IV-1 Etude de la cristallisation des phosphates en présence des substances chimiques IV-1-1 Méthodologie

La sursaturation du milieu urinaire est l’un des facteurs fondamentaux de la cristallisation des calculs, ou plus exactement celle des constituants des calculs.

Normalement, il existe dans les urines un équilibre entre promoteurs (calcium, phosphate, oxalate) et inhibiteurs de cristallisation (pyrophosphate, magnésium, citrate, nephrocalcine, glycoaminoglycane, Tamm-Horsfall glycoprotéine, osteopontin, etc…) [122-133].

La mise en évidence d’une éventuelle action inhibitrice de quelques substances chimiques sur la cristallisation des phosphates à pH = 6.5 et 8 peut avoir des retombées très positives sur la santé des lithiasique. Cela nous a incité à tester in vitro l’effet de ces substances chimiques sur la cristallisation des phosphates calcique et magnésique à partir de l’urine artificielle.

IV-1 Etude de la cristallisation des phosphates en présence des substances chimiques IV-1-1 Méthodologie

Les substances chimiques sont utilisées séparément. La même méthodologie en absence d’inhibiteur a été suivie. A t = 0 les solutions (A et B) et la substance chimique sont mélangées simultanément.

IV-1-2 Substances chimiques testées

Le tableau 39 donne les différentes substances chimiques testées et leurs concentrations.

Tableau 39. Concentrations des substances chimiques

Substances chimiques Concentration (mmol/l)

Acide citrique 0,1 - 6

Fer III 0,125-1,5

Pyrophosphate 0,06-0,2

IV-2 Résultats

IV-2-1 Cristallisation à pH = 6.5

La cristallisation seule favorise la formation de la brushite à pH=6,5. Les granulations sont apparues après cinq minutes. Les tailles maximum des cristaux étaient de 10 µm et celles des agrégats de 61µm.

IV-2-1-1 Etude de l’effet de l'acide citrique

Pour recouvrir la plage d'excrétion physiologique, une gamme de concentration en acide citrique a été testée [134] allant de 0,1 à 6 mmol/l.

La cristallisation des phosphates à pH= 6,5 en absence d'inhibiteur, induit à la formation de la brushite ( hydrogénophsphate de calcium dihydraté) et des granulations qui ont été identifiées par microscopie optique à lumière polarisée comme étant des phosphates amorphes de

calcium carbonaté (PACC).

IV-2-1-1-1 Morphologie des cristaux

L'analyse des prélèvements au microscope optique à lumière polarisante a révélé que la morphologie des cristaux obtenus en présence d’acide citrique n'a pas changé, la forme générale des cristaux reste sous forme de baguettes et de poinçons faiblement polarisants, plus ou moins agrégées, et sous forme aciculaires polarisants agrégés en gerbes, comme pour le cas des cristaux en absence d'inhibiteurs (photographies 70, 71 et 72).

brushite en présence de 0,1 mmol/l d’acide citrique

Cri:7,5 µm

Agr:37,5 µm

Photographie 70: diminution de la taille des cristaux de 25 % et des agrégats de 32% en présence d'acide citrique à 0,1mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie: cristaux (10µm) et agrégats

(55µm) de la brushite à 41 min (10 x 40 x 2,5)

IV-2-1-1-2 Taille moyenne des cristaux et des agrégats

Les résultats du suivi de l'évolution de la taille moyenne des cristaux de brushite en fonction du temps, en présence de l’acide citrique sont présentés en annexe 11.

Nos résultats montrent qu'en présence de l’acide citrique, la taille des cristaux diminue en fonction de la concentration en acide citrique.

En absence d’inhibiteurs les cristaux sont apparus après 17 min de cristallisation. Toutes les concentrations de l’acide citrique retardent la nucléation de la brushite (temps d’induction >

17 minutes).

L’acide citrique à toutes les concentrations a un effet inhibiteur remarquable sur les agrégats de la brushite qui se traduit par la diminution de leur taille ainsi qu’un ralentissement dans le temps de leur apparition.

Le tableau 39, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence et en absence de l’acide citrique.

Granulations de PACC

Photographie72: granulations de PACC à 3 mmol/l

d'acide citrique (10 x 40x 2,5).

Tableau 39 : Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence de l’acide citrique.

