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Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, oxystérols et ORP11 : un trio régulateur du trafic du cholestérol dans les
macrophages
Maud Arnal
To cite this version:
Maud Arnal. Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, oxystérols et ORP11 : un trio régulateur du trafic du cholestérol dans les macrophages. Biochimie [q-bio.BM]. Université Claude Bernard - Lyon I, 2015.
Français. �NNT : 2015LYO10288�. �tel-01462820�
Numéro d’ordre : 288 – 2015 Année 2015
THESE DE L'UNIVERSITE DE LYON Délivrée par
L'UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
ECOLE DOCTORALE INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE
DIPLÔME DE DOCTORAT Discipline : Biochimie
Maud ARNAL-LEVRON
Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, oxystérols et ORP11 : un trio régulateur du trafic du cholestérol dans les macrophages
Thèse codirigée par Isabelle Delton et Céline Costaz Soutenue le 15 décembre 2015
Jury
Madame Canet-Soulas Emmanuelle, PU, Université Claude Bernard Lyon 1 Présidente
Monsieur Antonny Bruno, DR CNRS, Université Nice Sophia Antipolis Rapporteur
Monsieur Lizard Gérard, DR INSERM, Université de Bourgogne Rapporteur
Monsieur Olkkonen Vesa, Docent, Université d’Helsinki, Finlande Examinateur
Madame Delton Isabelle, PU, INSA Lyon Directrice de thèse
Madame Costaz Céline, MC, INSA Lyon Co-directrice de thèse
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université
Vice-président du Conseil d’Administration Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire
Vice-président du Conseil Scientifique Directeur Général des Services
M. François-Noël GILLY
M. le Professeur Hamda BEN HADID M. le Professeur Philippe LALLE M. le Professeur Germain GILLET M. Alain HELLEU
COMPOSANTES SANTE
Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard Faculté de Médecine et de Maïeutique Lyon Sud - Charles Mérieux
Faculté d’Odontologie
Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine
Directeur : M. le Professeur J. ETIENNE Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS Directeur : Mme la Professeure C. VINCIGUERRA Directeur : M. le Professeur Y. MATILLON
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COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Faculté des Sciences et Technologies Département Biologie
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UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives
Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon Polytech Lyon
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Directeur : M. F. DE MARCHI
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Directeur : M. le Professeur C. VITON
Directeur : M. le Professeur A. MOUGNIOTTE
Directeur : M. N. LEBOISNE
RESUME
L’athérosclérose est une complication cardiovasculaire majeure des maladies liées à une augmentation du stress oxydatif, comme le diabète de type 2 et le syndrome métabolique. Dans ces situations, les lipoprotéines de faible densité (LDL) subissent une oxydation et leur forte absorption induit une accumulation de cholestérol dans les macrophages sous-endothéliaux.
D'autre part, les LDL oxydées sont enrichies en produits d'oxydation du cholestérol appelés oxystérols, dont certains sont impliqués dans la capacité des LDL oxydées à induire un stress oxydant cellulaire et une cytotoxicité, principalement par apoptose.
Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP) est un phospholipide unique, localisé préférentiellement dans les endosomes tardifs, compartiment cellulaire clef dans le métabolisme du cholestérol dérivé des LDL. Lors de travaux antérieurs, l’équipe a démontré le rôle prépondérant du BMP dans la régulation de l'homéostasie du cholestérol dans les macrophages.
L’objectif de ce travail a été de décrypter les mécanismes moléculaires intervenant dans le trafic intracellulaire du cholestérol. Ainsi, le BMP régule l’efflux de cholestérol par les HDL (high density lipoproteins) grâce à des mécanismes impliquant les LXRs (liver X receptors) et les transporteurs ABCA1/ABCG1 (ATP binding cassette-type A1/G1). De plus, notre étude indique que le BMP exerce également un rôle protecteur contre l’effet pro-apoptotique des LDL oxydées via la réduction de la production intracellulaire d’oxystérols.
Comme une partie du trafic intracellulaire des stérols au sein des macrophages est régulé
par OSBP (oxysterol binding protein) et ses protéines dérivées, les ORPs (OSBP-related
proteins), nous montrons dans ce rapport que l’action de protection du BMP contre les effets
cytotoxiques des oxystérols est fortement diminuée dans des cellules où la protéine ORP11 est
supprimée, suggérant que le BMP exerce son rôle protecteur via un mécanisme utilisant la
fonction d’ORP11 dans le transport intracellulaire de stérols.
ABSTRACT
Atherosclerosis is a major cardiovascular complication in increased oxidative stress- related diseases such as type 2 diabetes and metabolic syndrome. In these situations, the low density lipoproteins (LDL) undergo oxidation and their high uptake induces cholesterol accumulation in subendothelial macrophages. On the other hand, oxidized LDL are enriched in cholesterol oxidation products called oxysterols, some of them are involved in the ability of oxidized LDL to induce cellular oxidative stress and cytotoxicity, mainly by apoptosis.
Bis(Monoacylglycero)Phosphate (BMP) is a unique phospholipid localized preferentially in late endosomes, a central cellular compartment of LDL-cholesterol metabolism. In previous work, the team demonstrated the leading role of BMP in regulation of cholesterol homeostasis in macrophages. The aim of this work was to characterize the molecular mechanisms involved in the intracellular trafficking of cholesterol. Thus, BMP regulates cholesterol efflux to HDL (high density lipoproteins) by mechanisms involving liver X receptors (LXRs) and ABCA1/ABCG1 (ATP binding cassette-type A1/G1) transporters. Moreover, we report BMP also exerts a protective role against the pro-apoptotic effect of oxidized LDL via a reduced production of intracellular pro-apoptotic oxysterols.
