Caractérisation des défauts cellulaires après transfert nucléaire chez le poisson rouge, et mise au point d'un nouveau modèle de cellules donneuses embryonnaires

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nucléaire chez le poisson rouge, et mise au point d’un nouveau modèle de cellules donneuses embryonnaires

Charlène Rouillon

To cite this version:

Charlène Rouillon. Caractérisation des défauts cellulaires après transfert nucléaire chez le poisson rouge, et mise au point d’un nouveau modèle de cellules donneuses embryonnaires. Biologie animale.

Agrocampus Ouest, 2019. Français. �NNT : 2019NSARB326�. �tel-03136049�

T HESE DE DOCTORAT DE

AGROCAMPUS OUEST

C ^OMUE U ^NIVERSITE B ^RETAGNE L ^OIRE

E COLE D OCTORALE N ° 600

Ecole doctorale Ecologie, Géosciences, Agronomie et Alimentation Spécialité : Biologie et physiologie animales

Caractérisation des défauts cellulaires après transfert nucléaire chez le poisson rouge, et mise au point d’un nouveau modèle de cellules donneuses embryonnaires

Thèse présentée et soutenue à Rennes, le 12/11/2019

Unité de recherche : INRA UR 1037 Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons Thèse N° : B-326, 2019-17

Par Charlène ROUILLON

Rapporteurs avant soutenance :

Sylvie CHASTANT-MAILLARD Professeure, Ecole Nationale Vétérinaire, Toulouse

Pascal MERMILLOD Directeur de recherche, INRA PRC, Nouzilly

J' ADRESSE MES REMERCIEMENTS A TOUTES LES PERSONNES QUI M ' ONT AIDEES DANS LA REALISATION DE CETTE THESE DE DOCTORAT .

En premier lieu, je tenais à remercier mes directeurs de thèse, Mme Catherine Labbé et M.

Pierre-Yves Le-Bail. En commençant ma thèse, je ne pensais pas qu’il était possible d’être aussi bien encadrée. Ils m’ont guidée dans mon travail, avec bienveillance, soutien, écoute, conseils, disponibilité… Je ne saurais combien les remercier pour toutes les opportunités qu’ils m’ont données, notamment le parcours EIR-A et les nombreux congrès. Sans eux, ma thèse n’aurait pas été ce qu’elle est aujourd’hui ; et sans ma thèse, je ne serais pas ce que je suis aujourd’hui.

Je remercie aussi les membres de mon comité de thèse : Mme Nathalie Beaujean, M.

Guillaume Halet, M. Pascal Vaudin, Mme Violette Thermes, M. Jean-Jacques Lareyre, Mme Alexandra Depincé et mes directeurs de thèse, pour l’intérêt qu’ils ont porté à ce travail et les discussions passionnantes.

Un grand merci également à M. Pascal Mermillod et Mme. Sylvie Chastant-Maillard d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ma thèse ; à Mme Karine Reynaud d’être examinatrice, et enfin à M. Pierre-Guy Marnet, le président de jury.

Je remercie une fois de plus ma chère collègue Alex, qui m’a énormément aidée dans l’obtention des clones, d’une grande préciosité ! Merci pour tes conseils, les expériences sur les clones que tu avais menées avant même le début de ma thèse, et l’exemplarité de tes cahiers de laboratoire. Je ne pourrai plus gratter à ta porte avant de rentrer dans ton bureau.

L’obtention de matériel biologique n’aurait pas été possible sans les membres des

installations expérimentales, notamment Pierre-Lo et Jean-Marc, qui s’occupaient merveilleusement

bien des carassins ! Donc merci également.

Je n’oublie pas les nombreuses heures/journées passées au plateau d’histologie du laboratoire. Merci à Béa pour sa formation, et sa réactivité à mes questions. Merci aussi à Adèle, pour les conseils qu’elle m’a procurés lorsque mes coupes faisaient des leurs…

I also have a special thought for the research team at the University of Nottingham, where I did my EIR-A internship: Dr Walid Maalouf, Dr Adam Watkins, and Dr Hannah Morgan. Thanks for the trust you have placed in me, for the kind hospitality and the many things you taught me.

Je souhaite également remercier Guylène, Patricia, Nathalie et Céline, pour l’appui administratif apporté au cours de ma thèse.

Enfin, ou presque, merci aux thésardes pour le soutien ! En particulier ma Yélé … Yako pour la fin de ta thèse ;) et merci pour tout… Bon courage à toutes mes amies thésardes pour la fin de thèse !

Merci à tous ceux du laboratoire qui m’ont aidée, de près ou de loin. Merci à tous ceux qui ont cru en moi.

Pour finir, je souhaite particulièrement remercier ma famille. Merci maman, papa et ma sœurette Réré, pour leur soutien plus qu’énorme. Dieu sait à quel point ceux qui ne sont plus là auraient aimé lire ces lignes, je pense à eux. Merci de m’avoir supportée, de m’avoir portée jusque- là, de m’avoir aidée jusqu’à chercher les fautes de frappes… vous aurez au moins finalement compris (ou pas) ce dont je parlais pendant ces trois ans.

Merci à lui. Finalement, j’ai soumis ma thèse de doctorat... la plus grande réalisation de ma

vie jusqu'à présent. Je trouve que trop de gens imaginent à tort qu'il faut être « intelligent » pour

obtenir un doctorat, que cela nous amène à une sorte de « prestige social ». La réalité, ce n'est pas

que "l'intelligence" qui nous amène ici, mais la détermination à ne jamais abandonner. La thèse

demande tellement d’investissements que la limite entre la vie professionnelle et personnelle en

devient floue. Ainsi, la plupart d'entre nous font face à d'énormes défis en cours de route. Pendant

mes trois dernière années, ma thèse m’a permis de grandir, d’évoluer et de révéler des qualités que

je ne soupçonnais pas. Je suis plus indépendante que jamais à présent et je n’abandonnerai jamais,

car quoi qu’il arrive « All is well… ». ❤

« C’est le temps que tu as perdu pour ta rose qui fait ta rose si importante »

Le Petit Prince, Antoine de Saint Exupéry.

I. CONTEXTE AGRONOMIQUE, ECOLOGIQUE, ET POSITIONNEMENT DU SUJET 2

S ITUATION AGRONOMIQUE 2

S ITUATION DE LA BIODIVERSITE 3

P OSITIONNEMENT DU SUJET 4

II. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 7

II.A. R APPELS SUR LE CYCLE ET LA DIVISION CELLULAIRE 7

II.B. D E LA FECONDATION DES GAMETES A L ’ EMBRYON 15

II.B.1.Spécificités des gamètes de poisson 15

II.B.2.La rencontre des gamètes 19

II.B.3.L’activation de l’ovule 23

II.B.4.La fusion des pronoyaux 23

II.B.5.La formation de la première cellule : le blastodisque 25

II.C. D EVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE DU POISSON ROUGE 27

II.C.1.Période de clivage (2 à 64 cellules) 29

II.C.2.Blastulation (128 cellules à début d’épibolie) et activation du génome embryonnaire 31 II.C.3.Gastrulation (Gastrula de 50 % épibolie à bourgeon caudal) 33

II.C.4.Période de segmentation (1 à 26 somites) 35

II.C.5.Période pharyngienne (Pigmentation et circulation sanguine) 37

II.C.6.Eclosion 37

II.D. L E TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES POISSONS 41

II.D.1.Définitions du clonage 41

II.D.2.Historique du transfert nucléaire 42

II.D.3.Les usages du clonage 45

II.D.4.Les questions éthiques liées au clonage animal 47

II.D.5.Contraintes méthodologiques associées au transfert nucléaire chez les poissons 49 II.D.6.Questionnements liés au niveau de différenciation de la cellule donneuse pour le

succès du transfert nucléaire 55

II.D.7. Taux de succès du transfert nucléaire et qualité des embryons clonés chez les poissons