Concentration en Acide citrique

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des cristaux

(%)

Taux d’inhibition des agrégats

(%)

Taux d’inhibition des

cristaux+agrégats (%)

SI 17 20 - - -

0,1 mmol/l 17 20 25 32 31

0,5 23 26 25 43 40

1 23 26 50 63 61

2,5 23 - 100 100 100

Le tableau 39 montre que Le pourcentage d'inhibition augmente avec la concentration initiale en acide citrique. L'inhibition est totale à partir de 2,5 mmo/l en acide citrique. Le taux d’inhibition varie de 25 et 100%.

IV-2-1-1-3 Analyse par infrarouge à transformer de fourrier (IRTF)

Le spectre IRTF 10 confirme l'inhibition totale de la brushite à une concentration en acide citrique de 2,5 mM. Cette inhibition est traduite par la disparition des bandes caractéristiques de la brushite et l'apparition du PACC.

87 3, 59 54 6 14 28 ,9 93 9 33 26 ,6 05 2

23 45 ,0 15 6

16 33 ,4 11 4

10 70 ,2 99 1

56 3, 11 23

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

CM-1

ab so rb an ce

Spectre10: spectre de PACC à pH =6,5 [AC] = 2,5mM

Le spectre 10 montre des bandes caractéristiques du PACC. Il comporte des fréquences caractéristiques de cette dernière.

 Bande phosphate, arrondi, forte, asymétrique et centré sur 1068 cm

 Pas de bande à 600 cm

Les granulations répondaient d'après leur formes et polarisation aux PACC. A 3mmol/l même ces granulations se sont disparues.

A partir de 0,1 mmol/l en acide citrique, le temps de cristallisation et d'agrégation passe respectivement de 17 et 20 minutes en l'absence d'inhibiteurs à 23 et 26 minutes après addition de l’acide citrique. Son effet est significatif, une inhibition totale pour une concentration de 2,5 mmol/l. Une concentration qui correspond à la valeur moyenne physiologique de la citraturie chez les sujets normaux [135].

L'augmentation du temps d'induction en présence d'inhibiteur nous laisse supposer que le mode d'action du citrate sur la brushite à pH= 6,5 est une complexation

D'après les travaux de Hennequin [8], l'acide citrique réagit sur les ions Ca

, en les

complexant (croissance du Ti) en donnant ainsi un sel très soluble qui peut être facilement éliminé.

IV-2-1-2 Etude de la cristallisation avec l'ion ferrique

Nous avons testé l'effet du Fe

dans les mêmes conditions que les expériences précédentes.

Nous avons mené les expériences sous une température fixe à 37 °C. La gamme des concentrations varie de 0,125 à 1,5 mmol/l. [136].

IV-2-1-2-1 Morphologie des cristaux

Le suivi de la cinétique par microscopie optique à lumière polarisée, en présence du fer III, nous

a révélé la formation des granulations de PACC et de la brushite. La morphologie des cristaux

obtenus n'a pas changé par rapport à sans inhibiteurs. La forme générale des cristaux est restée

sous forme de baguettes et de poinçons faiblement polarisants, plus ou moins agrégées, et sous

forme aciculaire polarisante agrégée en gerbes (photographies 73, 74 et 75).

IV-2-1-2-2 Taille moyenne des cristaux et des agrégats

Les résultats concernant l'évolution de la taille des cristaux et des agrégats en absence et en présence du fer à pH = 6,5 sont donnés dans l’annexe 11.

Nous remarquons que le fer III a un effet inhibiteur important sur la taille des agrégats par rapport à la cristallisation seule. Son effet sur la croissance de la brushite est un peu moins important. La taille des cristaux et des agrégats semble inférieure avec toutes les concentrations

Brushite en présence de 0,2 mmol/

l de FeIII.

Cri7,5 µm.

Agr:18,32µm

Photographie 73: diminution de la taille des cristaux de 25 % et des agrégats de 67 %de la brushite en présence du Fe

à 0,2.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Brushite en présence de 1mmol/l de Fe III

Cri: 6,66µm.

Photographie 75: diminution de la taille des cristaux de 34 % et disparition des agrégats de la brushite en présence du Fe

à 1.mmol/l (10 x 40x 2,5).

PACC en présence de 1,5 mmol/l de FeIII

Granulations de PACC

Photographie74: Nucleus de PACC en présence du Fe

à 1,5.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie: cristaux (10µm) et agrégats

(55µm) de la brushite à 41 min (10 x 40 x 2,5)

en fer III représentées respectivement par les photographies 6, 7 et 8. La taille la plus faible des cristaux et des agrégats a été obtenue avec 1mmol/l de fer.

