Génotypage de la Dihydropyrimidine déshydrogénase DPYD (4 variations pathogéniques)

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Évaluation pour la mise à jour du Répertoire québécois et système de mesure des procédures de biologie médicale

MARS 2020

AVIS

Une production de^l’Institut national d’excellence en santé

et en services sociaux (INESSS) Direction des services de santé et de l’évaluation des technologies

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Le contenu de cette publication a été rédigé et édité par l’INESSS.

Membres de l’équipe projet Auteure principale

Emmanuelle Tchekanda, Ph. D.

Coordonnateur scientifique Éric Potvin, Ph. D.

Directrice

Michèle de Guise, M.D., FRCPC

Soutien administratif Annabelle Suire

Équipe de l’édition Patricia Labelle Denis Santerre Hélène St-Hilaire

Sous la coordination de Renée Latulippe, M.A.

Avec la collaboration de

Josée De Angelis, révision linguistique

Dépôt légal

Bibliothèque et Archives nationales du Québec, 2020 Bibliothèque et Archives Canada, 2020

ISSN 1915-3104 INESSS (PDF) ISBN 978-2-550-86343-4 (PDF)

La reproduction totale ou partielle de ce document est autorisée à condition que la source soit mentionnée.

Pour citer ce document : Institut national d’excellence en santé et en services sociaux (INESSS).

Génotypage de la Dihydropyrimidine déshydrogénase DPYD (4 variations pathogéniques) Évaluation pour la mise à jour du Répertoire québécois et système de mesure des procédures de biologie médicale. Rapport rédigé par E.Tchekanda. Québec, Qc : INESSS; 2020. 32 p.

L’Institut remercie les membres de son personnel qui ont contribué à l’élaboration du présent document.

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GÉNOTYPAGE DE LA DIHYDROPYRIMIDINE DÉSHYDROGÉNASE DPYD (4 VARIATIONS PATHOGÉNIQUES)

(RÉFÉRENCE – 2016.02.001V)

Avis - validité analytique

1. INFORMATION GÉNÉRALE

1.1. Demandeur : Centre universitaire de santé McGill

Mise en garde

Le présent avis est fondé sur l’information fournie par les personnes responsables de l’analyse dans les laboratoires concernés ainsi que sur une recherche documentaire complémentaire selon les données disponibles au moment de l’évaluation de l’analyse par l’INESSS.

Conflits d’intérêts

Le D^r David Rosenblatt n’a pas participé aux délibérations et à la formulation de la recommandation.

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2. INTRODUCTION

L’avis se rapportant au génotypage de la mutation DPYD*2A du gène responsable de la synthèse de la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPYD) a été publié après transmission au ministre de la Santé et des Services sociaux le 17 février 2017.

L’objectif était d’évaluer l’utilité d’introduire cette analyse dans le Répertoire québécois et système de mesure des procédures de biologie médicale, ci-après nommé Répertoire, afin de dépister la mutation DPYD*2A chez des patients atteints de cancer et susceptibles de subir des toxicités graves s’ils reçoivent des fluoropyrimidines en guise de traitement.

L’avis d’évaluation a été soumis au comité scientifique des analyses de biologie médicale de l’INESSS qui a émis la recommandation d’introduire l’analyse au Répertoire accompagnée des quatre précisions suivantes :

• Les membres du comité reconnaissent la valeur pronostique et thérapeutique du test au regard des données cliniques publiées et présentées en appui.

• L’utilisation d’un plus grand nombre d’échantillons est nécessaire avant la mise en application du test.

• L’accès rapide aux résultats constitue un enjeu important pour cette analyse.

• L’analyse des autres variantes défectueuses de la DPYD devrait être considérée.

Dans l’avis portant sur les meilleures stratégies pour réduire le risque de toxicités sévères causées par une déficience en dihydropyrimidine déshydrogénase, publié en mars 2019, l’INESSS recommande que le génotypage de quatre allèles

consensuels de DPYD soit intégré dans la planification des traitements à base de fluoropyrimidines [INESSS, 2019]. Le présent avis est produit dans le contexte de la phase II d’une désignation complémentaire du laboratoire demandeur pour le génotypage des variantes génétiques DPYD*2A, c.2846A>T, c.1679T>G et c.1236G>A du gène DPYD.

