L EXPOSITION CHRONIQUE AU PLOMB INDUIT UNE DIMINUTION DES HORMONES SEXUELLES ET DES PERTURBATIONS DE LA SPERMATOGENÈSE CHEZ LES RATS MÂLES WISTAR.

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L’EXPOSITION CHRONIQUE AU PLOMB INDUIT UNE DIMINUTION DES HORMONES SEXUELLES ET DES PERTURBATIONS DE LA SPERMATOGENÈSE CHEZ

LES RATS MÂLES WISTAR.

CHRONIC EXPOSURE TO LEAD INDUCES DECREASED SEX HORMONES AND SPERMATOGENESIS DISTURBANCE IN MALE WISTAR RATS.

KONAN K.M.^1,2, ADON M.A.¹, ZOUGROU N.E.³, OBRO K.A.¹, N’GUESSAN A. A.J.^1,2,, DJAMAN A.J.^1,2, DOSSO M.¹, N’GUESSAN J.D²

1. Unité de Biologie Cellulaire, Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI)

2. Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique, Université Félix Houphouët-Boigny (UFHB).

3. Laboratoire d’Endocrinologie et Biologie de la reproduction (UFHB).

Correspondant : Konan Kouassi Martin

01 BP 12601 ABIDJAN 01, (225) 07633182 E-mail : kouassimartin.konan@yahoo.fr

RÉSUMÉ Plusieurs auteurs ont rapporté les effets délétères des polluants environnementaux sur la fonction sexuelle, tels que le tabac, les pesticides et les métaux lourds.

L’exposition aux métaux lourds a été associée à des effets néfastes sur le développement des gonades.

Chez les animaux, plusieurs études expérimentales ont rapporté une altération de la spermatogenèse.

Cependant les mécanismes impliqués dans la patho- genèse ne sont pas encore complètement élucidés.

Par conséquent, la présente étude a été menée sur des rats Wistar afin d’évaluer les effets du plomb sur la spermatogenèse d›une part et sur les hormones sexuelles sanguines et testiculaires d›autre part.

Méthodes: Pour cette étude, dix rats mâles ont été répartis au hasard en deux groupes (n = 5 dans chaque groupe). Le groupe contrôle a reçu de l’eau distillée et le groupe expérimental, de l’eau distillée enrichie

en acétate de plomb (0,3%) pendant 90 jours. Après la période d’exposition, les rats ont été euthanasiés.

Le sang et les testicules ont été échantillonnés pour l’exécution des différents tests.

Résultats: Les résultats révèlent une réduction significative des niveaux d’hormones sexuelles et des perturbations de la spermatogenèse chez les rats exposés.

Conclusion: La présente étude démontre que l’accumulation de plomb dans le sang affecte la fertilité masculine en perturbant la biosynthèse des gonadotrophines et de la testostérone ainsi que le processus de la spermatogenèse.

Mots-clés : Plomb, rat, hormones sexuelles, spermatogenèse

ABSTRACT Many authors have reported adverse effects of envi-

ronmental pollutants on sexual function, such as tobacco pesticides and heavy metals.

Exposure of heavy metals has been associated with adverse effects on development of gonads. In animals, several experimental studies have reported impairment of the spermatogenesis but the mechanisms implied in the pathogenesis are not yet completely understood.

Therefore, the present study was conducted on Wis- tar rats to study the effects of lead on spermatogenesis on the one hand and testicular and blood gonadotropins and testosterone on the other hand.

Methods: For this study, ten male rats were ran- domly divided in two groups (n=5 in each groups). The

control group received distilled water and the experi- mental groups received the lead acetate solution (0.3%) while 90 consecutive days. After 90 days, the rats were euthanized. The blood and the testes were sampled for carrying out of the different tests.

Results: The results indicate a significant reduction in sex hormone levels and spermatogenesis disturbance in exposed rats.

Conclusion: The present study demonstrates that the accumulation of lead in the blood affects male fertility by disrupting the biosynthesis of gonadotropins and testosterone as well as the progress of spermatogenesis.

