athérosclérose qui engendre l’hypertension artérielle. Ainsi, la présente étude a pour but de mettre un accent sur les différentes formes existantes de ce gène dans la

population béninoise en vue d’apprécier le risque de la survenue de certaines des maladies auxquelles elles conduisent.

L’objectif général de ce travail est d’évaluer la distribution du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 dans la population béninoise. Il s’agit spécifiquement de:

- Identifier les différents génotypes du gène paraoxonase 3 à partir de l’analyse de l’ADN total génomique par la technique PCR-RFLP ;

- Comparer les fréquences de ces différents génotypes de la population béninoise avec les fréquences observées dans d’autres populations précédemment étudiées.

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1. Historique

Les enquêtes sur la paraoxonase sérique chez les mammifères (PON), maintenant appelé PON1, a commencé, il ya près de 50 ans par Aldridge avec l'étude de son activité d'hydrolyse du paraoxon et d'autres organophosphates. La paraoxonase (PON, aryldialkyle phosphatase, EC 3.1.8.1), est une enzyme synthétisée dans le foie et est dépendante du Calcium. Elle est liée aux HDL et a un poids moléculaire de 43-45 kDakDaa environ avec une structure de glycoprotéine. PON est une hydrolase qui possède à la fois une activité arylestérase et une activité paraoxonase (Başkol et Köse, 2004). Le nom paraoxonase vient de l’utilisation de paraoxanes organiques du phosphore comme substrat. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse d'insecticides phosphoreux organiques, tels que le fluorophosphate de diisopropyle (DEP), sauf parathion et catalyse l'hydrolyse des gaz neurotoxiques comme le sarin, taurin qui sont dans le même groupe chimique. Cependant, le substrat naturel de PON n'est pas encore bien précis.

La paraoxonase a été initialement identifiée dans les lipoprotéines de haute densité après une électrophorèse du sérum humain en 1961 par (Mackness et Mackness, 2004).

Ensuite, il a été montré que surtout dans le sérum bovin, la paraoxonase purifiée est liée aux lipides et a la même masse moléculaire avec le complexe lipidique. Grace à l’ultracentrifugation du sérum, Mackness et al. (1985) ont rapporté que la paraoxonase est liée au cholestérol HDL dans le sang humain. Ainsi il est établi que l’activité de cette enzyme est liée à des particules de cholestérol HDL contenant Apo A1 chez les ovins (Bayrak et al., 2005). De même, il est démontré par (Azarsız et Sözmen, 2000; Bayrak et

al, 2005.) que la paraoxonase humaine est liée aux types de cholestérol HDL (High Density Lipoprotein) qui contiennent Apo AI et Apo J.

1.2. Les isoenzymes de paraoxonase

Il y a trois membres dans la famille du gène PON: PON1, PON2 et PON3. Ils possèdent tous des propriétés antioxydantes et sont similaire à 65% au niveau des acides aminés. Ils sont disposés en tandem sur le chromosome 7 chez l'homme et le chromosome 6 chez la souris. Bien que les chaînes d'acides aminés des trois protéines du PON sont semblables à 65% de leur volume, leur expression et leur dispersions dans les tissus sont différentes l'une de l'autre. PON1 et PON3 sont principalement exprimés dans le foie et sont transportés dans le plasma par le cholestérol HDL. PON2 n’a été trouvé que dans les cellules (les cellules endothéliales humaines et des cellules musculaires lisses aortiques humaines) et peut ne pas être associé avec les lipoprotéines (Hong-Liang et al, 2003; Aviram et Rosenblat, 2004).

La paraoxonase sérique humaine (PON1) est le membre de la famille le plus étudié. D’une masse de 45 kDakDaa, elle code pour l’insertion de 354 acides aminés et se trouve sur le chromosome 7 humain à la position 7q21-22. PON1 est synthétisée dans le foie et se trouve dans divers tissus et le plasma, surtout le foie mais aussi les reins et les intestins. Elle s’associe au cholestérol HDL dans le plasma (Ali et al., 2003). Le calcium est nécessaire à la fois pour l'activité et la stabilité de l'enzyme qui joue un rôle dans le mécanisme catalytique. L’activité arylestérase de PON1 dépendante du calcium peut être totalement et irréversiblement inhibée par l'EDTA, tandis que la protection des LDL contre oxydation peut ne pas exiger du calcium (Bayrak et al., 2005). Cette activité sérique de PON1 est inversement associée au stress oxydatif, non seulement dans le sérum, mais également dans les macrophages qui caractérisent l'athérogenèse précoce. Ce qui fait qu’elle est associée à une meilleure reconstitution d'une lésion athérosclérotique.

PON1 a ainsi un intérêt par ses propriétés antioxydantes (Aviram et Rosenblot, 2004).

PON2 se retrouve surtout dans la couche endothéliale du foie, les reins, le cœur, le cerveau et les tissus testiculaires (Bayrak et al., 2005). Grâce aux méthodes immunohistochimiques, PON2 est également retrouvé dans les cellules musculaires lisses de l'aorte (Hong-Liang et al., 2003). Bien que PON2 soit définie suivant PON1 et moins étudié, il a attiré plus d'attention en raison de son activité antioxydante dans les cellules endothéliales de l’endothélium vasculaire ( Bayrak et al., 2005).

Comme PON1, PON3 est essentiellement dans le foie et dans le plasma avec le cholestérol HDL (Bayrak et al., 2005). PON2 et PON3 ne peuvent pas hydrolyser la paraoxonase parce qu'ils n'ont pas de résidu lysine à la position 105 dans leur chaîne polypeptidique. Toutefois, les deux isoenzymes PON2 et PON3 étaient tous deux suggéré de posséder des propriétés anti-oxydantes, comme le cas chez les lapins où PON3 protège le cholestérol LDL de l'oxydation, mais ils hydrolysent rapidement le lactone (Aviram et Rosenblat, 2004;Ekmekçi et al., 2004).

1.3. Structure de la paraoxonase

L’enzyme PON1 comprend 354 acides aminés et trois chaînes de carbonhydrates qui forment 15,8% de sa masse totale. Le gène qui code l'enzyme PON1 est situé au q 21- 22, zone du septième chromosome humain. Son point isoélectrique pH est de 5,1. Sa teneur en acides aminés ne montre aucune propriété spécifique (Gülcü et Gürsu, 2003).

PON1 a trois acides aminés cystéine dans sa structure. Il existe des liaisons disulfures entre les deux acides aminés cystéines de l'enzyme (Cys 42-352) et le troisième acide aminé cystéine en position 284 est libre (voir Figure 1). Cette cystéine libre se trouve à côté du site fonctionnel de l'enzyme et permet une reconnaissance du substrat et sa liaison à l'enzyme (Azarsız et Sözmen, 2000;. Bayrak et al., 2005). Bien que la cystéine libre a un effet significatif sur la protection des cholestérols LDL de l'oxydation, il n'a aucun effet sur l'hydrolyse des composés organophosphorés (Ekmekçi et al., 2004). D'autre part, la liaison disulfure qui se trouve dans la structure de PON1 est responsable de la forme cyclique de la chaîne polypeptidique (Memişoğulları et Orhan, 2010).

