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REVUE DE SYNTHESE

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Conservation des cellules souches hématopoïétiques à + 4°C en autogreffe : rationnelle d’utilisation et revue de la littérature

Liquid storage of autologous hematopoietic stem cell: foundamental aspect and review

A. Belbachir

, L. Mahmal

, M. Harif

1 Banque des yeux, CHU Mohammed VI, Marrakech

2 Centre d’Onco-Hématologie, CHU Mohammed VI, Marrakech

*

Banque des yeux. CHU Mohammed VI - Marrakech E-mail : anass.belbachir@yahoo.fr

Résumé

L‘utilisation de l’azote pour la conservation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente la technique de référence. Ces dernières années, de nombreuses publications se sont intéressées à la conservation des CSH à + 4°C comme alternative à la congélation pour certaines pathologies. Cette option a soulevé de nombreuses interrogations quant à l’efficacité de cette technique conduisant à la réalisation de différentes études pour répondre à ces interrogations et rechercher les conditions idéales pour une bonne conservation des CSH sans congélation. A l’aide d’une recherche bibliographique approfondie, nous tentons de reprendre les différentes publications traitant du sujet et esquisser les différentes conclusions auxquelles elles ont abouties.

Les résultats retrouvés ont démontré l’efficacité de cette méthode sous réserve du respect de certains paramètres stricts : température de stockage, durée maximale de stockage…

Mots clés :

Introduction

La conservation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente une étape importante du processus de greffe autologue hématopoïétique. Elle est située entre 2 autres étapes non moins importantes à savoir, celle de la collecte des CSH et la réinjection du produit de thérapie cellulaire prélude à la greffe de CSH proprement dite. Elle est pratiquée, de manière conventionnelle, par la congélation en azote (en phase liquide ou vapeur). Elle représente la méthode de référence permettant une très longue durée de survie des CSH [1-3]. Elle nécessite un investissement lourd en matière d’infrastructure, d’approvisionnement en azote et de normes de sécurité [1].

De ce fait, la technique de conservation des CSH sans congélation a été proposée comme une alternative à la congélation [4, 5]. Elle est, de fait, déjà utilisée en situation d’allogreffe [6]. En effet, le centre greffeur n’est pas forcément le centre préleveur, surtout dans les situations de donneurs non-apparentés [6]. De plus, l’objectif de greffe en cellules CD34 positives n’est pas toujours atteint lors de la première séance. Une deuxième séance est assez souvent nécessaire; ce qui engendre pour le premier prélèvement un délai d’attente de 24 heures [6]. La conservation de ce greffon à + 4°C en attente du second prélèvement est la règle [6, 7]. De manière générale, le laps de temps entre la collecte du premier prélèvement et l’injection du greffon ne doit pas excéder 48 heures [3, 7, 8].

Mais en situation d’autogreffe, la conservation à

+ 4°C ne fait pas l’unanimité. En effet, son utilisation de façon routinière s’est retrouvée confrontée à plusieurs écueils : la nécessité d’utiliser des protocoles de chimiothérapie particuliers avec une demi vie courte et sur une courte période n’excédant pas les 3 jours [2, 5]. Par ailleurs, il a fallu répondre à certaines interrogations essentielles dont la faisabilité / efficacité de cette technique, la température et la durée idéale de conservation.

De nombreuses études ont essayé d’y répondre. Nous nous proposons de faire une revue de la littérature traitant de ce sujet dans le but de mettre l’accent sur cette méthode peu couteuse de conservation des CSH, de démontrer son efficacité et son innocuité lorsque les conditions optimales d’utilisation sont respectées (durée de conservation, température de stockage…).

Méthodes

Pour répondre aux différentes questions que posent la conservation sans congélation des CSH en situation autologue, nous avons procédé à une revue de littérature en utilisant la base de données PUBMED à la recherche des publications pertinentes, en langue anglaise et française, traitant du sujet. Les principaux mots clefs recherchés furent : conservation des cellules souches hématopoïétiques, non-cryopreserved stem cell et liquid storage.

Abstract

The use of nitrogen represents the « gold standard » in term of preservation of hematopoietic stem cell. Recently, many authors explored a non-cryopreserved way to store hematopoietic stem cells for several days. This method seems within the reach of medical structures.

A systemic review of this issue has been performed in order to evaluate the efficiency of this technique and assess the optimal conditions for a safe conservation without exposing the product to unnecessary risk.