Key Words: Lead, rat, sex hormone, spermatoge- nesis.

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INTRODUCTION Au cours de ces dernières années, plu-

sieurs équipes de recherche se sont inté- ressées aux effets potentiellement toxiques de divers agents chimiques et physiques de notre environnement sur la fertilité masculine (Toppari et al., 1996 ; Haouas et al., 2015).

Par ailleurs, plusieurs auteurs ont rappor- té les effets délétères des polluants environnementaux sur les fonctions de reproduction mâle, tels que le tabac (Tuormaa, 1995), les pesticides (Issam et al., 2011) et les métaux lourds (Xie et al., 1995 ;Ono et al., 1997 ; Hamadouche et al., 2013 ; Konan et al., 2017). Ces substances environnementales qui ont la capacité de mimer ou d’antagoniser les hormones naturelles attirent l’attention de la communauté scientifique, désireuse d’établir un lien entre l’exposition à de tels composés et l’apparition des effets délétères observés sur la reproduction (Gorbel et al., 2002).

L’exposition aux métaux lourds a été associée à des effets néfastes sur le dévelop-

pement des gonades (Sharma et Garu, 2011).

Le plomb, considéré comme l’un des princi- paux polluants environnementaux (Lamia et al., 2008) peut avoir des origines diverses telles que la nourriture contaminée ou mal conservée, la tuyauterie hydratée au plomb, la pollution industrielle, la circulation rou- tière (Lopez et al., 1996) et l’eau de boisson (WHO, 2000). Les principales sources d’exposition chez les hommes sont les aliments et l’eau de boisson (Lamia et al., 2008).

Chez les animaux, plusieurs études expérimentales ont rapporté une altération de la spermatogenèse ((Gorbel et al., 2002 ; Haouas et al., 2015) mais les mécanismes impliqués dans cette pathogenèse ne sont pas encore complètement élucidés.

Par conséquent, la présente étude a été menée sur des rats Wistar afin d’évaluer les effets du plomb sur la spermatogenèse d›une part et sur les hormones sexuelles testiculaires et sanguines d›autre part.

MATÉRIEL ET MÉTHODES TRAITEMENT DES ANIMAUX

Pour cette étude, dix (10) rats mâles adultes (âgés de 12 à 14 semaines), issus de l›Ecole Normale Supérieure (ENS) d’Abidjan, de poids moyen 250 ± 3 g, ont séjournés dans l’animalerie de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI) à température ambiante (25

± 2°C), sous aération suffisante, dans des cages collectives en plastique tapissées de copeaux de bois, munies d’une mangeoire et d’un biberon.

Le cycle jour/nuit a été maintenu (environ 12 heures de lumière et 12 heures d’obscu- rité). Les rats ont été acclimatés pendant 14 jours à leur nouvel environnement avant l’exposition.

Les rats mâles ont été divisés au hasard en deux groupes (n = 5, un groupe contrôle et un groupe exposé). Le groupe contrôle a reçu de l›eau distillée comme eau de boisson et le groupe expérimental, de l›eau distillée enrichie en acétate de plomb (C₄H₆Pb₂H₂O) à raison de 0,3%. Les rats ont eu libre accès à une nourriture standard stérilisée, corres-

pondant à une alimentation pour rongeur.

Après la période d’exposition, les rats ont été pesés puis euthanasiés. Les testicules ont été prélevés puis débarrassés de leurs tis- sus adipeux. L’un des testicules a été utilisé pour la détermination des taux de gonadotrophines et de testostérone, et le second a été utilisé pour les examens histologiques (HE).

Le sang a été recueilli pour les dosages des hormones sexuelles et du plomb.

Examens histopathologiques des testicules

Les tests histopathologiques ont été réali- sés selon les procédures classiques de laboratoire décrites par Tarabishy et al. (2008).

La coloration utilisée a été l’hématoxyline- éosine et les lames ont été observées puis photographiées en utilisant un microscope optique (Olympus Japan).