Le tableau 40, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence et en absence de l’acide citrique.

Tableau 40: Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence du fer III.

Concentration du fer III

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des cristaux

(%)

Taux d’inhibition des agrégats

(%)

Taux d’inhibition des

cristaux+agrégats (%)

SI 17 20 - - -

0,2 20 23 25 67 61

0,25 23 29 25 70 63

0,5 23 29 25 76 68

1 23 - 34 100 80

1,5 - - 100 100 100

Le tableau 40, montre que pour une concentration en fer III de 1,5 mmol/l à pH= 6,5, l'inhibition est quasiment totale. Elle reste toutefois effective 25 % à 0,2 mmol/l.

Cette inhibition est traduite par l'augmentation des temps de nucléation et d'agrégation qui passent respectivement de 17 et 20 minutes en absence d'inhibiteurs à 23 et 29 minutes à 0,25 mmol/l. Le taux d’inhibition des cristaux varie de 25 à 100%.

L'inhibition des agrégats est évolutive en fonction de la concentration en ions ferrique jusqu'à la disparition totale de ces derniers à partir d'une concentration de 1mM.

Le domaine d’inhibition des agrégats est très peu étendu par rapport à celui des cristaux, il varie de 67 à 100%

IV-2-1-2-3 Analyse par IRTF

Le spectre 11, confirme l'inhibition totale de la brushite à partir d'une concentration de 1,5 mM de fer III et ceci par la disparition des bandes caractéristiques de la brushite qui sont remplacées par celles caractéristiques du PACC.

Le spectre 11 montre des bandes caractéristiques du PACC. Il comporte des fréquences caractéristiques de cette dernière.

 Bande phosphate, arrondi, forte, asymétrique et centré sur 1068 cm

 Pas de bande à 600 cm

IV-2-1-3 Etude de l’effet du pyrophosphate

L’étude bibliographique concernant l’inhibition du pyrophosphate révèle qu’il est beaucoup plus efficace autant qu’inhibiteur vis à vis de la cristallisation phosphocalcique [137-140].

Le même protocole expérimental a été adopté à l’étude inhibitrice pour le pyrophosphate. Ce dernier a été testé à des concentrations allant de 0,06 à 0,4 mmol/l. La force ionique est maintenue constante à 0,15 M.

IV-2-1-3-1 Morphologie des cristaux

32 82 ,2 50 5

23 56 ,5 86 4

16 44 ,9 82 2

13 88 ,4 96 1

52 4, 54 29 7 10 72 ,7 99 8

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

CM-1

ab so rb an ce

Spectre11: spectre de PACC à pH =6,5 [Fe

] = 1,5mM

Le suivi de la cinétique par microscopie optique à lumière polarisée, en présence du fer III, nous a révélé la formation des granulations de PACC et de la brushite. La morphologie des cristaux obtenus n'a pas changé par rapport à sans inhibiteurs. La forme générale des cristaux est restée sous forme de baguettes et de poinçons faiblement polarisants, plus ou moins agrégées, et sous forme aciculaire polarisante agrégée en gerbes mais de taille plus petite par rapport à sans inhibiteurs (photographies 76, 77 et 78).

IV-2-1-3-2 Taille moyenne des cristaux et des agrégats

Photographie 76: diminution de la taille des cristaux de 25 % et des agrégats de

76 % de la brushite en présence du

pyrophosphate à 0,06.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie 77: diminution de la taille des cristaux de 25 % et des agrégats de 81 % de la brushite en présence du pyrophosphate à 0,1.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie 78: inhibition totale 100%

de la brushite en présence du pyrophosphate à 0,2.mmol/l

Photographie: cristaux (10µm) et agrégats

(55µm) de la brushite à 41 min (10 x 40 x 2,5)

Les résultats du suivi de l’évolution de la taille moyenne des cristaux de brushite par microscope optique polarisant, à pH = 6,5 et en présence du pyrophosphate comme inhibiteur, sont représentés en annexe 12.

La présence pyrophosphate a provoqué une diminution de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite. Cette diminution est remarquable à partir de la plus faible concentration 0,06 mol/l. En fin des expériences leur taille s’est stabilisée respectivement à 7,5 µm et 13,32 µm au lieu de 10 µm et 55 µm.