The liquid storage turn out to be a safe method to preserve hematopoietic stem cells provided that some recommendations are respected, principally, the storage at a refrigerated temperature for, preferably, less than 72 hours and the use of citrate.

Key words :

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Résultats et discussion

Peu d’articles traitent du sujet. La majeure partie représente soit des séries de cas où les auteurs rapportent l’expérience de leur centre en matière de conservation sans congélation des CSH, ou des études comparatives portant sur des éléments bien précis (ex : conservation à + 4°C et à température ambiante).

Un seul essai randomisé a été rapporté. Il portait sur l’effet de la congélation différée des CSH après une conservation à + 4°C comparé à la congélation immédiate. Le tableau I récapitule les principales caractéristiques des publications pertinentes.

Tableau I : Récapitulatif des principales publications abordant la conservation des CSH sans congélation Année Type d’article

Auteurs But de l’étude

Ahmed et al [9]

Carey et al [10]

Köppler et al [11]

Elliott et al [12]

Jestice et al [13]

Preti et al [14]

Beaujean et al [15]

Hechler et al [16]

Burger et al [4]

Ruiz-argüelles et al [17]

Lazarus et al [18]

Papadimitriou et al [19]

Petzer et al [7]

Cuellar-Ambrosi et al [1]

Moroff et al [20]

Thakral et al [8]

Antonenas et al [21]

Donmez et al [2]

Wannesson et al [5]

Kao et al [6]

1991 1991 1991 1994 1994 1994 1996

1996 1999 1999

2000 2000 2000 2004

2004 2005 2006 2007 2007 2011

Etude comparative Séries de cas Séries de cas Survey (questionnaire) Séries de cas Etude comparative Etude comparative

Série de cas Etude comparative Série de cas

Essai randomisé Série de cas Etude comparative Série de cas

Etude comparative Série de cas Etude comparative Etude comparative Revue de la littérature Etude comparative

Comparaison entre produits congelés avec les produits conservés à + 4°C

Evaluer la faisabilité et l’innocuité du conditionnement et de la conservation sans congélation des CSH Evaluer la faisabilité et l’innocuité du conditionnement et de la conservation sans congélation des CSH Identification des pratiques en matière de prélèvement, transformation et stockage des CSH Evaluer la faisabilité et l’innocuité du conditionnement et de la conservation sans congélation des CSH Comparaison entre produits congelés avec les produits conservés à + 4°C

Evaluer la qualité des produits dont la congélation a été différée de 24h après une conservation à + 4°C et + 22°C

Evaluer l’effet de la durée de stockage à +4°C sur les CSH Etude de différents milieux de conservation

Evaluer la faisabilité et l’innocuité de la conservation sans congélation des CSH par analyse des résultats du centre.

Comparaison entre produits immédiatement congelés avec les produits dont la congélation a été différée Evaluer la technique de conservation à +4°C après une séance unique prolongée d’aphérèse

Etude de l’effet de la température et de la durée de stockage sur les CSH

Evaluer la faisabilité et l’innocuité de la conservation sans congélation des CSH par analyse des résultats du centre.

Etude de l’effet de la durée de stockage et possibilité de stockage à + 4°C jusqu’à 3 jours avant congélation Etude de l’effet de la durée de stockage à +4°C

Evaluer l’effet des différentes températures de stockage sur les CSH

Comparaison entre produits immédiatement congelés avec les produits dont la congélation a été différée Evaluer la faisabilité et l’innocuité de la conservation sans congélation des CSH

Etude de l’effet de la température, durée de stockage et des différents anticoagulants sur les CSH

Certaines difficultés ont été rencontrées lors de l’analyse des différentes publications. D’abord, le faible nombre de cas rapportés dans certaines études (6 à 9 cas). Ensuite, la méthodologie adoptée par les auteurs était souvent différente (utilisation de poches ou d’aliquot, CSH utilisée cliniquement ou seulement in vitro, milieu de conservation différent…).

Enfin, pour certains auteurs, la conservation à + 4°C n’a été utilisée que comme étape intermédiaire pour une durée de 24 h avant la congélation des CSH.

La faisabilité et l’efficacité de la technique

Pour répondre à ces questions, les différents auteurs se sont basés sur l’analyse de la viabilité des cellules souches, le nombre de cellules CD34 positives au niveau du prélèvement et les tests fonctionnels de clonogénicité des CSH CFU (étude du nombre de colonies formées après ensemencement et culture d’échantillon issu du produit) [2, 5, 7, 8, 17].