As part of macrophage intracellular sterol traffic is regulated by oxysterol binding protein
(OSBP) and OSBP-related proteins (ORPs), we show that protective action of BMP against
cytotoxic oxysterol effects in ORP11-silenced cells, was markedly abrogated, suggesting BMP
exerts its protective role via a mechanism involving the function of ORP11 in intracellular sterol
transport.
REMERCIEMENTS/ACKNOWLEDGMENTS
Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au laboratoire CarMeN (Cardiovasculaire, Métabolisme, diabétologie et Nutrition) au sein de l’équipe 4, INFOLIP (INgénierie et FOnction des LIpides & lipoProtéines). Ma mobilité doctorale en Finlande a été soutenue par la bourse Explo'RA DOC de la région Rhône-Alpes et par un financement du programme Avenir Lyon Saint-Etienne.
J’aimerais tout d’abord remercier le Dr Hubert Vidal pour m’avoir permis d’effectuer ma thèse au sein du laboratoire CarMeN. Merci également au Pr Michel Lagarde, au Pr Philippe Moulin et au Dr Marie-Caroline Michalski, responsables de l’équipe 4, pour leurs conseils scientifiques tout au long de ce travail. Merci à tous les membres du laboratoire CarMeN pour leur sympathie.
Merci à mes rapporteurs, Dr Gérard Lizard et Dr Bruno Antonny. Je suis vraiment honorée que vous ayez accepté de corriger mon travail. Merci au Pr Emmanuelle Canet-Soulas d’avoir bien voulu présider mon jury de thèse.
Un grand merci à mes formidables directrices de thèse, Isabelle et Céline, sans vous cette thèse n’aurait pas été la même. Vous m’avez permis une grande autonomie sur le plan scientifique en me laissant développer mes idées et accomplir mes projets, notamment partir trois mois en Finlande. Et vous avez toujours été là pour m’accompagner et me conseiller. Cette thèse est une vraie réussite personnelle pour moi et c’est vraiment grâce à vous. Merci également à Françoise pour nos discussions et la relecture de ma partie biblio. Monique, merci pour ton aide en manips et de m’avoir permis de participer à l’aventure de la démarche Qualité !
Vesa, thank you so much for the warm welcome in your lab. On a scientific level, my thesis work
made such an important step forward in Finland, thank you for seeing this project through with
me. I really enjoyed leaving in Finland and discovering this nice country. I will definitely go back
there. Thanks again for agreeing to serve on my thesis committee, it’s a long way and it means a
lot to me.
Manon et Charlotte, au départ colocataires de bureau, vous êtes devenues de véritables amies, merci d’avoir illuminé mes trois années de thèse ! Merci aussi à Jérémie et Huy pour nos discussions et pour les découvertes culinaires ! Merci Yinan pour ton aide précieuse pendant cette thèse.
Merci à mes parents et Flore pour m’avoir toujours soutenue durant ces trois années.
Enfin, merci Damien pour avoir compris que réaliser cette thèse était important pour moi et
d’avoir fait en sorte que tout se déroule bien. Ces trois années ont été, je pense, les plus belles de
notre vie, notre petite Zoé nous le rappelle tous les jours.
LISTE DES PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES
Thèse sur articles
h Article introductif
Luquain-Costaz, C., Lefai, E., Arnal-Levron, M., Markina, D., Sakaï, S., Euthine, V., Makino, A., Guichardant, M., Yamashita, S., Kobayashi, T., et al. (2013).
Bis(monoacylglycero)phosphate accumulation in macrophages induces intracellular cholesterol redistribution, attenuates liver-X receptor/ATP-binding cassette transporter A1/ATP-binding cassette transporter G1 pathway, and impairs cholesterol efflux.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 33, 1803-1811.
h Article 1
Arnal-Levron, M., Chen, Y., Delton-Vandenbroucke, I., and Luquain-Costaz, C. (2013).
Bis(monoacylglycero)phosphate reduces oxysterol formation and apoptosis in macrophages exposed to oxidized LDL. Biochemical Pharmacology 86, 115-121.
h Article 2
Arnal-Levron, M., Chen, Y., Greimel, P., Gaget, K., Calevro, F., Riols, F., Bertrand-Michel, J., Hullin-Matsuda, F., Olkkonen, VM., Delton, I. and Luquain-Costaz, C. (2015).
Bis(monoacylglycero)phosphate regulates OSBP-related protein 11 dependent sterol trafficking. Submitted in Journal of Biological Chemistry.
Article supplémentaire
h Chen, Y., Arnal-Levron, M., Lagarde, M., Moulin, P., Luquain-Costaz, C., and Delton, I.
(2015) THP-1 macrophages oxidize cholesterol, generating 7-derivative oxysterols specially
released by HDL. Steroids 99, 212-8.
LISTE DES COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES
Communications orales
Arnal-Levron, M., Olkkonen, VM, Delton-Vandenbroucke, I., and Luquain-Costaz, C. BMP regulates macrophage oxysterol generation and apoptosis: implication of ORP11.
h 4 th ENOR (European Network for Oxysterol Research) Symposium, 18-19 septembre 2014, Coimbra, Portugal.
h 19ème journée de l’EDISS (Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences Santé), 16 octobre 2014, Lyon, France.