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3. RÉSUMÉ DE L’ÉVALUATION PRÉCÉDENTE

Un survol de l’évaluation menée en phase I par l’INESSS est présenté dans le tableau 1.

Tableau 1 Résumé exécutif de l’évaluation de l’utilité clinique en phase I Génotypage de la variation DPYD*2A du gène de la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPYD) par PCR en

temps réel Demandeur

original CHUM Objectif de

l’analyse

L’analyse visait à discriminer les patients susceptibles de développer des toxicités aigües lors d’un traitement à base de fluoropyrimidines en détectant la présence de la mutation DPYD*2A chez les patients atteints de cancers digestifs, du sein, de la tête ou du cou.

Utilité clinique

Parmi les porteurs de l’allèle DPYD*2A traités à base de

fluoropyrimidines, le risque d’expérimenter une toxicité générale grades

≥ 3 a été estimé à au moins 5 fois plus élevé que celui des non-porteurs.

La stratification par type de toxicité grades ≥ 3 met en évidence, chez les porteurs de l’allèle DPYD*2A, un risque plus élevé : de toxicité

hématologique, de mucites et de diarrhées, équivalent à respectivement 15,8 ; 7,5 ; et 5,5 fois plus que celui des non-porteurs.

L’incidence d’une toxicité de grades ≥ 3 aux fluoropyrimidines a été réduite de 73 %, dans une cohorte non soumise au génotypage de l’allèle DPYD*2A, à 28 % dans la cohorte ayant été au préalable testée avant le traitement. Par ailleurs, une amélioration de la valeur prédictive positive a été démontrée lorsque les mutations DPYD*2A et 2846A>T sont simultanément recherchées.

Impact budgétaire

Deux scénarios ont été élaborés notamment :

1. Si la détection de la mutation DPYD*2A est effectuée chez tous les patients atteints de cancers colorectal et du sein, les coûts directs liés à l’introduction de cette analyse dans le Répertoire sont estimés à 375 147 $ pour le total des trois prochaines années.

2. Si la détection est effectuée chez les patients atteints de cancer colorectal, de cancer du sein, et ayant des toxicités aigües lors d’un traitement à base de fluoropyrimidines, les coûts pourraient varier de 18 758 $ à 37 515 $ pour le total des trois premières années.

Positions et orientations d’organismes d’intérêt

Certains des organismes consultés préconisent une réduction de la dose de traitement; la recherche de plusieurs variantes génétiques de DPYD ou une analyse systématique des patients susceptibles de recevoir les fluoropyrimidines serait donc à envisager.

Enjeux particuliers

Les patients porteurs de l’allèle DPYD*2A sont en moyenne hospitalisés pour une période plus longue pour cause de toxicité (18 jours), alors que ce n’est pas le cas pour les non-porteurs (2,5 jours). Toutefois, l’efficacité du traitement pourrait être altérée.

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4. ANALYSE ÉVALUÉE

4.1. Description de la méthode

L’analyse vise à déterminer la présence des variantes génétiques c.1905+1G>A [*2A], c.2846A>T, c.1679T>G et c.1236G>A à transmission autosomique

dominante dans l’ADN génomique extrait d’un échantillon de sang du patient atteint de cancer. La détection qualitative de ces mutations s’effectue par une réaction en chaîne par polymérase en temps réel, à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques aux variantes c.1905+1G>A, c.2846A>T, c.1679T>G et c.1236G>A du gène DPYD.

La PCR en temps réel repose sur la détection et la quantification d’un émetteur fluorescent pendant le processus d’amplification. Le demandeur utilise pour ce faire une sonde TaqMan^MC spécifique à la mutation analysée. La technologie TaqMan^MC est basée sur l’activité 5’-exonucléase de la Taq polymérase lors de la transcription du brin complémentaire (Figure 1). La sonde contient deux fluorochromes, dont un émetteur et un suppresseur. Lorsqu’ils sont à proximité l’un de l’autre, le

fluorochrome émetteur transfert son énergie au fluorochrome suppresseur, qui la dissipe sous forme de chaleur au lieu d’émettre la fluorescence. Par la suite, durant l’étape d’hybridation de la PCR, la sonde et les amorces se fixent à leurs séquences complémentaires respectives et déterminent ainsi la spécificité du produit amplifié.