III. STRATEGIES SCIENTIFIQUES DE LA THESE 67

III.A. C HOIX DU MODELE : LE POISSON ROUGE 68

III.B. O BTENTION D ’ UN REFERENTIEL DE LA DYNAMIQUE NUCLEAIRE PRE ET POST - FECONDATION CHEZ LE POISSON

ROUGE 68

III.C. D EVENIR DES ADN MATERNEL ET SOMATIQUE 69

III.D. D EVELOPPEMENT D ’ UN NOUVEAU MODELE DE CELLULES DONNEUSES : LES CORPS EMBRYONNAIRES 69

I. MATERIEL BIOLOGIQUE 72

I.A. P REPARATION DES GENITEURS 72

I.B. P RELEVEMENT DES GAMETES 72

I.C. F ECONDATION IN VITRO ET CONTROLE DE LA QUALITE DES OVULES 73

II. PROCEDURE DU TRANSFERT NUCLEAIRE 73

III. MARQUAGE IN VIVO DE L’ADN DES GAMETES 74

III.A. M ARQUAGE DE L ’ADN DES SPERMATOZOÏDES 74

III.B. M ARQUAGE DE L ’ADN DES OVULES NON - ACTIVES 74

III.C. M ARQUAGE DE L ’ADN DES OVULES ACTIVES 76

III.D. M ARQUAGE DE L ’ADN DES OVULES FECONDES 77

IV. ANALYSE HISTOLOGIQUE DES OVULES, DES EMBRYONS ET DES CLONES 77

IV.A. F IXATION DES ECHANTILLONS 77

IV.B. M ISES AU POINT SPECIFIQUES LIEES AU MATERIEL ETUDIE 78

IV.C. C OUPES HISTOLOGIQUES ET MONTAGES 80

IV.D. I MMUNO - FLUORESCENCE ET MARQUAGE DE L ’ADN SUR COUPES 80

V. CARACTERISATION DES CORPS EMBRYONNAIRES 82

V.A. P RODUCTION DES CORPS EMBRYONNAIRES 82

V.B. T RAITEMENT A LA T RICHOSTATINE A DES CALOTTES EMBRYONNAIRES 82

V.C. E XTRACTION DES ADN ET ARN TOTAUX 84

V.D. A NALYSE DES NIVEAUX DE TRANSCRITS DES CORPS EMBRYONNAIRES 84 V.E. A NALYSE DE LA METHYLATION DE L ’ADN DES CORPS EMBRYONNAIRES 86

V.F. A NALYSE DES PROPORTIONS DE CELLULES EN MITOSE 90

V.G. A NALYSE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE PAR INCORPORATION DE B RD U 91 V.H. E STIMATION DE LA MORT CELLULAIRE PAR MARQUAGE A L ’ IODURE DE PROPIDIUM 92

VI. ANALYSES STATISTIQUES 92

I. MISE EN PLACE D’UN REFERENTIEL DE LA DYNAMIQUE NUCLEAIRE PRE ET POST-

FECONDATION CHEZ LE POISSON ROUGE 95

I.A. C ARACTERISATION DES ADN DE L ’ OVULE , DES SPERMATOZOÏDES ET DES EMBRYONS PAR MARQUAGE IN VIVO

97

I.A.1.Spermatozoïdes 97

I.A.2.Repérage de l’ADN maternel en métaphase II dans l’ovule non-activé et caractérisation

des signaux fluorescents 99

I.A.3.Caractérisation de l’ADN maternel après activation de l’ovule : Repérage du pronoyau

maternel et du second globule polaire 105

I.A.4.Repérage des pronoyaux maternel et paternel dans l’ovule fécondé 109 I.A.5.Conclusion des marquages in vivo de l’ADN pour établir un référentiel avant transfert

nucléaire 110

I.B. C ARACTERISATION DES ADN PAR HISTOLOGIE 110

I.B.1.Caractérisation par histologie de l’ADN maternel de l’ovule non-activé 111 I.B.2.Caractérisation de l’ADN par histologie lors de la première division post-fécondation 113

I.C. C ONCLUSION : CHOIX ET STRATEGIES 115

II. DEVENIR DE L’ADN MATERNEL ET SOMATIQUE APRES TRANSFERT NUCLEAIRE 116 II.A. D EVENIR DE L ’ADN MATERNEL ET SOMATIQUE APRES INJECTION DE LA CELLULE SOMATIQUE DANS LES OVULES

EN METAPHASE II 118

II.B. A NALYSE DU PROFIL D ’ EXPULSION DES GLOBULES POLAIRES APRES ACTIVATION DES OVULES CHEZ LES CLONES

120

II.C. C ARACTERISATION DU DEVENIR DES ADN ET DES BLASTOMERES PENDANT LA PREMIERE DIVISION CELLULAIRE

III. UN NOUVEAU MODELE POUR LE TRANSFERT NUCLEAIRE : LES « CORPS

EMBRYONNAIRES» 136

III.A. J USTIFICATION DE L ’ ETUDE 136

III.B. M ORPHOLOGIES DES CORPS EMBRYONNAIRES AVEC ET SANS TRAITEMENT A LA TRICHOSTATINE A 140 III.C. D YNAMIQUE DU CYCLE CELLULAIRE DES CORPS EMBRYONNAIRES TRAITES A LA TRICHOSTATINE A 142

III.D. V IABILITE DES CELLULES DE CORPS EMBRYONNAIRES 146

III.E. A NALYSE DE LA TAILLE DES CELLULES DES CORPS EMBRYONNAIRES TRAITES A LA TRICHOSTATINE A 148 III.F. A NALYSE DE METHYLATION DE L ’ADN DES CORPS EMBRYONNAIRES TRAITES A LA TRICHOSTATINE A 152 III.G. A NALYSE DES NIVEAUX DE TRANSCRITS DE GENES MARQUEURS DANS LES CELLULES DE CORPS EMBRYONNAIRES

TRAITES A LA TRICHOSTATINE A 154

III.H. D ISCUSSION 157

III.I. C ONCLUSION 162

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 164

E XPLICATION DE LA NEUTRALISATION DE L’ADN MATERNEL 164

E TENDUE DES DEFAUTS LIES AU CYCLE CELLULAIRE 166

I DENTIFICATION DE LEVIERS POUR L ’ AMELIORATION DE LA QUALITE CELLULAIRE DES CLONES 168 D EVELOPPEMENT D ’ UN MODELE PERMETTANT LA VALIDATION DES LEVIERS 175 P ERSPECTIVES D ’ APPLICATION D ’ OUTILS OPERATIONNELS POUR LA SAUVEGARDE DES RESSOURCES GENETIQUES 175

R EFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 179

A NNEXE 1. S YNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE - Les défauts cellulaires après transfert nucléaire chez les

mammifères 195

A NNEXE 2. P UBLICATION N °1 - Somatic cell nuclear transfer in non-enucleated goldfish oocytes :

understanding DNA fate during oocyte activation and first cellular division 220

A NNEXE 3. P UBLICATION N °2 - Testicular morphology and serum fatty acids are modified by paternal

low protein diet and methyl-donor supplementation 233

A NNEXE 4. P OSTER N °1 - Cellular and epigenetic reprogramming after nuclear transfer in fish :

characterization of clones defects in relation to the donor cell origin 269 A NNEXE 5. P OSTER N °2 - Compréhension des perturbations induites par le transfert nucléaire chez le carassin : caractérisation de la reprise de méiose et des premières mitoses 271 A NNEXE 6. P OSTER N °3 - Meiosis resumption and early mitosis after somatic cell nuclear transfer in non enucleated goldfish oocyte : understanding the cellular defects 273 A NNEXE 7. P OSTER N °4 - Production of offsprings from embryoid bodies : The challenges of nuclear

transfer 275

A NNEXE 8. F ICHES PROTOCOLES 277

Figure 1. Utilisation et consommation apparente de poisson dans le monde (FAO, 2018). Depuis les années 1950, la demande mondiale de poissons pour l’alimentation augmente. Cela est corrélé avec l’accroissement démographique (population). Entre 1961 et 2016, la consommation alimentaire mondiale de poissons a distancé l’accroissement de la population. Les poissons non destinés à la consommation humaine sont utilisés dans l’alimentation des poissons en aquaculture, dans les industries pharmaceutiques ou encore à des fins ornementales.