Le tableau 41, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence et en absence de l’acide citrique.

Tableau 41 : Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence du pyrophosphate.

Concentration du pyrophosphate

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des

cristaux (%)

Taux d’inhibition des agrégats

(%)

Taux d’inhibition des cristaux+

agrégats (%)

SI 17 20 - - -

0,06 23 29 25 76 68

0,08 26 29 25 79 71

0,1 26 29 25 81 72

0,2 - - 100 100 100

L’effet du pyrophosphate à pH = 6,5 sur la brushite est impressionnant, l’inhibition est totale à partir d'une concentration de 0,2 mmol/l. La présence du pyrophosphate a aussi provoqué une nette diminution de la taille moyenne de la brushite même à faibles concentrations. Ce qui traduit l’effet inhibiteur puissant du pyrophosphate sur les trois phases cristallines de la formation de la brushite.

Les résultats trouvés montrent qu'à la concentration 0,2mmo/l en pyrophosphate, l'inhibition de la brushite est quasiment totale. Elle commence à être importante (68%) dés 0,06 mmol/l.

Cette dernière a provoqué un ralentissement de la cristallisation et de l'agrégation.

Le temps de cristallisation et celui d'agrégation passent respectivement de 17 et 20 minutes en l'absence d'inhibiteur à 23 et 29 minutes.

L’augmentation du temps d’induction en présence d’inhibiteur nous laisse supposer que le mode d’action du pyrophosphate est une complexation ce qui concorde avec les données bibliographiques [8].

IV-2-1-3-3 Analyse par IRTF

Le spectre IRTF 12 confirme l’inhibition totale de la brushite à 0,2 mmol/l en pyrophosphate.

Cette inhibition est traduite par la disparition des bandes caractéristiques de la brushite. Ces dernières sont remplacées par les bandes caractéristiques des apatites.

Spectre 12 : Pyrophosphate 0,2 mmo/l à pH =6,5

IV-2-2 Cristallisation à pH = 8

IV-2-2-1 Etude de l’effet de l'acide citrique

Le même protocole expérimental a été adopté à l'étude inhibitrice par l'acide citrique à pH= 8.

En l'absence d'inhibiteur, les cristaux et granulations identifiés et confirmés par spectroscopie IRTF sont respectivement la struvite (phosphate ammoniaco-magnésien héxahydraté) et la carbapatite.

IV-2-2-1-1 Morphologie des cristaux

L'étude de la cinétique de cristallisation en présence de l’acide citrique à différentes concentrations a révélé la formation des granulations de la carbapatite et des cristaux de la struvite. La morphologie des cristaux et des agrégats obtenus par effet de cette substance n'a pas changé, la forme générale des cristaux et des agrégats est restée orthorhombique et rectangulaire, comme pour le cas des cristaux en absence d'inhibiteur (photographies 79, 80 et 81).

Struvite en présence de 2,5 mmol/l d’acide citrique

Agr:30m Cri:5µm

Photographie 79: diminution de la taille des cristaux de 60 % et des agrégats de 62 % de la struvite en présence d'acide citrique à 2,5.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Struvite en présence de 0,5mmol/l d’acide citrique

Agr:34,16 µm.

Cri: 7,5 µm

Photographie 75: diminution de la taille

des cristaux de 40% et des agrégats de 44 % de

la struvite en présence d'acide citrique à 0,5

mmol/l (10 x 40x 2,5).

IV-2-2-1-2 Taille moyenne des cristaux et des agrégats

Les résultats concernant l'évolution de la taille des cristaux et des agrégats de struvite à pH = 8 en fonction du temps sont regroupés dans l’annexe 13.

La taille des cristaux là aussi est inférieure avec toutes les concentrations d’acide citrique.

Même chose a été observée avec les agrégats. La taille la plus inférieure des cristaux et des agrégats a été observée avec la concentration 3mmol/l en acide citrique. La taille des cristaux et des agrégats s’est réduite respectivement de 12,5 µm et 61 µm en absence d’inhibiteurs à 5 µm et 11,66 µm à cette concentration. Ce qui montre que l’effet de l’acide citrique est beaucoup plus important sur l’agrégation que sur la croissance cristalline de la struvite à ce pH.

Le tableau 42, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence et en absence de l’acide citrique.