DOSAGE DES HORMONES SEXUELLES

Le niveau des hormones sexuelles a été évalué au département de Biochimie Fonda-

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L’exposition chronique au plomb induit une diminution des hormones sexuelles et des...

mentale et Médicale de l›Institut Pasteur de Côte d›Ivoire en utilisant un kit commercial (Architect, Abott, Germany).

Les niveaux d’hormones sexuelles sanguines ont été mesurés par la méthode décrite par Haouas et al. (2015).

Les taux d’hormones sexuelles dans les testicules ont été mesurés comme décrit ci- dessus dans les homogénats testiculaires obtenus selon la méthode décrite par Konan et al. (2017).

ANALYSES DE PLOMB DANS LE SANG Le plomb a été dosé selon la méthode décrite par Gbétoh et al. (2012), par Spectro- métrie d’Absorption Atomique (SAA) à l’aide d’un appareil Varian AA20.

ANALYSES STATISTIQUES

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel Graph Pad Prism 5 Demo. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type. Le test de Student et le test d’ANOVA ont été utilisés pour la comparaison des moyennes. Une valeur de p <0,05 a été considérée comme significative. Les différences statistiques significatives sont annoncées dans les ta- bleaux par une étoile (*), les différences statistiques très significatives par deux étoiles (**) et les différences statistiques hautement significatives par trois étoiles (***).

RÉSULTATS POIDS DES RATS ET DES TESTICULES

Le plomb induit une diminution significative du poids des rats traités comparativement aux rats contrôles (Tableau I). Concer-

nant les testicules, le plomb a induit une augmentation significative des poids absolus (p = 0,0347) et relatifs (p = 0,0034) chez les rats traités (Tableau I et Figure 1A; 1B).

Table1: Poids des rats et des testicules

Groupes Poids des rats (g) Poids des testicules (g) Poids relatifs (g) Contrôles 289,0 ± 5,711 1,226 ± 0,0799 0,765 ± 0,0328

Exposés 262,7 ±5 ,417** 1,470 ± 0,05329* 1,05 ±0,0616**

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Figure 1A: poids absolu des testicules Les résultats révèlent une augmentation significative du poids absolu des testicules chez les rats exposés (p = 0,0347) comparativement aux rats non exposés.

Figure 1B: Poids relatif des testicules La figure 1B montre les résultats des poids relatifs des testicules des rats. Ils révèlent une augmentation très significative du poids testiculaire des rats exposés comparativement aux rats non exposés (p = 0,0034).

Figure 2A: Testostérone dans le sang La figure montre les résultats du dosage de la testostérone dans le sang.

Ces résultatsrévèlent une diminution significative (p = 0,0025) de la testostérone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

Figure 2B: Testostérone testiculaire La figure 2B montre les résultats du dosage de la testostérone dans les testicules. Ces résultats révèlent une diminution significative (p = 0,0005) de la testostérone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

Figure 1A: poids absolu des testicules

Les résultats révèlent une augmentation significative du poids absolu des testicules chez les rats exposés (p = 0,0347) comparativement aux rats non exposés.

Figure 1B: Poids relatif des testicules

La figure 1B montre les résultats des poids relatifs des testicules des rats. Ils révèlent une augmentation très significative du poids testiculaire des rats exposés comparativement aux rats non exposés (p = 0,0034).

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KONAN K.M., ADON M.A., ZOUGROU N.E., OBRO K.A. et al 58

Hormones sexuelles

Le plomb induit une diminution significative des hormones sexuelles sanguines (Tableau 2) et testiculaires (Tableau 3) chez les rats exposés comparativement aux rats

et de grands diamètres avec des espaces interstitiels étroits (Figure 6A). Nous avons également observé une spermatogenèse normale. Les cellules germinales : sperma- togonies, spermatocytes I, spermatocytes II, spermatides et enfin des spermatozoïdes (avec leurs flagelles qui remplissent le centre de la lumière du tube) étaient disposées de la membrane basale vers la lumière du tube (Figure 6B).

