BIOTECHNOLOGIE DES ANTICORPS

INTRODUCTION

Plusieurs antigènes de groupes sanguins et tissulaires appartenant aux systèmes ABO, Rhésus et HLA, ont été découverts grâce aux anticorps polyclonaux des immun-serums humains et animaux.

L’exemple - il en existe beaucoup - de la maladie hémolytique du nouveau né MHNN démontre bien leur importance en médecine, notamment en transfusion sanguine. En 1939, Levine et Stetson décrivent une réaction post-transfusionnelle sévère, chez une mère venant d’accoucher d’un second enfant mort-né et transfusée avec le sang de son mari. Son enfant était atteint d’une anémie hémolytique. Le sérum de la mère contenait un anticorps qui agglutinait les hématies de l’enfant

BIOTECHNOLOGIE DES ANTICORPS

Résumé: De grandes perspectives en biologie et en médecine ont été ouvertes grâce à la biotechnologie des anticorps : techniques des hybridomes et de transformation lymphoblastoide par l’EBV.

De l’analyse unitaire, l’exploitation des anticorps est passée à l’analyse protéomique grâce aux puces à anticorps monoclonaux. L’anticorps monoclonal anti-CD3 (OKT3) de souris a été le chef de file d’une série d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapie. Des difficultés d’exploitation liées à la spécificité étroite des anticorps monoclonaux et à leurs propriétés biologiques ont ralenti leur expansion. L’évolution de l’ingénierie cellulaire et moléculaire a permis de résoudre nombre de ces problèmes. Des anticorps monoclonaux chimériques, humanisés et humains dont les performances biologiques et la spécificité ont été améliorées, sont actuellement utilisés avec succès, tels l’anti-CD20 et l’anti-Her2/neu en oncologie.

Mots clés : hybridomes – transformation lymphoblastoide - anticorps monoclonal - anticorps chimérique – anticorps humanisé – phage display.

N.HABTI

Faculté de médecine et de Pharmacie Laboratoire de génie génétique et cellulaire 19, Rue Tarik Ibnou Ziad - Casablanca – Maroc

habtino@hotmail.com

et du mari. C’était la démonstration de l’allo- immunisation foetomaternelle, survenant chez la mère dont les globules rouges étaient dépourvus d’un antigène présent sur les globules rouges de l’enfant et du mari. Ainsi on a compris le mécanisme de la MHNN jusqu’alors mystérieuse et inexpliquée. Grâce aux travaux de Landsteiner et Wiener en 1940 et de Levine en 1960, les antigènes Rhésus et LW ont été définis. Tous ces travaux ont été réalisés en étudiant et en utilisant les anticorps polyclonaux humains et animaux qui reconnaissent les antigènes présents à la surface de la membrane érythrocytaire. Plus de 276 antigènes de groupes sanguins sont dénombrés aujourd’hui et regroupés en 23 systèmes [1-2]..

Avec la notion de la monoclonalité et du fait du grand intérêt pour l’homme en biologie et en médecine, la biotechnologie des anticorps a profité de l’évolution des différentes disciplines scientifiques. Des découvertes et des améliorations importantes y ont été apportées depuis les anticorps polyclonaux jusqu’aux anticorps monoclonaux recombinants. Vu leurs multiples et importantes applications, Il est utile dans le présent article de résumer l’évolution et les principales actualités de la biotechnologie des anticorps.

1-Les aNTICORps pOLyCLONaUx

Les anticorps polyclonaux sont d’origine humaine ou animale. Les animaux les plus utilisés pour la production sont les souris, les lapins, les chèvres…

Les anticorps polyclonaux proviennent de plusieurs clones lymphocytaire B différents, dirigés contre plusieurs déterminants antigèniques, dits épitopes, constitutifs d’un même antigène. Ils ne possèdent pas les mêmes caractéristiques physicochimiques et biologiques. Ils sont donc hétérogènes et possèdent une spécificité étendue. Ils présentent beaucoup de réactions croisées indésirables. Les résultats obtenus au laboratoire avec les anticorps polyclonaux ne sont jamais rigoureusement reproductibles d’un lot immun-sérum à un autre, puisque ces derniers sont dépendants de la réponse immunitaire de l’individu ou de l’animal immunisé qui n’est jamais identique. Leur production chez l’homme ou chez l’animal est éthiquement difficilement acceptable. L’approvisionnement est donc difficile. La technique de production est

facile et rapide. Le coût est bas pour de petites quantités mais élevé pour de grandes quantités qui nécessitent un nombre élevé d’animaux, des conditions d’élevage contraignantes et des infrastructures onéreuses.