Communications affichées
h Riols, F., Gotti, G., Arnal-Levron, M., Delton, I., Bertrand-Michel, J. Validated Gas Chromatography – Mass Spectrometry Quantitative Method for oxysterols: application on lipoproteins and in pellets and cell supernatant (macrophage). 5 th European Lipidomic Meeting, 2-4 septembre 2015, Swansea, United Kingdom.
h Arnal-Levron, M., Olkkonen, VM, Delton-Vandenbroucke, I., and Luquain-Costaz, C.
Bis(monoacylglycero)phosphate regulates macrophage oxysterol generation and apoptosis:
correlation with ORP11/ORP9. 14ème Journée Scientifique de l'IMBL (Institut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides), 11 Juin 2014, Lyon, France.
h Arnal-Levron, M., Delton-Vandenbroucke, I., and Luquain-Costaz, C. BMP protects from oxidized LDL-induced apoptosis in macrophages. 81 ème congrès de l'EAS (European Atherosclerosis Society), 2-5 Juin 2013, Lyon, France.
h Arnal-Levron, M., Delton-Vandenbroucke, I., and Luquain-Costaz, C. Role of BMP in the
regulation of the apoptotic effect of oxidized LDL in macrophages. 2 nd ENOR Symposium, 20-
21 septembre 2012, Dijon, France.
LISTE DES ABREVIATIONS
7α/β-HC : 7α/β-hydroxycholesterol 7-KC : 7-ketocholesterol
7-OOHC : 7α/β-hydroperoxycholesterol 24-HC : 24S-hydroxycholesterol
24,25-EC : 24(S),25-epoxycholesterol 25-HC : 25-hydroxycholesterol 27-HC : 27-hydroxycholesterol
h A
ABCA : ATP binding cassette-type A ABCG : ATP binding cassette-type G ACAT : acetyl CoA cholesterol acyl transferase
AIF : apoptose induced-factor ANK : ankyrin repeats
Apo : apolipoprotein h B
BHK : baby hamster kidney
BMP : bis(monoacylglycero)phosphate h C
CAD : caspase-activated DNase CCL2 : CC-chemokine ligand 2 CCL5 : CC-chemokine ligand 5 CD36 : cluster of differentiation 36 CE : cholesterol ester
CETP : cholesteryl ester transfer protein CHO : chinese hamster ovary
CL : cardiolipine
CXCL1 : CXC-chemokine ligand 1 h D
DHA : docosahexaenoic acid
DOPG : dioleoyl-phosphatidylglycerol h E
ECV : endosomal carrier vesicles Egr1 : early growth response protein 1 Endo-G : endonuclease G
ER : endoplasmic reticulum
ERC : endocytic recycling compartment
ESCRT : endosomal sorting complex required for transport
h F FFA : free fatty acids
FFAT : two phenylalanines in an acidic tract motif
h G GOLD : golgi dynamics GSH : glutathione
GTP : guanine triphosphate h H
HDL : high density lipoproteins HMG-CoA reductase : 3-hydroxy-3- methylglutaryl reductase
h I
ICAD : inhibitor of caspase-activated DNase ICAM-1 : intercellular adhesion molecule-1 IDL : intermediate density lipoproteins IDOL : inducible degrader of the low-density lipoprotein receptor
IL-1 : interleukine-1 IL-6 : interleukine-6
Insig : insulin induced gene h K
KO : knock-out h L
LAL : lipase acid lysosomal LBPA : lysobisphosphatidic acid
LCAT : lecithine-cholesterol acyltransferase LD : lipid droplet
LDL : low density lipoproteins LE : late endosomes
LH : lipase hepatic
LOX : lectin-like oxidized LDL receptor 1 LPL : LDL receptor related protein
LTP : lipid transfer protein
LXR : liver X receptor h M MAG : monoacylglycerol
MCP1 : monocyte chemoattractant protein 1 MCS : membrane contact site
M-CSF : macrophage colony stimulating factor-1
MLN64 : metastatic lymph node 64 MMP-9 : matrix metallopeptidase-9 MVBs : multivesicular bodies
h N
NADPH : nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NOS : nitric oxide synthase NPC : Niemann-Pick type C NPC1 : Niemann-Pick type C1 NPC1 : Niemann-Pick type C2 NTD : N-terminal domain
h P
PARP : poly(ADP-ribose) polymerase PC : phosphatidylcholine
PC12 : pheochromocytome PCSK9 : proprotein convertase subtilisin/kexin type 9
PE : phosphatidylethanolamine PG : phosphatidylglycerol
PHD : pleckstrin homology domain PI : phosphatidylinositide
PI(4)P : phosphatidylinositol-4-phosphate PIPs : polyphosphoinositides
PLTP : phospholipid transfer protein PM : plasma membrane
PS : phosphatidylserine h O
OF : OSBP-fingerprint motif
ORD : OSBP-related ligand-binding domain ORP : OSBP-related protein
OSBP : oxysterol binding protein OSBPL : OSBP-like protein Osh : OSBP homolog
h R R-LDL : LDL receptors ROS : reactive oxygen species
h S S1P : site 1 protease S2P : site 2 protease
SCAP : SREBP clevage activating protein SM : sphingomyeline
SNARE : soluble N-ethylmaleimide- sensitive-factor attachment protein receptor SR-A1/2 : scavenger receptor class A type 1/2
SR-B1 : scavenger receptor class B type 1 SRE : sterol regulatory element
SREBP : sterol regulatory element binding protein
SREC1 : scavenger expressed by endothelial cells 1
SR-PSOX : scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized LDL SSD : sterol sensing domain
StAR : steroidogenic acute regulatory protein START : StAR-related lipid transfer
h T TG : triglyceride
TGN : trans-Golgi network TM : transmembrane segment TNF-α : tumor necrosis factor
h U U18666A : 3-β-[2-
(diethylaminoethoxy)androst-5-en-17-one]
h V
VAP : VAMP-associated protein
VCAM-1 : vascular cell adhesion molecule-1
VLDL : very low density lipoproteins
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure générale d’une lipoprotéine ... 20