A l’opposé, les coupes histologiques des rats exposés au plomb présentaient des changements histopathologiques suivants:

une réduction du nombre des tubes sémini- fères ainsi que de leur diamètre, une réduc- tion significative des cellules germinales et une augmentation significative de la lumière des tubes séminifères et des espaces interstitiels (Figure 6C).

De plus, nous avons observé une disposi- tion irrégulière des cellules germinales ainsi qu’une augmentation des vacuoles (Figure D) et une dégénérescence de certains tubes séminifères (Figure 6E).

Table II: Concentration en testostérone, FSH et LH dans le sang.

Groupes Testostérone (µg/L) FSH (µg/L) LH (µg/L) Contrôles 4,51 ± 0,229 3,87 ± 0,241 1,94 ± 0,133

Exposés 2,76 ± 0,331** 2,28 ± 0,249** 1,14 ± 0,0712***

Table III: Concentration en testostérone, FSH et LH dans les testicules Groupes Testostérone (µg/L) FSH (µg/L) LH (µg/L) Contrôles 454 ± 31,9 273 ± 8,70 116 ± 2,82

Exposés 210 ± 29,2*** 196 ± 8,45*** 66 ± 3,05***

Plombémie

Les résultats de la plombémie ont révélé une augmentation très significative de la concentration du plomb dans le sang (p = 0,0006) chez les rats exposés comparativement aux rats contrôles (Figure 5).

Figure 5: Concentration de Pb dans le sang La figure 5 révèle le taux de plomb dans le sang des rats. Ces résultats révèlent que le plomb est significativement plus concentré (p = 0,0006) chez les rats exposés que chez les rats non exposés.

Figure 5: Concentration de Pb dans le sang

La figure 5 révèle le taux de plomb dans le sang des rats.

Ces résultats révèlent que le plomb est significativement plus concentré (p = 0,0006) chez les rats exposés que chez les rats non exposés.

Examens histopathologiques

Les échantillons de rats non exposés ont montré une structure testiculaire normale.

Les tubes séminifères étaient nombreux

non exposés. Ces résultats montrent égale- ment que les concentrations des hormones sexuelles sont plus élevées dans les testicules que dans le sang.

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E

E1

E1 E1

C D

C C

A B

A A

A B

C D

E

Figure 6: Structure testiculaire et spermatogenèse chez les rats Wistar

Les images de la figure 6 montrent la structure des testicules et la spermatogenèse chez les rats exposés au plomb et chez des rats non exposés à ce métal lourd.

La figure 6A montre la photographie (Olympus Japan, X 100) d’une structure testiculaire chez des rats non exposés (rats contrôles).

6A1: Désigne un tube séminifère chez les rats contrôles.

6A2: Désigne les espaces interstitiels chez les rats contrôles.

Figure 6B est un zoom de la figure A pour présenter la spermatogenèse chez des rats non exposés. La figure 6B montre une spermatogenèse normale. De la membrane basale vers la lumière du tube séminifère, nous observons des spermatogo- nies, des spermatocytes I, des spermatocytes II, des spermatides et des spermatozoïdes remarquables par leurs flagelles qui remplissent la lumière du tube séminifère.

Figure 6C est la photographie (Olympus Japan, x 100) d’une structure testiculaire de rats exposés au plomb.

6C1: Désigne un tube séminifère chez les rats exposés au plomb 6C2: Désigne un espace interstitiel chez des rats exposés au plomb.

Figure 6D est un zoom de la figure C pour montrer la spermatogenèse chez les rats exposés au plomb. La Figure 6D montre une spermatogenèse fortement perturbée. Désorganisation des cellules germinales, de plus, la lumière du tube séminifère apparait presquevideavec présence de plusieurs vacuoles.

La Figure 6E présente une photographie (Olympus Japan, X 100) d’une coupe histologique de testicules de rats exposés au plomb avec des tubes séminifères en dégénérescence.

E1 montre des tubes séminifères en dégénérescence.