L’étape d’élongation subséquente se caractérise par la synthèse d’un nouveau brin d’ADN catalysée par la Taq polymérase dont l’activité 5’-exonucléase déplace la sonde le long du brin d’ADN à copier qui est hydrolysée pour chaque molécule d’ADN synthétisée. Le fluorochrome est ainsi libéré de l’action du suppresseur et émet de la fluorescence. L’intensité de la fluorescence est directement

proportionnelle à la quantité de produit amplifié (amplicons) au cours de la réaction [Poitras et Houde, 2002].

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Figure 1 Principe de la technologie TaqMan^MC lors d’une PCR en temps réel

Source : adaptée de Poitras et Houde [2002]. La figure est à titre informatif seulement et peut ne pas nécessairement représenter l’approche exacte employée par le laboratoire demandeur.

4.2. Homologation

Il s’agit d’une analyse maison développée par le laboratoire central de diagnostic moléculaire du CUSM, en utilisant un test de génotypage de type TaqMan^MCMGB probes, Applied Biosystems non homologué par Santé Canada ou la FDA.

4.3. Valeur pondérée : 36,0

4.4. Participation à un contrôle de qualité externe

Le demandeur prévoit participer à des contrôles de la qualité externes, notamment le programme EQA « proficiency testing program » du College of American

Pathologists (CAP), qui consiste à effectuer deux envois annuels de trois échantillons de 25 µg d’ADN par an. Le laboratoire demandeur participera à ce programme dès l’automne 2019.

5. DONNÉES DE VALIDITÉ ANALYTIQUE

5.1. Données fournies par le demandeur

Actuellement, le laboratoire demandeur a été désigné pour le génotypage des quatre variantes du gène DPYD, une analyse qui sera effectuée à partir d’un seul et même échantillon du patient. Les résultats issus de la détection seront contenus dans un même rapport délivré au médecin pour interprétation. Le demandeur prévoit réaliser 40 analyses par semaine. Dans son plan de validation, le

demandeur mentionne entre autres références consultées, le document Z316.8-18 (CSA Guideline), relativement aux exigences concernant la conception, le

Dénaturation

Hybridation

Élongation

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développement et la validation d’essais conçus en laboratoire pour le dépistage, le diagnostic et la gestion des conditions cliniques.

5.2. Paramètres de performance évalués par le demandeur

L’objectif principal de la validation était d’évaluer les performances caractéristiques du génotypage du gène DPYD avant son implantation comme méthode de routine de diagnostic moléculaire. Les paramètres de performance qui ont été évalués étaient notamment :

• La détection des quatre variantes à partir de contrôles hétérozygotes naturels à l’aide de la technologie TaqMan^MC (validation primaire);

• La sensibilité et la spécificité évaluées en comparant la méthode de génotypage par TaqMan^MC au séquençage selon la méthode de Sanger;

• La répétabilité (évaluation de la précision);

• La reproductibilité (évaluation de la précision);

• La robustesse;

• L’établissement de la quantité minimale d’ADN nécessaire à l’obtention de résultats reproductibles.

Un ensemble de 230 échantillons a été analysé pour détecter les quatre variantes du gène DPYD en se servant de la technologie TaqMan^MC, suivi du séquençage de Sanger pour confirmer les résultats obtenus pour quelques-uns des

échantillons testés. De plus, 20 échantillons préalablement caractérisés à l’aide de la technologie TaqMan^MC ont été reçus du laboratoire moléculaire du CHUS et génotypés à l’aveugle.

5.3. Validation initiale

Quinze échantillons hétérozygotes ont été détectés parmi un total de

230 échantillons génotypés. La qualité moyenne des résultats générés a été déterminée à 98,82 %. Les quatre variantes testées ont été rapportées parmi les échantillons hétérozygotes (tableau 2). Cependant, aucune des variantes n’était représentée sous forme d’homozygotes, corroborant ainsi la faible fréquence de ces allèles au sein de la population.