Struvite en présence de 3mmol/l d’acide citrique

Cri:5µm Agr:18,32µm

Photographie 80: diminution de la taille des cristaux de 60 % et des agrégats de 70 % de la struvite en présence d'acide citrique à 3.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Nucleus de PACC en présence de 6mmol/l d’acide citrique

Nucleus de PACC.

Photographie 81: nucleus de PACC en

présence d'acide citrique à 6.mmol/l (10 x 40x

2,5).

Tableau 42 : Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la struvite en présence de l’acide citrique.

Concentration en acide citrique

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des cristaux

(%)

Taux d’inhibition des agrégats

(%)

Taux d’inhibition des

cristaux+agrégats (%)

SI 5 8 - - -

0,5mmol/l 8 11 40 40 44

1mmol/l 8 11 60 48 53

2,5mmol/l 8 11 60 59 62

3mmol/l 8 11 60 68 69

6mmol/l 8 11 100 100 100

En présence de l’acide citrique, l’apparition des cristaux et des agrégats de la struvite a été légèrement retardée. Le temps d’induction ainsi que celui d’agrégation passent respectivement de 5 et 8minutes en absence d’inhibiteurs à 8 et 11 minutes pour toutes les concentrations. Par rapport à sans inhibiteurs, Nous avons remarqué d’après le tableau 30 une diminution

progressive de la taille des cristaux de struvite en fonction des concentrations en acide citrique jusqu'à une inhibition totale de celle-ci à 6mmol/l. Le taux d’inhibition varie de 40 à 100%. En plus de son effet sur la croissance cristalline de la struvite, l’acide citrique exerce un effet

inhibiteur remarquable sur l’agrégation de cette espèce cristalline qui se traduit par la diminution de la taille des agrégats. De même que pour les cristaux, le pourcentage d’inhibition varie de 40 à 100%. Comme à pH = 6,5, l’effet de l’acide citrique sur les cristaux de struvite est important soit sur la croissance ou l’agrégation. L’inhibition de la croissance de la struvite est déjà importante à partir de 0,5 mmol/l d’acide citrique avec un taux d’inhibition de 60 %.

IV-2-2-1-3 Analyse par IRTF

La microscopie optique a montré que l'acide citrique à 6mM a provoqué une inhibition totale de la struvite. Les granulations ont été identifiées comme étant la carbapatite par leur intense polarisation. Le spectre 13, confirme ces résultats et prouve l'inhibition totale de la struvite, ceci par la disparition des bandes caractéristiques de celle-ci. Le constituant majoritaire est la carbapatite.

10 33 ,1 58 9 14 32 ,8 50 8 16 27 ,6 26 32 59 ,1 08 9

23 46 ,9 44 1

75 9, 81 59 2 60 5, 53 85 7 46 0, 90 35 6

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

0 1000 2000 3000 4000 5000

ab so rb an ce

Le spectre IRTF 13 montre des bandes caractéristiques de la carbapatite, comme composé principale. Les bandes caractéristiques de la carbapatite sont :

 Valence asymétrique PO4 à 1033 cm

, forte, large, asymétrique ;

 Vibrations secondaires à 600 et 563 cm

;

 Vibrations carbonates : valence 1432 cm

. IV-2-2-2 Etude de l’effet des ions ferrique

Rappelons qu'à ce pH, en l'absence d'inhibiteur, la seule forme cristalline qui précipite a été identifiée par microscopie optique et confirmée par IRTF était la struvite. Les granulations répondaient à la forme de la carbapatite.

IV-2-2-2-1 Morphologie des cristaux

L'étude de la cinétique de cristallisation en présence de fer III à différentes concentrations a révélé la formation des granulations de la carbapatite et des cristaux de la struvite. La morphologie des cristaux et des agrégats obtenus par effet de cet inhibiteur a légèrement changé, la forme générale des cristaux et des agrégats est restée orthorhombique et rectangulaire mais déformées pour certaines concentrations de fer à la différence des cristaux en absence d'inhibiteur (photographies 82, 83 et 84).

146

Struvite en présence de 0,25 mmol/l de Fe

Agr:55µm

Cri:5µm

Photographie 82: diminution de la taille des Struvite en absence d’inhibiteurs à pH =8

Cri:12,5 µm

Agr:61µm

Nucleus de PACC

Photographie: cristaux (12,5µm) et agrégats

IV-2-2-2-2 Taille des cristaux et des agrégats

Les résultats du suivi de l’évolution de la taille moyenne des cristaux de struvite par microscope optique polarisant, à pH = 8 et en présence du fer III comme inhibiteur, sont présentés dans l’annexe 14.