Figure 2 : Structures générales d’un phospholipide (A) et d'un triglycéride (B) ... 21
Figure 3 : Structure du cholestérol libre ... 22
Figure 4 : Conséquences de l’internalisation de LDL dans les cellules mammifères ... 26
Figure 5 : Schéma récapitulatif des trois voies de transport intra-vasculaire des triglycérides et du cholestérol ... 28
Figure 6 : Distribution lipidique dans les différents compartiments cellulaires ... 30
Figure 7 : Endocytose des LDL ... 32
Figure 8 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP ... 33
Figure 9 : Modèle de vésicules d’endosomes tardifs MLN64/ABCA3 et NPC1/ORP1L ... 35
Figure 10 : Représentation schématique de la structure de NPC1 ... 37
Figure 11 : Schéma d’action du senseur STARD4 ... 38
Figure 12 : Représentation schématique de l'athérogenèse ... 40
Figure 13 : Processus d’athérogenèse ... 43
Figure 14 : Origine et formation des oxystérols majeurs ... 47
Figure 15 : Voie de biosynthèse du cholestérol et du 24(S),25-époxycholestérol ... 49
Figure 16 : Orientation membranaire du cholestérol, du 7-KC et du 25-HC ... 50
Figure 17 : Régulation de l’homéostasie du cholestérol ... 52
Figure 18 : Activation de l’apoptose par le 7-KC et le 7β-HC ... 55
Figure 19 : Famille des Osh ... 59
Figure 20 : Structure cristallisée d'Osh4p et de son ligand 25-HC ... 60
Figure 21 : Famille des OSBP-ORPs ... 61
Figure 22 : Complexe modélisé ORP1L/25-HC ... 62
Figure 23 : Transport par Osh6p de la PS du réticulum endoplasmique à la membrane plasmique ... 65
Figure 24 : Modèles des fonctions des ORPs ... 68
Figure 25 : Transport par OSBP du cholestérol du réticulum endoplasmique au trans- Golgi ... 70
Figure 26 : Schéma de la localisation cellulaire probable des ORPs participant au trafic intracellulaire du cholestérol ... 74
Figure 27 : Localisation subcellulaire du BMP (LBPA) dans les macrophages THP1 observée en immunofluorescence ... 76
Figure 28 : Structure du BMP et du PG ... 77
Figure 29 : Accumulation de BMP dans les macrophages RAW après supplémentation en DOPG pendant 24 heures... 83 Figure 30 : Rôle de NPC2 dans la sortie du cholestérol des endosomes tardifs/lysosomes ... 87 Figure 31 : Modèles d'action pour ORP11 ... 138
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Caractéristiques des principales apolipoprotéines ... 23
Tableau 2 : Caractéristiques physicochimiques des lipoprotéines plasmatiques humaines
... 24
SOMMAIRE
RESUME ... 4
ABSTRACT ... 5
REMERCIEMENTS/ACKNOWLEDGMENTS ... 6
LISTE DES PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES ... 8
LISTE DES COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES ... 9
LISTE DES ABREVIATIONS ... 10
LISTE DES FIGURES ... 12
LISTE DES TABLEAUX ... 13
INTRODUCTION GENERALE ... 17
Chapitre I – RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ... 19
A. Métabolisme des lipoprotéines et du cholestérol chez l’Homme ... 19
1. Lipoprotéines ... 19
a. Généralités sur les lipoprotéines ... 19
b. Structure des lipoprotéines ... 19
c. Constituants des lipoprotéines ... 20
i. Glycérolipides ... 20
ii. Cholestérol ... 22
iii. Apolipoprotéines ... 22
d. Classification des lipoprotéines ... 24
e. Métabolisme des lipoprotéines ... 24
i. Voie n°1 : voie d’apport exogène ... 24
ii. Voie n°2 : voie d’apport endogène ... 25
iii. Voie n°3 : voie de retour du cholestérol ... 26
2. Cholestérol ... 28
a. Généralités sur le cholestérol ... 28
b. Distribution cellulaire du cholestérol ... 29
c. Trafic intracellulaire du cholestérol ... 31
i. Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol ... 31
ii. Transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs/lysosomes ... 34
iii. Transport du cholestérol entre réticulum endoplasmique et membrane plasmique ... 37
iv. Trafic du cholestérol entre endosomes tardifs et mitochondrie ... 39
3. Athérosclérose ... 39
a. Généralités ... 39
b. Macrophages ... 41
c. Origines de l'athérosclérose : athérogenèse ... 41
d. Oxydation des LDL ... 44
e. Altération du trafic intracellulaire du cholestérol ... 45
B. Oxystérols ... 47
1. Généralités ... 47
a. Origine et fonctions des oxystérols... 47
b. Interactions différentielles avec les membranes et les protéines ... 50
c. Régulation de l’homéostasie du cholestérol... 51
2. Oxystérols et athérosclérose... 53
a. Athérogenèse ... 53
b. Apoptose des macrophages spumeux ... 54
3. Autres pathologies impliquant les oxystérols ... 56
a. Maladie de Niemann-Pick de type C ... 56
b. Maladies neurodégénératives ... 57
C. Oxysterol binding protein et OSBP-related proteins ... 57
1. Généralités ... 57
a. Première identification des familles OSBP/ORPs ... 57
b. Phylogénie et structure ... 58
c. Distribution cellulaire des ORPs ... 63
2. Fonctions des ORPs ... 63
a. Ligands des ORPs ... 63
b. ORPs, transporteur de stérols et/ou modulateurs de signaux lipidiques ... 66
c. Implication des ORPs dans le trafic intracellulaire du cholestérol ... 69
i. OSBP et ORP4 ... 69
ii. ORP1L ... 70
iii. ORP2 ... 71
iv. ORP5 et ORP8 ... 72
v. ORP9, 10 et 11 ... 73
D. BMP ... 75
1. Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP ... 75
a. Découverte et distribution du BMP ... 75