Tableau 2 Résultats issus de l’analyse des 230 échantillons

NOMBRE dbSNP

MUTATIONS CHANGEMENT D’ACIDE AMINÉ

ÉCHANTILLONS n = 230

QUALITÉ DES RÉSULTATS (%) rs3918290 c.1905+1G>A

[haplotype*2A] - 4 98,8

rs55886062 c.1679T>G

[haplotype*13] p.Ile560Ser 2 98,9

rs67376798 c.2846A>T p.Asp949Val 4 98,6

rs56038477

c.1236G>A** p.Glu412 5 98,6

Négatifs - 215 98,8

** Cette variante est reliée à la mutation c.1129-5923C>G [haplotype HapB3]

Abréviations : dbSNP : de l’anglais “ Database for Single Nucleotide Polymorphism’

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5.4. Sensibilité et spécificité

Un ensemble d’échantillons ayant été au préalable analysé en employant la technologie TaqMan^MC ont été ensuite caractérisés par séquençage Sanger à des fins de comparaison. Un total de 35 échantillons séquencés par la méthode Sanger a révélé 15 hétérozygotes et 20 négatifs (figure 2). Deux régions de la variante c.1236G>A ont été séquencés démontrant que cette variante est un proxy de la variante c.1129-2-5923C>G également connu comme l’haplotype HapB3 (figure 2). Toutefois, seuls les résultats obtenus pour la variante c.1236G>A ont été retenus pour comparaison entre les deux méthodes.

La sensibilité et la spécificité ont été évaluées à partir d’un tableau 2 x 2 en accord avec les recommandations du protocole EP12-A2 pour approbation de nouvelles méthodes de diagnostic, comme suit :

• Sensibilité = vrai positif / (vrai positif + faux négatif)

• Spécificité = vrai négatif / (vrai négatif + faux positif)

• Exactitude = (vrai positif = vrai négatif) / (vrai positif + faux négatif + vrai négatif + faux positif)

Figure 2 Représentation des différentes variantes du gène DPYD après le séquençage Sanger.

R : références; H : hétérozygotes. Le panel d. témoigne de la proximité entre les mutations c.1236G>A et c.1129- 5923C>G localisées sur le même chromosome.

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Aucune discordance n’a été rapportée entre les résultats issus de l’analyse TaqMan^MC, et ceux du séquençage Sanger (tableau 3). Une sensibilité de 100 % (IC 95 %, 78,2 - 100), une spécificité de 100 % (IC 95 %, 83,16 - 100 %) et une exactitude de 100 % (IC 95 %, 90 - 100 %) ont été rapportées par les deux méthodes comparées.

Tableau 3 Détection des variantes du gène DPYD par séquençage Sanger MUTATION CHANGEMENT

D’ACIDE AMINÉ

NOMBRE D’ÉCHANTILLON

S ÉVALUÉS*

NOMBRE D’ÉCHANTILLONS

PORTANT UNE MUTATION

VRAI POS.

FAUX NÉG.

FAUX POS.

VRAI NÉG.

c.1905+1G>A - 35 4 4 0 0 31

c.1679T>G p.Ile560Ser 35 2 2 0 0 33

c.2846A>T p.Asp949Val 35 4 4 0 0 31

c.1236G>A* p.Glu412 35 5 5 0 0 30

Total 140* 15 15 0 0 125

* Ces échantillons ont été analysés par TaqMan^MC et 140 positions ont été séquencées.

Nég. : négatif; Pos. : positif; Répétabilité et seuil de détection

5.5. Précision intermédiaire

La précision intermédiaire a été définie comme étant la stabilité du test malgré toute variabilité entre les lots de réactifs, les micropipettes ou système de pipetage automatique et les techniciens. Les quatre variantes ont été recherchées dans un total de 16 échantillons (9 hétérozygotes et 7 homozygotes pour l’allèle de

référence) par deux techniciens, qui utilisaient des lots différents de réactifs, et des micropipettes ou système de pipetage automatique différents. Tous les résultats générés par les techniciens avaient une concordance de 100 % dans l’analyse des échantillons. La qualité des résultats obtenus correspondait aux intervalles

d’attentes (tableau 4).

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Tableau 4 Précision intermédiaire de la technologie TaqMan^MC pour les variantes de DPYD

SPÉCIMEN NOM DU TEST

TECHNICIEN 1 TECHNICIEN 2 QUALITÉ

(MOYENNE) QUALITÉ

(%)

GÉNOTYPE QUALITÉ (%)

GÉNOTYPE

S1 DPYD-1905 97,928 Hmz C/C 97,928 Hmz C/C 97,928

DPYD-1679 97,986 Hmz A/A 97,986 Hmz A/A 97,986 DPYD-2846 97,928 Hmz T/T 97,928 Hmz T/T 97,928 DPYD-1236 97,928 Htz G/A 97,928 Htz G/A 97,928