L’effet du fer III sur la croissance et sur l’agrégation de la struvite est puissant à 1,5 mmol/l.

La taille des cristaux et des agrégats passe respectivement de 12,5 et 61 µm en absence d’inhibiteur à 3,33µm et 19,19 µm.

Struvite en présence de 1,5mmol/

l

Agr:19,19µm Cri:5µm

Photographie 84: diminution de taille des cristaux de 74%et des agrégats de 69% de la struvite en présence du Fe

à 1,5.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Struvite en présence de 0,5 mmol/l de Fe

Cri:5µm

Agr:45,82µm

Photographie 83: diminution de la taille des

cristaux de 40% et des agrégats de 25 % de la

struvite en présence du Fe

à 0,5.mmol/l (10 x

40x 2,5).

Le tableau 43, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la brushite en présence et en absence de l’acide citrique.

Tableau 43 : Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la struvite en présence du fer III.

Concentration du fer III

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des

cristaux (%)

Taux d’inhibition des

agrégats (%)

Taux d’inhibition cristaux+ agrégats

(%)

SI 5 8 - - -

0,2 8 11 40 8 13

0,25 8 11 40 10 28

0,5 8 11 40 25 28

1 8 11 40 44 44

1,5 8 11 74 69 70

On trouve là aussi l'inhibition évolutive de la struvite en fonction de la concentration en ions ferrique. Plus, on augmente la concentration en fer plus la taille moyenne des cristaux diminue. Le pourcentage d’inhibition des cristaux varie de 40 à 74 %. Celui des agrégats varie entre 13 et 70 %.

D'après le tableau 42, on remarque que le fer n'a pas d'action sur la nucléation, le temps de cristallisation varie peu. Le fer III exerce un effet sur la croissance et l'agrégation.

Le fait que le fer III n'agit pas sur la nucléation suppose qu'il a un mode d'action différent de celui de l'acide citrique. Le domaine d'inhibition de la croissance et l'agrégation de la brushite par les ions ferrique est très peu étendu par rapport à celui de la struvite qui reste assez étendu.

IV-2-2-2-3 Analyse par IRTF

Le spectre infrarouge 14, montre les valeurs des fréquences caractéristiques de la struvite à une concentration en fer III de 1,5 mM à pH =8. On note la disparition de la carbapatite.

Les bandes caractéristiques de la struvite sont :

 Valence asymétrique PO

à 1006 cm

, forte, large, asymétrique ;

 Vibrations carbonates : valence 1435 cm

.

 Plateau molécules H

O + ion NH

entre 3700 cm

, et 2300 cm

, décrochant à 2362 cm

. IV-2-2-3 Etude de l’effet du Pyrophosphate

IV-2-2-3-1 Morphologie des cristaux

L'étude de la cinétique de cristallisation en présence du pyrophosphate à différentes concentrations a révélé la formation des granulations de la carbapatite et des cristaux de la struvite. La morphologie des cristaux et des agrégats obtenus par effet de cet inhibiteur a légèrement changé, la forme générale des cristaux et des agrégats est restée orthorhombique et rectangulaire. Néanmoins ces cristaux sont parfois altérés pour certaines concentrations en pyrophosphate à la différence de ces cristaux en absence d'inhibiteur (photographies 85, 86 et 87).

23 48 ,8 72 6 32 41 ,7 52 7

16 19 ,9 12 1

14 32 ,8 50 8

10 06 ,6 59 7

75 4, 03 05 2

56 6, 96 92 4 46 0, 90 35 6

0 0,5 1 1,5 2 2,5

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Fréquence cm-1

A b so rb an ce

Spectre14: spectre de struvite à pH =8 [Fe

] = 1,5mM

Photographie 87: diminution de la taille des cristaux de 74% et des agrégats de 66 % en présence du pyro à 0,4.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie 85: diminution de la taille des cristaux de 40 %et des agrégats de36 % de la struvite en présence du pyro à 0,08.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie 86: dminution de la taille des cristaux de 60 % et des agrégats de 55 % de la struvite en présence du pyro à 0,1.mmol/l (10 x 40x 2,5).