b. Localisation subcellulaire du BMP ... 75
2. Structure du BMP ... 77
a. Squelette glycérophosphate ... 77
b. Composition en acides gras ... 78
4. Fonctions cellulaires du BMP ... 81
a. BMP et homéostasie cellulaire du cholestérol : état des lieux ... 81
i. Anticorps anti-BMP et accumulation du cholestérol dans les endosomes tardifs ... 81
ii. Modèle d’accumulation du BMP et effet antioxydant ... 82
b. Rôle du BMP dans la biosynthèse, l'organisation et la dynamique des endosomes tardifs ... 84
c. Rôle du BMP dans la fonction de dégradation des endosomes tardifs ... 85
d. Rôle du BMP dans le transport du cholestérol hors des endosomes tardifs ... 85
Chapitre II – ARTICLE INTRODUCTIF ... 88
Chapitre III – ARTICLE 1 ... 102
Chapitre IV – ARTICLE 2 ... 110
DISCUSSION, CONCLUSION & PERSPECTIVES ... 134
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 140
INTRODUCTION GENERALE
L’athérosclérose est une complication cardiovasculaire majeure de maladies associées à une augmentation du stress oxydatif, comme le diabète de type 2 et le syndrome métabolique. Dans ces situations, les lipoprotéines de faible densité (LDL) sont modifiées par oxydation. Les LDL oxydées sont alors considérées comme très athérogènes car elles induisent une forte accumulation de cholestérol dans les macrophages sous-endothéliaux conduisant à la formation de cellules dites spumeuses et le développement de la plaque d'athérome (Schmitz et Grandl. 2008). Plus spécifiquement, les LDL oxydées sont enrichies en produits d'oxydation du cholestérol appelés oxystérols, dont certains sont impliqués dans la capacité des LDL oxydées à induire un stress oxydant cellulaire et une cytotoxicité, principalement par apoptose (Vejux et Lizard. 2009). Longtemps considérés comme de simples intermédiaires dans le catabolisme du cholestérol, les oxystérols sont désormais associés à la régulation du métabolisme des lipides, à l'inflammation et comme facteurs contribuant à des complications cliniques de l'athérosclérose (Brown et Jessup. 2009). D’autre part, il est bien établi que la transformation des macrophages en cellules spumeuses est associée à une dérégulation de l’homéostasie cellulaire du cholestérol en relation avec l’oxydation des LDL (Moore et al. 2013). Dans les conditions physiologiques, l’homéostasie du cholestérol cellulaire est assurée par l’équilibre finement régulé entre l’apport de cholestérol via l’endocytose des LDL, le stockage sous forme d’esters de cholestérol et son élimination par des mécanismes d’efflux dépendant des HDL. La modification oxydative des LDL conduit à l’internalisation incontrôlée de ces particules entrainant des défauts des fonctions cellulaires d’estérification et d’efflux (Zhou et Tabas. 2013, Tall et al. 2008).
Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide cellulaire unique,
localisé préférentiellement dans les membranes internes des endosomes tardifs. Notre équipe a
montré que le BMP a un impact important sur l'homéostasie du cholestérol au sein des
macrophages. En effet, les endosomes tardifs sont un compartiment carrefour pour le transport
et la distribution du cholestérol intracellulaire. L’utilisation d’un anticorps anti-BMP qui
perturbe l’organisation des membranes internes des endosomes tardifs, nous a permis de
démontrer son implication dans la régulation du trafic intracellulaire du cholestérol (Delton-
Vandenbroucke et al. 2007). D’autre part, il faut souligner l'importante accumulation du BMP dans certaines lipidoses lysosomales, telle que la maladie de Niemann-Pick de type C, dont le mécanisme reste encore à déterminer (Hullin-Matsuda et al. 2009). Dans ce but, notre équipe a mis au point une méthode d'enrichissement cellulaire en BMP qui mime cette condition pathologique. En effet, via la supplémentation en DOPG (dioleoyl-phosphatidylglycérol), son précurseur de synthèse, le contenu en BMP peut être augmenté de manière significative (Bouvier et al. 2009).
Dans ce contexte, mon travail de thèse s'est porté sur l'analyse des conséquences fonctionnelles de l'accumulation de BMP sur l'homéostasie du cholestérol dans des macrophages incubés dans un premier temps avec des LDL natives (non modifiées) puis après incubation avec des LDL oxydées afin de se rapprocher d'une situation pathologique d'athérogenèse découlant d'un stress oxydant drastiquement augmenté. De plus, les mécanismes de sortie du cholestérol des endosomes tardifs restent assez mal caractérisés, en particulier, le contrôle de la destination du cholestérol et de ses produits d'oxydation générés au sein des endosomes tardifs. Or, les protéines transporteurs des (oxy)stérols, OSBP (oxysterol binding protein) et ses protéines associées, les ORPs (OSBP-related proteins) sont de véritables régulateurs de stérols intracellulaires qui contrôlent des processus importants au cours de l'athérogenèse. Ces protéines jouent notamment des rôles de transporteurs de stérols et/ou de glycérophospholipides, ayant des impacts fonctionnels sur le métabolisme cellulaire des lipides, la signalisation et le transport vésiculaire (Vihervaara et al. 2011a, Olkkonen.