DPYD-1679 97,986 Hmz A/A 98,886 Hmz A/A 98,436 DPYD-2846 97,928 Htz A/T 98,886 Htz A/T 98,407 DPYD-1236 97,928 Hmz G/G 98,886 Hmz G/G 98,407

S3 DPYD-1905 97,928 Htz C/T 98,886 Htz C/T 98,407

DPYD-1679 97,986 Hmz A/A 98,886 Hmz A/A 98,436 DPYD-2846 97,928 Hmz T/T 98,886 Hmz T/T 98,407 DPYD-1236 97,928 Hmz G/G 98,886 Hmz G/G 98,407

DPYD-1679 97,986 Htz A/C 98,886 Htz A/C 98,436 DPYD-2846 97,928 Hmz T/T 98,886 Hmz T/T 98,407 DPYD-1236 97,928 Hmz G/G 98,886 Hmz G/G 98,407

DPYD-1679 97,986 Hmz A/A 98,886 Hmz A/A 98,436 DPYD-2846 97,928 Hmz T/T 98,886 Hmz T/T 98,407

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SPÉCIMEN NOM DU TEST

TECHNICIEN 1 TECHNICIEN 2 QUALITÉ

(MOYENNE) QUALITÉ

(%)

GÉNOTYPE

DPYD-1236 97,928 Hmz G/G 98,886 Hmz G/G 98,407

DPYD-1679 97,986 Hmz A/A 98,886 Hmz A/A 98,436 DPYD-2846 97,928 Hmz T/T 98,886 Hmz T/T 98,407 DPYD-1236 97,928 Htz G/A 98,886 Htz G/A 98,407 Abréviations : Hmz : Homozygote; Htz : Hétérozygote; S : spécimen

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5.6. Précision - Répétabilité

La répétabilité a été évaluée en déterminant les génotypes de 5 hétérozygotes et 5 homozygotes pour chacune des quatre variantes. L’analyse des échantillons a été effectuée en trois jours différents. Les résultats issus de l’analyse des

10 échantillons sur trois jours distincts avaient une concordance de 100 % à l’exception du dixième spécimen à partir duquel la variante DPYD c.1679T>G n’a pu être amplifiée. Cette discordance a été attribuée à une erreur spécifique survenue pendant la PCR, et non à la performance de l’analyse. Les résultats de l’évaluation de la répétabilité sont résumés dans le tableau 5.

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Tableau 5 Démonstration de la répétabilité SPÉCIMEN NOM DU

TEST

JOUR 1 JOUR 2 JOUR 3 ÉCART-

TYPE QUALITÉ

(%)

GÉNOTYPE

S1 DPYD-1905 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 0

DPYD-1679 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,244 Hmz A/A 0,08 DPYD-2846 97,382 Hmz T/T 97,503 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Htz G/A 97,382 Htz G/A 97,382 Htz G/A 0,00

S2 DPYD-1905 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 0,00

DPYD-1679 97,382 Htz A/C 97,382 Htz A/C 97,244 Htz A/C 0,08 DPYD-2846 97,382 Hmz T/T 97,503 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 0,00

S3 DPYD-1905 97,382 Htz C/T 97,382 Htz C/T 97,382 Htz C/T 0,00

DPYD-1679 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,244 Hmz A/A 0,08 DPYD-2846 97,382 Hmz T/T 97,503 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 0,00

DPYD-1679 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,244 Hmz A/A 0,08 DPYD-2846 97,382 Htz A/T 97,503 Htz A/T 97,382 Htz A/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 0,00

DPYD-1679 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,244 Hmz A/A 0,08 DPYD-2846 97,382 Hmt T/T 97,503 Hmt T/T 97,382 Hmt T/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 0,00

DPYD-1679 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 0 n. d. -

DPYD-2846 97,382 Hmz T/T 97,503 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 0,07 DPYD-1236 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 0,00 Abréviations : Hmz : Homozygote; Htz : Hétérozygote; n.d. : non déterminé; S : Spécimen

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5.7. Précision - Reproductibilité

La reproductibilité a été évaluée en déterminant le génotype d’échantillons qui avaient été au préalable testé dans un laboratoire du CIUSSS de l’Estrie - Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke (CHUS) par la technologie TaqMan^MC. Tous les vingt échantillons ont été testés à l’aveugle, dont 10 échantillons étaient hétérozygotes pour au moins une des quatre variantes ciblées, et 10 échantillons étaient négatifs.