Figure 2. Production halieutique et aquacole mondiale, de 1990 à 2030 (FAO, 2018). L’aquaculture

pour la consommation humaine dépasse aujourd’hui celle issue de la pêche.

I. C ONTEXTE AGRONOMIQUE , ECOLOGIQUE , ET POSITIONNEMENT DU SUJET

Situation agronomique

« Les sociétés humaines sont confrontées à un immense défi : assurer un approvisionnement en nourriture et des moyens d’existence à une population qui dépassera largement les neuf milliards au milieu du XXIe siècle, tout en faisant face aux incidences disproportionnées du changement climatique et de la dégradation de l’environnement sur la base de ressources. Le Programme de développement durable à l’horizon 2030 (Programme 2030) […] consiste à engager le monde sur la voie de la durabilité et de la résilience […]. Depuis 1961, la croissance annuelle mondiale de la consommation de poisson est le double de la croissance démographique […]. Le secteur contribue de plus en plus à la croissance économique et à la lutte contre la pauvreté. […] Cependant, la pêche et l’aquaculture connaissent aussi des difficultés. Il faudrait, entre autres, réduire la part des stocks de poissons qui sont exploités au-delà de la limite de durabilité biologique ; veiller à ce que les problèmes liés à la biosécurité et aux maladies animales soient réglés. »

José Graziano da Silva Directeur général de la FAO La situation mondiale des pêches et de l’aquaculture, 2018

Dans un contexte d’accroissement démographique mondial et d'une augmentation de la

consommation de poissons par habitant de 1,5 % par an, la demande mondiale de poissons à des fins

alimentaires augmente, passant de 20 millions de tonnes en 1950 à 171 millions de tonnes en 2016

(Figure 1) (FAO, 2018). Pour pallier ces demandes de consommation humaine, et face à la

disponibilité limitée des ressources issues de la pêche, l’aquaculture s’est fortement développée,

passant de 13 millions de tonnes en 1990 à 88 millions de tonnes en 2019. Les statistiques de la FAO

montrent que ce chiffre ne va qu’augmenter dans les années à venir, en lien avec les progrès

technologiques et scientifiques en aquaculture, suggérant une production aquacole de 109 millions

donc dû être mises en place par la FAO, dès 1998. Elles font notamment écho à l’adoption de la Convention sur la Diversité Biologique (CDB) de Rio en 1992. Ces actions visent à garantir la conservation des ressources génétiques piscicoles et leur biodiversité.

Extrait de l’article 9.3 du Code de conduite de la FAO, 1998 :

« Les Etats devraient conserver la diversité génétique et maintenir l'intégrité des communautés et écosystèmes aquatiques [ …] »

« Les Etats devraient, lorsqu'il y a lieu, promouvoir la recherche et, lorsque c'est possible, la mise au point de techniques d'aquaculture pour protéger, régénérer et accroître les stocks d'espèces menacées d'extinction, en tenant compte de la nécessité impérieuse de conserver la diversité génétique des espèces menacées d'extinction [ …] ».

Cette nécessité de protection des ressources halieutiques en produisant des poissons d’élevage a imposé une optimisation des pratiques piscicoles pour les rendre compétitives et économes en ressources. Un levier important a été la mise en place de la sélection génétique qui a permis d’améliorer la croissance des poissons à partir d’une même quantité de nourriture, leur résistance aux maladies pour diminuer les pertes de cheptel, ou leur aptitude à supporter des aliments moins riches en produits animaux (diminution des proportions de farines et huiles de poisson). L’augmentation de la valeur génétique des cheptels du fait de leur sélection sur plus de 10 générations aujourd’hui a conduit la profession à rechercher la sécurisation de ces ressources génétiques, en faisant notamment appel aux biotechnologies de cryoconservation.

Situation de la biodiversité

La biodiversité mondiale, alors qu’elle est encore en cours de caractérisation, subit du fait de l’anthropisation galopante, une accélération de son érosion à tel point que l’on parle d’une sixième extinction (Kolbert, 2015) en référence aux extinctions rencontrées au cours des ères géologiques.

L’Ichtyodiversité, prise ici au sens large (Chondrichtyens, Actinoptérygiens…), représenterait 27 % de

la biomasse générée par les animaux (Bar-On et al., 2018). Selon l’IUCN, entre 6 et 58 % des espèces

selon les différentes familles de poissons, seraient menacées au niveau mondial, et 16 % des espèces

d’eau douce le seraient en France métropolitaine. Si la première action à mener pour protéger cette

ichtyodiversité doit porter sur la protection des milieux naturels et sur la gestion de la pêche

artisanale comme industrielle, il n’en demeure pas moins que devant l’urgence de la situation, en

particulier pour les espèces en voie d’extinction, d’autres outils de préservation doivent être mis en

place pour permettre une préservation à court terme en attendant une amélioration durable de l’environnement de ces espèces.

Positionnement du sujet

Afin de sécuriser tous les programmes de sélection génétique (conservation de la diversité génétique initiale et de la sélection acquise), mais également le patrimoine génétique d’espèces sauvages, des cryobanques ont été mises en place. Actuellement dans le monde, quelques centres de ressources biologiques aquacoles permettent la cryoconservation (conservation en azote liquide à - 196 °C) du patrimoine génétique de nombreuses espèces de poissons, contenu dans les spermatozoïdes, les cellules germinales souches, les cellules embryonnaires ou somatiques (cellules de nageoire par exemple) (Martinez-Paramo et al., 2017).

En France, la restauration d’individus à partir de ces cellules cryoconservées, via la mise en place de biotechnologies de la reproduction, constitue aujourd’hui un objectif dans des instituts de recherche comme l’INRA (Institut national de la recherche agronomique) et l’Ifremer (Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer).

Chez les poissons, contrairement aux mammifères, il est actuellement impossible de cryoconserver les œufs (ovules) ou les embryons entiers du fait de la présence d’une importante réserve nutritive (vitellus) et d’une membrane externe (chorion) permettant le développement embryonnaire externe des embryons (Chenais et al., 2014). Aujourd’hui, la régénération d’individus ne peut donc se faire qu’à partir du patrimoine génétique paternel (spermatozoïdes) ou de cellules germinales souches cryoconservées. Ce matériel biologique nécessite de disposer d’animaux à des stades de maturité sexuelle bien précis, ce qui limite le champ d’applications lorsqu’il s’agit d’individus précieux exposés à un risque soudain (accident d’élevage, épizootie), ou d’espèces sauvages en danger.