Elles ont toutes conclu que cette conservation s’avérait faisable, sans risque pour le patient lorsque des conditions très strictes concernant la température et la durée de stockage étaient respectées [1, 2, 5, 6, 15-17, 19].

La température de conservation

La majeure partie des études se sont focalisées sur la conservation à température ambiante (18 - 24 °C), à température réfrigérée (2 - 8°C) et dans une moindre mesure à + 37°C [1, 6, 10, 11, 17, 21-23]. Ainsi, Antonenas et al. ont mesuré le taux de mortalité des CSH conservées à ces trois plages de température et ce jusqu’à 72 heures [21]. Le résultat de ce travail est colligé dans le tableau II.

Des données similaires [6, 8] ont pour leur part comparé la viabilité des CSH conservées à + 4°C et + 22°C pendant 72 heures. Elle était de 71,12 % à + 4°C contre 31,12 % à + 22 °C.

Ces données, parmi d’autres, ont démontré que le stockage à + 4°C représente la température idéale pour la conservation des CSH [1, 2, 4, 6-9, 13, 20, 21]. Ces études ont révélé, également, que même à + 4°C, il y avait une diminution linéaire, progressive, de la viabilité et du nombre de cellules [6, 8, 13, 21].

Ces constations ont abouti à la conclusion que la conservation des CSH à + 4°C était possible mais pour une durée limitée.

La durée de stockage

Différentes études ont évalué ce paramètre à la recherche de la période optimale de conservation sans congélation des CSH. Elles se sont étalées sur une période de 1 à 9 jours [1, 2, 8, 9, 13, 14, 16, 19, 20].

Thakral et al. ont rapporté que la viabilité des cellules restait supérieure à 85 % jusqu’à 96 heures après conservation à + 4°C [8]. Heschler et al. ont tenté de tracer sur 8 jours l’évolution de la viabilité des CSH conservées à +4°C. Celle-ci est passée de 90,8 % à J0, à 82,5 % à J4, 79,7 % à J5 pour tomber à 69,5 % à J8. En analysant ces résultats, ils ont conclu que la conservation des CSH à + 4°C était sans risque pour le patient jusqu’à 5 jours (aux alentours de 80 % de viabilité cellulaire) [16].

Preti et al. ont observé la capacité des CSH conservées à + 4°C à donner des colonies érythroïdes BFU et myéloïdes CFU in vitro et l’ont comparé avec les résultats retrouvés à partir des CSH congelées. Ils n’ont observé différence significative (baisse du nombre de colonies) qu’après 5 jours pour les colonies érythroïdes et jusqu'au 9^éme jour pour les colonies myéloïdes [20]. Ces résultats n’ont pas été corroborés par deux autres études qui ont retrouvé une baisse des CFU à 61 % après 72 heures et à 39 % après 96 heures [3, 24, 25].

En règle générale, il est admis que plus le délai de réinjection était court de 24 à 72 h à + 4°C, meilleure était la survie des cellules souches hématopoïétiques [6, 8, 13, 20].

L’utilisation d’anticoagulant

Une étude s’est intéressée à cet élément [6]. Elle a comparé l’effet d’utilisation de 3 combinaisons d’anticoagulant sur le produit : les citrates seules (Acide Citrate Dextrose-A : ACD-A), l’héparine seule Temps de conservation des CSH

72 heures 28 % 43,3 % 100 % 48 heures 19,4 % 30,7 % 100 % 24 heures 9,4 %, 21,9 %, 100 % + 2 à 8°C

+ 18 à 24°C + 37°C Taux de

mortalité cellulaire (%)

Tableau II : Evolution du taux de mortalité des CSH conservées entre + 2 à 8°C, + 18 à 24°C et + 37°C pendant 72 heures [21]

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ou l’association héparine-ACD-A. Cette étude s’est, particulièrement, intéressée au taux d’acide lactique dans le produit après utilisation des anticoagulants.

L’acide lactique étant connu pour être nocif à dose élevée pour les cellules. Il a été démontré que la concentration d’acide lactique était plus basse dans la poche du greffon avec l’ACD-A seul comparé avec l’héparine ou l’association héparine-ACD-A.