Figure 1: la structure de l’enzyme paraoxonase (Turunç et Aşkar, 2012)

La PON1, qui est liée au cholestérol HDL, est synthétisée dans le foie. Le peptide signale N-terminal hydrophobe de la PON1 est nécessaire pour l'interaction avec le cholestérol HDL. C’est par cette peptide signale que l'enzyme se fixe sur un phospholipide et les lipoprotéines. Mais aussi les sous-unités de liaison des cholestérols HDL avec PON1 contiennent l'apolipoprotéine (apo) A1 et Apo J (clusterine) qui sont des protéines. Başkol et Köse, 2004 estiment qu’Apo 1 et Apo J peuvent affecter cette liaison.

Dans la structure tridimensionnelle de l'enzyme, il existe deux ions de calcium ayant 7,4 Å d’intervalle au centre des chaînes β. L'un d'eux est le calcium structurel et son retrait de la structure provoque une dénaturation irréversible. L'autre calcium assume un rôle catalytique dans l’activité de l'enzyme. Cet ion calcium interagit avec une molécule d'eau et l'oxygène de l'ion phosphate (Khersonsky et Tawfik, 2005).

1.4. Facteurs influençant l'activité de la paraoxonase

L’activité sérique de PON1 est affectée par le régime alimentaire, la grossesse, le tabagisme, les hormones et l'âge. Cette activité de PON1 chez les nouveaux nés et les prématurés est la moitié par rapport à celle de l'adulte, seulement après une année, il atteint son niveau adulte. L’activité de PON1 diminue avec l'âge (Biasioli et al, 2003;

Seres et al, 2004), mais elle ne varie pas selon les sexes (Azarsız et Sözmen, 2000;

Ekmekçi et al, 2004). Il est montré que le régime alimentaire qui est riche en graisses saturées, réduit l’activité arylestérase de PON tandis que le régime alimentaire qui est riche en acides gras insaturés augmente l’activité arylestérase de PON (Laplaud et al., 1997). A côté de cela, il a été montré que chez les hommes adultes l’activité de PON1 augmente avec une consommation modérée d'alcool (Azarsız et Sözmen, 2000). Il a également été montré que le vin rouge et l'apport en polyphénols augmentent l'activité PON chez les rats avec une carence en Apo E, tandis que le tabagisme inhibe l'activité PON1 (Azarsız et Sözmen, 2000). Les troubles du métabolisme de l'Apo AI ont ainsi un effet sur l'activité de PON1 (Azarsız et Sözmen, 2000).

1.5. Les fonctions de la paraoxonase

L'enzyme paraoxonase a des fonctions très importantes dans l'organisme:

1.5.1 Protéine contre les organophosphorés (activité Hydrolytique)

La paraoxonase est une estérase dépendante du calcium qui a été initialement identifiée par son hydrolyse des esters d'acides carboxyliques aromatiques, des insecticides organophosphorés et des gaz neurotoxiques. Son nom reflète sa capacité à hydrolyser paraoxon, un métabolite de l’insecticide parathion (Cabana et al., 2003). Elle hydrolyse les liaisons ester O-P dans le paraoxon (Ekmekçi et al., 2004). Les Oxons qui ne passent pas par la désintoxication du foie des mammifères sont hydrolysées par PON1 avant que les organophosphates n’affichent leur activité (Azarsız et Sözmen, 2000).

Cette enzyme catalyse aussi l'hydrolyse de divers carbamates et les esters d'acide carboxylique aromatique tels que : phenylacetate, le 4-nitrophénylacétate, l'acétate de 2- naphtyl (Gülcü et Gürsu, 2003). Elle catalyse l'hydrolyse des gaz neurotoxiques tels que le sarin, le soman, qui sont du même groupe chimique.

Les insectes sont des organismes cibles pour les organophosphates. Parce que PON1 ne peut pas être synthétisée chez les insectes, oiseaux, poissons et reptiles. Par conséquent, il ya une tendance pour une intoxication aux organophosphorés chez les oiseaux, les poissons, les reptiles et les mammifères (par rapport à Azarsız et Sözmen, 2000). Des études antérieures sur la toxicologie des pesticides organophosphorés ont révélé que, la faiblesse de l’activité sérique de la PON1 est due aux effets aigus des composés organophosphorés (Costa et Furlong, 2003). La détermination de la séquence du gène codant pour la PON1, l'identification des polymorphismes, ont conduit à l'idée que les individus ayant une faible activité de la PON1 sont plus sensibles à l'empoisonnement aux organophosphorés (Li et Costa, 2000).

Au cours des études menées ces dernières années, il a été montré que l'injection de la PON1 purifiée aux animaux qui sont exposés aux pesticides organophosphorés, c'est-à- dire une augmentation artificielle de la PON1 sérique, à permis de réduire les effets toxiques de certains organophosphates comme chlorpyrifos et le diazinon, mais inefficace contre une exposition au parathion (Main, 1956). Afin d'être utilisé comme un agent prophylactique contre l'exposition aux organophosphates, l’efficacité catalytique de PON1 doit être augmentée et l'enzyme doit être obtenu au montant adéquat.

En utilisant des méthodes d'ingénierie des protéines, des changements ont été apportés à certains acides aminés de PON1, ces variantes de PON1 ont été exprimées dans des systèmes bactériens et l'augmentation de l'activité enzymatique contre certains organophosphorés ont été obtenus (Harel et Brumshtein, 2007). Ces études montrent pertinemment que PON1 joue un rôle important dans le métabolisme de certains organophosphorés et une addition artificielle du taux sériques de PON1 à des animaux fournit une protection contre la toxicité des organophosphates.

1.5.2 Prévention de l'oxydation des LDL (activité anti-athérogène)

La deuxième fonction importante de PON1 est son activité anti-athérogène. PON1 est liée au cholestérol HDL dans le plasma et permet d'éviter l'oxydation des lipoprotéines plasmatiques (Aviram, 1999). PON1 est efficace sur les peroxydes lipidiques et aussi sur le peroxyde d'hydrogène. Elle a donc une activité peroxydase (Memişoğulları et Orhan, 2010). L’activité sérique de PON1 est particulièrement importante pour la protection des phospholipides LDL contre l'oxydation. En effet protecteur contre l'athérosclérose, le cholestérol LDL protège contre la libre-oxydation des LDL induite par des radicaux du cholestérol dans les parois artériennes et protège contre les effets nocifs des LDL oxydés (Aviram, 1999). En plus de LDL l’enzyme protège aussi le HDL qui est un véhicule du peroxyde lipidique (Azarsız et Sözmen, 2000).