Malgré ces inconvénients, ils sont aujourd’hui encore utilisés en thérapie, en diagnostic et dans la recherche. Ainsi, les gamma globulines anti-rhésus D humains polyclonaux continuent à jouer un rôle très important dans la prévention de la maladie hémolytique du nouveau né MHNN [3]. D’autres anticorps, d’origine animale, sont conjugués à des marqueurs ou à des enzymes en vue de la fabrication de kits de diagnostic immunocytochimique et de recherche.

2- Les aNTICORps mONOCLONaUx

Les techniques du génie cellulaire permettent d’obtenir, en quantité indéfinie, de façon reproductible et illimitée dans le temps, des anticorps monoclonaux provenant d’un même clone lymphocytaire B. Ils ont tous les mêmes caractéristiques physicochimiques et biologiques.

Ils sont donc homogènes, ce qui permet de standardiser les tests.

Ils reconnaissent tous spécifiquement un seul épitope. Leur spécificité est donc étroite, ce qui permet d’appréhender la structure des divers épitopes constitutifs d’un antigène donné. Cela permet aussi d’identifier un déterminant antigènique au sein de mélanges complexes comme les liquides biologiques.

2.1 Techniques de l’ingénierie cellulaire

Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps monoclonaux. La technique des hybridomes et la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV .

Technique des Hybridomes.

Grâce aux travaux des hybridations cellulaires entrepris par Georges Barski et Boris Ephurssi en 1960, les généticiens ont pu associer la perte de certaines caractéristiques et fonctions à la perte de certains chromosomes ou fragments de chromosomes. En effet, les cellules hybrides obtenues à partir de cellules d’espèces différentes

sont très instables du fait d’une charge importante en matériel génétique. L’exclusion aléatoire de chromosomes ou de fragments chromosomiques permet d’aboutir à des cellules plus stables [4].

L’exploitation de la technique d’hybridation cellulaire en immunologie dans le but d’étudier la structure des anticorps a permis à Köhler et Milstein en 1975 (prix Nobel 1984) d’immortaliser et de sélectionner un hybride sécréteur d’anticorps anti- globules rouges de mouton. La fusion cellulaire a été réalisée à l’aide du virus de Sendai entre un lymphocyte de souris immunisée avec des globules rouges de mouton et un myélome de souris. C’est la technique des hybridomes qui depuis a beaucoup évolué. Le principe consiste à faire fusionner une cellule splénocytaire sécrétrice d’un anticorps provenant d’une souris balb/c immunisée et une cellule myélomateuse murine SP2/O-Ag14 ou P3X63Ag8 toutes les deux dérivant du myélome MOPC21. Les lignées myélomateuses sont sélectionnées pour leur déficit, généralement en l’enzyme Hypoxantine Guanine Phosphoribosyl Transférase (HGPRT ou HPRT) ou plus rarement, en l’enzyme Thymidine Kinase . Cette déficience est exploitée dans la sélection des cellules hybrides.

Les deux enzymes sont impliquées dans la synthèse des acides nucléiques à partir des bases puriques et du phosphoribosyl pyrophosphate pour produire des nucléotides puriques monophosphates . C’est une étape importante de la voie alterne.

Les cellules qui en sont déficientes (HGPRT- ou TK-) sont obligées d’utiliser la voie de novo. Le blocage de cette dernière par l’ajout dans le milieu de culture de l’aminoptérine ou de l’azasérine ou du methotrexate tue les cellules HGPRT-, TK.

L’aminoptérine étant un antifolate bloquant la thymidylate synthétase, la thymidine est rajoutée dans le milieu. L’hypoxathine est aussi rajoutée pour satisfaire un besoin temporaire en bases puriques.

Son apport est suspendu pendant la 2^ème semaine voire la 1^ère semaine après la fusion. Le myélome ne peut utiliser la voie HGPRT et meurt. Seules les cellules hybrides ayant la complémentation génique, héritant à la fois l’enzyme HGPRT de la cellule parentale lymphocytaire et le caractère myélomateux de multiplication indéfinie dans le temps ont la capacité de survivre et de proliférer dans le milieu sélectif HAT contenant de l’Hypoxanthine,

de l’Aminoptérine et de la thymidine. Le milieu HAT est remplacé par le milieu Hypoxanthine- Thymidine une semaine après la fusion puis par le milieu de culture habituel deux semaines après la fusion. Les cellules myélomateuses sont incapables de sécréter des anticorps. L’absence de sécrétion permet d’obtenir à partir d’ hybridomes sélectionnés un seul et unique type d’anticorps (Fig 1) [5-8].