2013). Un point essentiel de mon travail de thèse a été de rechercher un possible partenaire protéique parmi les membres de la famille des OSBP/ORPs expliquant le rôle du BMP dans le trafic intracellulaire du cholestérol.
La première partie de ce mémoire sera consacrée aux rappels bibliographiques
(chapitre I) comportant 4 parties. La première s'intéresse au métabolisme des lipoprotéines et
du cholestérol chez l'Homme, la deuxième est consacrée aux oxystérols. Dans une troisième
partie, nous décrirons les protéines de la famille des OSBP/ORPs et enfin, la dernière partie
traite du BMP et de ses caractéristiques. Les parties II, III et IV contiennent les publications
répondant aux objectifs de ce travail de thèse et enfin, une dernière section permettra de
conclure et de donner des perspectives quant aux suites possibles pour ce travail.
C HAPITRE I – RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
A. M ETABOLISME DES LIPOPROTEINES ET DU CHOLESTEROL CHEZ L ’H OMME
1. L IPOPROTEINES
a. Généralités sur les lipoprotéines
Les lipoprotéines sont des complexes macromoléculaires sphériques qui permettent l’acheminement des lipides insolubles en milieu aqueux dans le système vasculaire. Elles assurent la distribution des triglycérides, source d'énergie pour l'organisme et du cholestérol, constituant indispensable des membranes cellulaires ainsi que précurseur des hormones stéroïdes, des sels biliaires et de vitamines liposolubles.
Il existe 4 types de lipoprotéines : les chylomicrons, synthétisés par les entérocytes, qui permettent le transport des lipides exogènes apportés par l’alimentation, de l’intestin vers le foie ; les VLDL (very low density lipoproteins), d’origine hépatique, transportant les triglycérides endogènes qui vont être hydrolysés dans la circulation donnant naissance aux IDL (intermediate density lipoproteins) puis aux LDL (low density lipoproteins) qui conduisent le cholestérol vers les tissus périphériques ; les HDL (high density lipoproteins) en charge du transport retour du cholestérol vers le foie.
b. Structure des lipoprotéines
Les lipoprotéines comportent toutes un cœur hydrophobe contenant des lipides neutres
(esters de cholestérol -CE- et triglycérides -TG-) ainsi qu'une monocouche amphiphile
périphérique composée de lipides polaires (phospholipides et cholestérol libre) et de
différentes apolipoprotéines (apo) (Figure 1). Le cœur hydrophobe représente le réservoir
lipidique des lipoprotéines ; il contient principalement des TG pour les chylomicrons et les
VLDL tandis que pour les lipoprotéines de plus haute densité, LDL et HDL, il est composé
essentiellement de CE. Les apolipoprotéines confèrent à chaque édifice lipoprotéique son identité et ses propriétés fonctionnelles.
Figure 1 : Structure générale d’une lipoprotéine (Gautier et al. 2010)
1. Apolipoprotéine. 2. Phospholipides. 3. Cholestérol libre.
4. Cholestérol estérifié. 5. Triglycérides.
c. Constituants des lipoprotéines i. Glycérolipides
Les glycérolipides sont des molécules résultant de l'estérification des trois fonctions
alcools d’un glycérol par des acides gras et/ou un phosphate. Le résidu glycérol peut être lié
trois fois à des acyles gras, créant ainsi un tri-acyl-glycérol ou triglycéride (Figure 2A) ou il
peut être lié à deux acyles gras en position sn-1 et sn-2 tandis que la position sn-3 comprend
un groupement phosphate, lui-même estérifié par un groupement alcool : il s'agit alors d'un
(glycéro)phospholipide (Figure 2B). Les chaines acyles reliées au glycérol composent la queue
hydrophobe du phospholipide alors que le phosphate et le groupement alcool constituent la
tête polaire. Les phospholipides se situent en périphérie des lipoprotéines. En effet, leur nature
amphiphile est essentielle à la solubilité et à la structure des lipoprotéines ; leur tête hydrophile
étant en contact avec le plasma aqueux alors que le pôle opposé hydrophobe interagit avec le
noyau lipidique. Par opposition, les TG sont situés à l’intérieur des lipoprotéines du fait de leur forte hydrophobicité. Ils sont particulièrement enrichis dans les chylomicrons et les VLDL à partir desquels ils sont mobilisés par des lipases qui hydrolysent les résidus acyles en position sn-1 ou sn-3 afin de libérer des acides gras utilisés par les tissus périphériques (adipocytes, muscles) pour la production ou le stockage de l'énergie.
(A) (B)
Figure 2 : Structures générales d’un phospholipide (A) et d'un triglycéride (B) (figures modifiées à partir de Lagarde et al. 2015)
Les chaines d'acyles gras sont représentées en bleu, la molécule de glycérol en noir, le
groupement phosphate en rose et le groupement alcool en orange
ii. Cholestérol
Le cholestérol dont la structure a été publiée pour la première fois en 1932 par Wieland et Dane, est un lipide de la famille des stéroïdes de formule empirique C 27 H 46 O, formé par quatre cycles A, B, C, D et une chaine hydrocarbonée branchée sur le carbone 17 (Vance et Van den Bosch, 2000). Les atomes de carbone de la molécule sont numérotés de 1 à 27 (Figure 3).