1.5.3 Protection contre les endotoxines bactériennes (inactivation de lipopolysaccharide)

Dans des études récentes, il a été défini que le HDL associé au PON1 protège l’organisme contre l’endotoxine bactérienne par hydrolyse de lipopolysaccharides bactériens (Bayrak et al. 2005). PON1 hydrolyse les lipopolysaccharides bactériens avec son activité phosphatase. PON 1 empêche aussi la réaction inflammatoire en évitant les interactions entre les protéines spécifiques des macrophages et la liaison avec les lipopolysaccharides bactériens (Aviram 1999, et Azarsız Sözmen, 2000).

1.6. Rôle de la paraoxonase dans le stress oxydatif

Les espèces oxygénées actives (ROS) sont des molécules contenant de l'oxygène produites pendant le fonctionnement normal du métabolisme. Lorsque la production de ces espèces oxygénées actives dommageables (ROS) est supérieure à la capacité des défenses antioxydantes de l'organisme à les détoxiquer, une condition connue sous le nom contrainte oxydative se produit. Les espèces oxygénées actives peuvent endommager les tissus, en particulier dans le tissu endothélial. Les lipides et les lipoprotéines sont également touchés par les ROS (Altındağ et al., 2007). Par conséquent le stress oxydatif est associé à la peroxydation des lipides et des lipoprotéines dans le sang artériel et les cellules y compris les macrophages. Les particules LDL denses et petits sont plus sensibles à l'oxydation par rapport aux grosses particules (Chait et al., 2005). Ces

macrophages "oxydés" possédent une capacité accrue pour convertir LDL active en LDL oxydé. Le stress oxydatif est ainsi impliqué dans les pathologies de l'athérosclérose. On caractérise les lésions d'athéroscléroses précoces par des cellules mousseuses constituées de macrophages remplis de cholestérol, oxystérols et lipides oxydés (Fuhrman et al., 2002). La paraoxonase associé (PON1) au cholestérol HDL est une enzyme antioxydante qui protège les cholestéroles LDL et HDL à partir de la peroxydation lipidique. Elle est considéré comme la principale anti-athérosclérotique (Forclusion à l'athérosclérose) contenant de HDL (Gülcü et Gürsu, 2003). PON1 protège les lipoprotéines et des cellules artérielles contre l'oxydation, probablement par hydrolyse de lipides peroxydés tels que les esters de cholestérol oxydés spécifiques et les phospholipides. La paraoxonase contribue à la protection antioxydante conférée par HDL sur l'oxydation des LDL (Mackness et al. 1991).

1.7. Le lien entre l'activité de la paraoxonase et la survenue de diverses pathologies Dans les maladies telles que l'obésité et la malnutrition, l'activité de PON1 est supprimée (Yurttagül, 2007). Le faible taux de PON / HDL et PON / Apo AI est observé chez des patients ayant un risque élevé d’athérosclérose et il est conclu que la capacité antioxydante du cholestérol HDL a diminué dans ces cas (Azarsız et Sözmen, 2000).

Chez les patients atteints d’athérosclérose coronaire, l'effet inhibiteur de PON1 dans l'oxydation des LDL se produit au cours de la répression de la réponse inflammatoire au niveau des cellules qui sont sur la paroi artérielle avec une destruction des lipides actifs dans le groupe des cholestérols LDL (Yurttagül, 2007). Dans les études qui montrent que PON1 protège l'oxydation du cholestérol HDL, il est révélé que PON1 diminue le taux de lipides peroxydés à 95% ainsi que l'accumulation des aldéhydes. Cet effet protecteur de PON1 sur l'oxydation du cholestérol HDL peut être liée à la chélation d'ions métalliques, ou d'une activité péroxydasique (Aviram et al. 1998; Yurttagül, 2007).

Il a été montré que dans la maladie de theilériose tropicale qui provoque d'énormes pertes économiques dans l’élevage il y a une diminution de l’activité de PON1 (Turunç et Askar, 2012). D'autre part, l’activité de PON1 diminue également dans la dirofilariose (maladie du ver du coeur), qui est une zoonose maladie causée par les nématodes. Les parasites matures immitis de Dirofilaria causent également de dommages oxydatifs au niveau du cœur. Ainsi pour prévenir ces dommages PON1 fonctionne entant que antioxydant (Kina, 2009).

Figure 2 : Le rôle du complexe HDL-PON1 dans l'oxydation des LDL (Turunç et Aşkar, 2012)

Dans le diabète sucré (DS) on constate une augmente de la peroxydation des lipides. Les lipides oxydés sont facilement phagocytés par des macrophages. Ce qui génère des cellules mousseuses caractéristiques de l’athéropathogenèse.

1.8. Le gène paraoxonase 3

C’est en 1996 que Primo-Parmo et collaborateurs ont identifiés après PON1 deux gènes qu'ils désignent PON2 et PON3. Puis Reddy et collaborateurs en 2001 ont pu cloné PON3 par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) à partir de la lignée cellulaire de carcinome de foie humain HepG2. L’analyse par Northern blot a détecté un transcrit d'environ 1,3 kb principalement dans le foie, avec une expression faible dans les reins. Par contre celle par Western blot des cellules HEK293 de rein embryonnaire humain détecte un PON3 endogène à une masse moléculaire apparente de 40 kDakDaa. L’analyse par la technique Western blot a montré que, comme PON1, PON3 est localisé exclusivement au niveau des fractions HDL dans le plasma humain.

Un autre clonage de PON3 fait par Lu et al. en 2006 à partir d'une banque d'ADNc du foie fœtal montre que la protéine mature déduite a 354 acides aminés et a une masse moléculaire calculée de 39,6 kDa. Il contient 3 cystéines qui sont conservées dans PON1 et PON2. Cys41 et cys351 sont prévus pour former un pont disulfure intramoléculaire, et cys283 est prévu pour être impliqué dans une activité antioxydante. L’électrophorèse de PON3 recombinant natif a une masse moléculaire apparente de 94,9 kDakDaa, ce qui

suggère qu'il est constitué probablement de dimères (Draganov et al., 2005). De plus le traitement du sérum humain au Glycosidase a suggéré que la forme sécrétée de PON3 contient des glucides complexes.

1.8.1 Description du gène paraoxonase 3

Figure 3 : Taille du gène paraoxonase 3 (Benoît Labrecque et al. 2009)

Comme le schéma l’indique, le gène paraoxonase 3 a une taille de 1,4 kb et code pour la synthèse d’une protéine de 40kDa environ. Cette protéine est constituée de 354 acides aminés. Chez l’homme on retrouve ce gène au niveau du chromosome 7 tandis qu’on le rencontre sur le chromosome 6 chez certains animaux (le porc, les rats).

1.8.2 Localisation du gène paraoxonase 3

Figure 4 : Famille du gène paraoxonase sur le chromosome7 (Koustubh Ranade et al., 2005)

Sur le chromosome7 humain, le gène paraoxonase 3 est situé entre paraxonase 1 et paraoxonase 2 puis il est situé sur le chromosome 6 chez certains animaux (porc et rats).