Figure 1 : Voies de synthèse des acides nucléiques et niveaux de blocage par les antifolates

Voie exogène

Hypoxantine ___HGpRT__®IMP® AMP + GMP ⇑

Azasérine bloquant ||

Aminoptérine bloquant ||

Synthèse endogène DMP + folates ou PRPP + folates

||

Aminoptérine bloquant Voie exogène ⇓

Thymidine ________TK______ __®TMP HGPRT : Hypoxantine Gauanine Phosphoribosyl Transférase

TK : Thymidine Kinase

IMP : Inosinate MonoPhosphate AMP : Adénylate MonoPhosphate GMP : Guanylate Monophosphate TMP : Thymidylate MonoPhosphate DMP : Déoxyuridyl Monophosphate PRPP : Phosphoriboribosylpyrophosphate

Brièvement, la technique des hybridomes peut être résumée en quatre grandes étapes.

L’étape n°1 consiste à faire fusionner à l’aide du polyéthèneglycol le lymphocyte sécréteur d’un anticorps dirigé contre l’antigène ayant servi à l’immunisation de l’animal et le myélome. L’étape n°2 est l’identification des hybridomes sécréteurs des anticorps. L’étape n°3 consiste à isoler une cellule et une seule et à la maintenir en culture

pour obtenir un seul et unique clone ou famille de cellules toutes identiques sécrétrices d’un même anticorps dit monoclonal. C’est le clonage par dilution limite. Plusieurs clonages successifs sont des fois nécessaires pour obtenir un clone stable génétiquement. L’hybridome cloné est cultivé en système bioréacteur pour l’obtention d’un concentré de l’anticorps monoclonal ou en système Rollers pour l’obtention de l’anticorps monoclonal moins concentré sous forme de surnageant de culture. Il peut être injecté dans l’abdomen de la souris Balb/

c pour l’obtention d’ascite concentrée en anticorps monoclonal (Fig 2).

Figure 2 : Les différentes étapes de la technique des hybridomes

Technique de Transformation Lymphoblastoide par le Virus d’Epstein-Barr (EBV).

Cette technique est une alternative à la technique des hybridomes qui ne permet pas l’obtention d’anticorps dirigés contre les antigènes de certains systèmes de groupes sanguins humains tels Rhésus, Duffy, Kell…

Il s’agit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur d’un anticorps donné en y introduisant le virus d’Epstein-Barr EBV. Le virus est un membre de la famille des herpès virus.

Il infecte 90 % à 95 % des adultes. Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt. Au laboratoire, il est obtenu dans le surnageant de culture de la lignée B.95 du singe marmouset.

Les lymphocytes sécréteurs d’un anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des autres éléments figurés du sang sur gradient de densité 1.077. Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles. Plusieurs copies du génome viral peuvent pénétrer dans le cytoplasme de la cellule grâce au récepteur (CR2,CD21) qui est aussi le récepteur de la molécule du complément, facteur de croissance, C3d.

Le récepteur CD21 est un régulateur intracellulaire des lymphocytes. Une fois dans la cellule, les copies du virus peuvent y rester sous forme épisomique ou intégrer le génome humain. La transformation lymphoblastoide est observée entre la 3^ème et la 5^ème semaine de culture. Les lymphoblastoides sécréteurs obtenus sont généralement très instables génétiquement. Ils sont stabilisés d’abord par hétérofusion avec le myélome murin, ensuite par clonages successifs par dilution limite. La production en grandes quantités de l’anticorps monoclonal peut alors avoir lieu in vitro [9,10].

Autres techniques de l’ingénierie cellulaire

Les techniques de l’ingénierie cellulaire ont beaucoup évolué.

La stimulation in vitro de lymphocytes B mémoires CD22+IgM-, IgD-, IgA- d’individus victimes du syndrome respiratoire aigü sévère SRAS a récemment permis d’isoler plusieurs lignées EBV anti-coronariavirus [11].

La greffe intrahépatique des cellules souches CD34 humaines à des souris immunodéficientes donne un grand espoir pour l’obtention des anticorps monoclonaux humains après immunisation de ces souris [12].

2.2 De l’ingénierie cellulaire à l’ingénierie moléculaire

Bien qu’ils soient spécifiques, les anticorps monoclonaux peuvent présenter dans certains

cas des réactions croisées indésirables entre deux épitopes différents. En outre, du fait de leur étroite spécificité, ils peuvent ne pas ou mal reconnaître, notamment certains antigènes de groupes sanguins ne présentant pas tous les épitopes constitutifs ou dont le nombre de sites antigèniques est faible [13].

La technique des hybridomes a donné l’espoir de l’utilisation des anticorps monoclonaux murins dans l’immunothérapie. Cependant, des échecs ont souvent été enregistrés du fait de la réponse immune anti- souris, de la faiblesse ou de l’absence des fonctions biologiques dues à l’incapacité des fragments cristallisables Fc de certains anticorps monoclonaux, à recruter les cellules effectrices immuno compétentes et les molécules du complément [14]. Ces fonctions biologiques sont très importantes, par exemple, dans la prévention de la MHNN.