Figure 3 : Structure du cholestérol libre (figure issue de la thèse de Jérôme Bouvier. 2008)
Le cholestérol existe sous deux formes principalement ; une forme libre présente en surface des lipoprotéines et une forme estérifiée où la fonction hydroxyle sur le carbone 3 en position β, est estérifiée par un acide gras, lui conférant une certaine hydrophobicité qui lui permet de s'enfouir au centre des lipoprotéines.
iii. Apolipoprotéines
Plus d’une quinzaine d’apolipoprotéines avec des importances biologiques variables
sont décrites actuellement dans la littérature. Elles exercent plusieurs grands rôles.
Tableau 1 : Caractéristiques des principales apolipoprotéines (Charrière et Moulin, 2007)
Les enzymes du métabolisme des lipoprotéines apparaissant dans ce tableau seront définies et décrites dans le paragraphe A.1.e. Métabolisme des lipoprotéines.
Tout d’abord, elles assurent la cohésion structurale des lipoprotéines grâce à leur hélice α amphipathique qui leur permet d’interagir à la fois avec les lipides et le milieu plasmatique.
C’est le cas des apolipoprotéines B48 pour les chylomicrons, B100 pour les VLDL et LDL et enfin, AI/AII pour les HDL. Certaines possèdent aussi une fonction de cofacteur enzymatique avec, par exemple, l’apoCII, activatrice de la lipoprotéine lipase (LPL), enzyme hydrolysant les triglycérides des chylomicrons et des VLDL. Enfin, une fonction de reconnaissance des récepteurs membranaires permettant l’adressage spécifique des lipoprotéines est assurée par l’apoB100 et l’apoE qui sont notamment des ligands des récepteurs aux LDL (R-LDL) (Tableau 1).
Apolipoprotéines Fonctions
apoAI Protéine de structure des HDL Activateur de la LCAT Ligand d’ABCA1 et SR-B1 apoAII Protéine de structure des HDL
Modulateur de la LH apoAIV Activation de la LCAT
apoB100 Protéine de structure des VLDL et LDL Ligand du récepteur R-LDL apoB48 Protéine de structure des chylomicrons
apoCI Activateur de la LCAT Inhibiteur de la CETP apoCII Activation de la LPL apoCIII Inhibiteur de la LPL
apoE Ligand des récepteurs R-LDL et LRP
d. Classification des lipoprotéines
Les lipoprotéines sont classées généralement en fonction de leur densité avec, par ordre croissant, les chylomicrons, les VLDL, les IDL, les LDL puis les HDL2, 3 et pré-β. Elles peuvent donc être séparées par ultracentrifugation différentielle à partir du plasma (Havel et al. 1955). Elles se distinguent aussi par leur taille inversement proportionnelle à leur densité, par leur proportion d'esters de cholestérol/triglycérides (CE/TG) ainsi que par leurs apolipoprotéines spécifiques (Tableau 2).
Lipoprotéines Densité (g/ml) Taille (nm) CE/TG Principales apolipoprotéines Chylomicrons 0.93 75-1200 1/19 B48, CI, CII, CIII, E
VLDL 0.93-1.006 30-80 1/3.3 B100, CI, CII, CIII, E
IDL 1.006-1.019 27-35 1/3.5 B100, E
LDL 1.019-1.063 18-27 1/0.23 B100
HDL2 1.063-1.125 9-12 1/0.22 AI, AII, AIV, CI, CII, CIII, E HDL3 1.125-1.210 7-9 1/0.19 AI, AII, AIV, CI, CII, CIII, E
Pré-β HDL 1.210-1.250 < 7 AI
Tableau 2 : Caractéristiques physicochimiques des lipoprotéines plasmatiques humaines
(Gautier et al. 2010) e. Métabolisme des lipoprotéines
i. Voie n°1 : voie d’apport exogène
Les lipides alimentaires sont absorbés en période postprandiale au niveau des
entérocytes de l’intestin grêle qui vont sécréter des chylomicrons extrêmement riches en TG et
de composition en acides gras proche de celle des lipides ingérés. Cette voie permet la mise à
disposition des lipides alimentaires aux tissus cibles pour la production et le stockage de
l'énergie ou encore la synthèse de diverses molécules. En effet, sous l’action de la LPL
présente sur la paroi de l’endothélium capillaire et activée par l’apoCII, les TG sont hydrolysés générant des acides gras libres (FFA pour free fatty acids) et des monoacylglycérols (MAGs). Les chylomicrons résiduels (ou remnants) plus petits et plus denses vont être captés par le foie grâce à la liaison de l’apoE aux R-LDL ou aux LRP (LDL receptor related protein) pour être ensuite dégradés. La majorité des chylomicrons a disparu de la circulation 12h après le repas (Dallongeville. 2006).
ii. Voie n°2 : voie d’apport endogène
Cette voie permet le transport des lipides endogènes du foie vers les tissus périphériques. Quelques heures après le repas, lorsque la quantité de chylomicrons en circulation devient faible, le foie sécrète de nouvelles lipoprotéines, les VLDL ; leur production étant stimulée par les acides gras libres captés après un repas riche en graisses.