1.8.3 Fonction du gène paraoxonase 3

Une étude récente a révélé une association entre la maladie coronarienne et le polymorphisme 192 de la paraoxonase (ou apoprotéine K) chez des diabétiques non insulino- dépendants (DNID) (Dragnov et al., 2005). Cette enzyme, connue depuis plus de trente ans, a été localisée au niveau des cholesterol high density lipoproteins (HDL-cholestérol) (lu et al., 2006). Elle tient son nom de sa capacité de détoxifier un organophosphoré extrêmement toxique : le paraoxon, utilisé pour quantifier l’activité enzymatique de la paraoxonase. Sa liaison exclusive au HDL-cholestérol a fait rechercher une relation entre la paraoxonase et l’athérosclérose. L’effet cardio- protecteur du HDL-cholestérol est bien connu et la concentration de HDL-cholestérol est un bon marqueur prédictif d’atteinte cardiovasculaire chez les sujets d’âge moyen.

Le mécanisme en cause n’est cependant pas clairement élucidé. Il est généralement attribué à sa capacité d’extraire l’excès de cholestérol du tissu périphérique pour le transporter au niveau du foie. Mais d’autres hypothèses ont été avancées : en particulier, le HDL-cholestérol pourrait protéger les low density lipoproteins ou LDL contre les processus oxydatifs Mochizuki et al. Les LDL oxydées sont en effet captées par les macrophages qui possèdent des récepteurs spécifiques et qui se transforment en cellules spumeuses, participant ainsi à la formation des stries lipidiques, la première étape dans la genèse de la plaque d’athérosclérose. En outre, l’effet protecteur du HDL ne se limiterait pas à un simple transfert de lipides peroxydés à partir des LDL : la quantité de lipides oxydés produite à partir des LDL est en effet clairement diminuée en présence de HDL. Ces observations suggèrent la présence de mécanismes enzymatiques capables d’éliminer les lipides oxydés. Ce pourrait être le rôle de la paraoxonase liée au HDL-cholestérol d’hydrolyser les lipides peroxydés.

L’étude de l’action enzymatique de la paraoxonase vis-à-vis de divers substrats exogènes a permis de définir trois phénotypes pour la paraoxonase : à activité faible (phénotype A), intermédiaire (AB) et forte (B). La modulation de l’activité enzymatique de la paraoxonase a été attribuée à deux allèles d’un seul gène autosomique, situé sur le chromosome 7 près du gène responsable de la mucoviscidose.

1.8.4. Polymorphisme du gène paraoxonase 3.

Le polymorphisme est la variation induite par les mutations génétiques. Ces mutations peuvent être neutres, faiblement délétères ou favorables du point de vue de la sélection naturelle. Elles sont ou non conservées dans le patrimoine génétique de l’espèce ou d’une sous-population par différentes adaptations (mimétisme susceptible d’améliorer la survie des individus). La persistance d’allèles faiblement délétères pourrait jouer un rôle important dans le polymorphisme génétique, notamment au sein de l’espèce humaine. Le polymorphisme correspond également aux variations de la séquence nucléotidique de l’ADN d’un gène dans la population. Un gène est dit polymorphe s’il existe au moins deux allèles à une fréquence égale ou supérieure à 1%. Il existe quatre polymorphismes au niveau du gène de la paraoxonase 3. Trois de ces polymorphisme sont de de type SNP, Simple Nucleotide Polymorphism (remplacement d’un seul nucléotide) donnant lieu à des changements d’acides aminés : Glutamate en lysine (Glu146Lys), Alanine en Aspartate (Ala179Asp) et la Tyrosine en cystéine (Tyr233Cys) au niveau des résidus 146, 179 et 233 respectivement. Le quatrième est une substitution du nucléotide portant la base azotée Adénine par un nucléotide portant la base azotée Guanine. Cette substitution, objet de notre étude, entraine donc un remplacement synonyme de l’acide aminé Alanine au niveau du résidu 99 (Ala99Ala). En 2013, Zhang et collaborateurs ont montré qu’il y une implication du polymorphisme de la paraoxonase dans le développement des Accidents Vasculaires Cardiaques (Zhang et al., 2013). C’est ainsi qu’il qualifie l’allèle A du polymorphisme Ala99Ala de PON3 d’allèle protecteur et l’allèle G comme facteur de risque du développent des maladies cardiovasculaires. De même en 2005, Ranade et al avaient démontré qu’il existe une corrélation entre le polymorphisme Gln192Arg de PON1 avec le risque du développement des maladies cardiovasculaires. Ces différentes études confirment le rôle protecteur de la paraoxonase contre l’athérosclérose.

II. CADRE – MATERIEL ET METHODE

2.1 CADRE DU TRAVAIL

Les analyses moléculaires ont été réalisées au Laboratoire de Génétique et des Biotechnologies de l’Université d’Abomey-Calavi. Ce Laboratoire est subdivisé en trois grandes unités de recherche: l’unité de Biologie Moléculaire; l’unité de Biotechnologies et celle des Ressources Phyto-génétiques. L’unité de Biologie moléculaire est composée essentiellement de deux salles de manipulations à savoir : la salle de caractérisation du vivant et la salle d’amplification du matériel génétique par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction). La salle de caractérisation du vivant sert à :

- L’extraction du matériel génétique végétal, animal, microbien etc.

- L’électrophorèse sur gel (agarose ou polyacrylamide)

- La lecture des gels de polyacrylamide ou d’agarose au transluminateur à UV (spécialement dans la chambre noire)

La salle PCR a servi aux manipulations destinées à l’amplification du matériel génétique.

2.2 MATERIEL

2.2.1 Matériel et appareils

 Tubes EDTA

 Tubes Falcon de 15ml

 Micropipettes (10, 20, 100, 200 et 1000)

 Papier essuie tout

 Portoirs

 Centrifugeuses réfrigérée

 Congélateurs ( -20°C)

 Etuves

 Four à micro-ondes

 Agitateurs, types mécanique et magnétique

 Eprouvettes graduées

 Erlenmeyer

 Bécher

 Cônes (jaune et bleu)

 Pipettes jetables

 Pipettes pasteur

 Tubes eppendorf

 Appareil PCR ou Thermocycleur

 Cuve d’électrophorèse

 Barques

 Transluminateur

 Pissettes

 Parafilm

2.2.2 Matériel biologique, Réactifs et solutions

 Sang veineux non coagulé

 Tampon d’extraction T10E1

 Tampon d’homogénéisation

 Mélange phénol-chloroforme

 Alcool absolu

 Alcool 96°

 Alcool 70°

 Eau Merck

 Eau distillée

 Agarose

 BET (Bromure d’Ethidium)

 TBE (Tris Borate EDTA)

 Bleu de charge

2.3 METHODOLOGIE

Le traitement des échantillons au cours du travail a suivi les étapes suivantes : 2.3.1 Collecte des échantillons

L’enquête était anonyme. Un questionnaire a été élaboré pour sélectionner les individus, sans distinction de sexe, dont le profil cadrait avec les objectifs de l’étude. Ce questionnaire a été administré à tous les sujets venus au Laboratoire de l’hôpital de zone d’Abomey-Calavi/Sô-Ava pendant la période d’enquête. Après avoir obtenu le consentement éclairé du malade, un prélèvement veineux sur anticoagulant EDTA a été réalisé. Les échantillons ont été envoyés immédiatement au Laboratoire de Génétique et des Biotechnologies pour leur conservation après avoir subi un traitement adéquat.