Les scientifiques travaillent ainsi sur des méthodes de régénération de géniteurs à partir

d’autres types cellulaires. Le transfert nucléaire, autrement appelé clonage, est une de ces stratégies

ressource porteuse du génome, a l’intérêt de ne pas être invasive puisqu’elle ne nécessite pas le sacrifice de l’animal donneur. En effet, la nageoire possède des capacités de régénération intrinsèque qui rend la collecte d’un petit fragment peu invalidante pour l’animal. La collecte de ce tissu peut en outre être réalisée à partir de n’importe quel individu, peu importe son âge et son stade de maturité sexuelle, son sexe et sa préciosité génétique. De plus, la cryoconservation de fragments ou de cellules de nageoire est aujourd’hui maitrisée chez de nombreuses espèces de poissons (Chenais et al., 2014). Disposer d’une technique de transfert nucléaire opérationnelle permettra alors de tirer profit des nombreux tissus somatiques stockés au sein des cryobanques pour régénérer des individus reproducteurs, à la base du renouvellement de lignées d’intérêt. En cas de perte de lignées précieuses ou d’extinction d’une espèce sauvage, le transfert nucléaire pourra devenir une option intéressante de régénération. Pour autant, une limite actuelle de cette biotechnologie réside dans le faible taux de succès constaté chez de nombreuses espèces de poissons. Les embryons arrêtent leur développement de manière précoce, et les quelques survivants présentent des anomalies morphologiques importantes, des aneuploïdies, les rendant souvent stériles et inaptes à la survie et à la reproduction.

Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse était de mieux comprendre l’origine des défauts

des embryons issus de transfert nucléaire chez les poissons, afin de dégager des pistes

d’amélioration de cette technique. Afin d’appréhender les différents questionnements scientifiques

de cette thèse, il était essentiel de s’approprier les fondamentaux de biologie cellulaire mis en jeu

lors du développement précoce, et les spécificités biologiques et techniques du transfert nucléaire

chez les poissons. Une introduction bibliographique permettra donc de rappeler quelques notions de

cycle cellulaire et d’expliciter les évènements cellulaires lors de la fécondation et le développement

précoce chez le poisson. Cette introduction bibliographique abordera également, le transfert

nucléaire, ses contraintes méthodologiques et l’état de l’art spécifique aux poissons. Suite à cette

étude bibliographique, nous poserons les questionnements scientifiques de la thèse et les stratégies

expérimentales choisies seront expliquées. Une deuxième partie de la thèse décrira ensuite les

méthodes générales utilisées lors des expérimentations. Elle sera suivie d’une troisième partie

contenant les trois chapitres expérimentaux de la thèse et leur discussion. Une discussion générale

reprendra les principaux acquis de ce travail et en présentera les perspectives.

Figure 3. Schéma des différentes phases du cycle cellulaire (Lamond, 2002). La cellule grossit

pendant l’interphase, qui se constitue de plusieurs phases : la phase G1, S (réplication de l’ADN), et

G2. Ensuite, la cellule, son stock d’ADN et de cytoplasme, se divisent pendant la mitose (phase M).

II. I NTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE

Le travail de cette thèse s’appuie sur un grand nombre de connaissances autour de la biologie du développement du poisson. Dans la présente introduction bibliographique, nous aborderons quelques rappels génériques concernant le cycle cellulaire et la dynamique de division, qui sont des évènements au cœur de nos questionnements pendant le développement embryonnaire. Ensuite, nous décrirons les différentes étapes menant à la formation d’un embryon de poisson, afin d’identifier les phases critiques du développement et les spécificités biologiques liées au modèle poisson, pouvant expliquer les évènements observés lors du transfert nucléaire. Enfin, nous introduirons le transfert nucléaire chez les poissons, son principe et ses applications, ainsi que les facteurs dès lors réputés pour influencer le succès de cette biotechnologie. L’ensemble de cette synthèse constituera une base essentielle à la compréhension des résultats de la thèse.

Face au caractère très large des domaines abordés dans ce travail, incluant le cycle cellulaire, son contrôle et ses désordres, le développement embryonnaire, le transfert nucléaire chez les mammifères et poissons, et enfin la différenciation et reprogrammation cellulaire, nous avons choisi de ne pas faire un état de l’art exhaustif de tous ces domaines. Nous avons concentré les informations sur les données essentielles à la compréhension de la thèse, sans faire toujours référence à l’ensemble des publications sous-jacentes à ces données. Par ailleurs, beaucoup des notions développées ici sont issues d’un travail bibliographique de trois mois réalisé en début de thèse, présenté en annexe 1, qui a permis l’appropriation du sujet, et dans lequel des informations plus exhaustives peuvent être trouvées.

II.A. Rappels sur le cycle et la division cellulaire

La mise en place du développement embryonnaire est un processus complexe faisant

intervenir de nombreux processus moléculaires et physiologiques, incluant la division cellulaire. Les

différentes phases du cycle cellulaire sont universelles dans le monde vivant. Le cycle cellulaire, qui

correspond au cycle de vie d’une cellule, se compose de plusieurs phases durant lesquelles la cellule

duplique son matériel génétique (la réplication ou phase S) et se divise (la mitose ou phase M) pour

Figure 4. Structure d’un centrosome : deux centrioles et du matériel péri-centriolaire (PCM).

Figure 5. Les différentes phases de la duplication du centrosome au cours du cycle cellulaire .

Schéma repris de la revue de Delattre et Gonczy (2004). La duplication des centrosomes est

étroitement liée au cycle de réplication et de division de l’ADN. En phase G1, la cycline-CDK2 induit

une désorganisation du centrosome. Ses deux centrioles perdent leur orientation orthogonale. Au

cours de la réplication (phase S), chacun des deux centrioles (représentés en noir et gris sur la figure)

se duplique, via l’allongement de nouveaux centrioles de manière perpendiculaire (représentés en

blanc sur la figure). En phase G2, les centrioles initiaux se séparent complètement, et le matériel

péri-centriolaire se divise, formant deux centrosomes matures. Au moment de l’entrée en mitose,

juste avant la rupture de l’enveloppe nucléaire, les centrosomes (centrioles et matériel péri-

centriolaire) vont commencer à migrer à des pôles différents en périphérie du noyau et vont entamer

la synthèse de microtubules via la nucléation, c’est-à-dire l’assemblage des dimères de tubuline, puis

l’élongation où les microtubules croissent en longueur. Chaque microtubule reste donc attaché à son

centrosome (Delattre et Gonczy, 2004).

En phase G1, la cellule va grossir et fabriquer des protéines indispensables à son activité et à sa division. Des molécules appelées cyclines et CDK (Cyclin-dependent kinase) vont lui permettre de passer à la phase suivante, la phase S (Lamond, 2002 ; Suryadinata et al., 2010). Il s’agit d’une phase de réplication (synthèse) de l’ADN, où la cellule double sa quantité d’ADN. Elle duplique également une structure cellulaire importante pour les phases suivantes de division, le centrosome (Lamond, 2002).

Le centrosome est un organite situé dans le cytoplasme de la cellule. Il s’agit d’un centre organisateur de microtubules (ou MTOC) composé d’une paire de centrioles et d’une matrice protéique qui les entoure (la matrice péri-centriolaire) (Figure 4). Les centrioles sont des structures cylindriques composées de 9 doublets de microtubules. Les deux centrioles qui forment le centrosome sont reliés entre eux par une structure filamenteuse lâche (Delattre et Gonczy, 2004, Schatten et Sun, 2009). La duplication du centrosome lors de la phase S se met en place à partir de chacun des centrioles (Figure 5). Le centrosome a pour rôle la nucléation (fabrication) d’un des éléments constituant le cytosquelette de la cellule, les microtubules. Les microtubules sont composés d’hétérodimères de tubuline (α et β), composé d’une extrémité « + » à croissance rapide du côté des chromosomes, et d’une extrémité « - » du côté du centrosome. Ils permettent le transport cytoplasmique (de protéines, vésicules etc…), la migration cellulaire, la symétrie de division, et jouent un rôle primordial dans la division cellulaire. Avant la mitose, les centrosomes polymérisent des microtubules qui rayonnent en étoile autour de chacun d’eux et que l’on appelle

« asters ». L’ensemble des microtubules, du matériel péri-centriolaire et des centrioles constituent l’appareil microtubulaire (Delattre et Gonczy, 2004 ; Schatten et Sun, 2009).