Aucune différence n’a été observée entre les résultats recueillis dans le laboratoire du demandeur et ceux du CHUS. Aucun échantillon portant la variante DPYD c.1679T>G n’a été détecté (tableau 6).

Tableau 6 Reproductibilité des résultats entre le CUSM et le CHUS MUTATION DE

cDNA

ÉCHANTILLONS TESTÉS

RÉSULTATS DU CUSM

RÉSULTATS DU CHUS

CONCORDANCE (%) c.1905+1G>A 6 Hétérozygote Hétérozygote 100

c.1679T>G 0 0 0 0

c.2846A>T 2 Hétérozygotes Hétérozygotes 100 c.1236G>A 2 Hétérozygotes Hétérozygotes 100

Aucune 10 Homozygotes Homozygotes 100

Abréviations : CUSM : Centre Universitaire de santé McGill; CHUS : Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke.

5.8. Robustesse de la détection des quatre variantes du gène DPYD par la technologie TaqMan

^MC

La robustesse permet de mesurer l’habileté d’un test analytique à demeurer non affecté, lorsque de petites variations dans les paramètres de la méthode

surviennent. Elle donne un indice sur la fidélité de l’analyse pendant son utilisation.

La robustesse de la technologie TaqMan^MC a été évaluée en analysant

10 échantillons dont 5 hétérozygotes et 5 homozygotes avec des variations dans le protocole usuel, incluant :

• La conservation des réactifs TaqMan^MC à 4˚C au lieu de – 20˚C pendant 48 heures.

• Les échantillons dilués d’ADN étaient conservés à la température ambiante pendant une semaine au lieu de 4˚C.

• Les volumes finaux des réactions de PCR contenaient plus ou moins 10 % de variation de volume.

Aucune différence n’a été observée dans le génotypage des 10 échantillons testés, démontrant ainsi la capacité du test à tolérer des variations dans le protocole sans toutefois affecter la qualité des résultats présentés dans le tableau 7. De plus, une concordance de 100 % et un écart-type de 0 ont été rapportés.

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Tableau 7 Robustesse de la technologie TaqMan^MC pour la détection des quatre variantes du gène DPYD SPÉCIMEN NOM DU

TEST

Température à 4˚C Température ambiante Volume – 10% Volume + 10%

Qualité (%)

Génotype Qualité (%)

Génotype

S1 DPYD-

1905

97,382 HmzC/C 97,382 HmzC/C 97,382 HmzC/C 97,382 HmzC/C

DPYD- 1679

97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A 97,382 Hmz A/A DPYD-

2846

97,382 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T 97,382 Hmz T/T DPYD-

1236

97,382 Htz G/A 97,382 Htz G/A 97,382 Htz G/A 97,382 Htz G/A

S2 DPYD-

1905

97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C DPYD-

1679

97,382 Htz A/C 97,382 Htz A/C 97,382 Htz A/C 97,382 Htz A/C DPYD-

2846

1236

97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G 97,382 Hmz G/G

S3 DPYD-

1905

97,382 Htz C/T 97,382 Htz C/T 97,382 Htz C/T 97,382 Htz C/T DPYD-

1679

2846

1236

S4 DPYD-

1905

1679

2846

97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T DPYD-

1236

(17)

SPÉCIMEN NOM DU TEST

Qualité (%)

Génotype

S5 DPYD-

1905

1679

2846

97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T 97,382 Htz A/T DPYD-

1236

S6 DPYD-

1905

1679

2846

1236

S7 DPYD-

1905

1679

2846

1236

S8 DPYD-

1905

1679

2846

1236

S9 DPYD-

1905

97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C 97,382 Hmz C/C

(18)

SPÉCIMEN NOM DU TEST

Qualité (%)

Génotype DPYD-

1679

2846

1236

S10 DPYD-

1905

1679

2846

1236

(19)

5.10. Limite de détection d’ADN

La quantité minimale d’ADN nécessaire à l’obtention de résultats reproductibles et précis a été évaluée en utilisant une dilution en série de l’échantillon, commençant à 10 ng d’ADN dans une réaction. Des dilutions allant de 10 ng d’ADN à 0,078 ng d’ADN ont été testées. Deux échantillons ont été utilisés, à savoir un hétérozygote et un homozygote, de l’allèle de référence constitué de la variante c.1905+1G>A.