La formule de Schwartz a été utilisée pour estimer la taille minimale de la population d’étude:

n est la taille de l'échantillon, z est une constante issue de la loi normale selon un certain seuil de confiance (en général 95% et z=1,96), p : est le pourcentage de gens qui présentent le caractère observé, e est la marge d'erreur d'échantillonnage choisie. Dans le cas de l'estimation d'une proportion : Un échantillon défini à un seuil de confiance de 95% et avec une marge d'erreur e = 3% permet d'extrapoler chaque résultat issu de l’enquête, avec 5% de risques de se tromper de + ou - 3%.

Puisqu’il s’agit d’une étude prospective transversale, nous avons procédé à un sondage aléatoire simple pour collecter les échantillons de mi-octobre à mi-novembre 2012. Au total nous avons retenu 84 échantillons constitués de 24 hommes et 60 femmes dont l’âge est compris entre 12 et 71 ans. Ils sont tous de nationalité Béninoise.

2.3.2 Conservation des échantillons

Une fois au laboratoire de Génétique et de Biotechnologies, les échantillons sont traités puis conservés à 4°C.

2.3.3 Extraction de l’ADN total génomique

Nous avons utilisé la technique du mélange Phénol-Chloroforme dont le protocole détaillé se trouve en annexe 2. Ce protocole a été amélioré au Laboratoire de Génétique et des Biotechnologies de l’Université d’Abomey-Calavi (LGB-UAC).

2.3.4 Vérification de l’ADN total génomique

Pour s’assurer de la qualité du matériel génétique obtenu après extraction, une migration par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% est faite pour tous les échantillons. On procède de la manière suivante :

 Prélever 100 ml de TBE (Tris Borate EDTA), à l’aide d’une burette graduée, dans une fiole jaugé

 Ajouter 1 g d’agarose

 Dissoudre la poudre d’agarose à l’aide d’une fourre à micro-ondes

 Laisser refroidir le gel

 Disposer les peignes dans la cuve d’électrophorèse

 Couler le gel dans la barque d’électrophorèse sans faire de bulles

 Laisser le gel se polymériser

 Retirer soigneusement les peignes du gel polymérisé afin d’obtenir des puits de dépôt

 Disposer correctement la barque dans la cuve d’électrophorèse

 Immerger totalement le gel avec le TBE

 Déposer 8μl du Bleu de charge sur du para film préalablement immobilisé par de l’eau distillée

 Ajouter au 8μl du bleu de charge 2μl d’extrait d’ADN

 Homogénéiser correctement le mélange en utilisant la micropipette

 Déposer soigneusement les 10μl du mélange obtenu dans le puits en évitant toute contamination éventuelle

 Refermer convenablement la cuve d’électrophorèse

 Mettre sous tension de 100V la cuve d’électrophorèse pendant 20minutes

 Arrêter la migration en mettant hors tension la cuve d’électrophorèse

 Retirer le gel de la solution du TBE 1×

 Plonger le gel dans une solution de BET pendant 5minutes

 Retirer le gel du BET

 Lire le gel au transluminateur en absence de la lumière

 Faire la photo du gel pour des analyses ultérieures

Il faut noter que l’étape d’immersion du gel dans le BET peut être contournée par l’incorporation de celui-ci dans la préparation du gel en amont. Cette étape nous renseigne dans un premier temps de la présence effective du matériel génétique extrait (ADN total dans ce cas) et ensuite de la concentration de ce matériel dans chaque échantillon. Ce qui nous a permis de faire une dilution appropriée de tous les échantillons. 2.3.5 Amplification de la séquence du gène paraoxonase 3 par la technique de la PCR

A partir de l’ADN total génomique dilué, nous avons amplifié la séquence du gène étudié par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette manipulation a été réalisée avec le thermocycleur de type PTC-100^TM (Programmable Thermal Controller). Le milieu réactionnel est composé de :

ADNT………3 μl

Eau Merck ………....10,5 μl Buffer (tampon)……….2,5 μl

MgCl₂ ………...1,25 μl

dNTP ……….1 μl Amorce R ………....2,5 μl Amorce F ………....2,5 μl DMSO ………...1 μl Taq polymerase ………..0,75 μl Total ………25 μl

Le programme d’amplification utilisé est :

o Pré-dénaturation ……….94°C………10min o Dénaturation ………..94°C…………...45sec

o Hybridation ………50°C…………...45sec

o Elongation ………..72°C…………...45sec

o Cycles ………30 cycles

o Incubation ………...72°C…………..7min o Refroidissement ………..4°C

2.3.6 Vérification du produit d’amplification de la séquence du gène paraoxonase 3 Cette étape est similaire à la vérification de la quantité et de la qualité de l’ADN total génomique extrait à la différence que le gel d’agarose est à 2% et qu’on utilise un marqueur de taille de 100 pb. Ce marqueur de taille nous permet de vérifier la taille des séquences amplifiées.

2.3.7 Digestion des produits d’amplification par l’enzyme de restriction HhaI

Cette étape consiste à mettre en contact le produit d’amplification obtenue avec l’enzyme de restriction HhaI. Le milieu réactionnel est :

- ADN (produit PCR) ………10 μl

- Eau Merck …..……….. 7,5 μl - Tampon (10× NEB) ………. 2 μl

- Enzyme (HhaI) ………. 0,5μl

Tout ce mélange a été incubé au Bain Marie à 37ºC pendant 4h.

L’enzyme HhaI reconnait la séquence

Elle coupe entre les dernières bases de la guanine et de la cytosine dans le sens 5’ vers 3’ puis libère après digestion les extrémités cohésives.

HhaI

5’………GCG C……….3’

3’………C GCG……….5’

HhaI

2.3.8 Electrophorèse des produits de digestion enzymatique sur gel d’agarose

Au cours de cette dernière phase nous avons utilisé un gel d’agarose à 2% pour mieux apprécier la présence ou non des différents fragments éventuels. Cette étape est similaire à celle de la vérification des produits d’amplification. Mais il faut noter qu’à cause de la taille des fragments obtenus après digestion, il est nécessaire d’augmenter la quantité d’échantillon à déposer. Ce qui nous a conduit à faire une dilution au ½ avec le bleu de charge. C'est-à-dire 5 μl d’échantillon contre 5 μl du bleu de charge. Quant au marqueur de taille préalablement préparé avec le bleu, un volume de 10 μl a été déposé dans les puits des extrémités. Puisqu’il s’agit d’une migration pour une séparation éventuelle de plusieurs fragments par échantillon, nous avons soumis le gel d’agarose à une tension de 50 V pendant 1h. Après 1h de migration, nous avons immergé le gel d’agarose dans la solution de BET (Bromure d’Ethidium) pendant 15min et en suite dans de l’eau pendant 5 min avant de passer à la lecture au transluminateur à UV. A ce niveau, nous avons utilisé les produits d’amplification comme témoin pour les produits de digestions et parallèlement le marqueur de taille pour identifier la taille des fragments obtenues après digestion. Les différents cas possibles qu’on peut obtenir après digestion sont :