Le génie génétique peut être d’une aide précieuse pour améliorer les performances des anticorps monoclonaux murins et humains: l’avidité qui représente l’ensemble des forces de liaisons chimiques entre l’anticorps et l’antigène, ainsi que la spécificité dépendante de l’affinité de l’anticorps peuvent être augmentées par mutagénèse dirigée, par modification d’un ou de plusieurs acides aminés.

Les techniques dites d’humanisation des anticorps murins permettant l’obtention des anticorps chimériques et humanisés peuvent partiellement voire totalement résoudre les problèmes de spécificité et de la réaction anti-souris. Les anticorps chimériques sont obtenus en liant les régions d’ADN codant pour les parties variables H et L d’un anticorps monoclonal de souris aux régions constantes H et L d’un anticorps humain. Dans les anticorps dits humanisés, quant à eux, seules les régions hypervariables sont d’origine murine . Le clonage est effectué, grâce à des vecteurs appropriés, dans des cellules eucaryotes [15-20].

Par ailleurs, l’étude des domaines variables et constants des immunoglobulines peut être effectuée séparément en les exprimant à la surface de phages filamenteux chez E.Coli. Des anticorps nouveaux peuvent être créés en combinant les régions variables sélectionnées pour leur spécificité et les régions constantes sélectionnées pour leurs propriétés fonctionnelles. C’est grâce à cette technique dite de « Phage-display » qu’ont pu être produits des anticorps anti-Rhésus D recombinants. Ils sont

actuellement en cours d’évaluation clinique en vue de leur utilisation dans la prophylaxie de la Maladie Hémolytique du Nouveau Né [21-23].

Chez les souris transgéniques, les gènes codant pour les anticorps sont remplacés par les gènes humains.

Ces souris peuvent présenter des réponses primaires et secondaires. Cette méthode donne la possibilité de produire des anticorps monoclonaux humains de haute affinité contre tout agent immunogène [24].

Toutes ces techniques de combinaison et de substitution doivent tenir compte de la structure tridimensionnelle de l’anticorps qui dépend, entre autres, de la structure primaire des acides aminés et des sites de glycosylation. Des études de cristallographie et de modélisation sont donc nécessaires [25].

3- appLICaTIONs Des aNTICORps mONOCLONaUx

Les anticorps monoclonaux qui sont spécifiques permettent d’assurer des examens beaucoup plus précis que les anticorps polyclonaux. Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour l’immunomarquage des leucémies aigues. Leur utilisation dans la recherche fondamentale a permis l’étude et la compréhension de nombreux processus biologiques. Un panel d’anticorps monoclonaux permet de cartographier et d’étudier le rôle des épitopes dans certaines fonctions et mécanismes cellulaires. Plusieurs classes de différenciation ont été définies et ont permis de distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires. Après l’analyse unitaire ELISA, aujourd’hui grâce aux puces à anticorps monoclonaux, ces derniers ont un rôle important dans la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse. D’une façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique [13, 26-28].

En thérapie, les anticorps monoclonaux ont une place de plus en plus importante car ils ont une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction. A titre d’exemple, les anticorps anti-CD20 sont utilisés dans le traitement

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R é f é R e N C e s

des lymphomes non Hodgkiniens et des maladies autoimmunes. Quant à la prévention de la Maladie Hémolytique du Nouveau Né (MHNN), les anticorps polyclonaux anti-D humains seront bientôt remplacés par les anticorps monoclonaux recombinants après l’évaluation clinique qui est en cours. Le problème d’approvisionnement sera alors résolu.

Comme le montre le tableau 1, plusieurs autres molécules sont sur le marché, notamment l’anti- CD3 utilisé dans les transplantations et l’anti- oncogène HER-2/neu utilisé dans le traitement du cancer du sein [19,23].

CONCLUsION

L’apport des anticorps pour le développement humain est très prometteur pour l’avenir.

Leur utilité est déjà prouvée dans les nouvelles technologies de la génomique, de la protéomique, de l’imagerie et de la nanobiotechnologie.

Malgré quelques difficultés, le potentiel des applications thérapeutiques et diagnostiques ouvre des perspectives ayant un grand impact socioéconomique. Il est certain que l’acquisition de ces technologies de laboratoire est primordiale notamment pour l’industrie pharmaceutique de demain. Des investissements doivent y être consacrés.

Tableau 1 : Quelques anticorps monoclonaux AcM utilisés en thérapie

Nom de l’acm / Commerce Origine Spécificité Utilisation

OKT3 / Orthoclone Muromonab Souris CD3 Transplantation

Zenapax / Daclizumab Humanisé CD25 Transplantation

Remicade / Infliximab Chimérique TNFα Inflammation

Humira / Adalimumab Humain TNFα Inflammation

Herceptin / Trastuzumab Humanisé HER2/Neu Oncologie

Rituxan / Rituximab Chimérique CD20 Oncologie