Après réplication de l’ADN et du centrosome, la cellule se trouve en phase G2 pendant laquelle elle continue de remplir ses fonctions. La chromatine s’y trouve sous une forme décondensée dans le noyau pour permettre aux gènes utiles à la fonction de la cellule d’être exprimés. L’ADN est toujours enfermé dans la membrane nucléaire (Lamond, 2002).

Ensuite, la cellule entre en mitose (phase M). Durant la prophase de mitose, l’ADN dupliqué

se condense et l’un des centrosomes migre à l’opposé de l’autre grâce aux microtubules polaires. A

Figure 6. Différents types de microtubules au cours de la mitose, émanant des centrosomes . Les microtubules astraux permettent de maintenir et d’ancrer les centrosomes à la membrane plasmique. Les microtubules polaires (« interpolar ») interagissent entre eux au centre du fuseau bipolaire pour maintenir les centrosomes à leurs pôles respectifs. Les microtubules kinétochoriens assurent l’accrochage des chromosomes au niveau des kinétochores. © 2014 Nature Education

Figure 7. Comparaison des dynamiques microtubulaires en fonction du type cellulaire. Dans les petites cellules, les centrosomes sont positionnés à des pôles opposés autour de la zone nucléaire, et possèdent un aster de microtubules en étoile. Ce n’est qu’en pro-métaphase que les microtubules astraux s’ancrent dans le cortex pour maintenir et positionner le fuseau. En métaphase, les microtubules kinétochoriens ont aligné les chromosomes sur le plan équatorial. Les chromosomes se séparent en anaphase par des forces de traction exercées par les dynéines et provenant du cortex.

Dans les cellules larges, ce sont les asters des centrosomes qui s’ancrent au cortex et positionnent le

fuseau. L’aster disparait ensuite par catastrophe (dépolymérisation) et le fuseau reste à la

localisation définie en prophase. Les microtubules astraux et kinétochoriens sont synthétisés, et

exercent leurs rôles. En anaphase, les microtubules astraux n’ont toujours pas atteint le cortex, mais

les chromatides sœurs sont séparées par des forces provenant des dynéines cytoplasmiques.

les microtubules polaires qui interagissent entre eux pour maintenir la séparation des centrosomes à leurs pôles respectifs. En pro-métaphase, des microtubules astraux orientés tout autour des centrosomes sont synthétisés et permettent d’ancrer les centrosomes au cortex cellulaire (couche spécialisée de cytoplasme, située sur la face interne de la membrane plasmique, qui lui sert de support mécanique). Enfin les microtubules kinétochoriens assurent l’accrochage des chromosomes au niveau de leurs centromères (la région de contact entre deux chromatides sœurs). Ce sont les microtubules kinétoriens qui permettent, par dépolymérisation (catastrophes), la séparation des chromatides sœurs et d’effectuer la ségrégation (séparation) des chromosomes dans les cellules filles (Lamond, 2002).

La seconde phase de la mitose est la métaphase où les chromosomes s’alignent sur une plaque équatoriale métaphasique, à l’extrémité des microtubules kinétochoriens, au centre du fuseau de division. Les microtubules kinétochoriens et polaires sont dans une dynamique équilibrée de polymérisation et dépolymérisation. Ils gardent des longueurs équivalentes et constantes aux deux pôles pour assurer le centrage de la métaphase sur la plaque équatoriale. Dans les cellules de plus grande taille comme les cellules d’embryons de 1 à 8 cellules, le mécanisme de centrage de la métaphase est différent. En effet, le large volume des cellules rend impossible l’ancrage des microtubules astraux au niveau du cortex cellulaire. L’orientation et le positionnement du fuseau se fait donc avant même la mitose, lorsque les centrosomes, localisés aux pôles opposés, disposent de microtubules organisés en asters. L’aster a quant à lui eu le temps de s’ancrer au cortex et de positionner centralement le futur fuseau avant l’entrée en mitose. Dès la fin de prophase, ces microtubules subissent des catastrophes, laissant place à des microtubules astraux non attachés au cortex durant la métaphase (Figure 7, Figure 8) (Wuhr et al., 2010).

Au moment de l’anaphase, on assiste à la ségrégation des chromosomes. Les chromosomes

de deux chromatides sœurs sont séparés de manière synchrone et migrent en direction opposée vers

les pôles à la suite d’un raccourcissement des microtubules kinétochoriens à leurs extrémités « plus »

par dépolymérisation rapide mais également grâce à l’éloignement des pôles. Les pôles des fuseaux

s’écartent grâce à un allongement des microtubules polaires et à des forces de traction issues de

l’interaction des microtubules astraux et du cortex cellulaire. Ces forces sont, entre autres, générées

Figure 8. Organisation de l’ADN et des fuseaux de division lors de la première division d’un embryon de grenouille (cellules larges) observée en microscopie à fluorescence (Wuhr et al., 2010).

Les embryons de grenouilles ont été allongés artificiellement par compression et fixés. Par immunofluorescence, les microtubules ont été marqués (jaune) ainsi que les centrosomes (rouge). En prophase, les centrosomes sont déjà localisés à des pôles opposés, avant même la rupture de l'enveloppe nucléaire. Les microtubules issus de l’aster sont ancrés dans le cortex de la cellule et positionnent le fuseau avant de se dépolymériser en métaphase pour laisser place aux microtubules astraux et kinétochoriens. En anaphase et télophase, les microtubules astraux se polymérisent en direction du cortex.

Figure 9. Les deux processus de l’anaphase permettant la ségrégation chromosomique.

Enfin, durant la télophase, les chromatides sœurs séparées se trouvent aux pôles opposés de la cellule. Leur ADN commence à se décondenser et une membrane nucléaire se reforme. Le cytoplasme se divise également, en fonction du positionnement du fuseau mitotique. Le sillon de division apparaît dans le plan de la plaque métaphasique, c’est-à-dire perpendiculairement au fuseau, via la formation d’un anneau contractile d’actine et de myosine qui invagine la membrane (Maddox et al., 2012).

Durant toutes ces phases du cycle cellulaire (Figure 10), des « points de contrôle » vont être effectués par des mécanismes protéiques contrôlant l’intégrité du matériel génétique. Ces

« checkpoints » vérifient que l’ADN ne comporte pas de lésions, qu’il est correctement dupliqué et réparti équitablement dans les cellules filles après la mitose. La cellule fille produite peut alors repartir dans un nouveau cycle cellulaire, en phase G1, ou bien entrer dans une phase G0 qui est une période de quiescence où la cellule est non-proliférative (Lamond, 2002).

C ONCLUSION

Un cycle cellulaire fonctionnel implique donc une duplication conforme des centrosomes.

Cela aboutit à une organisation microtubulaire particulière et précise, nécessaire au positionnement du fuseau de division sur le plan équatorial, afin d’aboutir à une division cytoplasmique symétrique de la cellule.

Cependant, des divergences dans le centrage du fuseau de division apparaissent entre les

petites cellules, comme les cellules somatiques, et les cellules plus larges, comme les premières

cellules embryonnaires. Ces différences impliquent des mécaniques microtubulaires différentes en

fonction de la nature de la cellule. Il faudra ainsi être attentif quant à la capacité de formation d’un

fuseau d’une petite cellule somatique dans une large cellule comme l’ovule.