Figure5 : Profils électrophorétiques des différents cas possibles

M : Marqueur de taille

III. RESULTATS ET COMMENTAIRES

3.1. Digestion enzymatique des produits PCR par HhaI

Le produit d’amplification après électrophorèse sur gel d’Agarose 2% est un fragment dont la taille est de 197pb (voir Figure 6 bandes 8, 18 et 81). Ce fragment contient un site de restriction qui après digestion par l’enzyme de restriction HhaI libère un fragment de 22pb (non visible sur le gel à cause de sa faible taille) et un fragment de 175pb (voir Figure 6 bande 30d). Le polymorphisme Ala99Ala fait apparaître un deuxième site de restriction pour l’enzyme HhaI sur le fragment du produit d’amplification et sa digestion engendre les fragments de 112pb, 63pb (non visiblesur le gel à cause de sa faible taille également) et 22pb (non visible). Les individus de génotype A/A sont représentés par la bande de 175pb (voir Figure 6 bande 30d) et ceux de génotype G/G par la bande de 112pb. Lorsqu’on obtient à la fois le fragment de 175pb et celui de 112pb, alors il s’agit d’un individu hétérozygote A/G (voir Figure 6 bandes 8d, 18d, 62d et 81d).

Figure 6: Electrophorèse des produits de digestion

Le profil électrophorétique du produit de la digestion enzymatique de tous les échantillons est consigné dans le tableau ci-après (voir Tableau I) :

M : Marqueur de taille

Nd: Produit digéré de l’échantillon N

Tableau I : Profil électrophorétique du produit de digestion et les génotypes correspondants Profils Profil 1 Profil 2 Profil 3

électrophorétiques Total Taille des fragments 175pb 112pb 175pb et 112pb

De restriction

Génotypes A/A G/G A/G

Effectifs 80 00 04 84 Fréquences 95,24 00 4,76 100

3.2. Distribution du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 dans la population Béninoise.

Tableau II : Distribution du polymorphisme Ala99Ala de PON3 dans la population béninoise Génotypes Phénotypes

A/A A/G G/G A G Fréquence en % 95,24 4,76 00 97,62 2,38

De ce tableau, nous pouvons déduire que la probabilité qu’un gamète (mâle ou femelle) porte l’allèle A dans la population béninoise est 0,976 soit p². Ainsi celle du port du gamète G sera égale à q² =1-0,95 soit 0,024. Puisque 2pq donne 0,47 (0,47≈0.476) alors nous pouvons dire que notre population d’étude respecte l’équilibre de Hardy-Weinberg qui stipule que la distribution à l’équilibre est : A/A : A/a : a/a (p² : 2pq : q²).

3.3. Comparaison de la distribution du polymorphisme Ala99Ala de paraoxonase 3 des béninois avec les autres populations

Nous avons comparé nos résultats avec ceux d’autres races en occurrences celui de l’ethnie Li de Hainan en Chine (Wu et al., 2010), celui des Anglais (Pasdar et al., 2006) et celui des Américains (Koustubh et al., 2005) (voir Tableau III).

Tableau III : Comparaison de la distribution du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 dans la population Béninoise avec les autres populations

Populations Effectifs Génotypes Phénotypes A/A G/G A/G A G Béninoise 84 0,952 0,000 0,048 0,976 0,024 Minorité Li Chinoise 150 0,580^*** 0,080^** 0,340^*** 0,750^*** 0,250^***

Anglaise 450 - - - 0,520^*** 0,480^***

Américaine 2338 0,219^*** 0,295^*** 0,486^*** 0,462^*** 0,538^***

(**)Il y a une différence très significative, (***) et une différence hautement significative entre la distribution du polymorphisme Ala99Ala de paraoxonase 3 dans la population béninoise étudiée et les autres populations précédemment analysées (P<0,01)

IV. DISCUSSION

La présente étude nous a permis d’examiner la distribution du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 dans la population béninoise étudiée. En utilisant la digestion enzymatique, par l’enzyme de restriction HhaI, nous avons pu identifier deux allèles de ce gène dans notre population. Le premier nommé A est majoritaire avec un seul site de restriction sur la séquence amplifiée et libère deux fragments de longueurs 22pb et 175pb après digestion. Le second nommé G est rare et possède deux sites de restriction sur la séquence amplifiée, qui après digestion libère trois fragments de longueur 22pb, 63pb et 112pb.

Nous avons obtenu deux génotypes, la forme A/A et la forme A/G. les individus homozygotes A/A sont majoritaires avec une forte fréquence de 95,24% tandis que les hétérozygotes A/G sont rare avec une fréquence de 4,76%. Quant aux individus homozygotes de type G/G, ils sont absents dans notre population d’étude.

Par ailleurs, il faut noter que ce même polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 a été étudié dans d’autres races ; en occurrences l’ethnie Li de Hainan en Chine (Wu et al., 2010), les Anglais (Pasdar et al., 2006) et les Américains (Koustubh et al., 2005).

L’absence d’individus homozygotes G/G dans notre échantillon contrairement aux travaux précités, ne signifie pas que ce génotype n’existe pas dans la population béninoise.

Car les individus hétérozygotes A/G observés sont issus probablement du mariage de ces derniers (G/G) avec les homozygotes A/A. On peut ajouter que la faible fréquence des individus hétérozygote A/G confirme la rareté des homozygotes G/G. De plus le sondage aléatoire simple utilisépour la collecte de nos échantillons pourrait influencer la distribution de ces génotypes. Autrement dit une étude sur un plus grand effectif en utilisant un sondage aléatoire stratifié dans plusieurs localités du Bénin permettrait d’affiner cette distribution.

En 2010, Wu et collaborateurs ont obtenu respectivement 0,58 de génotypes AA; 0,08 de génotype GG et 0,34 de génotype AG avec 0,75 de phénotype A et 0,25 de phénotype G dans l’ethnie Li de Hainan en Chine. On constate dans l’ethnie Li que la proportion d’individus homozygotes G/G est également faible. Ce qui rapproche l’ethnie Li des Chinois à la population Béninoise. Mais l’ensemble de la distribution est différente de celle des Béninois.

Chez les Anglais en 2006, Pasdar et collaborateurs ont observés 0,52 de phénotype A et 0,48 de phénotype G. Ces phénotypes sont significativement différents de celui des

Béninois. Mais on pourrait attribuer cet écart à la population d’étude qui est choisie sur la base d’un certain nombre de critères tel que le profil lipidique, le diabète, l’hypertension artérielle et autres. Cette spécificité dans le choix de la population d’étude n’est pas la même que celle de la population béninoise étudiée et celle des Anglais. Ce qui justifie une nette différence dans la distribution du polymorphisme Ala99Ala de PON3.