Le génotype et la qualité des résultats n’ont pas été affectés par une diminution de la quantité d’ADN. Toutes les variantes ont été proprement identifiées par

discrimination allélique, toutefois les résultats obtenus avec la variante c.1905+1G>A sont présentés à titre illustratif dans la figure 3.

Figure 3 Représentation de la discrimination allélique de la variante DPYD c.1905+1G>A détecté par la technologie TaqMan^MC. Les réactifs et les sondes ont été synthétisés pour le brin complémentaire de l’ADN complémentaire.

(20)

6. RÉSUMÉ DE LA DÉLIBÉRATION

Pour ce dossier, le MSSS a demandé au CSABM d’évaluer rapidement les données de validation analytique. Les communications électroniques effectuées entre les membres du CSABM, dont l’expertise leur permet d’apprécier ce type de données, ont servi à élaborer les constats présentés ici ainsi que la

recommandation finale.

Validation analytique et robustesse de la technologie

Les membres du CSABM sont en accord sur le fait que le TaqMan^MC est une procédure répandue en laboratoire clinique et sera réalisée dans un laboratoire dont l’expertise est reconnue en diagnostic moléculaire. Le rapport de validation analytique actuellement présenté a été jugé très bon compte tenu de la rareté des échantillons naturels.

Les quelques points suivants restent à être documentés :

• calculer la sensibilité et la spécificité analytiques pour chaque mutation avec un intervalle de confiance;

• définir comment a été calculé la valeur de qualité de l’appel des bases;

• développer une stratégie pour se prémunir, détecter ou prévenir le drop-out allélique.

Besoin de santé non comblé

L’INESSS a récemment reconnu la pertinence clinique de tester 4 variations pathogéniques du gène DPYD dans le contexte d’une évaluation du risque de toxicité aigüe aux fluoropyrimidines. Les experts du comité rappellent que cette recommandation engendre un contexte de pratique où les prescripteurs sont fortement incités à tester leurs patients avant de donner la chimiothérapie. Du point de vue du décideur, cette situation crée également un sentiment d’urgence d’implantation puisque ce test n’en remplace aucun autre.

Certains experts sont préoccupés par la balance des risques encourus par le patient entre la non-conformité d’un point de vue analytique et les conséquences cliniques de retarder l’accès au test. En effet, le délai d’implantation du service généré par la complétion de la validation analytique retarde l’accès au test pour des patients dont seulement une minorité pourrait souffrir d’une erreur

diagnostique attribuable à la mise en évidence d’une fausse variation pathogénique ou à un faux négatif.

Disponibilité des échantillons

Tous les membres du comité s’entendent sur le fait qu’il semble difficile de se procurer des échantillons positifs. Dans ce contexte, l'utilisation d’échantillons artificiels est nécessaire à court terme lorsqu'il y a rareté d’échantillons naturels porteurs de certains génotypes. Toutefois, il apparait raisonnable de penser que dans un avenir plus ou moins rapproché, le dépistage systématique avant un

(21)

traitement aux fluoropyrimidines permettra de recueillir des échantillons humains homozygotes mutés qui serviront de témoins positifs.

Précaution sur les limites inhérentes à la couverture du test

Une dernière préoccupation concernant la couverture mutationnelle du test

émerge des discussions. Effectivement, le test proposé ne permet pas d’évaluer le risque des personnes originaires de l’Asie de l’Est et une mutation pathogénique majeure propre aux personnes d’origine africaine n’est pas incluse. On rappelle aussi que même avec ce test, 30 à 50 % des toxicités ne sont pas couvertes puisque les mécanismes qui mènent à la toxicité aigüe des fluoropyrimidines sont multiples (microARN, modifications post-transcriptionnelles, etc.). Le rapport devra indiquer que malgré un résultat négatif pour ces 4 variations pathogéniques, un risque résiduel de développer une toxicité sévère aux fluoropyrimidines demeure présent.

(22)

7. RECOMMANDATION DE L’INESSS

GÉNOTYPAGE DE LA DIHYDROPYRIMIDINE DÉSHYDROGÉNASE DPYD (4 VARIATIONS PATHOGÉNIQUES)

La recommandation de l’INESSS

Considérant qu'il s'agit d'une demande de désignation complémentaire pour une analyse dont l’utilité clinique a déjà été reconnue, les données de validation analytique ont été jugées, selon la norme CSA Z316.8-F18 :

☐ Complètes

☒ Incomplètes

Précisions accompagnant la recommandation

• L’INESSS recommande au laboratoire demandeur de compléter les points suivants :

- calculer la sensibilité et la spécificité analytiques pour chaque mutation avec un intervalle de confiance;

- définir comment a été calculée la valeur de qualité de l’appel des bases;

- développer une stratégie pour se prémunir, détecter ou prévenir le drop- out allélique.