Photographie: cristaux (12,5µm) et agrégats

(61µm) de struvite en absence d’inhibiteurs

(10x40x2,5)

IV-2-2-3-2 Taille moyenne des cristaux et des agrégats

Les résultats du suivi de l’évolution de la taille des cristaux de struvite par microscope optique

polarisant à pH = 8 et en présence du pyrophosphate comme inhibiteur sont représentés en

annexe 15.

On remarque une diminution progressive de la taille moyenne des cristaux de struvite en fonction de la concentration en pyrophosphate, par comparaison aux résultats trouvés en l'absence d'inhibiteur.

L’effet pyrophosphate sur la taille des cristaux et des agrégats de struvite, est aussi important que celui enregistré sur la brushite. La taille passe respectivement de 12,5µm et 61 µm en absence d’inhibiteur à 3,33µm et 20,83 µm à 0,4mmol/l.

Le tableau 44, regroupe les temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la struvite en présence et en absence de l’acide citrique.

Tableau 44: Temps d’induction et d’agrégation ainsi que le taux d’inhibition (%) de la taille des cristaux et des agrégats de la struvite en présence du pyrophosphate.

Concentration du pyrophosphate

Temps de nucléation

(min)

Temps d’agrégation

(min)

Taux d’inhibition des cristaux

(%)

Taux d’inhibition des agrégats

(%)

Taux d’inhibition des cristaux+agrégats

(%)

SI 5 8 - - -

0,06 8 11 40 25 28

0,08 8 11 40 36 37

0,1 8 11 60 55 56

0,2 8 11 60 65 64

0,4 8 11 74 66 68

Spectre 15 : spectre du pyrophosphate 0,4 mmol/l à pH =8

IV-3 Comparaison de l’inhibition phosphocalcique et ammoniaco-magnésienne à pH = 6,5 et 8 avec l’inhibition oxalocalcique par les substances chimiques.

Les taux d’inhibition (I%) des cristaux + agrégats de la brushite et la struvite sont comparés avec ceux de l’oxalate de calcium [11].

Pour comparer ces résultats, nous avons représenté les valeurs des pourcentages d’inhibition dans le tableau 45.

Tableau 45. Comparaison de l’inhibition phosphocalcique et ammoniaco-magnésienne à pH=6,5 et 8 avec l’inhibition oxalocalcique par les substances chimiques.

Substances chimiques

Concentration Mmol/l

Taux d’inhibition cristaux + agrégats (I%)

Brushite Struvite 0xalates de calcium

0,1 31 44 29

Acide citrique 1 61 53 32

2,5 100 62 87

0,2 61 13 -

Fer III 0,5 68 28 -

1 80 44 -

1,5 100 70 -

0,06 68 28 -

Pyrophosphate 0,1 72 56 18

0,2 100 64 44

- : Concentrations non testées par la méthode de microphotographie

D’après le tableau 45, nous remarquons que les pourcentages d’inhibition cristaux + agrégats obtenus pour la brushite en présence de l’acide citrique sont plus importants que ceux pour la struvite et l’oxalate de calcium. D’après les données bibliographiques, l’acide citrique est un inhibiteur plus efficace dans les urines neutres qu’en urines acides [127]. Ceci concorde avec nos résultats.

Concernant le fer, il est plus actif contre la brushite que sur la struvite et l’oxalate de calcium.

En conformité avec les donnés bibliographiques, le fer agit sur la germination du phosphate de calcium (brushite) [8].

L’effet inhibiteur du pyrophosphate sur les phosphates est remarquable par rapport aux oxalates. Ceci concorde avec les données bibliographiques qui confirment que les propriétés inhibitrices du pyrophosphate s’exercent principalement vis-à-vis du phosphate du calcium [127].

DAUDON et al. [12] montrent que le pH est capable de moduler l’activité inhibitrice du pyrophosphate. Elle est plus intéressante à un pH acide ou neutre qu’à un pH alcalin ce qui concorde avec nos résultats.

IV-4 Discussion

Le suivi de la cinétique de la cristallisation par microscope optique à lumière polarisée et l’analyse spectrale par infrarouge à transformée de Fourier, révèlent que, dans l’urine artificielle sans inhibiteur, les cristaux formés à pH = 6,5 sont la brushite et à pH = 8 sont la struvite.

Les résultats obtenus de la cristallisation des phosphates avec les inhibiteurs chimiques proposés à différentes concentrations montrent des taux d’inhibition très variables.

Le tableau 46 résume les résultats de l’effet de quelques substances chimiques sur la cristallisation de la brushite.