Chez les Américains Koustubh et collaborateurs en 2005 ont remarqué une forte fréquence des individus homozygotes G/G. Ce qui est contraire au sein des populations Béninoise et Chinoise où l’allèle G est rare. Koustubh Ranade a travaillé sur les sujets de

« American Heart Association » cela pourrait justifier l’effectif très élevé des individus homozygotes G/G. De plus il s’agit d’une population constitué de personnes âgées dont le risque de développer les maladies cardiovasculaires est élevé. Ces différents paramètres affectent la distribution du polymorphisme Ala99Ala de PON3 dans cette population. Ce qui justifie cette différence entre la population Américaine et celle Béninoise.

Au total, la distribution du polymorphisme Ala99Ala de paraoxonase 3 varie d’une population à une autre. Cette différence est statistiquement significative et dépend non seulement des critères de choix de la population d’étude mais aussi et surtout de la mise en compte des autres facteurs de risque.

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

CONCLUSION

L’analyse du polymorphisme Ala99Ala du gène paraoxonase 3 nous a permis d’identifier deux allèles dans la population béninoise dont les fréquences sont 97.62% de A et 2.38% de G. Il y a une différence significative de la distribution de ce polymorphisme entre la population béninoise et celle de certaines autres races étudiées (p<0,01). Cette distribution pourrait servir de base pour explorer l’implication du polymorphisme du gène paraoxonase 3 dans le développement des diverses pathologies telles que les maladies cardiovasculaires.

SUGGESTIONS

Pour mieux comprendre l’impact du polymorphisme Ala99Ala de paraoxonase 3 dans notre milieu, nous suggérons de :

- Poursuivre ce travail sur un échantillon plus large afin de couvrir d’éventuelles autres formes existantes de ce gène.

- Faire une étude cas témoins pour mieux appréhender le rôle de chaque forme de ce gène dans la survenue des maladies cardiovasculaires.

- Etudier les causes de ce polymorphisme pour réduire considérablement les conséquences

- Ali, A.B., Zhang, Q., Lim, Y.K., Fang, D., Retnam, L., 2003. Expression of major HDL associated antioxidant PON-1 is gender and regulated during inflammation, Free Rad Bio & Med, 34, 824-829.

- Altındağ, O., Karakoc, M., Soran, N., Çelik, H., Çelik, N., Selek, Ş., 2007.

Paraoxonase and arylesterase activities in patients with rheumatoid artritis, Turkish Journal of Rheumatology, 22 (4), 132-136.

- Aviram, M., 1999. Does paraoxonase play a role in susceptibility to cardiovascular disease, Mol Med Tod, 5, 381-386.

- Aviram, M., Rosenblat, M., 2004. Paraoxonases 1, 2, and 3, oxidative stress, and macrophage foam cell formation during atherosclerosis development. Free Radical Biology & Medicine, 37, 1304–1316

- Aviram, M., Rosenblat, M., Bisgair, C.L., 1998. Paraoxonase inhibits high density lipoprotein (HDL) oxidation and preserves its functions: a possible peroxidative role for paraoxonase, J Clin Invest, 101, 1581-1590.

- Azarsız, E., Sözmen, E.Y., 2000. Paraoksonaz ve klinik önemi, Türk Biyokimya Dergisi, 25 (3), 109-119.

- Başkol, G., Köse, K., 2004. Paraoksanase: Biyokimyasal özellikleri, fonksiyonları ve klinik önemi, Erciyes Medical Journal, 26 (2), 75-80.

- Bayrak, T., Bayrak, A., Demirpençe, E., Kılınç, K., 2005. Yeni bir kardiyovasküler belirteç adayı: Paraoksonaz, Hacettepe Medical Journal, 36,147-151.

- Biasioli, S., Schiavon, R., Petrosino, L., De Fanti, E., Cavalcanti, G., 2003.

Paraoxonase activity and paraoxonase 1 gene polymorphism in patients with uremia, ASAIO J, 49, 295-299.

- Benoît Labrecque^{a, b}, Danièle Beaudry^a, Marian Mayhue^a, Catherine Hallé^a, Vilceu Bordignon^c, Bruce D. Murphy^b, Molecular characterization and expression analysis of the porcine paraoxonase 3 (pon3) gene. Science Direct Page 110-120. 2009

- Cabana, V.G., Reardon, C.A., Fenf, N., Neath, S., Lukens, J., Getz, G.S., 2003. Serum paraoxonase: effect of the apolipoprotein composition of HDL and the acute phase response, J Lipid Res, 44, 780-792.

- Chait, A., Han, C.Y., Oram, J.F., Heinecke, J.W., 2005. Lipoprotein-associated inflammatory proteins: markers or mediators of cardiovascular disease? J Lipid Res, 46, 389-403.

- Costa L.G., Cole T.B., Furlong C.E., 2003. Polymorphisms of paraoxonase (PON1) and their significance in clinical toxicology of organophosphates. J Toxicol Clin Toxicol, 41(1): 37-45.

- Deakin S, Leviev I, Brulhart-Meynet MC, James RW. Paraoxonase-1 haplotypes du promoteur et la paraoxonase sérique: un rôle prédominant pour polymorphe position 107, impliquant le facteur de transcription Sp1 Biochem Jl 2003; 372 :643-649) - Draganov, D. I., Teiber, J. F., Speelman, A., Osawa, Y., Sunahara, R., La Du, B. N.

Human paraoxonases (PON1, PON2, and PON3) are lactonases with overlapping and distinct substrate specificities. J. Lipid Res. 46: 1239-1247, 2005.

- Ekmekçi Balcı, Ö., Donma, O., Ekmekçi, H., 2004. Paraoxonase, Cerrahpaşa J Med, 35, 78-82.

- Fuhrman, B., Volkova, N., Aviram, M., 2002. Oxidative stress increases the expression of the CD36 scavenger receptor and the cellular uptake of oxidized low- density lipoprotein in macrophages from atherosclerotic mice: protective role of antioxidants and of paraoxonase, Atherosclerosis, 161, 307-316.

- Gülcü, F., Gürsu, F.M., 2003. Paraoksanaz ve Aril Esteraz Aktivite Ölçümlerinin Standardizasyonu, Türk Biyokimya Dergisi, 28 (2), 45-49.

- Harel M., Brumshtein B., Meged R., 2007. The 3-D structure of serum paraoxonase 1 sheds light on its activity, stability, solubility, and crystallizability. Arh Hig Rada Toksikol, 58: 347-53.

- Hong-Liang, L., De-Pei, L., Chihj-Chuan, L., 2003. Paraoxonase gene polymorphisms, oxidative stress and diseases, J Mol Med, 81, 766-779.

- JM Fauvel

Facteurs de risque cardiovasculaire

- Khersonsky, O., Tawfik, D.S., 2005. Structure-reactivity studies of serum paraoxonase PON-1 suggest that its native activity is lactonase, Biochemistry, 44, 6371-6382.

- Kına, O., 2009. Dirofilaria immitis’li köpeklerde paraoksonaz aktivitesi ve lipid profilinin belirlenmesi, Master Thesis, University of Mustafa Kemal, Hatay, Turkey.