• Toutefois, l’INESSS considère que les données sont suffisamment étayées pour que le service soit offert immédiatement et ne demandera pas à revoir ce dossier.

• Le rapport devra indiquer que malgré un résultat négatif pour ces 4 variations, un risque de toxicité sévère aux fluoropyrimidines demeure.

• Il est très important de noter que le test ne reflète pas la diversité ethnique du Québec et doit être utilisé avec précaution.

(23)

ANNEXE A

Résumé des tests de la mise au point technique pour la détection des trois variantes du gène DPYD

DATE DE L’ANALYSE

MUTATION Patients non mutés

Patients hétérozygotes

(Patients hollandais)

Témoins artificiels homozygotes

Témoins de la NASCOLA

Témoins artificiels non mutés

Témoins artificiels hétérozygotes

H2O

Test #1 (20190308)

c.2846A>T 1- 1+(Ht) 1+(Ho) 1 OK

c.1679T>G 1- 1+(Ht) 1+(Ho) 1 OK

c.1236G>A* 2- 2? 2? 2 OK

Test #2

(20190328) c.2846A>T

4-

1+(Ht)

3+(Ho) (1µl, 1/100, 1/10 000)

1Ht, 1WT 1 OK

c.1679T>G

4-

1+(Ht)

3+(Ho) (1µl, 1/100, 1/10 000)

2 WT 1 OK

c.1236G>A*

6-

1?

3???

(1µl, 1/100, 1/10 000)

1 OK

Test #3 (20190404)

c.1236G>A*

4-

1?

6??? (1µl, 1/1 000, 1/10 000 000 )

1 OK

Test #4

(20190411) c.1236G>A**

8-

2+(Ht) 4+(Ho, 1µl, 1/1 000)

1-(NM, 1/1 000)

4+(Ht, 1/1000)

2 OK

Test #5

(20190412) c.1236G>A**

8- 8+(Ho,

1/10 00, 1/10 000)

2-(NM, 1/1 000)

4+(Ht, 1/1000, 1/10 000))

2 OK

Test #6

(20190506) c.2846A>T 6- 1+(Ho,

1/10 000)

1+(Ht, 1/10 000)

1 OK

c.1679T>G 6- 1+(Ho,

1/10 000)

1+(Ht, 1/10 000)

1 OK

c.1236G>A** 6- 1+(Ho,

1/10 000)

1+(Ht, 1/10 000)

1 OK Abréviations : Ho : Homozygote; Ht : Hétérozygote, NASCOLA : North American Specialized

Coagulation Laboratory Association; NM: non mute.

*: Variante artificielle synthétisée par ThermoFisher Scientific

** : Variante artificielle synthétisée par IDT

(24)

Résultat du génotypage par discrimination allélique Test #2 2019-0328

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

Résultat du génotypage de la variante DPYD*2A par discrimination allélique

(30)

Répartition des échantillons à analyser pour le génotypage des quatre variantes du gène DPYD dans une plaque de 96-puits

(31)

Rapport des tests moléculaires pour le génotypage du gène DPYD, produit par le laboratoire demandeur

(32)

ANNEXE B

Données issues du contrôle de la qualité externe

(33)

(34)

RÉFÉRENCES

Institut national d’excellence en santé et en services sociaux (INESSS). Traitements à base de fluoropyrimidines : meilleures stratégies pour réduire le risque de toxicités sévères causées par une déficience en dihydropyrimidine déshydrogénase.

Rapport rédigé par Mélanie Béland. Québec, Qc : INESSS; 2019. Disponible à : https://www.inesss.qc.ca/fileadmin/doc/INESSS/Rapports/Oncologie/INESSS_DP YD_Traitements.pdf.

Poitras E et Houde A. La PCR en temps réel : principes et applications. Reviews in Biology and Biotechnology 2002;2(2):2-11.

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Proc Natl Acad Sci U S A 1977;74(12):5463-7.

(35)