Tableau 46 : Récapitulatif de l’effet de quelques substances chimiques sur le temps d’induction, la taille des cristaux et la taille des agrégats de la brushite à pH = 6,5.

Substances chimiques

Concentration

(mM) Effets

Acide citrique

0,1 ● Effet neutre sur la nucléation.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 32%.

0,5

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et celui de l’agrégation de 26 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 43%.

1

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et celui de l’agrégation de 26 minutes.

● Inhibition des cristaux à 50%.

● Inhibition des agrégats à 63%.

2,5 ● Inhibition des cristaux et des agrégats à 100%.

Fe

0,2

● Ralentissement de la nucléation de 20 minutes et celui de l’agrégation de 23 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 67%.

0,25

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et celui de l’agrégation de 29 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 70%.

0,5

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et celui de l’agrégation de 29 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 76%.

1

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et inhibition totale des agrégats

● Inhibition des cristaux à 34%.

● Inhibition des agrégats à 100%.

1,5 ● Inhibition des cristaux et des agrégats à 100%.

Suite du tableau 46 . Récapitulatif de l’effet de quelques substances chimiques sur le temps d’induction, la taille des cristaux et la taille des agrégats de la brushite à pH = 6,5.

Substances chimiques

Concentration

(mM) Effets

Pyro

0,06

● Ralentissement de la nucléation de 23 minutes et celui de l’agrégation de 29 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 76%.

0,08

● Ralentissement de la nucléation de 26 minutes et celui de l’agrégation de 29 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 79%.

0,1

● Ralentissement de la nucléation de 26 minutes et celui de l’agrégation de 29 minutes.

● Inhibition des cristaux à 25%.

● Inhibition des agrégats à 81%.

0,2

● Inhibition des cristaux et des agrégats à 100%.

Le tableau 47 résume les résultats de l’effet de quelques substances chimiques sur la cristallisation de la struvite.

Tableau 47. Récapitulatif de l’effet de quelques substances chimiques sur le temps d’induction, la taille des cristaux et la taille des agrégats de la struvite à pH = 8.

Substances chimiques

Concentration (mM)

Effet

Acide citrique

Fe

0,5

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 40%.

1

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 60%.

● Inhibition des agrégats à 48%.

2,5

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 60%.

● Inhibition des agrégats à 59%.

3

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 60%.

● Inhibition des agrégats à 68%.

6

● Inhibition des cristaux et des agrégats à 100%.

Concentration (mM)

Effet

0,2

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 8%.

0,25

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 10%.

0,5

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 25%.

1

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 44%.

1,5

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 69%.

Pyro 0,06 ● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 25%.

0,08

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 36%.

0,1

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 60%.

● Inhibition des agrégats à 65%.

0,2

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 74%.

● Inhibition des agrégats à 66%.

0,06

● Ralentissement de la nucléation de 8 minutes et celui de l’agrégation de 11minutes.

● Inhibition des cristaux à 40%.

● Inhibition des agrégats à 25%.

 pH= 6,5 :

L’effet de l’acide citrique à différentes concentrations a été clairement démontré, nous avons obtenus 100% d’inhibition à partir de la concentration 2,5 mmol/l. A des concentrations de 0,2, 0,25, et 0,5 mmol/l le Fer agit sur la nucléation, la taille des cristaux et des agrégats.

En augmentant la concentration à 1mmol/l, le fer exerce une inhibition totale sur les agrégats et à 1,5 mmol/l, l’inhibition totale s’étend aux cristaux.

A des concentrations inférieures à 0,1 mmol/l, le pyrophosphate agit sur la nucléation, la croissance et l’agrégation cristalline, à 0,2 mmol/l, il entraîne l’inhibition totale des cristaux et des agrégats. Enfin, nous avons obtenu 100 % d’inhibition pour une concentration de 7 mmol/l en magnésium.

 pH= 8 :

A ce pH et à des concentrations inférieures ou égales à 3mmol/l, l’acide citrique, exerce un effet inhibiteur sur la nucléation, la taille des cristaux et des agrégats. A 6mmol/l, l’inhibition devient totale.

Le fer et le pyrophosphate présentent presque le même effet inhibiteur sur la nucléation, la

croissance et l’agrégation cristalline, avec des taux d’inhibition pour les cristaux allant de 40 à

66 % et pour l’agrégation de 8 %à 69 % et 25 % à 66 % respectivement.