- Koustubh Ranade, PhD; Todd G. Kirchgessner, PhD; Olga A. Iakoubova, PhD; James J. Devlin, PhD; Terrye DelMonte, BS; Priya Vishnupad, BS; Lester Hui, BS; Zenta Tsuchihashi, PhD; Frank M. Sacks, MD; Marc S. Sabatine, MD, MPH; Eugene Braunwald, MD; Thomas J. White, PhD; Peter M. Shaw, PhD; Nicholas C. Dracopoli, PhD Evaluation of the Paraoxonases as Candidate Genes for Stroke : Gln192Arg

Polymorphism in the Paraoxonase 1 Gene Is Associated With Increased Risk of Stroke 2005; 36:2346-2350.

- Laplaud, P. M., Lelubre, A. et Chapman, M. J. (1997). "Antioxidant action of Vaccinium myrtillus extract on human low density lipoproteins in vitro: initial observations." Fundamental & Clinical Pharmacology 11(1): 35-40.

- Li W.F., Costa L.G., Richter R.J., 2000. Catalytic efficiency determines the in vivo efficacy of PON1 for detoxifying organophosphates. Pharmacogenetics; 10: 767-79.

- Lu, H., Zhu, J., Zang, Y., Ze, Y., Qin, J. Cloning, purification, and refolding of human paraoxonase-3 expressed in Escherichia coli and its characterization. Protein Expression Purification 46: 92-99, 2006.

- Mackness, M., Mackness, B., 2004. Paraoxonase 1 and atherosclerosis: is the gene or the protein more important? Free Radic Biol Med, 37, 1317–1323.

- Mackness, M.I., D. Harty, D. Bhatnagar, P.H. Winocour, S. Arrol, M. Ishola, and P.N.

Durrington. 1991. Serum paraoxonase activity in familial hypercholesterolaemia and insulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis. 86:193–199.

- Mackness, M.I., Hallam, S.D., Peard, T., Warner S., Walker, C.H. 1985. The separation of sheep and human serum “A”-esterase activity into the lipoprotein fraction by ultracentrifugation. Comp. Biochem. Physiol., 82B, 675–677.

- Main AR. 1956. The role of A-esterase in the acute toxicity of paraoxon, TEPP and parathion. Can J Biochem Physiol,; 34: 197-216.

- Mathers CD, Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS Med 2006; 3(11):e442.

- Memişoğulları, R., Orhan, N., 2010. Paraoksonaz ve Kanser, Konuralp Medical Journal, 2(2), 22-26.

- Mochizuki, H., Scherer, S. W., Xi, T., Nickle, D. C., Majer, M., Huizenga, J. J., Tsui, L.-C., Prochazka, M. Human PON2 gene at 7q21.3: cloning, multiple mRNA forms, and missense polymorphisms in the coding sequence. Gene 213: 149-157, 1998.

- Primo-Parmo, S. L., Hsu, C., Law, D. J., La Du, B. N. Location and arrangement of three paraoxonase genes: PON1, PON2, and PON3, on human chromosome 7.

(Abstract) Am. J. Hum. Genet. 59 (suppl.): A406, 1996.

- Primo-Parmo, S. L., Sorenson, R. C., Teiber, L., La Du, B. N. The human serum paraoxonase/arylesterase gene (PON1) is one member of multigene family. Genomics 33: 498-507, 1996.

- Reddy, S. T., Wadleigh, D. J., Grijalva, V., Ng, C., Hama, S., Gangopadhyay, A., Shih, D. M., Lusis, A. J., Navab, M., Fogelman, A. M. Human paraoxonase-3 is an HDL-associated enzyme with biological activity similar to paraoxonase-1 protein but is not regulated by oxidized lipids. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21: 542-547, 2001.

- Seres, I., Paragh, G., Deschene, E., Fulop, T., Khalil, A., 2004. Study of factors influencing the decreased HDL associated PON1 activity with aging, Exp. Gerontol, 39, 59-66.

- statistiques 2008 Global atlas on cardiovascular disease prevention and control.

Geneva: WHO; 2011

- Turunç, V., Aşkar, T.K., 2012. The Determination of Oxidative Stress by Paraoxonase Activity, Heat Shock Protein and Lipid Profile Levels in Cattle with Theileriosisi, The Journal of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Kafkas. (In press)

- WU Qiang, LI Lin-jiang, LI Dong-mei, FU Qiong-yao, WU Jie, FAN Zhi-gang, PEI Hua, Qian Shi-yun Polymorphism distribution of paraoxonase 3 gene Ala99Ala in Hainan Li nationality JOURNAL OF HAINAN MEDICAL COLLEGE 2010, 16(11) R596.1

- Yurttagül, K., 2007. Koroner arter hastalarında HDL alt grupları ile paraoksonaz enzim aktivitesi dağılımları, Doctorate thesis, University of Istanbul, Turkey. mları, Doctorate thesis, University of Istanbul, Turkey.

- Zhang Guojun , Wenjin Li , Zhiqiang Li , Hong Lv , Yonghong Ren , Ruimin Ma , Xiaohong Li , Xixiong Kang , Yongyong Shi , et Sun Yimin Association entre gène paraoxonase et d'AVC dans la population chinoise Han BMC Med Genet 2013; 14. : 16.

TABLE DES MATIERES

HOMMAGES RESPECTUEUX ... iv

SOMMAIRE ... v

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX ... vi

RESUME: ... vii

ABSTRACT: ... viii

Liste des sigles et abréviations ... ix

INTRODUCTION ... 1

I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 4

1.1. Historique ... 5

1.2. Les isoenzymes de paraoxonase ... 6

1.3. Structure de la paraoxonase ... 7

1.4. Facteurs influençant l'activité de la paraoxonase ... 9

1.5. Les fonctions de la paraoxonase ... 9

1.5.1 Protéine contre les organophosphorés (activité Hydrolytique) ... 9

1.5.2 Prévention de l'oxydation des LDL (activité anti-athérogène) ... 11

1.6. Rôle de la paraoxonase dans le stress oxydatif ... 11

1.7. Le lien entre l'activité de la paraoxonase et la survenue de diverses pathologies ... 12

1.8. Le gène paraoxonase 3 ... 13

1.8.1 Description du gène paraoxonase 3 ... 14

1.8.2 Localisation du gène paraoxonase 3 ... 14

1.8.3 Fonction du gène paraoxonase 3 ... 15

II. CADRE – MATERIEL ET METHODE ... 17

2.1 CADRE DU TRAVAIL ... 18

2.2 MATERIEL ... 19

2.2.1 Matériel et appareils... 19

2.2.2 Matériel biologique, Réactifs et solutions ... 19

2.3 METHODOLOGIE ... 20

2.3.1 Collecte des échantillons ... 20

2.3.2 Conservation des échantillons ... 21

2.3.3 Extraction de l’ADN total génomique ... 21

2.3.4 Vérification de l’ADN total génomique ... 21

III. RESULTATS ET COMMENTAIRES ... 25