Dans la circulation, les nombreux TG que les VLDL contiennent, vont rapidement être hydrolysés par la LPL. En s'appauvrissant en TG, les VLDL évoluent progressivement en IDL, plus petites et plus denses. Une partie de ces IDL ainsi que les VLDL résiduelles sont recaptées par le foie via la liaison de l’apoE aux R-LDL ou aux LRP. L'autre partie des IDL continuent de s'appauvrir en TG sous l'action de la lipase hépatique (LH) présente sur les cellules endothéliales des capillaires intra-hépatiques et qui permet ainsi la formation des LDL, riches en CE et principaux transporteurs de cholestérol aux tissus périphériques. Chez l'Homme, les VLDL et les IDL acquièrent également des CE contre des TG par échange avec les HDL. Ce transfert est réalisé grâce à la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP ou cholesteryl ester transfer protein). C'est donc la combinaison des activités LPL (sur les VLDL), LH (sur les IDL) induisant une perte progressive des TG, et de l'activité CETP induisant un enrichissement en CE, qui conduit à la formation des LDL à partir des VLDL (Masson et al. 2009).
Les particules de LDL en circulation sont ensuite reconnues grâce à la liaison de leur
apoB100 aux R-LDL (Brown et Goldstein. 1979). L’internalisation des LDL dans la cellule se
fait par endocytose via les endosomes précoces puis les endosomes tardifs/lysosomes, lieu de
l’hydrolyse des CE en cholestérol libre. S'ensuit toute une série de phénomènes de régulation ;
diminution de l’activité HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl) réductase, enzyme clef de la
biosynthèse de cholestérol dans le réticulum endoplasmique ; activation de l’ACAT (acetyl CoA cholesterol acyl transferase) permettant la réestérification du cholestérol libre et son stockage ; diminution de la synthèse et du nombre de R-LDL (Figure 4).
Figure 4 : Conséquences de l’internalisation de LDL dans les cellules mammifères (Goldstein et Brown. 2009)
iii. Voie n°3 : voie de retour du cholestérol
Cette voie de retour appelée communément « transport inverse du cholestérol »
correspond au transport du cholestérol des tissus extra-hépatiques vers le foie, où il est recyclé
ou éliminé via la bile. Ce processus est initié par une apoAI délipidée sécrétée par le foie ou
l'intestin, qui permet la reconnaissance du transporteur ABCA1 (ATP binding cassette-type
A1). Ce dernier appartient à la superfamille des transporteurs à cassette utilisant l’ATP pour
assurer le transfert de divers substrats entre différents compartiments cellulaires et l’extérieur
de la cellule. La reconnaissance d’ABCA1 par l’apoAI déclenche le transfert de cholestérol
libre et de phospholipides de la membrane plasmique vers l’apoAI conduisant à la formation
d’une pré-β HDL ou HDL naissante, elle-même substrat d’ABCA1 (Duong et al. 2008). Cette
particule pauvre en lipides est considérée comme le principal accepteur préférentiel du
cholestérol cellulaire. L’intervention de la lécithine-cholestérol acyltransférase (LCAT) qui
permet l’estérification du cholestérol participe à la transformation des pré-β HDL de forme
discoïdale en HDL3 sphériques matures comportant un cœur lipidique hydrophobe de CE, puis en HDL2 de grande taille. Les HDL2 et 3 sont dites de type α par opposition aux pré-β HDL car plus riches en lipides neutres. L'évolution des HDL3 en HDL2 est également favorisée par la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) qui permet d'échanger les CE des HDL3 contre des TG des VLDL et des IDL. Les TG contenus dans les HDL2 vont pouvoir être hydrolysés par la LH, activée par l’apoAII. L'action combinée de la CETP et de la LH appauvrit le cœur des HDL2 en lipides neutres ; il apparait alors une instabilité de la particule qui conduit à la reformation d’une particule HDL3 et à la libération d'une pré-β HDL. D'autre part, les HDL3 évoluent également en HDL2 grâce à l'action de la protéine de transfert des esters de phospholipides ou PLTP (phospholipid transfer protein) qui, après transfert de phospholipides des VLDL aux HDL3, permet la fusion de deux HDL3 pour former une particule HDL2 de grande taille et lors de cette fusion, une pré-β HDL est également libérée. Ce système d'interconversion permet donc de régénérer des particules apoA1 pauvres en lipides afin de continuer de stimuler le système d'efflux via ABCA1 (Charrière et Moulin. 2007, Tall et al. 2008, Lagarde et al. 2015).
Les transporteurs ABCG1 et ABCG4 (ATP binding cassette-type G1/G4) contrairement à ABCA1, sont capables de servir d’accepteurs aux HDL2 et HDL3 mais pas aux pré-β HDL (Wang et al. 2004). Il a été proposé qu’ABCA1 et ABCG1 fonctionnent de manière séquentielle, ABCA1 ubiquitaire initiant l’efflux de cholestérol en permettant la formation d’une particule mature de HDL qui va ensuite être capable de servir d’accepteur à ABCG1 particulièrement exprimé dans les macrophages (Gelissen et al. 2006). D’autre part, des études de double knock-out (Abca1 -/- , Abcg1 -/- ) sur des souris montrent que l’effet combiné des deux protéines est absolument nécessaire à l’efflux de cholestérol dans les macrophages sous peine d’induire une déficience de la voie de transport inverse du cholestérol (Out et al. 2008, Yvan-Charvet et al. 2007, Tall et al. 2008, Rosenson et al. 2015).
Les HDL sont par la suite recaptées au niveau du foie par les récepteurs SR-BI
(scavenger receptor class B type I) reconnus par l’apoAI en vue de l’excrétion biliaire du
cholestérol (Figure 5). Ces récepteurs sont exprimés dans de nombreux tissus périphériques
mais leur intervention dans l’efflux net de cholestérol est toutefois considérée comme
marginale par rapport à celle du tandem ABCA1/ABCG1 (Wang et al. 2007).