Figure 10. Organisation de l’ADN et des fuseaux de division lors des différentes phases de la division cellulaire observées en microscopie à fluorescence dans des cellules pulmonaires de triton fixées (Rieder et Khodjakov, 2003). Les noyaux ont été marqués au Hoechst 33342 (bleu) et les microtubules ont été colorés avec des anticorps fluorescents (vert).

(A) Noyau en interphase avec des chromosomes décondensés et aster de microtubules localisés en dehors du noyau.

(B) Noyau en prophase avec des chromosomes condensés, et les microtubules émanant des deux pôles centrosomaux opposés.

(C-D) Noyaux en métaphase avec des chromosomes condensés, s’alignant sur un plan équatorial, grâce aux deux pôles de microtubules.

(E-F) Noyaux en anaphase avec des chromosomes condensés, se séparant aux deux pôles de microtubules.

(G) Noyau en télophase avec des chromosomes condensés, et la formation d’un sillon de division.

(H) Noyau en fin de mitose, avec des chromosomes décondensés et un réseau de microtubules

étendus dans toute la cellule.

II.B. De la fécondation des gamètes à l’embryon

Dans ce chapitre, nous nous intéresserons à notre modèle d’étude, l’ovule et l’embryon de poisson rouge. Nous aborderons brièvement les évènements de l’ovogenèse importants pour la compréhension de la thèse, ainsi que la fécondation et le développement embryonnaire.

II.B.1. Spécificités des gamètes de poisson II.B.1.a. L’ovogenèse

L’ovocyte est issu d’un processus d’ovogenèse, annuel chez le poisson rouge, pendant lequel des cellules germinales indifférenciées, les ovogonies, se divisent et se différencient en des cellules hyperspécialisées haploïdes capables d’assurer une fécondation et un développement embryonnaire, les ovules (Lubzens et al., 2010 ; Wootton et Smith, 2015).

L’ovogenèse débute par la différenciation de cellules germinales souches en ovogonies.

Après une phase de prolifération intense de ces cellules, les ovogonies entrent en division méiotique,

au cours de laquelle elles vont subir d’importants changements structuraux, nucléaires et

cytoplasmiques. Une fois leurs ADN dupliqués lors de la phase S dite pré-meiotique, les ovogonies

entrent et se bloquent en prophase de première division méiotique (stade diplotène). Elles

constituent alors les ovocytes primaires ou ovocytes I. Cette période de blocage du cycle de division

constitue une phase importante d’accumulation de matériel (ARNm, protéines, lipides, vitamines)

nécessaire au développement du futur embryon dans le milieu externe. Cette phase d’accroissement

est appelée vitellogenèse, du fait de l’incorporation massive chez les poissons des produits de la

vitellogénine sécrétée par le foie de la femelle. Ainsi, progressivement, l’ovocyte va prendre du

volume avec l’accumulation de ces réserves vitellines. A la fin de cette phase de croissance, les

cellules somatiques ovariennes qui entourent l’ovocyte sécrètent la membrane protectrice du futur

ovule, le chorion. L’ADN de l’ovocyte primaire (2n, 2c : chromosomes en paire à 2 chromatides),

jusque-là bloqué en prophase, subit ensuite une division réductionnelle asymétrique pour former

l’ovocyte secondaire (1n, 2c). La deuxième moitié du patrimoine génétique de l’ovocyte primaire est

expulsé dans une petite cellule très pauvre en cytoplasme : le premier globule polaire. Sous

l’impulsion du MPF (mitosis/meiosis promoting factor), l’ovocyte secondaire continue sa division,

Figure 11. Les différentes étapes de l’ovogenèse chez les poissons téléostéens (Schéma repris de Lubzens et al., 2010), de l’ovocyte primaire à l’ovule mature. En fin d’ovogenèse et lors de l’ovulation, l’ovocyte est bloqué en métaphase de deuxième division méiotique. Il ne quittera ce stade que lors de l’activation de l’ovule, et la fécondation. GV : vésicule germinative.

Figure 12. Les différentes localisations des ARNm maternels accumulés pendant l’ovogenèse chez

le poisson-zèbre (Howley et Ho, 2000 ; Lubzens et al., 2017). La majeure partie des transcrits

maternels sont distribués de façon homogène dans l'ovocyte (ubiquitous), mais se relocalisent au

niveau du pôle animal lors de l’activation de l’ovule à la fécondation. D’autres ARNm se localisent

directement au pôle animal pendant l'ovogenèse (il existe des différences temporelles en ce qui

concerne le stade auquel cela se produit), et restent à ce pôle lors de l'activation des ovules. Des

ARNm se localisent dans le pôle végétatif pendant l'ovogenèse et y restent lors de l’activation. Enfin,

des ARNm se positionnent à la périphérie de l’ovule, au niveau du cortex de l'ovocyte, et se

relocalisent au pôle animal lors de l'activation de l'ovule.

histones H1 impliquées dans la condensation des chromosomes. Le blocage au stade MII est très particulier puisqu’il suppose le maintien de niveaux élevés de MPF dans l’ovocyte permettant le maintien des chromosomes à l’état condensé. La sortie de méiose est empêchée par la stabilisation du MPF grâce à un autre facteur, le CSF (cytostatic factor). L’ADN de l’ovocyte secondaire « mature » est donc condensé et aligné sur le plan équatorial en plaque métaphasique en attendant l’ovulation (Figure 11) (Lubzens et al., 2010 ; Kagawa, 2013). L’ovocyte mesure alors près d’un millimètre de diamètre chez le poisson rouge.

En période de reproduction, en début d’été chez le poisson rouge, les ovocytes matures sont tous ovulés en même temps sous l’effet de l’augmentation de la température de l’eau. Ils sont ainsi libérés dans la cavité ovarienne où ils attendent leur émission lors du frai (comportement de reproduction entre le mâle et la femelle). Les ovocytes vont être ovulés dans le milieu extérieur avec leur liquide cœlomique et former une ponte. A ce moment, les ovocytes sont appelés ovules et leur matériel nucléaire est bloqué en métaphase II. Plusieurs travaux de microscopie électronique ont caractérisé différentes régions de l’ovule de poisson à ce stade (Hart et Pontier, 1979 ; Brummett et Dumont, 1981 ; Hart et Fluck, 1995). Une représentation générale qui englobe un maximum d’espèces dont le poisson-zèbre (Hart et Becker, 1992) inclut la présence d’une masse centrale de réserves vitellines. Une structure périphérique cytoplasmique contenant des granules corticaux, souvent plus épaisse dans la région du micropyle est également décrite. Des variations sont rapportées selon l’espèce, et une représentation de l’ensemble de l’ovule qui englobe également la position de la métaphase II manque toujours chez le poisson rouge.

II.B.1.b. L’accumulation des ARNm et polarisation de l’ovule de poisson

Au cours des étapes de l’ovogenèse et de la vitellogenèse, l’ovocyte se polarise. Des ARN

messagers maternels (transcrits de gènes à effet maternel) sont accumulés et se localisent dans des

régions spécifiques de l’ovocyte. Certains ARNm sont localisés dans la région corticale de l’ovocyte,

d’autres au pôle animal ou au pôle végétatif de l’ovule (Figure 12). Cette régionalisation joue un rôle

important dans l’établissement des axes antéro-postérieur et dorso-ventral du futur embryon. En

effet, suite aux premières divisions, les cellules embryonnaires précoces n’ayant pas les mêmes

Figure 13. Diversité dans la contribution paternelle à la formation du centrosome zygotique (revu d’après Delattre et Gonczy, 2004). Chez toutes les espèces, les ovules sont des cellules acentriolaires.