L’adjonction d’un milieu de conservation

Une bonne conservation des CSH dépend de plusieurs facteurs dont le pH, le taux d’acide lactique. Afin de garantir le maintien de ces différents facteurs à des taux non dangereux pour les cellules et d’éviter ainsi un stress cellulaire, l’adjonction d’un milieu de conservation a été proposée par certains auteurs [4, 6, 12]. Ce choix était variable selon les institutions: aucun milieu [2], utilisation du plasma autologue [2, 7, 8, 26], du sérum salé [12] voire d’un milieu de conservation (plasmalyte A, RPMI, α–MEM…) [4, 6]. Pour l’heure, il n’y a pas de consensus concernant l’adjonction systématique d’un milieu de conservation au produit de thérapie cellulaire en attente de la greffe.

Rôle de la concentration

cellulaire/volume du produit de thérapie cellulaire

De nombreuses études ont démontré qu’une concentration élevée des globules blancs (supérieure à 300 x 10⁹/l) dans le produit après collecte, surtout à température ambiante, engendre un besoin en oxygène et en glucose et une baisse du pH créant, ainsi, une toxicité cellulaire [2, 6, 7, 26]. Cela se manifeste notamment, par un retard dans la prise de greffe et la sortie d’aplasie pour les polynucléaires neutrophiles et les plaquettes [2]. Dans une étude, cette augmentation de la densité cellulaire au niveau du prélèvement a été corrélée à une perte cellulaire lors de la conservation des CSH à + 4°C [26].

Pour y remédier, une augmentation du volume du milieu de suspension souvent par du plasma autologue à + 4°C a été préconisée par plusieurs études car elle engendre, de fait, une diminution de la concentration des globules blancs [2, 7, 8, 26].

Les prélèvements de moelle osseuse sont moins touchés par ce facteur du fait de l’hémodilution qui se produit lors de la collecte du greffon [6].

Conservation à + 4°C et manipulation sur le greffon

Lazarus et al. se sont intéressés à cette question dans un essai randomisé comparant les CSH congelées immédiatement et celle conservées initialement à + 4°C avant d’être congelées [18]. Ils n’ont pas mis en évidence de différence statistiquement significative en matière de sortie d’aplasie. Cette constatation les a amenés à conclure que la conservation à + 4°C peut s’avérer être une option intéressante dans les situations où plusieurs jours de collecte sont nécessaires. Les différentes poches obtenues peuvent, ainsi être regroupées en une seule poche et diminuer alors le nombre de manipulation du greffon et son coût.

La sortie d’aplasie et conservation à + 4°C

Ahmed et al. ont étudié cet élément [9]. Ils ont objectivé une sortie d’aplasie plus rapide pour les CSH conservées à + 4°C par rapport aux produits congelés (17 jours contre 23 jours pour les globules blancs et 24 jours contre 51 pour les plaquettes).

Les principales indications médicales

Peu de centres de traitement utilisent cette technique de conservation des CSH du fait de la nécessaire adaptation des protocoles thérapeutiques avec l’utilisation de chimiothérapie à demi-vie courte.

La principale indication reste le myélome multiple [1, 5, 8, 17].

Certains auteurs ont élargi les indications potentielles de cette méthode de préservation des CSH aux leucémies aigues lymphoblastique et myéloblastique [1, 17], à la leucémie myéloïde chronique [17], aux lymphomes non hodgkiniens résistants [5, 17], au lymphome de Hodgkin résistant [1, 17], à l’histiocytose langerhansienne [1], au cancer du sein métastatique [1, 17] et aux tumeurs germinales testiculaires [5].

Conclusion

La conservation des cellules souches à + 4°C en situation autologue, bien que moins utilisée par rapport à l’allogreffe du fait des contraintes auxquelles les médecins greffeurs sont confrontés (protocoles thérapeutiques particuliers à demi-vie courte étalés sur une courte période), peut s’avérer être une technique séduisante du fait de son faible coût permettant une "démocratisation de la greffe". La liste des indications possibles ne cesse de croitre avec en chef de file le myélome multiple. Elle permet aussi une conservation provisoire du produit avant congélation dans certaines situations, comme en cas de plusieurs cytaphérèses étalées sur plusieurs jours lorsque les centres préleveur et greffeur sont éloignés, permettant de pooler les différents prélèvements et réduire ainsi le nombre et le coût des manipulations à effectuer.

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