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DISCUSSION Dans cette étude, les animaux ont été

exposés au plomb afin d’évaluer les effets de ce métal sur les fonctions testiculaires à savoir la spermatogenèse et la production d›hormones sexuelles notamment la testos- térone et les gonadotrophines.

En ce qui concerne la morphologie des testicules, nos résultats ont montré une augmentation significative de cet organe chez les rats exposés. Ces résultats sont contraires à ceux de plusieurs auteurs (Adibmoradi et al. 2015 ; Shubina et Dudenkova, 2016).

Ces auteurs ont rapporté une diminution du volume des testicules chez les rats expo- sés au plomb sur une période allant de 7 à 35 jours. Par ailleurs, les études menées par Gorbel et al. (2002) ont montré que les rats exposés au plomb avaient une diminution du testicule entre 15 et 45 jours alors qu’après 60 jours d’exposition, les testicules retrouvaient des valeurs comparables à celles des rats contrôles. Ces observations ont été confirmées par les travaux de Lamina et al.

(2008). Cette équipe de chercheurs a remar- qué que les rats exposés à 0,3% d’acétate de plomb comme dans cette étude avaient des testicules atrophiés après un mois de traitement mais des testicules hypertrophiés après deux mois d’exposition.

La présente étude a montré qu’après exposition des rats à l’acétate de plomb, il y’a eu une diminution significative de la FSH, de la LH et de la testostérone dans le sang et le fluide testiculaire. Ces résultats sont similaires à ceux de Lamina et al. (2008) qui avaient constaté une réduction significative de ces hormones après deux mois d’exposition à l’acétate de plomb.

Cette réduction hormonale chez les rats exposés serait imputable à la concentration du plomb dans le sang. Par ailleurs, les analyses statistiques ont révélé une corrélation négative entre la concentration de la FSH et la plombé- mie chez les animaux exposés au plomb.

En outre, ces analyses statistiques ont ré- vélé une corrélation positive entre la concentration de la testostérone et la concentration

de la LH. Ces résultats sont en concordance avec ceux de Habert et al. (2001). En effet, ces auteurs ont montré que la sécrétion de la testostérone était stimulée par la LH.

Les réductions significatives des hormones sexuelles auraient pour conséquences notables les changements histopathologiques observés au niveau de la spermatogenèse des rats exposés.

En effet, l’examen histologique des gonades des rats non exposés a révélé une architecture testiculaire normale avec plusieurs tubes séminifères de grands diamètres contenant les cellules germinales aux diffé- rents stades de la spermatogenèse. A l’oppo- sé, les testicules des rats exposés au plomb ont montré une structure désorganisée avec des tubes séminifères peu nombreux, de diamètres très réduits et parfois en dégéné- rescence. En outre, les coupes histologiques ont révélé un processus spermatogénique fortement perturbé à plusieurs étapes avec pour corollaire des tubes séminifères presque vides. Ces résultats confirmeraient les hypo- thèses de De Gendt et al. (2004).

Selon ces auteurs, la spermatogenèse progresse rarement au delà de la méiose en l’absence de testostérone ou en l’absence de récepteurs d’androgène. Autrement dit, les cellules germinales restent bloquées au stade de spermatocyte I ; ce qui expliquerait une absence de flagelle dans la lumière des tubes séminifères avec pour conséquence la réduction du nombre de spermatozoïdes.

Les résultats de cette étude sont sem- blables aux observations de plusieurs auteurs ayant analysé la spermatogenèse après exposition de rongeurs à des produits entrainant la baisse des hormones sexuelles (Gorbel et al. 2002 ; Lamina et al. 2008 ; Zhao et al. 2014).

Toutefois, les changements histopathologiques rapportés dans ces travaux sont plus accentués que ceux rapportés récemment par Adibmoradi et al. (2015) ; Shubina et Dudenkova (2016), qui ont exposés les rats au plomb respectivement pendant 35 et 7 jours.