Ils ne possèdent pas de centrioles, mais disposent de matériel péri-centriolaire. Quelle que soit

l’espèce, les spermatozoïdes n’apportent pas de matériel péri-centriolaire. En revanche, ils

n’apportent pas tous le même bagage centriolaire. Chez les amphibiens et les poissons, notamment

le poisson-zèbre, un cyprinidé comme le poisson rouge, les spermatozoïdes apportent deux

centrioles. Chez les insectes et les primates, ils n’en apportent qu’un seul. Chez la souris, aucun

centriole paternel n’est apporté, comme c’est également le cas dans les situations de reproduction

parthénogénétique. Ainsi, la formation du centrosome de l’embryon est différente en fonction des

espèces ce qui conduit à des mécanismes de formation des fuseaux de division différents

II.B.1.c. Le matériel centrosomal de l’ovule et du spermatozoïde

Nous l’avons vu auparavant, le centrosome, composé de deux centrioles et du matériel péri- centriolaire, joue un rôle important dans la formation des fuseaux de division dans les cellules mitotiques. Toutefois, les gamètes ne disposent pas d’appareils centrosomaux complets. Pendant l’ovogenèse, l’ovocyte perd ses centrioles et devient acentriolaire (Figure 13). Il ne garde dans son cytoplasme que les protéines du matériel péri-centriolaire (Manandhar et al., 1998 ; Simerly et al., 1999 ; Schatten et Sun, 2009). Chez les poissons et les amphibiens, le spermatozoïde quant à lui apporte uniquement les deux centrioles dépourvus de matériel péri-centriolaire (Figure 13). Cette situation décrite chez les poissons n’est cependant pas universelle. En effet, chez les insectes et les primates, le spermatozoïde n’apporte qu’un seul centriole (Figure 13), car lors de la deuxième division de méiose de la spermatogenèse, le centrosome n’est pas dupliqué. La duplication du centriole se fait donc après fécondation pour former le centrosome du zygote (Delattre et Gonczy, 2004). Chez les rongeurs (souris et rat), les spermatozoïdes présentent une dégradation totale de leur matériel centrosomal pendant la spermatogenèse. Ils ne possèdent donc, une fois matures, aucun centriole ni protéine centrosomale (Figure 13) (Manandhar et al., 1998). La formation du premier fuseau de division embryonnaire chez la souris et le rat se fait donc grâce à la présence d’asters cytoplasmiques et d’une synthèse de novo de microtubules. C’est la présence de l’ADN et de certaines protéines associées à l’ADN qui stimule une signalisation protéique capable d’induire l’assemblage du fuseau mitotique. Ce n’est qu’au moment de la pré-implantation (4 jours après la fécondation chez la souris) que des centrioles apparaissent dans les cellules embryonnaires, permettant d’amorcer les divisions cellulaires de manière centrosomale (Manandhar et al., 1998 ; Delattre et Gonczy, 2004 ; Tomioka et al., 2007 ; Coelho et al., 2013). Ceci nous montre la grande plasticité évolutive des protéines à l’origine des premières divisions embryonnaires, et l’existence de mécanismes assurant la formation de fuseaux mitotiques sans appareillage centrosomal.

II.B.2. La rencontre des gamètes

Au moment de la fécondation, les spermatozoïdes et les ovules de carassin sont émis dans

l’eau. Alors qu’ils sont immobiles dans les canaux déférents du mâle, les spermatozoïdes deviennent

mobiles au contact de l’eau sous l’effet de la baisse d’osmolarité du milieu (Morisawa, 1994).

Figure 14. Schéma de micropyle avec son vestibule et le canal micropylaire permettant le trajet du spermatozoïde vers la membrane de l’ovule (Wootton et Smith, 2015).

Figure 15. Micropyles de poisson rouge (Yanagimachi et al., 2017).

(A-C) Schéma illustrant différentes vues : (A) du dessus, (B) de profil, (C) et en coupe transversale, de micropyle.

(D-F) Images de microscopie électronique à balayage d'un ovule de poisson rouge ; (D) rainures disposées radialement sur le chorion, autour du micropyle. Une flèche en (E) indique l'ouverture extérieure du micropyle.

(G) Région du micropyle sur le chorion isolé d'un ovule de poisson rouge.

(H, I) Vue latérale du micropyle de deux autres espèces de poisson, respectivement la loche et le poisson-zèbre.

Figure 16. Photos de micropyles observés sur les ovules de poisson rouge (données personnelles).

L’entrée (vestibule) du micropyle est discernable par les petites aspérités à la surface de l’ovule

(photo de gauche). La présence d’une dépression (photo du milieu) et la forme en entonnoir (photo

de droite) contribuent au guidage du spermatozoïde vers la membrane plasmique de l’ovule, au fond

du micropyle.

canal en forme d’entonnoir formé par l’invagination des membranes de l’ovule lors de l’ovogenèse.

Chez les espèces de poissons téléostéens où le spermatozoïde ne dispose pas d’acrosome, ce canal permet l’accès du spermatozoïde à la membrane plasmique de l’ovule et la fusion des gamètes (Figure 14, Figure 15, Figure 16) (Hart et Donovan, 1983 ; Lee et al., 1999). La fusion des membranes plasmiques des gamètes induit une dépolarisation de la membrane ovocytaire (Nuccitelli, 1987 ; Iwamatsu et al., 1991). Des protéines de la famille des Src kinases activent la voie de signalisation de la phospholipase/IP3 (Wu et Kinsey, 2000 ; Wu et Kinsey, 2002). L’augmentation de la concentration en IP3 (Inositol triphosphate) permet alors d’induire une libération de calcium contenu dans les réticulums endoplasmiques localisés près du micropyle. L’influx intracellulaire de calcium se propage ensuite dans tout l’ovule afin d’induire l’exocytose des granules corticaux, et ainsi induire ce que l’on appelle la réaction corticale. D’autres vagues oscillantes de calcium suivent cette première vague au cours de l’activation ovocytaire, et sont impliquées dans la contraction ovocytaire et la ségrégation du cytoplasme et du compartiment vitellin (Hart et Donovan, 1983 ; Iwamatsu et al., 1991 ; Kinsey et al., 2007).

La libération hors du cytoplasme du contenu des granules corticaux, contenant beaucoup de protéines comme des glycoprotéines ou des protéases, conduit au décollement et gonflement du chorion de l’ovule, qui se sépare de la membrane plasmique (Figure 17) (Hart et Yu, 1980 ; Iwamatsu et al., 1991). La matrice extracellulaire, entre le chorion et la membrane plasmique de l’ovule, est restructurée sous l’effet de ce contenu protéique relargué. Le chorion subit en outre des remaniements protéiques conduisant à l’acquisition d’un pouvoir d’adhésion de sa surface externe.

Cela permet à l’ovule activé de se coller à un support physique comme les plantes ou la boite de Pétri. Cela contribue in fine à la protection mécanique et biochimique du futur embryon contre l’environnement aqueux éventuellement instable dans lequel il va se développer.

Ce remaniement du chorion a également pour but d’éviter la polyspermie puisque les

protéines relarguées réduisent l’affinité des spermatozoïdes à l’ovule. La polyspermie est également

évitée grâce au faible diamètre du micropyle et la présence de microvillosités au bout de ce long

canal micropylaire. De plus, le gonflement et décollement du chorion permettent également de

boucher l’orifice du micropyle (Figure 18) (Hart et Donovan, 1983 ; Iwamatsu et al., 1991 ; Kinsey et

Figure 17. Ovules de poisson rouge avant et après fécondation (Photos N. Chenais). Avant fécondation, les ovules baignent dans leur liquide cœlomique, ce qui les maintient dans un état

« inactivé » (photo de gauche). Après libération dans l’eau et fécondation éventuelle par des spermatozoïdes, le chorion se décolle de la membrane plasmique de l’ovule suite à la réaction corticale (photo de droite).