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CONCLUSION La présente étude démontre que l’accu-

mulation de plomb dans le sang affecte la fer- tilité masculine en perturbant la biosynthèse des gonadotrophines et de la testostérone ainsi que le processus de la spermatogenèse.

Conflit d’intérêt

Nous déclarons n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI), où nous avons conduit l’essentiel de ces travaux et l’Institut National Polytechnique Houphouët-Boigny (INPHB) où nous avons réalisé le dosage du plomb dans le sang.

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Figure 1A: poids absolu des testicules Les résultats révèlent une augmentation significative du poids absolu des testicules chez les rats exposés (p = 0,0347) comparativement aux rats non exposés.

Figure 1B: Poids relatif des testicules La figure 1B montre les résultats des poids relatifs des testicules des rats. Ils révèlent une augmentation très significative du poids testiculaire des rats exposés comparativement aux rats non exposés (p = 0,0034).

Figure 2A: Testostérone dans le sang La figure montre les résultats du dosage de la testostérone dans le sang.

Ces résultatsrévèlent une diminution significative (p = 0,0025) de la testostérone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

Figure 2B: Testostérone testiculaire La figure 2B montre les résultats du dosage de la testostérone dans les testicules. Ces résultats révèlent une diminution significative (p = 0,0005) de la testostérone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

Figure 2A: Testostérone dans le sang La figure montre les résultats du dosage de la testostérone dans le sang. Ces résultats révèlent une diminution significative (p = 0,0025) de la testostérone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

Figure 2B: Testostérone testiculaire

La figure 2B montre les résultats du dosage de la testostérone dans les testicules. Ces résultats révèlent une diminution significative (p = 0,0005) de la testos- térone chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés.

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Figure 3A: FSH dans le sang

Ces résultats indiquent une diminution significative (0,0018) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 4,51 ȝg / L ± 0,229 chez les rats non exposés contre 2,76 ȝg / L ± 0,331 chez les rats exposés.

Figure 3B: FSH testiculaire

Ces résultats indiquent une diminution significative (p = 0,0002) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 273 ȝg / L ± 8,70 chez les rats non exposés contre196 ȝg / L ± 8,45 chez les rats exposés.

Figure 4A: LH dans le sang

Cette figure révèle que le niveau de LH dans le sang est significativement plus élevé (p = 0,0007) chez les rats contrôles que chez les rats non exposéscontre 2,76 ȝg / L ± 0,331 chez les rats exposés.

Figure 4B: LH testiculaire

Cette figure révèle que le niveau de LH dans les testicules est significativement plus élevé (p = 0,0001) chez les rats contrôles que chez les rats non exposés.

Cette figure révèle que le niveau de LH dans le sang est significativement plus élevé (p = 0,0007) chez les rats contrôles que chez les rats non exposés contre 2,76 μg / L

± 0,331 chez les rats exposés.

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Ces résultats indiquent une diminution significative (0,0018) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 4,51 ȝg / L ± 0,229 chez les rats non exposés contre 2,76 ȝg / L ± 0,331 chez les rats exposés.

Ces résultats indiquent une diminution significative (p = 0,0002) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 273 ȝg / L ± 8,70 chez les rats non exposés contre196 ȝg / L ± 8,45 chez les rats exposés.

Cette figure révèle que le niveau de LH dans le sang est significativement plus élevé (p = 0,0007) chez les rats contrôles que chez les rats non exposéscontre 2,76 ȝg / L ± 0,331 chez les rats exposés.

Ces résultats indiquent une diminution significative (0,0018) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 4,51 μg / L ± 0,229 chez les rats non exposés contre 2,76 μg / L ± 0,331 chez les rats exposés.

Ces résultats indiquent une diminution significative (p

= 0,0002) de la FSH chez les rats exposés comparativement aux rats non exposés. La concentration moyenne de cette hormone était de 273 μg / L ± 8,70 chez les rats non exposés contre196 μg / L ± 8,45 chez les rats exposés.

contre 2,76 μg / L ± 0,331 chez les rats exposés.