Figure 18. Evènements lors de la rencontre spermatozoïde/ovule chez le poisson (Iwamatsu et al.,

1991). Lors de la fécondation, le spermatozoïde entre dans le micropyle jusqu’à atteindre la

membrane de l’ovocyte. La polyspermie est évitée par deux mécanismes : le diamètre du micropyle

qui ne donne accès à la membrane de l’ovule qu’à un seul spermatozoïde à la fois, et la réaction

corticale via la libération des granules corticaux et le gonflement du chorion (Ca : granules corticaux,

Ch : chorion).

II.B.3. L’activation de l’ovule

Lors de l’activation de l’ovule, la chute du CSF et du MPF est indispensable pour permettre à la cellule de finir sa division méiotique. L’influx de calcium lors de la fécondation induit la dégradation du MPF, en activant un complexe, l’APC (Anaphase Promoting Complex) responsable in fine de la ségrégation des chromosomes (Schmidt et al., 2006). Les deux jeux de chromosomes maternels sont alors séparés selon un processus de cytokinèse asymétrique, expulsant la moitié du matériel génétique dans le second globule polaire. En fin de méiose, la membrane nucléaire de l’ovule se reforme et la chromatine se décondense, constituant le pronoyau femelle (Hart et Donovan, 1983 ; Iwamatsu et Kobayashi, 2002 ; Dekens et al., 2003).

L’activation de l’ovule, de sa reprise de méiose à la réaction corticale, n’est pas nécessairement inféodée au processus de fécondation par un spermatozoïde. Elle peut également se faire spontanément, au contact de facteurs naturels ou expérimentaux (Wolenski et Hart, 1988).

Chez le poisson rouge, l’activation de l’ovule est provoquée au seul contact de l’eau. Chez le médaka, l’ovule est activé à la suite d’une simple piqûre physique (Uwa, 1967).

Il a cependant été montré chez le poisson-zèbre que, à la différence d’une activation par fécondation, l’activation spontanée de l’ovule sans passer par la fécondation ne provoque pas les mêmes cascades de signalisation (Lee et al., 1999 ; Wu et Kinsey, 2000). L’activation de certaines protéines Src-kinases dans l’ovule fécondé n’a pas été détectée dans les ovules activés spontanément, comme la protéine Fyn (Wu et Kinsey, 2000). Cette protéine serait impliquée dans le maintien du pôle animal/végétatif, dans la formation de la première cellule et dans l’élaboration des plans de clivage. L’ovule activé non-fécondé ne présente pas non plus toutes les oscillations de calcium au niveau du cortex ovocytaire (Lee et al., 1999). Ainsi, les cascades de signalisation différentes engagées lors de fécondation ou d’activation spontanée de l’ovule pourraient impacter la mise en place des évènements embryonnaires précoces.

II.B.4. La fusion des pronoyaux

Nous avons vu qu’après la reprise de méiose et l’expulsion du second globule polaire, la

membrane nucléaire se reforme autour de la chromatine maternelle pour former le pronoyau

Figure 19. Images en microscopie électronique et représentation schématique de la fusion des pronoyaux maternel et paternel, et de la caryogamie dans un ovule de médaka après fécondation (Iwamatsu et Kobayashi, 2002).

(A) Début de fusion des pronoyaux femelle et mâle d'un ovule de médaka. Les enveloppes nucléaires (ne) des pronoyaux femelle (f) et mâle (m) sont alignées parallèlement l'une à l'autre et fusionnent à 40 min post-fécondation.

(B) Fusion avancée des pronoyaux femelle et mâle de médaka. Des amas de chromatine condensée (ch) et de corps ressemblant à des nucléoles (no) sont observés dans tout le nucléoplasme. Les flèches indiquent les ponts de fusion intra-nucléaire.

(C) Rétrécissement du noyau du zygote de médaka. Le noyau est légèrement rétracté avec une enveloppe nucléaire dilatée et une forme irrégulière, à 43 min post-fécondation.

(D) Un noyau de zygote au moment de la rupture de l'enveloppe nucléaire avant la première mitose

embryonnaire. Le noyau a une forme extrêmement irrégulière en raison du plissage et de la

dégradation (astérisques) de l'enveloppe nucléaire à 45 min post-fécondation. (ch, chromosomes ;

mt, mitochondries ; ne, enveloppe nucléaire ; no, nucléole ; m, mâle ; f, femelle) (Barre d’échelle : 2

µm).

la constitution d’un pronoyau mâle (Wu et al., 1996 ; Iwamatsu et Kobayashi, 2002 ; Lindeman et Pelegri, 2010). Juste après la duplication de l’ADN des pronoyaux (Dekens et al., 2003 ; Lindeman et Pelegri, 2010 ; Loppin et al., 2015), la fusion pronucléaire commence (Figure 19). Les centrioles apportés avec le spermatozoïde fusionnent avec le matériel péri-centriolaire maternel (dépourvu de centriole). Le centrosome formé synthétise des microtubules pour former l’aster spermatique. Le pronoyau mâle est centré dans l’ovule grâce à l’aster spermatique et aux forces de traction médiées par des protéines motrices cytoplasmiques (Bestor et Schatten, 1981 ; Reinsch et Gonczy, 1998 ; Kimura et Onami, 2005 ; Wuhr et al., 2010). Les microtubules astraux vont ensuite capturer le pronoyau femelle. En migrant le long des microtubules, le pronoyau femelle rejoint le pronoyau mâle (Bestor et Schatten, 1981 ; Dekens et al., 2003) et fusionne avec ce dernier pour former le noyau du zygote (Figure 19) (Iwamatsu et Kobayashi, 2002). Chez les poissons comme le médaka, le poisson- zèbre et le poisson rouge, la fusion des pronoyaux se produit donc avant la rupture de l’enveloppe nucléaire de la première mitose embryonnaire et la condensation des chromosomes zygotiques (Iwamatsu et Kobayashi, 2002). La chromatine de l'embryon, après sa duplication, se condense alors et entame sa première division embryonnaire (Manandhar et al., 1998 ; Simerly et al., 1999 ; Schatten et Sun, 2009).

II.B.5. La formation de la première cellule : le blastodisque

La formation de la première cellule embryonnaire, ou blastodisque, chez le poisson rouge est

directement issue de l’activation de l’ovule. Des contractions pulsatiles de l’ovule au niveau du cortex

commencent au niveau du pôle animal et diffusent dans l’entièreté de l’ovule. Elles induisent la

migration progressive du cytoplasme de l’ovule vers le pôle animal. On parle de migration

cytoplasmique pendant laquelle l’ovule activé apparaît strié de canalicules opaques convergeant vers

le pôle animal. On observe alors une ségrégation importante entre le vitellus et le cytoplasme à

l’origine de la formation du blastodisque (Iwamatsu et Kobayashi, 2002 ; Iwamatsu, 2004 ; Tsai et al.,

2013). A ce stade, aucune membrane ou autre barrière physique particulière ne sépare les réserves

vitellines du blastodisque (Figure 20). Ce dernier reste en contact étroit avec le compartiment

vitellin, ce qui autorise l’échange aisé de matériel moléculaire entre les deux. Des remaniements très

précis de la localisation de certains ARNm stockés dans l’ovule ont également lieu à ce moment

Figure 20. Embryon de poisson rouge au stade blastodique (1 cellule) à 50 min post-fécondation.

Présence d’un blastodisque au niveau du pôle animal, de canalicules de cytoplasme dans la réserve

de vitellus (compartiment vitellin) et un chorion gonflé et décollé de la membrane plasmique de

l’embryon.